Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ một chủng vi sinh vật phân lập ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐKQGHM

BAO CAO TONG KET
KẾT QUẢ TH ựC HIỆN ĐỀ TÀI KH&CN
CẤP ĐẠI HỌC QUÓC GIA

Tên đề tài: Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase
từ một chủng vi sinh vật phân ỉập ở Việt Nam
Mã số đề tài: KLEPT 12-01
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

ĐAI HỌC QUỐC GIA HA NỘI

ĨRUNG TAM th ò n g tin thư viện

0006 0 0 0 0 ^ 6 3

Hà Nội, 2015


PHẢN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài: Tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ một chủng vi sinh vật
phân lập ở Việt Nam
1.2. Mã số: KLEPT 12-01
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
TT

Đơn vị công tác

Vai trò thực
hiện đề tài

Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

Chủ trì đề tài

Chức danh, hoc vi, ho và tên

1

PGS.TS. Nguyễn Quang Huy

2

TS. Phạm Bảo Yên

PTN Trọng điểm CN Enzym Protein

Thành viên

3

ThS. Ngô Thị Trang

Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

Thành viên

Viện

vsv

và CNSH, ĐHQGHN

Thành viên

4

TS. Nguyễn Huỳnh Minh Quyên

5

ThS. Nguyễn Đàm Lý

Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

Thành viên

6

ThS. Nguyễn Ánh Tuyết

Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN

Thành viên

1.4. Đơn vị chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN
1.5. Thòi gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng:

1.5.2. Gia hạn (nếu có):

từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 8 năm 2014
đến tháng 7 năm 2015

1.5.3. Thực hiện thực tế: từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 6 năm 2015
1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
(v ề mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và tổ chức thực hiện; Nguyên nhân; Ỷ
kiến của Cơ quan quản lý)
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 500 triệu đồng.

PHẢN II. TỎNG QUAN KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u
Viết theo cấu trúc m ột bài báo khoa học tổng quan từ 6-15 trang (báo cáo này sẽ được đăng trên
tạp chí khoa học ĐHQGHN sau khi đề tài được nghiệm thu), nội dung gồm các phần:
1. Đ ặt vấn đề: Nhóm hợp chất halogen là nhóm hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong nhiều
ngành công nghiệp, nông nghiệp, y học. Bên cạnh những lợi ích mang lại thì việc sử dụng tràn lan
và thải ra môi trường m à không có phương pháp xử lý triệt để đã và đang gây ra những hậu quả
nghiêm trọng đến môi trường, hệ sinh thái và sức khỏe con người (Greaves và cộng sự, 1981). Việc
áp dụng các phương pháp vật lý, hóa học để giải quyết tình trạng ô nhiễm gây ra bởi các hợp chất
halogen cho hiệu quả cao song chi phí đắt cũng như đòi hỏi công nghệ hiện đại. Phương pháp sinh
học sử dụng khả năng phân giải của vi sinh vật tự nhiên được đánh giá là tiềm năng cao không chỉ
cho hiệu quả nhanh chóng m à còn mang tính bền vững, ít tốn kém, thân thiện với môi trường.
Trong tự nhiên tồn tại các nhóm vi sinh vật có khả năng sử dụng hợp chất halogen để thực hiện các
quá trình trao đổi chất, duy trì các hoạt động sống của cơ thể, chuyển hóa các hợp chất halogen từ
dạng độc hại trở nên ít độc hơn hoặc không còn độc với môi trường sinh thái và con người (Fetzner
và Ligens, 1994; W en và Fahrul, 2012; W ildeman và Verstraete, 2003).
1


Việt Nam là nước sản xuất nông nghiệp với khí hậu nhiệt đới nóng và ẩm thuận lợi cho sự

phát triển của cây trồng song cũng thuận lợi cho sự phát sinh, phát triến của sâu bệnh, cỏ dại gây hại
mùa màng, do vậy hàng năm Việt Nam sử dụng một lượng lớn hóa chất bảo vệ thực vật mà chủ yếu
là các họp chất nguồn gốc clo hữu cơ. Việc sử dụng tràn lan các họp chất này dẫn đến tồn dư các
loại họp chất này đã gây ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Nguyễn và cộng
sự, 2007). ở Việt Nam hiện chưa có nhiều nghiên cứu cơ bản về việc ứng dụng vi sinh vật có hoạt
tính phân giải hợp chất halogen để giải quyết ô nhiễm môi trường.
Dehalogenases là nhóm gồm nhiều enzym xúc tác cho việc loại bỏ các nguyên tử halogen từ
các họp chất hữu cơ có chứa halogen liên kết với cacbon. Sự phân tách của halogen khỏi liên kết
với sự tham gia của các enzym xúc tác theo nhiều cơ chế khác nhau: (i) Loại nhóm halogen là quá
trình thay thế nhóm halogen bởi nguyên tử hydro; (ii) Loại nhóm halogen với có sự tham gia của
phân tử oxy. Phản ứng trong nhóm này được xúc tác bởi monooxygenases (hoặc dioxygenases);
(iii) Thủy phân các dẫn xuất nhóm halogen, phản ứng

thủy phân được xúc tác bởi

halidohydrolases, nhóm halogen được thay thế bởi sự tham gia của nucleophin một nhóm hydroxy
có nguồn gốc từ nước; (iv) "Thiolytic" dehalogenation, một số nhóm vi khuẩn phân hủy
dichloromethane với sự tham gia của glutathione S-transferase xúc tác sự hình thành của một liên
kết glutathione S-chloromethyl dẫn tới với việc khử clo; (v) Loại bỏ nhóm halogen khỏi phân tử
qua việc hình thành của m ột liên kết đôi; (vi) Loại bỏ nhóm halogen có sự tham xúc tác của
hydratase (Hardman and Slater, 1981). Một số chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh enzym
dehalogenase đã được phân lập như Methylobacterium sp. HJ1 (Jing và cộng sự, 2008),
Pseudomonas putida (M otosugi và cộng sự, 1982), Xanthobacter autotrophicus GJ10 Ợanssen và
cộng sự, 2005), Pseudomonas B6P (Mesri và cộng sự, 2009)... Hầu hết, các vi khuẩn sản sinh
dehalogenase đều có hơn 1 loại dehalogenase.
Cho đến nay chỉ mới phát hiện duy nhất một loài có khả năng sản sinh ra 3 loại đồng phân
dehalogenase đó là Rhizobium sp. Nó có thể sản sinh ra 3 đồng phân halogenase Dehalogenase L
(DehL), Dehalogenase E (DehE), Dehalogenase D (DehD) để phân hủy các dẫn xuất halogen của
axít propionic trong đó có 2,2 DCPS được phân hủy bởi dehalogenase E.
2. Mục tiêu

- Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng các hợp chất có chứa clo
- Tinh sạch và nghiên cứu tính chất của dehalogenase tách từ một chủng vi khuẩn phân lập
3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Các mẫu bao gồm đất, nước, bùn được thu thập từ các môi trường khác nhau tại Việt Nam
(Hà Nội, Thái B ình...), tập trung chính là các khu vực có ô nhiễm chất thải chứa hợp chất clo như
sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu... Các m ẫu sau khi được thu thập sẽ được bảo quản
trong nhiệt độ lạnh và chuyển về phân tích tại phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzym và
Protein (Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN).
Các hóa chất được cung cấp từ các hãng có uy tín, 1,2-Dichloroethane (1,2-DCE) được mua
từ hãng

Prolabo

(M ỹ),

Sodium -2,2-Dichloropropionate

(2,2-DCP) từ Meck (Đức),

3,4-

Dichloroaniline (3,4-DCA) của Sigma (Mỹ), kit API 20, API 50NE (hãng Biomerus, Pháp). Các
thiết bị sử dụng chính được thực hiện tại Phòng enzym và phân tích hoạt tính sinh học, Phòng thí
nghiệm Trọng điểm Công nghệ enzym và protein.


Phương pháp phân lập: Các mẫu nuôi cấy được làm giàu 2 lần, 5 ngày/lần trong môi trường
chọn lọc (môi trường M GB) bao gồm các thành phần môi trường khoáng cơ bản BS, môi trường
các nguyên tố vi lượng TM SS và cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA với nồng độ lần lượt là
5mM, 20mM, 50mg/l tương ứng hoặc atrazin (không có trong báo cáo).

Phương pháp cấy gạt: Môi trường thạch MGB bao gồm các thành phần dung dịch BS lOx,
(K2H P 0 4.3H20 42,5g; (NH4)2S 0 4 20g, N aH 2P 0 4-3H20 lOg); dung dịch TMSS lOx (M gS04.7H20
2g, F eS 04.7H20 120mg, M n S 0 4.4H20 23mg, Z n S 0 418mg, C oC12-6H20

lOmg, EDTA 0,5M

pH=7,5); thạch 20g/l, EDTA 0,5M và bổ sung cơ chất khác nhau là 1,2- DCE nồng độ 5mM, 2,2DCP nồng độ 20mM và cơ chất 3,4-DCA nồng độ 50mg/l hoặc atrazi (không có trong báo cáo)
được đổ vào các đĩa petri thủy tinh sạch. Các m ẫu được pha loãng với các nồng độ từ 1CT2 đến 10' .
Phương pháp tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sử dụng họp chất clo: Môi
trường chọn lọc có bổ sung thạch và bromothymol blue (Fortin và cộng sự, 1998). Khả năng phát
triển và tạo màu trên môi trường có bromothymol blue để chọn lọc các chủng có khả năng phân giải
tốt cơ chất do Bromothymol blue là chất chỉ thị màu cho khả năng phân giải hợp chất clo
(Wildeman và Verstraete, 2003).
Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng vi sinh vật được tiến hành bằng sử
dụng kit API 20 NE (với vi khuẩn Gram âm) và kit API 50 (với vi khuẩn Gram dương) theo hướng
dẫn cùa hãng Biomerius (Pháp).
Phương pháp phân loại vi sinh vật: Phương pháp tách chiết, khuếch đại và xác định trình tự
16S ADNr theo quy trình của Sakiyam a và cộng sự , 2009. Trình tự 16S ADNr được phân tích trên
phần mềm CLUSTAL X theo Thom pson và cộng sự, 1997. Trình tự tham khảo, so sánh được lấy từ
dữ liệu của DDBJ, EM BL và ngân hàng gen. Cây phát sinh chủng loại được xây dựng theo Kimura,
1980, Saitou và Nei, 1987. Các m ẫu được giải trình tự gen tại Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học,
ĐHQG HN hoặc tại cô n g ty M a c ro g e n (Hàn Quốc).
Phản ứng khuếch đại ADN, thành phần phản ứng (|il): 10X buffer: IOịiI; dNTP 2 mM:10|il;
mồi xuôi 9F (10 pmol/|xl): 4|il; mồi ngược (10 pmol/ịil): 4 fil; Taq polymerase (5u/ịu1): 1 ịi\: ADN
khuôn ( 5 0 - 1 0 0 ^ 1 ) : ỉ-2ịi\; H20 . Chu trình nhiệt: 95*c - 3 phút, 35 chu kỳ; 95°c - 30 giây; 55°c 30 giây ; 72°c - 1 phút 30 giây; 4 °c -

00.

Mồi cho khuếch đại 16S ADNr gồm mồi xuôi 9F: 5'-

GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' và m ồi ngược 1492R: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3
Phương pháp tách dehalogenase: Dịch chiết được chuẩn bị từ tế bào vi khuẩn đang phát
triển ở giai đoạn cuối của pha log. Vi khuẩn được nuôi trong môi trường MGB có chứa 25mM cơ
chất 2,2 DCPS. Sau đó 500ml dịch tế bào vi khuẩn được ly tâm ở lO.OOOg /10 phút ở 4°c. Cặn tế
bào thu được đem rửa trong lOOml dung dịch đệm Tris-acetate 0,1M, pH 7,6. Tế bào vi khuẩn thu
được hòa tan trong 15ml Tris-acetate 0,1M , pH 7,6, để tiến hành siêu âm phá tế bào. Siêu âm phá tế
bào được thực hiện theo từng bước phá tế bào 15 giây, dừng 30 giây và được lặp lại 5 lần với cường
độ X = 10 um [17].
Phương pháp phân tích hoạt tính enzym dehalogen: Hoạt tính enzym được xác định bàng
tổng lượng ion Cl- đo được trong hỗn hợp phán ứng ở điều kiện 30°c. Hỗn hợp phản ứng gồm
4,700|il Tris-acetate 0,1 N Ị pH 7,6, trộn với 50|il cơ chất 2,2- DCPS ủ ở 30°c trong bế ổn nhiệt
trong 10 phút. Sau đó bổ sung 250|il dịch chiết enzvm thô ở 30°c trong 5 phút theo phưong pháp
Bergmann và Sanik, 1957. Mầu đối chứng được bổ sung HgSƠ 4 lmM để bất hoạt dehalogenase.


phương pháp điện di không biến tính protein: Điện di không biến tính xác định được enzym
cỏ trong dịch chiết hay không. Bán gel điện di không biển tính được chuấn bị theo phương pháp
Hardman và Slater, 1981 sử dụng hệ thống điện di Mini-protean. Gel có chứa dehalogenase không
bị biến tính được ủ với cơ chất 2,2-DCP 50mM ở

30°c, pH

7.6 trong 30 phút. Sử dụng dung dịch

chứa A gN 03 cho việc phát hiện các băng trong ban gel sau điện di (theo Hamiđ và cộng sự. 2010).
Phương pháp sắc ký trao đối anion được thực hiện theo Fahrul và Ronald, 2012. Sử dụng Q
Sepharose (Flex-Column 0,7x5cm). Các dung dịch đệm gồm hỗn hợp dung dịch có nồng độ muối
thấp: 5mM đệm phosphate pH 7.8; lm M EDTA; 10% glycerol; lm M DTT và dung dịch có nồng
độ muối cao: lOOmM đệm phosphate pH 7,8; lm M EDTA; 10% glycerol; lm M DTT. Sử dụng
građient nồng độ muối với nồng độ tăng dân từ 5mM đến lOOmM cho sắc ký trao đổi. 5 mg protein

từ dịch chiết enzym thô được bố sung lên cột sắc ký, tốc độ lm l/phút. Các phân đoạn được thu lại
với thề tích lm l để xác định hoạt tính enzym.
Phương pháp điện di SDS-PAGE: Các phân đoạn thu được sau khi chạy sắc ký sẽ được điện
di biến tính protein để kiểm tra độ tinh sạch của enzym. Dịch enzym qua cột được trộn với đệm
mẫu (4x) có thành phần (lOml) gồm lOOmM DTT, 4ml H20 , 40% glycerol, 8% SDS, 2.4% Tris,
Coomasie Brilliant Blue 0,04g; Dịch mẫu enzvm sẽ được trộn với đệm mẫu (tỷ lệ 1:3), ủ ở 95°c
trong 10 phút.
Phương pháp sắc ký lọc gel: enzym sau khi qua cột sắc ký trao đối anion được sắc ký lọc gel
bằng gel Sephadex G-75. 0,5mg protein được sử dụng trong dung dịch đệm gồm 20mM Trisacetate, 0,1M sodium acetate pH 7,5 được sử dụng để cân bằng và rửa cột sắc ký. Tốc độ chảy đạt
0,5ml/phủt, các phân đoạn được thu với thế tích lm l (Hardman và Slater, 1981).
Phương pháp thống kê sinh học: Các thí nghiệm được lập lại ít nhất 3 lần và số liệu được xử
lý bằng phần mềm Excel.
4. Tổng kết kết quả nghiên cứu
4.1. K ết quả về phân lập, tuyển chọn, phân loại các chủng vi sinh vật
4. ỉ. 1. phân lập và tuyến chọn các chủng
Từ các mẫu đất và nước thu được tại các khu vực khác nhau, sau 2 lần làm giàu liên tiếp (5
ngày/lần) trên môi trường M GB lắc ở 3 0 °c, 160rpm, dịch làm giàu được cấy trải trên môi trường
thạch MGB thạch bổ sung các loại cơ chất khác nhau với các nồng độ tương ứng 1,2 DCE nồng độ
5mM, 2,2-DCPS nồng độ 20mM và 3,4-DCA nồng độ 50mg/l.
Sau thời gian từ 3 đến 5 ngày nuôi cấy trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất chứa clo
khác nhau chúng tôi thu được kết quả trong bảng 1, 2 và 3. Kết quả nghiên cứu cho thấy đã không
phân lập được chủng vi nấm nào mọc trên môi trường chọn lọc hầu hết là vi khuẩn và số lượng các
loài vi khuẩn mọc trên các môi trường cũng rất đa dạng, vì thế chúng tôi lựa chọn đối tượng là các
chủng vi khuẩn trong các nghiên cứu tiếp theo (Nguyễn Bá Hữu và cộng sự, 2007).

4


B ản g 1. Đặc điếm các khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4- DCA

Kí hiệu chủng
. V
Mầu nước: 8 chủns
STT

Hình dạng khuẩn lạc

Màu sắc

Đường kính (mm)

1

NAI

Tròn, bóng, có tâm ở giữa

Trắng ngà

1,0-1,5 mm

2

NA2

Dẹt, khô, có tâm ở giữa

Vàng nhạt

Không xác định

3

NA3

To, bóng

Vàng nhạt

Không xác định

4

NA4

Tròn, bóng, dẹt, rìa khuẩn lạc nhăn

Trắng ngà

2,0 mm

5

NA5

Tròn dẹt

Trắng ngà

1,5 mm

6

NA6

Tròn, bóng, lồi, khuẩn lạc bé

Trăng trong

Không xác định

7

NA7

Bóng, dẹt, rìa phang

Trang ngà

Không xác định

8

NA8

Khuẩn lạc rất bé, lồi

Vàng nhạt

Không xác định

Mầu đất: 9 chủng
]

DAI

Tròn, to, dẹt, bóng

Trăng trong

3,0 mm

2

DA2

Dẹt, bóng, rìa khuẩn lạc có rãnh

Trắng trong

Không xác định

3

DA3

Tròn, dẹt, bé

Trắng sữa

0,3 mm

4

DA4

To, dẹt, bóng

Trắng trong

Không xác định

5

DA5

Bé, dẹt, khô

Trang trong

Không xác định

6

DA6

Tròn, dẹt, khô, nhẵn

Trắng đục

1,0 mm

7

DA7

Tròn, lồi, bề mặt nhẵn, có tâm

Trăng sữa

0,3 mm

&

DA8

Tròn, lồi, bóng

Cam nhạt

0,5 mm

9

DA9

Tròn, dẹt, bóng

Trắng sữa

0,8 mm

Trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 3,4-DCA chúng tôi đã phân lập được 17 loại
khuẩn lạc khác nhau đó có 9 chủng từ mẫu đất và 8 chủng từ mẫu nước. Các khuẩn lạc hầu hết có
hình tròn, màu trắng sữa, có một vài khuẩn lạc màu cam đến vàng nhạt, nhìn chung đường kính
khuẩn lạc dao động từ 0,3 đến 3,0mm. Một số khuẩn lạc kích thước nhỏ không xác định được
đường kính hoặc có hình tia hoặc chia thùy.
Bảng 2. Đặc điểm các khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2-DCPS
Hình dạng khuẩo lạc

Màu sắc

Đường kính (min)

STT

Kí hiệu chủng

1

HI

Tròn, dẹt, nhăn

Trắng sữa

3-5 mm

2

H2

Tròn, dẹt, nhăn, có màu sâm

Trắng sữa

2-4 mm

3

H3

Tròn, bóng, lôi

Trắng trong

lmm

4

H4

Tròn, ừăng, không bóng, nhân

Trăng trong

Không xác định

5

H5

Tròn, bóng

Trắng trong

0,5 mm

6

H6

Tròn, dẹt, viền ngoài có tia

Trăng trong

Không xác định

7

H7

Hình tia, dẹt, không lôi

Trăng trong

Không xác định

8

H8

Tròn, dẹt, không lồi

Trăng trong

2mm

9

H9

Tròn, lôi ở giữa,không bóng

Vàng chanh

2mm
5


10

H10

Tròn, chấm nhỏ ở giữa, dẹt

Trăng trong

3-5mm

11

HI 1

Tròn, bóng, lôi ờ giữa

Vàng chanh

l-3mm

12

H12

Tròn, tia viên ngoài, có nhân

Trăng đục

2-5mm

13

H13

Tròn, nhăn ở giữa, nhân trăng

Trăng đục

Không xác định

14

H14

Tròn, nhăn, viên ngoài có tia

Trăng đục

4mm

14

H15

Tròn, nhân, bóng, hơi lôi

Trăng đục

2mm

16

H16

Tròn,có nhân,bóng, lôi

Trăng đục

Không xác định

17

H17

Giông hình nâm,dẹt, không bóng

Vàng nhạt

2mm

18

H18

Tròn, bóng, lôi,viên ngoài nhạt

Trăng đục

3-5mm

19

H19

Tròn bóng, hơi nhăn

Vàng nhạt

2-3 mm

20

H20

Tròn, bóng, lôi, nhân đậm hơn

Trăng đục

Không xác định

Trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2-DCPS chúng tôi đã chọn được 20 loại khuẩn
lạc khác ihau. Cả 20 chủng vi khuẩn đều có hình tròn, đường kính nằm trong khoảng từ 0,5-5mm,
đa số có màu trắng trong hoặc trắng đục, một số có màu khác biệt là vàng nhạt hoặc vàng chanh.
Bảng 3. Đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường MGB bổ sung cơ chất 1,2-DCE
STT

Kí hiệu chủng

Hình dạng khuẩn lạc

Màu sắc

Đường kính (mm)

Mẩu nước: 9 chủne
1

NE1

Tròn, to, dẹt, bóng, có tâm

Trắng sữa

3,0 mm

2

NE2

To, lồi, bóng, rìa răng cưa

Trắng sữa

Không xác định

3

NE3

To, dẹt, bóng

Trắng ngà

Không xác định

4

NE4

Tròn, lồi, bóng

Trắng trong

1,0 mm

5

NE5

Dẹt, khô, có tâm ở giữa

Trắng ngà

Không xác định

6

NE6

Tròn, bé, lồi, bóng

Trắng sữa

0,5 mm

7

NE7

Tròn, rất bé, lồi, khô

Trắng sữa

0,2-0,3 mm

8

NE8

Rất bé, khô, có tâm ở giữa

Trắng sữa

Không xác định

9

NE9

Dẹt, khô

Trắng đục

Không xác định

Mấuđẩt: 5 chủng
1

DE1

Tròn, bóng, nhầy

Vàng nhạt

1,5 mm

2

DE2

To, dẹt, rìa răng cưa

Trắng ngà

Không xác định

3

DE3

Tròn, to, lồi, bóng

Trắng ngà

3,0 mm

4

DE4

Rất bé, lồi, khô

Trăng trong

Không xác định

5

DE5

Trònm, bóng, lồi

Trắng sữa

2,0 mm

Tương tự, phân lập được 14 chủng từ môi trường MGB có bổ sung cơ chất 1,2-DCE. Hầu
hết các ciủng có khuẩn lạc bóng, dẹt, một số khuẩn lạc kích thước không xác định.
lừ các chùng vi khuẩn phân lập chúng tôi tiến hành tuyển chọn các đại diện cho khả năng
phân hủ} cao đối với từng họp chất chứa clo. Các chủng được tuyển chọn cần đáp ứng hai tiêu chí
đó là có chả năng sinh trường tốt trên môi trường chọn lọc MGB bổ sung cơ chất đồng thời có khả
6


năng phân íiiai mạnh hợp chất clo thế hiện qua mức độ chuyên màu mạnh nhất trên môi trường
thạch MGB có bô sung Bromothymol blue.
Trên môi trường MGB có bố sung cơ chất 3,4-DCA, kết qua cho thấy một số chung ký hiệu
N A I, NA4, NA7, DAI có khả năng phát trièn mạnh. Tuy vậy, kết hợp với kết quá chuyến màu trên
mồi tnrờng thạch bổ sung Bromothymol bluc (75mg/l) chủng tôi đã chọn ra được chùng NA4 với
kha năng chuyên màu môi trường từ màu xanh sang màu va nu rõ rệt nhất (hình 1).

Tương tự như quá trình tuvên chọn bằng các thí nehiệm như cơ chất 3,4-DCA, đối với cơ
chất 2,2-DCPS, 1,2-DCE chúng tôi đã lựa chọn được lần lượt 2 chủng HI 1 và DE1 cho các nghiên
cứu tiếp theo.

Hình 1. Khuẩn lạc trên môi trường MGB có bổ sune Bromothymol blue và 1.2- DCK. 2,2 -DCPS và 3.4DCA (từ trái sang phải)
4.1.2. Đặc ãiêm sinh lý sinh hóa và phán loại các chủng vi sinh vật tuyên chọn
Kel qua nhuộm Gram cho thấy chung NA4 và H ll bẳt màu hồng với thuốc nhuộm, còn
chủng DE1 bắt màu tím với thuốc nhuộm. Bước đầu phân loại chúng NA4 và HI 1 là vi khuân
Gram (-), chủng DE1 là vi khuân Gram (+). Hình thái tế bào chủng NA4 và HI 1 đều có hình dạng
que ngắn, trong đó chung NA4 có kích thước tế bào khá lớn, dễ dàng nhìn thấy hỉnh dạng tế bào khi
soi dưới kính hiên vi. Chúng DE1 có dạng tê bào hình câu và các tê bào tập trung thành từng đám.
Đê quan sát kỹ hơn các đặc điểm hình thái tế bào chúng tôi tiến hành chụp ảnh tế bào trên
kính hiển vi điện tử quét JSM -5421LV đối với 3 chủng nghiên cứu.

Hình 2. Hình thái các chúng NA4. HI 1 và DE1 dưới kính hiển vi điện tử quét X 5000 lần (từ trái sáng phải)
Kêt quả từ hình 2 cho thấy hai chủng NA4 và HI 1 có hình que ngẩn, tế bào chúng NA4 có
kích thước khoáng 1,8 ịiin ± 0,3 |nm, kích thước tế bào chủng HI 1 khoang 2 (im ± 0,5p.m. Hình
chụp chủng DE1 cho thấy rõ tế bào dạng hình cầu, có đường kính khoảne từ 0,8± 0,2fim, các tế bào
có xu h ư ớ n o liên kết, kết dính lại với nhau (hình 2).
4.1.3. Nghiên cứu đặc điêm sình hỏa các chủng nghiên cứu bằng sử dụng kit thư API
Kit API cua hăng Biomeriux được sử dụng trong việc nghiên cứu giúp các đặc điếm hóa
sinh cua các chúng vi khuan thông qua việc đánh giá khá năng sử dụng các hợp chất hữu cơ từ đó
có cơ sở phân loại các chủng nghiên cứu.


p ổ i với 2 chủng NA4 và HI 1 chúng tôi sử dụng kit API 20NE đặc trưng cho nhóm vi khuấn
Gram (-)■ Kết quả nghiên cứu được thể hiện trong bảng 4.
Bảng 4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nghiên cứu (kit API 20NE)
C hủngH ll

Chủng NA4

E. colỉ

Potassium nitrate

+

+

+

L-tryptophane

-

-

D-glucose

+

+

+

L-arginine

-

-

-

Urea

+

+

-

Esculin ferric citrate

+

+

+

Gelatin (bovine origin)

+

-

+

4-nitrophenyl- D-galactopyranoside

+

+

+

D-glucose

+

+

+

L-arabinose

+

+

+

D-mannose

+

+

+

D-mannitol

+

+

+

N-acetyl-glucosamine

+

+

+

D-maltose

+

+

+

Potassium gluconate

+

-

+

Capric acid

-

-

Adipic acid

-

-

_

Malic acid

+

+

_

Trisodium citrate

+

+

_

Phenylacetic acid

+

+

Khả Iiăng sử dụng các loại hợp chất

1

+

Chú thỉch: (-) Không sử dụng; (+) Có sử dụng
So với đối chứng E. coli, hai chửng NA4 và HI 1 đều có khả năng chuyển hóa từ nitrate sang
nitrìte, khả năng lên men glucose, thủy phân esculin và khả năng đồng hóa đường glucose,
arabinose, mannose, mannitol. Bên cạnh đó, E.coli không sinh urea và không có khả năng sử dụng
citrate, còn NA4 và HI 1 thì lại cho phản ứng dương tính. Đây là hai trong những đặc điểm sinh hóa
rất đặc trưng của vi khuẩn thuộc chi Kỉebsiella hoặc Alcaligenes (Sylvain và cộng sự, 2006). Kết
quả chủng NA4 thuộc chi Klebsiella còn chủng H l l thuộc chi Alcaligenes kết quả dựa trên phân
tích bằng phần mềm hãng Biomeriux.
Đối với chủng DE1, để xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa chúng tôi sử dụng kit API
50CHB kit sử dụng cho nhóm vi khuẩn Gram (+) thu kết quả trong bảng 5.

8


Bảng 5. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng DE1 sử dụng kit API 50CHB
Chủng DE1

B. subtilis

Salicm

+

+

-

Cellobiose

+

+

-

-

Maltose

+

+

L- arabi nose

+

+

Lactose

+

-

Ribose

-

-

Melibiose

+

-

D- Xylose

-

-

Sucrose

+

+

L- Xylơse

-

-

Trehalose

+

+

Adonitol

-

-

Inulin

s

-

ị3- Methiyl- D- Xylose

-

-

Melezitose

-

-

Galactose

+

-

Raffmose

-

-

Glucose

+

+

Starch (Amidon)

-

+

Fructose

-

+

Glycogen

-

+

Mannose

-

+

Xylitol

-

-

Sorbose

-

-

Gentiobiose

-

-

Rhamnose

-

-

D- Turanose

+

-

Dulcitol

-

-

D- Lyxose

-

-

Inositol

-

+

D- Tagatose

-

-

Mannitol

-

+

D- Fucose

-

-

Sorbitol

-

+

L- Fucose

+

-

a-Methyl-DMannoside

-

-

D- Arabitol

-

-

a-Methyl-DGlucoside

-

-

L- Arabitol

-

-

N-AcetylGlucosiirnine

-

-

Gluconate

-

-

Amygdalin

-

-

2-Keto- Gluconate

-

-

Arbutin

-

+

5-Keto- Gluconate

-

-

Esculin

+

+

Chủng DE1

B. subtílis

Glycero'1

-

+

Erythritol

-

D- arabĩinose

Khả măng sử dụng
các loại hợp chất

Khả năng sử dụng
các loại hợp chất

Chú thích: (-) Không sử dụng; (+) Có sử dụng
Kết quả qua kit API 50CHB cho thấy chủng DE1 có khả năng sử dụng đa dạng các loại
đường. Đây là đặc điểm sinh hóa, sinh lý quan trọng của chủng vi sinh vật nghiên cứu để có thể sử
dụng được các cơ chất chứa clo hữu cơ khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy, có khả năng chuyển
hóa từ các họp chất có tính độc thành các chất không còn độc với môi trường.
4.1.4. Phán loại các chủng bằng phương pháp giải trình tự gen 16S ADNr
Các chủng vi khuẩn được cấy không quá 24 giờ để đảm bảo chất lượng ADN cho giải trình
tự gen. Kết quả giải trình tự 16S ADNr của các chủng nghiên cứu được so sánh với các trình tự gen
16S ADNr trong ngân hàng gen quốc tế dựa vào phần mềm Clustal X. Trên cơ sở đó, xây dựng cây
phát sinh chủng loại và xác định vị trí phân loại.


- ưncuRured Ktebsiella sp. ctone SL15 1ÉS ribm om àl RNA gcnc, partial Síqucnce
- Klebs iclia p n ttim o n itt strầin sctccT53 1SS ribosom il RNA gene, p a rtiil sequence

- UncuHured Klcbí icỉta íp. ckme SL1016S raKHOtral RNA gtne, partiil íequence
- Bttterãan LC55S lé s ribosữmal RNA gení, p irtia l sequence
- Unculturtd Kiebsiella sp. clone SLŨ8 16S ríb oso m il RNAgene, partial sequence
- Bàcteriưm LA1ÍS léS ribosom al RNA gene, partial stqucnce
- Uncultured Klebíịella sp. clon* SL171ÉS rtooiom ầ] RNA genc, partial sequenct
- Bicterium SS107E16$ ribosoma] RNA genc, partial stquence
- Bacterium CZ150S 1ỐS rĩb o ỉo m il RNA gme, partiàl sequence
- Uncukurtd K lebỉtelia íp . ctont S LU 1ÍS rồMMữmil RNA gene, partial ĩtquence

- Klebí ie ib v a r iic o b ítra jn C 1M 16$ ribosom al RNA gene, partial sequence
- Ktebs iílla variicote I t r ú n G?6 16$ rib o so m il RNA gcnc, p v t n l sequencc

- Kkbs ie iu sp. P2 gen€ for 1ỐS rRNA

- Unculturtd K ictoklỉiỉp. clont f7jun.4S u s rfa»omầl RNA genc, partiai íequence
- Ktebí Ielia ip . enrĩchmtnt cuttiBt d o m M1 lếS ribosomal RNA gene, p a rto ỉ scqutncc
- Ktebỉ kttầ pneumoniat gcne for 16$ rRNA, partỉal sequtnce, sĩn iK NBRC 3318
- UncuRured Ktebíielte sp. ctone F7jun.41 16$ ribosomal RNA gcnc, partial ỉequence
- NA4_cor«K}_l

- Kteb* ie lh sp. 299912 16$ riboíomal RNA gene, partal sequence
- K tebsiellapneum oni* s trú n S Y -11ÍS riboíom al RNA gírw, p v t n l scquence
- KM m ie lb sp. 21891316S ribosomal RNA gene, p arta l scquence

Hình 3. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng NA4
So sánh trình tự đoạn gen mã hóa 16S ADNr của chủng NA4 với các tìn h tự tương ứng đã
được công bố trên Ngân hàng gen thế giới cho thấy, chủng vi khuẩn NA4 tương đồng 99% với chi
Kỉeb.sieỉla (hình 3).

U.U.’

90

59

Pusiììimortas *ìoerĩemarmịi_ AY69582S
9"!
ccstcỉìcnuoUa ginscngisoỉi_ EƯS73313
100

Casteỉỉar.icP.a cacm AB166S79
1
casteUanieìỉa defragram AJ00544'!
'ỈU
CasieỉỉanUUc denừnjtcứns U82826
CasteHơnieỉia daỳeom nsís GQ241321
___ j Teữathooactcr kasbtỉirensừ AJ8644 70
.icheneỉìa mitnigar<ìẹfordwỉiis AYS80023
Bordeteila rrematbm AI27779S
Acỉìromobacter xyỉoioxidans subsp,
Paenaĩcahgeneỉ hommis_ FN391024
ix>r~ Akaligenes /aecaỉú subsp. parafaecaỉis_
■ Alcahgenes/aecalís subsp. pheĩĩoiicus
F ì Alcaligenes /aeca!is_ DSSOOS
55 H l l
" Burkholàeria cẹpacrá_AF097530

Hình 4. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng HI 1
Trình tự gen 16S ADNr của chủng HI 1 tương đồng 99,23 % (1419/1430 bp) với trình tự
gen 16S ADNr của Alcaligenes faecalis_D88008 (hình 4).
Trình tự đoạn gen mã hóa 16S ADNr của chủng DE1 tương đồng 99% với chủng
Staphylococcus sciuri (hình 5). Ket quả phân loại này trùng với các kết quả phân loại dựa trên đặc
đièm hình thái tế bào, sinh lý sinh hóa trước.
10


- »«pt>ytococtv« ic n r i \*wn YIM 11DI loV f- VtipHylococcve i c ư i í t r u ì U I H 1W n&oíMTi&l RVA ctn t, partRi 5«Ịixnce
- SapaytacocctB iộ, r t B M S IÍS rtb oỉom il RNA ọef*e, partl&ỉ ítq titn c ỉ

Sqphytococcuí tcluri ttiiỉn CHP9 u s rlbotomìi RNA qent RVTỉxl (tqutnce
Ỹtip^ytocorcưí ip. TV T1M Ì qtnt tof 1(S fW tV pânUt irqumce

ỉỉ^tiytotNKt* *fxttHI lft ributumdl RV44jrt»f. |i«tÚI
■ Í l4 ( ế i f k u ịi n u % i i tM t i i d n p . %I lu r i

">ậM S lh S íé m iíH T M l

im tu l

- llS rRAA y « p h y lo t« (m ttR iri, Onemic, 1>ÍÍ» r*|

- ÌUp*tyíoco«ư» tctvi9W for lti nboíomal RUft, pntitl Kqucnct. Itr»m: 1111
- )Upttytococcu» »(K 0RCI1 M i(bo»orml RNA 9en<, p v iiil »M|»K1K Í

- Dt1CCHINIỊ ỉ
- Sttpl»ytecí«ta »JX jCV l l i J ) g trtt for L6S rò c io rm l R N \ p « tu l u q ttn ce

- suplíytacoau i *JK NIS19 U ỉ K M ie a u l RMA genc, Ịttítlềl *Mjuef>ce
- SQphytecoccuí t c lu l ÌQ U I RPU 1ỐS rầMtOĐUl RNA ocne. p v iiằ i tcQuciKe

Uhcutỉurnl luntMbaaokan ctat BRC471(1 ritHMontl RVAQcm, pMbl (equenct
S ỉ4 p M flC f ir < u t t c i u r i t b ũ t f t l 4 A 1

r lb ữ iíK n iỉ A V A q tm , p m i ằ l t e ọ u t m e

ỈNpếiytaiouui tp.
ttt ribmurml RV4vmr, p#1mIitĩặMtur
-SlậỊéỉyliuimmuuri Ut4«i (MHItórihiMKiul ft\Atyrrv, |w1mI trqumtr
-J U p h y to e t.il* 'p . 1*11.1 ỈM ritxHom.ll KHA ỊỊW t, p«1ul

- iU p r ty to c c c íV B 5C U N í t r u n R l l - j A I M r i t m o n u l K kA g e m , p t r t t s i s t q u e n c e

- W ỉy ỉflc o c c u j K fc rl ít ju n SCM1 K ỉ I tttio r m l W A ỵ n t. p v tr ti itqu ơK t

Hình 5. Sơ đồ cây phát sinh chủng loại của chủng DE1
4.2. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng sinh trưởng các chủng phân lập
4.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Nuòi cấy lắc chủng HI 1 trên môi trường MGB có bổ sung cơ chất 2,2-DCPS 20mM trong 4
ngày, đo mật độ quang học tại OD 620nm đánh giá khả năng sinh trưởng (hình 6).

0.6
0.5
a
fP
3
B
JS
s
•<*

r-v 0.4
E
® 0.3
©
o

c ữ
ầ °
fS3
J3

0.2
0.1
0
3

6
9
12
Thời gian sinh trưởng (giờ)

Hình 6. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng HI 1
Khả năng sinh trưởng của chủng HI 1 mạnh nhất chỉ sau 12 giờ nuôi cấy (hình 6). Đối với
chủng NA4, khi nuôi cấy trên muôi trường MGB có bổ sung 25mg/l cơ chất 3,4-DCA trong thời
gian 12 rgày, qua giá trị OD 620nm nhận được sau từng ngày nuôi cấy cho thấy chủng NA4 sinh
trưởng m inh nhất sau 10 ngày (hình 7).
Nuòi cấy chủng DE1 trên môi trường MGB bổ sung 5mM cơ chất 1,2-DCE trong các khoảng
thời gian khác nhau, kết quả biểu thị ở hình 8 cho thấy thời gian sinh trưởng tốt nhất của chủng DE1
là sau 12 giờ.
11


0.25

g>

0.2

1ì ~1

015

I °

-NA4

« I
c Q
X
cO o
«0

0.1

ễ

0 05

0
6

10

8

11

12

Thời gian (ngày)

Hình 7. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trưởng của chủng NA4
0.45
0.4
0.35

'S
I „
i

I

0.3
0.25

« 2
05 Q 0.2
5 o
c — 0.15
HO
I

0.1

0.05

0
0

6

12

18

24

30

Thòi gian (giờ)

Hình 8. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sự sinh trường cùa chủng DE 1
Kết quả nghiên cứu cho thấy 3 chủng NA4, H I 1, DE1 có thời gian sinh trưởng tối ưu khác
nhau, điều này phụ thuộc vào đặc tính sinh trưởng riêng của từng chủng. Mặt khác, sự khác nhau về
đặc tính hóa học của từng loại cơ chất khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy cũng quyết định đến
thời gian sinh trưởng của các chủng. So với cơ chất 1,2-DCE và 2,2-DCPS thì cơ chất 3,4-DCA
được vi sinh vật khó sử dụng hơn cả (Amini và cộng sự, 2011).
4.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy
N hiệt độ là một trong những yếu tố môi trường tác động trực tiếp đến sự sinh trưởng và phát
triển của vi sinh vật. Kết quả nghiên cứu sự sinh trưởng của 2 chủng HI 1, NA4 khi nuôi cấy trên
môi trường MGB có bổ sung cơ chất tương ứng ở các mốc nhiệt độ khác nhau cho thấy cả 2 chủng
đều sinh trưởng mạnh nhất ở 30°c. Chủng NA4 sinh trưởng tốt ở dải nhiệt độ 25-30°C, trong khi đó
ở môi trường MGB sau 1 ngày nuôi cấy chúng tôi nhận thấy dải nhiệt độ thích hợp cho sự sinh
trưởng của chủng HI 1 là 25 đến 37°c.

12


„

;.4 Ĩ

—

c ;
o
Q

**ỊS

2, ' 2

p
r- r)?e,
5l -

♦f- y ^ ■
.E -•>•c .
“I "»

P o.t
r*
2 30?
-«
J.J-'

I
37

43

Nhiệt đ ộ (oC)

Hình 9. Ảnh hưởiig của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của 2 chủng HI 1 (cột phải) và NA4 (cột trái)
Đối với chủng DE1, sự sinh trưởng được nghiên cứu ở các mốc nhiệt độ thấp hơn do 1,2DCE khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy là cơ chất dễ bay hơi khi ở nhiệt độ cao. Kết quả hình 10
sau khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung nồng độ cơ chất 1,2-DCE 5mM ở các nhiệt độ từ 20 đến

37°c cho thấy chủng DE1 sinh trưởng tốt ở dải nhiệt độ từ 25-30°C (hình 10).

Hình 10. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trường của chủng DE1
4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất trong môi trường ảnh hưởng đến khả năng phát triển của vi sinh vật. Mỗi
chủng vi khuẩn khác nhau có khả năng phát triển thích hợp ở những nồng độ cơ chất khác nhau.
Thí nghiệm được tiến hành với dải nồng độ từ 25 đến 200mg/l cơ chất 3,4-DCA, kết quả thu
được cho thấy nồng độ 25mol/l là phù hợp nhất cho sự sinh trưởng của chủng NA4 (hình 11). Đây
cũng là nồng độ cơ chất ban đầu dùng trong quá trình phân lập. Nồng độ cơ chất cao có thể ức chế
sự phát triển của chủng nghiên cứu.

13


0.35
0.3

Ol
■I

a „ 0.25
J=
I 0.2

cÕ
- CM

□ NA4

W (Ò

^o

0.15

z

0.1

.ẽ

0.05

0^
25

50

100

150

200

Nồng đ ộ 3,4-DCA (mol/l)

Hình 11. Ảnh hường của nồng độ cơ chất lên sự sinh trưởng của chủng NA4
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu để tìm ra nồng độ cơ chất thích hợp nhất cho sự sinh trưởng,
phát triển của chủng vi khuẩn H ll. Dải nồng độ cơ chất được sử dụng là từ 5 đến 40mM, kết quả
sau 1 ngày nuôi cấy lắc, chúng tôi nhận thấy 25mM 2,2 DCPS là nồng độ tối ưu nhất cho chủng
HI 1. Kết quả này phù hợp cho việc ban đầu chúng tôi lựa chọn nồng độ cơ chất 20mM (hình 12).

0

5

10

15

20

25

30

40

_____ Nồng độ C ữ chất (mM)
Hình 12. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự sinh trưởng của chủng HI 1
Với cơ chất 1,2-DCE thí nghiệm ở dải nồng độ từ 5 đến 20mM kết quả (hình 13) cho thấy
nồng độ phù hợp cho sự sinh trưởng của chủng DE1 là lOmM.
0.4
0.35

03
c

0.3
!1. '
~ E 0.25 -1
1 1
ựi CM 0.2
to
a» Q
>ío o 0.15
c

□ DE1
_X _

0.1 ^
0.05
0
2

5

10

15

20

N ồng đ ộ 1,2 DCE (mM)

Hình 13. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên sự sinh trưởng của chủng DE1
Khả năng sinh trưởng ở nồng độ cao gấp 3,4 lần so với nồng độ thí nghiệm ban đầu của
chủng nghiên cứu là một cơ sở thuận lợi để có thể ứng dụng vào việc xử lý ô nhiễm trong thực tế,
khi m à mức độ ô nhiễm hợp chất clo cao.


4.2.4. Khà năng sử dụng các hợp chất clo khác
Khả năng sử dụng các hợp chất clo khác của các chủng vi sinh vật được đánh giá thông qua
khả năng phát triển trên môi trường MGB bổ sung các cơ chất 1,2-DCE, 2,2-DCP, 3,4-DCA và khả
năng hình thành màu trên môi trường MGB thạch có chất chỉ thị màu bromothymol blue (bảng 6).
Bảng 6. Khả năng phát triển của các chủng trên môi trường thạch MGB bố sung các loại cơ chất
Cơ chất thí nghiệm
Chủng
1,2-DCE

2,2-DCP

3,4-DCA

H ll

++

++

±

NA4

+

+

++

DE1

++

++

+

Ghi chú: ± Phát triển yếu, ++ phát triển mạnh, + phát triển/ có.
Ket quả nghiên cứu cho thấy các chủng phát triển trên cơ chất 1,2-DCE và 2,2-DCPS tốt
hơn cơ chất 3,4-DCA tương tự kết quả nghiên cứu của Amini và cộng sự , 2011.
4.2.5. Đánh giá khả năng phân hủy ClKhả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS của chủng H 11: Đánh giá khả năng phân giải cơ
chất 2,2-DCPS của chủng HI 1 trên môi trường MGB chúng tôi thu được kết quả hình 14.

3

6

9

12

thời gian nuôi cấy (giồr)
Hình 14. Khả năng phân hủy cơ chất 2,2-DCP của chủng HI 1

Sau 24 giờ tiến hành nuôi cấy chủng HI 1 trên môi trường MGB chứa 25mM 2,2 DCPS. Hàm
lượng C1 được tạo ra trong môi trường nuôi cấy là 70fiM sau 24h, tương đương với 0,28% DCP bị
phâm hủy (hình 14).

H ình 15. Khả năng phân hủy cơ chất 1,2-DCE của chủng DE1
15


Kẻt qua hình 15 cho thấy, sau 48 giờ nuôi cấy hàm lượng Cl- tạo ra cua chùng DE1 là 0,88
inM tương đương với 17,67% so với nồns, độ cơ chất 1.2 - DCE ban đầu là 5mM bị phân huy. Kết
quả định lượng Cl- uân như không thay dôi troníỉ các ngày nuôi cấy tiếp theo (hình 15). Đặc tính dễ
bay hơi cua cơ chât 1,2-DCE làm một lượng lớn cơ chất mất đi trong thời gian làm thí nghiệm cũng
là nguyên nhân làm eiảm nhanh hiệu suất phàn huy của vi khuân. Chùng Ancylobacter aquaticus
UV6 (Pilay, 2011) kha năng phân giải 6, lmM 1,2-DCE sau 84 giờ tương đương với 12,2 % cơ chất
bị phân huy khi nuôi cấy tronạ môi trường toi thiểu bố suiìiỉ 5mM 1,2-DCE tương d ươn tí với chúng
phân lập.
Đối với chung NA4, quá trình làm thí nghiệm 3,4-DCA được pha loãng trong ethanol 90%
do vậ\ việc thực hiện việc định lượng Clo tạo ra trong môi nuôi cấy bàng phương pháp so màu
chưa thật chính xác.
4.3. Két (ịna nghiên cứu tinh sạch enzym dehaỉogenase
Trong số các chừng phân lập và tuyển chọn có khả năng sinh trưởng nhanh và tốc độ chuyến
hóa hình thành clo trong môi trường nuôi cấy chúng tôi lựa chọn chủng HI I cho các nghiên cứu
tinh sạch dehalogenase (hình 16).

Hìiiln 16. Chưng vi khuẩn H! 1 trên môi trường MCiB (trái) và MCỈB bô sung Bromothymol blue (phải)
Đe xác định kích thước dehalogenase cua chủng Hỉ 1 chúng tôi tiến hành tinh sạch protein sứ dụng
sắc ký trao đối anion sử dạng gel Q sepharose. Sau khi tiến hành chạy sắc ký chúng tôi thu được 20 phân
đoạn có chứa các protein có kích thước khác nhau. Hai phân đoạn có hoạt tính dehalogenase cao là
phân đoạn thứ 8 và Ị 0. Còn các phàn đoạn còn lại hầu như không có hoạt tính hoặc rất yếu (báng 7).
Báng 7. Hoạt tính enzym dehalogen của chủng HI 1

Phân đoạn

Tông lượng protein
(mg/ml)

Hoạt độ enzym
(ụmol/min)

Hoạt tính riêng

thứ 8

0,0057

0.006

1.05

thứ 10

0.0095

0.0044

0.46

Dịch thô

0.178

0,0063

0,035

(Unit/mg)

Đẻ kiểm tra mức độ tinh sạch của các phân đoạn thu được chúng tôi tiến hành điện di các
phân đoạn trẽn gel SDS-PAGE với thành phần 12% gel tách và 4% gel cô.
Ket quả điện di cho thấy ở làn thứ 3 và 4 (tương ứng với phân đoạn thứ 8 và 10 sau khi sắc
ký qua gel Q sepharose) có xuất hiện băng có kích thước khoang 3 lkD a và 36kDa dậm hơn so với
các phân đoạn khác, tuy nhiên độ tinh sạch của enzym vẫn chưa cao còn xuất hiện một số băng
nhiều (hinh 17).


M

1

116
66
Ị l'
____ K,-

45
35

'
m

25

—

ịí * Ịi ‘ ' 'Ệ, ’,,c‘
■- ' ** • '

ị*

"/r% lểiggị
® **8BB8S8ỀT«iỉfc~
Vw»-V"- ••*•••'•-

nmirtật-

Hình 17. Kct qua điện di SDS-PACìlsau khi qua cột ọ sepharose
M: markẹr protein.
1-9: là số thứ tự phân đoạn thu dược sau
khi săc kv qua iicl Q sepharosc

^MWjfĩy ••■■^ 9 5

Đê đánh giá kha năng phân hủy cơ chât và xác định kích thước của dehalogenase chúns tôi
đã tiến hành điện di không biến tính các phân đoạn. Kết quá điện di không biến tính phân đoạn thứ
8 và 10 khăng định sự tồn tại của enzym dehalogenase trong phàn đoạn này (hình 18).
1»
100

Hình 18. Điện di không biến tính protein.

70

M: marker protein;

ss

R: enzvm dehalogenase thu được từ phân đoạn
thứ 8 và 10 sau khi sắc ký qua gel Q sepharose.
3S

Từ kết quả điện di không biên tính protein cho thấy dehalogenase của vi khuẩn Alcaligenes
ỷaecalis HI 1 có kích thước khoảng 72kl)a (hình 18) là một protein dimer tương tự dehalogenase
của chủng Methylobacterium sp. HJ1. Đe loại bỏ các bănti nhiều kỳ thuật sắc ký lọc gel với các
phân đoạn đã qua cột sắc ký trao đổi ion được sừ dụng. 2ml dịch đà qua cột mono Q được tra vào
cột gel Sephadex Ci75.
M
116
56
45
35

dichthô

1
Hình 19. Kết quả điện di SDS-PAGE sau khi
qua cột Sephadex G-75.
M: marker protein; dịch thô: hai phân đoạn 8
và 10 sau khi qua cột sắc ký qua gel Q
sepharose; các giếng 1-5: là các phân đoạn

25

Sau khi qua cột sắc ký lọc gel enzym dehalogen đã được tinh sạch hơn ớ hai giếng thứ ! và
2 (tương ứng với phân đoạn thứ 6 và 8 sau khi qua sắc ký lọc gel). Các băng chứa protein không
quan tàm đà giảm đi rất nhiều, điều này chửng tỏ enzym dehalogen có kích thước 36kDa gần như
đã được tỉnh sạch ơ phân đoạn thứ 6 và 8 sau khi sắc ký lọc gel (hình 19).
20 phân đoạn đầu được thu thập sau khi chạy qua cột sắc ký trao đổi anion Q sepharose
được xác định hoạt tính dehalogenase. Kết quá cho thấy 2 phân đoạn thứ 8 và 10 có hoạt tính cao
nhât. l iến hành phân tích kiểm tra trên SDS-PAGE trên không biên tính phân đoạn chứa enzym và
17
o o o e o o c o /^


sắc ký lọc gel Sephadex G-75 kết quả đã tinh sạch protein có kích thước 36kDa tương tự kết quả
nghiên cứu của Fahrul và Ronald, 2012.
5. Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận
Việc nghiên cứu dehalogenase trong đó có nhóm haloacid dehalogenase từ vi sinh vật có
nhiều cơ hội tiềm năng trong việc phát hiện các enzym mới. Đặc biệt, Việt Nam có mức độ đa dạng
cao nên khả năng phát hiện được các chủng có hoạt tính mạnh cũng như enzym mới trong nhóm
dehalogenase là rất khả thi và có ý nghĩa thực tiễn. Đe tài đã nghiên cứu đưa ra quy trình phân lập
được nhiều nhóm vi sinh vật phân hủy các chất chứa clo khác nhau thường được sử dụng trong
thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam và bước đầu nghiên cứu tinh sạch dehalogenase từ một chủng
phân hủy 2,2 DCPS). Đây là các kết quả khá khả quan và cần tiếp tục nghiên cứu ở mức độ sâu
hơn. Một số kết luận chính:
Từ các mẫu đất và nước thu thập tại nhiều địa điểm, khu vực ô nhiễm đã phân lập được
nhiều chủng vi sinh vật có khả năng phát triển trên môi trường MGB bổ sung các cơ chất chứa clo
khác nhau (1,2-DCE, 2,2-DCPS, 3,4-DCA, antrazin), trong đó đã tuyển chọn được 3 chủng là H l,
NA4, DE1 có khả năng phân giải hợp chất clo tương ứng mạnh nhất.
Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào. đặc điểm sinh lý, sinh hóa và kết quả giải
trình tự gen 16S ADNr kết luận chủng NA4 tương đồng 99% với loài Kỉebsielỉa pseudomonia,
chửng DE1 tương đồng 99% với loài Staphylococcus sciuri và chủng HI 1 tương đồng 99,23 % với

trình tự gen 16S ADNr của Alcaligenes/aecaỉis.
Đ3 xác định được các điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, nồng độ muối, cơ chất đối với từng
chủng cho sự phát triển cũng như phân hủy hợp chất chứa clo tương ứng. Bước đầu xây dựng quy
trình tinh sạch đehalogenase từ chủng H ll và xác định kích thước đehalogenase từ H ll có khối
lượng 36kDa, và là một dimer protein.
6. Tài liệu tham khảo
Amini s , Zulkifly AH, Yong WY and Huyop F (2011), Molecular identiíication and
characterization o f a bacterium that has potential to degrade haloalkanoic acid, Microbiol Res, 6:
552-559.
Bergmann JG andJohn s (1957), Determination o f trace amounts of chlorine in naphtha,
A n alytỉcd Chemistry, 29 (2): 241-243.
Fahrul ZH and Ronald c (2012), Degradation o f millimolar concentration o f the herbicide
dalapon (2,2-Dichloropropionic acid) by rhizobium sp isolated from soil, Biotechnol & Biotechnol,
26(4): 3106-3107.
Fetzner s and Ligens F (1994), Bacterial dehalogenases: Biochemistry, genetics and
biotechnological application, Microbiol. Rev, 58 (4):641-685.
Fortin N, Fulthorpe RR, Allen DG and Greer c w (1998), Molecular analysis of bacterial
isolates and total community DNA from kraữ pulp mill effluent treatment systems, Can. J.
Microbỉol, 44(6): 537-46.
Greaves MP, Davies HA and Marsh JA (1981), Effects o f pesticides on soil microílora using
dalapon as an example, Arch Environ Contam Toxicol, 10(4): 437-49.
Hamid AAA, Hamdan s , Ariffin SHS and Huyop F (2010), Molecular prediction of
dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis o f 2,2-dichloropropionate
degradinịị bacterium isolated from volcanic soil, J. Bioỉ. Sci, 10: 190-199.
18


Hardman DJ and Slater JH (1981), The dehalogenase complement o f a soil pseudomonad
grown in closed and open cultures on haloalkanoic acids. J. Gen. Microbiol, 127: 399 - 405.
Jing NH, Sulaiman FH, Wahab RA, Pakingking JR & Huyop F (2008), Puriíication and

properties o f a non-stereospecific dehalogenase enzyme E (DehE) from Methylobacterium sp. HJ1.
Afr. Microbiol. Res, 2(7), 187-191
Kimura M (1980), A simple method for estimating evolutionary rate o f base substitutions
through comparative studies of nucleotide sequences, J. Mol. Evol, 16: 111-120.
Motosugi K, Esaki N and Soda K (1982), Puriĩication and properties of 2haloacid dehalogenase
from p. Putida”, Agric. Biol. Chem, 46:837 - 838.
Mesri s , Wahab RA and Huyop F (2009), Degradation of 3-Chloropropionic acid (3CP) by
Pseudomonas sp. BÓP isolated from a rice paddy field , Ann. Microb, 59(3): 447-451
Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị cẩm Hà (2007), Xác định
cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt
cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nằng băng kỹ thuật PCR-DGGE, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triên nông
thôn, 16: 41-45.
Sakivama Y,

Nguyen

KNT, Nguyen

MG,

Miyadoh

s,

Duong

VH

and

Ando

K

(2009), Kineosporia babensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam, Int. J. Syst. Evol
Microbiol, 59: 550-554.
Saitou N and Nei M (1987), The neighbor-ịoining method: a ne\v method for reconstructing
phylogenetic trees, Mol. Biol. Evoỉ, 4: 406-425.
Sylvain B, Francine G, Patrick A. and Grimont D (2006), Prokaryotes, 6, chapter 3.3.8 The
Genus Klebsiella, 159-196.
Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F and Higgins DG (1997), The
CLUSTAL X windows interface: ílexible strategies for multiple sequence alignment aided by
quality analysis tool, Nucleic Acỉds Res, 25: 4876-4882.
Wen YW and Pahrul H (2012), Molecular identiíication and characterization o f Dalapon-2,2dichloropropionate (2,2-DCP) degrading bacteria from a rubber estate agricultural area, Afr. J.
Mỉcrobỉol. Res, 6(7): 1520-1526.
Wildeman SD and Verstraete w (2003). The quest for microbial reductive dechlorination o f C2
to C4 chloroalkanes is warranted, Appl. Microbioỉ. Biotechnol, 61 (2): 94-102.
7. Tóm tắ t kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Hợp chất halogen là hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp, nông nghiệp... Bên
cạnh những lợi ích to lớn, việc sừ dụng những hợp chất này một cách tràn lan và không có phương
pháp xử lý triệt để đã và đang gây ra ô nhiễm môi trường và hệ sinh thái. Từ những mẫu đất và
nước thải thu thập tại một số địa điểm ở Hà Nội, Thái Bình... đặc biệt tại những khu vực sử dụng
thuốc bảo vệ thực vật, thuốc trừ sâu, chúng tôi đã phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi sinh
vật có hoạt tính phân hủy các hợp chất chứa clo như 2,2 DCPS, 3,4 DCA, 1,2 DCE, antrazin... Đối
với mỗi cơ chất đã lựa chọn chủng có hoạt tính phân giải mạnh nhất. Dựa vào đặc điểm hình thái
khuẩn lạc, tế bào, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và kết quả giải trình tự gen 16S ADNr chủng NA4
tương đồns 99% với loài Kỉebsỉelỉa pseudomonia, chủng DE ĩ tương đồng 99% với loài
Staphylococcus sciurỉ và chủng H ll tương đồng 99,23% (1419/1430 bp) với trình tự gen 16S
ADNr của Ảlcaligenes faecalis.
19

Bằng phương pháp sắc ký cột trao đổi ion (Mono Q) và lọc gel (Sephadex G75) kết hợp với
điện di tfên gel polyacrylamit, bước đầu đã tinh sạch và xác định dehalogenase của chủng H 11 là
một prottin có kích thước 36 kDa.
From soil and water samples collected from different locations in Hanoi, Thai Binh... we
isolated and selected a bacterial strain that could grow in the media added clo compounds such as
2,2-DCPS, 3,4-DCA, 1,2-DCE or antrazin. Based on morphology, 16S rDNA sequencing analysis,
and biochemical characteristics, NA4 strain was similar 99% compared to Kìebsìeỉla pseitdomonia,
DH1 strain was similar 99% compared with

Staphyỉococcus sciuri and H ll strain was similar

99,23 % (1419/1430 bp) to Alcaligenes/aecalis.
2,2-DCPS degrading enzyme from H l l strain was preliminarily determined as a 36 kDa
protein and puriĩied using two chromatographical columns, an anion exchange (Mono Q Sepharose)
and a gel íiltration column (Sephadex G75).
PHẰN III. SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI
3.1. Kết quả nghiên cửu

TT

Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu
kinh tế - kỹ thuật

Tên sản phẩm

Đăng ký

Đạt được

1

Bài báo quốc tế

0

0

2

Bài báo trong nước

02

03

3

Hướng dẫn luận văn thạc sĩ

01

02

4

Cử nhân/ cử nhân thuộc chương trình nhiệm vụ chiến lược

02/01

05/03

5

Giấy xác nhận sở hữu trí tuệ

01

01

3.2. Hình thức, cấp độ công bố kết quả

TT

1
i.ì
1.2
2
2.1
2.2
3
3.1

3.1

4
4.1
4.2

Ghi địa chỉ
Tình trạng
(Đã in/ chấp nhận in/ đã nộp đơn/ và cảm ơn sự
Sản phẩm
tài trợ của
đã được chấp nhận đon hợp lệ/ đã
được cấp giấy xác nhận SHTT/ xác ĐHQGHN
đúng quy định
nhận sử dụng sản phẩm)
Còng trình công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống ISI/Sco ous
■----

r

•y

Đánh giá
chung
(Đạt, không
đạt)

r

Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đông xuât bản

Đăng ký sở hữu trí tuệ
Quy trình phân lập các chủng vi Đã được châp nhận đơn hợp lệ
khuẩn có khả năng sử dụng hợp
chất chứa clo
Quy trình tinh sạch dehalogenase Đã nộp đơn

từ chủng vi khuẩn phân hủy
2,2DCPS phân lập tại Việt Nam
Bài báo quốc tế không thuộc hệ thống ISI/Scopus

Có

Đạt

Có

20


5
5.1

5.2

5.3

5.4

6
6.1
6.2
7

Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHỌGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành quôc
gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Phạm Thị Vui, Phạm Thị Hoa,

Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang
Huy, nghiên cứu một số đặc điểm
Có
Đã in
sinh học của các chủng vi khuẩn
phân hủy 1,2 Dicloroethane phân
lập tại Việt Nam, tạp chí Sinh học
35,2013.89-94
Lê Thị Quỳnh Mai, Lê Thị Hông
Hạnh, Nguyễn Quang Huy,
Biological characterization of
Có
Đã in
Antrazin-degrading bacterial
strains isolated in Vietnam, VNU
Journal of Science 30, 2014, 226233
Nguyên Đàm Lý, Nguyên Anh
Tuyết, Phạm Bảo Yên, Nguyễn
Quang Huy, Isolation and
puriíĩcation of dehalogenase from
Có
Đã in
2,2 Dicloropropionic sodium (2,2
DCPS) degrading bacteria in
Vietnam, VNU Journal of Science
30, 2014,213-220.
Phạm Thị Hoa, Nguyên Thị Nhật
Ánh, Nguyễn Đàm Lý, Nguyễn
Quang Huy, 2015. Nghiên cứu đặc
Có

Gửi đăng
điểm sinh học hai chủng vi khuẩn
phân hủy 2,2 DCPS phân lập tại
Việt Nam, Tạp chí Khoa học và
Công nghệ
Báo cáo khoa học kiễn nghị, tư vẩn chính sách theo đặt hàng của đơn V sử dụng

Đạt

Kết quả dự kiến được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở ứng
dụng KH&CN

7.1
7.2
3.3. Kết quả đào tạo
TT

Họ và tên

Thòi gian và kỉnh phí tham
gia đề tài
(số tháng/số tiền)

Công trình công bố liên quan
(Sản phẩm KHCN, luận án,
luận văn)

Đã bảo vệ

Nghiên cứu sinh

1
Học viên cao học
1

Nguyễn Ánh Tuyết

6 tháng

- Bài báo (01)
- Luận văn tốt nghiệp

2013

2

Nguyễn Đàm Lý

10 tháng

- Bài báo (02)
- Luận văn tốt nghiệp

2014

21


PHẦN IV. TỎNG HỢP KÉT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI
Sô lưọng đã
Sô lượng

TT
Sản phâm
hoàn thành
đăng ký
1
Bài báo công bố trên tạp chí khoa học quốc tế theo hệ thống
0
0
ISI/Scopus
0
0
2
Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đông xuât bản
01
01
3
Đăng ký sờ hữu trí tuệ
4
Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus
5
Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp
02
03
chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng
trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Báo cáo khoa học kiến nghị, tư vấn chính sách theo đặt hàng cùa
6
0
0
đơn vị sử dụnp

7
Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính
sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN
8
Đào tạo/hô trợ đào tạo NCS
0
0
02
01
9
Đào tao thac sĩ
PHẦN V. TÌNH HÌNH s ử DỤNG KINH PHÍ
TT

Nội dung chi

Kinh phí
được duyệt
(triệu đồng)

Chi phí trực tiêp
Thuê khoán chuyên môn
Nguyên, nhiên vật liệu, cây con...
Thiết bị, dụng cụ
Công tác phí
Dịch vụ thuê ngoài
Hội nghi, Hội thảo, kiêm tra tiên độ, nghiêm thu
f
'
?

In ân, Văn phòng phâm
Chi phí khác
Chi phí gián tiêp
Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tổng số

A
1
2
3
4
5
6
7
8
B
1
2

Kinh phí
thực hiện
(triệu đồng)

140,0
187,0
0,0
20,0
40,0
40,0

9,0
24,0

140,0
187,0
0,0
20,0
40,0
40,0
9,0
24,0

20,0
20,0
500,0

20,0
20,0
500,0

Ghi chú

PHẦN VI. KIẾN NGHỊ

Có thêm thời gian để hoàn thành bài báo quốc tế.
PHÀN VII. PHỤ LỤC (minh chứng các sản phẩm nêu ở Phần III)

Các bài báo sản phẩm của đề tài.
Đơn chấp nhận đăng ký sở hữu trí tuệ
Minh chứng sản phẩm đào tạo (Thạc sĩ, Cử nhân thuộc chương trình nhiệm vụ chiến lược)

r
/ o

/

Đơn vị chủ trì đề tài
(Thủ trưởng đom vị kỵ tên, đóng dâu)
PHO HlỆu Ĩ8ỮỎNO
----^

Hà Nội, ngày 3 tháng 3 năm 20ỉ 5
Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên'chữ ký)

•
"
TR Ư 'T.N G X

Í Ị i Đ Ạ i M O C “ V*

ị Ịkhca học/ I
ụ . , r ư 1\!HÌỀW,4/
Lá>uà//'L- y /ỹ iú M '

.T S -


PHỤ LỤC
1. Sản phẩm bài báo, báo cáo

1. Phạm Thị Vui, Phạm Thị Hoa, Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang Huy, nghiên cứu một
số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn phân hủy 1,2 Dicloroethane phân lập
tại Việt Nam, Tạp chí Sinh học 35, 2013, 89-94.
2. Lê Thị Quỳnh Mai, Lê Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Quang Huy, Biological
characterization o f Antrazin-degrading bacterial strains isolated in Vietnam, VNU
Joumal o f Science 30, 2014, 226-233.
3 Nguyễn Đàm Lý, Nguyễn Ánh Tuyết, Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang Huy, Isolation
and puriíication o f dehalogenase from 2,2 Dicloropropionic sodium (2,2 DCPS)
degrading bacteria in Vietnam, VNU Journal o f Science 30, 2014, 213-220.
4. Phạm Thị Hoa, Nguyễn Thị Nhật Ánh, Nguyễn Đàm Lý, Nguyễn Quang Huy, 2015.
Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai chủng vi khuẩn phân hủy 2,2 DCPS phân lập tại
Việt Nam, Gửi đăng Tạp chí Khoa học và Công nghệ (gửi đăng).

2. Sản phẩm dạng quy trình công nghệ, số liệu
1. Danh mục một số chủng vi khuẩn có hoạt tính sử dụng hợp chất clo hữu cơ phân lập
được.

2 Quy trình tinh sạch dehalogenase từ chủng vi khuẩn phân hủy 2,2 DCPS phân lập tại
Việt Nam (đã nộp đơn đăng ký giải pháp hữu ích).
3. Quy trình phân lập chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy hợp chất clo hữu cơ (có
Quyểt định của Cục sở hữu trí tuệ chấp nhận đơn hợp lệ).

3. Sản phẩm đào tạo
1. Thạc sĩ (02 học viên)
2. Cử nhân thuộc chương trình nhiệm vụ chiến lược (03 sinh viên)
3. Cử nhân CNSH (02 sinh viên)


Tạp chí

ISSN 0866 - 8612

KHOA HOC
ĐẠI HỌC QUỒC GIA HÁ NỘI
VNU JOURNAL 4

Natural Sciences and TectiìSÊ

Ip liH i& B
llp llllll
m m E liH I
ÍỀISbsS

s u
PS@í%8B§gBB«Ìag p i

aB pgMf
' ;: llraiÉ

/&Ệ3&Ì