Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mô ung thư

Đ Ạ I H Ọ C QƯÓC G IA HÀ NỘ I

BÁO CÁO TỎNG KÉT
K Ế T Q UẢ T H ự C H IỆ N ĐỀ T À I K H & C N
CÁ P Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA

Tên đề tài:

Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN
từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư

Mã số đề tài:

QG.16.22

Chủ trì đề tài:

PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

P h ò n g th í n g h iệm trọ n g điểm C ô n g ng h ệ E nzym v à P rotein
T rư ờ n g Đ ại học K h o a học T ự nh iên

ĐẠ! HỌC Q U ỗ C GIA H A Nụ.
TRUNG TÂM THÒNG TIN THƯ VIEN

CCCGCCCO^M

Hà Nội , 2017

I

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài: Nghiên cứu tạo kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư
1.2. Mã số: QG.16.22
1.3. Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực hiện đề tài
Đon vị công tác

Vai trò thực hiện đề tài

PGS.TS. Nguyễn Thị Vân Anh

Trường ĐHKHTN

Chủ nhiệm đề tài

2

GS.TS. Phan Tuấn Nghĩa

Trường ĐHKHTN

Thành viên

3

TS. Phạm Thị Thu Hường

Trường ĐHKHTN

Thành viên

4

PGS.TS. Nguyễn Hoàng Nam

Trường ĐHKHTN

Thành viên

5

CN. Trần Thị Mỹ

Trường ĐHKHTN

Thành viên

6

CN. Nguyễn Thị Huyền

Trường ĐHKHTN

Thành viên

7

TS. Nguyễn Hòa Anh

Công ty ANABIO R&D

Thành viên

8

TS. Hoàng Quốc Trường

Bệnh viện QĐTƯ108

Thành viên

9

PGS.TS. Trần Vân Khánh

Trường ĐH Y Hà Nội

Thành viên

TT

Chức danh, hoc vi, ho và tên

1

1.4. Đou vị chủ trì: T rư ờ n g Đại học Khoa học T ự nhiên
•

o

1.5. Thòi gian thực hiện:
1.5.1. Theo hợp đồng:
1.5.2. Gia hạn (nếu có):
1.5.3. Thực hiện thực tế:

#

•

•

•

từ tháng 1 năm 2016 đến tháng 12 năm 2017
Không
từ tháng 1 năm 2014 đến tháng 12 năm 2017

1.6. Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có):
( v ề m ụ c tiê u , n ộ i d u n g , p h ư ơ n g p h á p , k ế t q u ả n g h i ê n c ứ u v à t o c h ứ c t h ự c h iệ n ; N g u y ê n n h â n ;

Ỷ kiến của Cơ quan quản lý)
1.7. Tổng kinh phí đưọ’c phê duyệt của đề tài: 665.000.000đ (sáu trăm sáu mươi lăm triệu đồng).
PHẦN II. TỎNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u
1. Đ ặt vấn đề
Sử dụng nến và paraíin trong bảo quản lâu dài các mô ung thư là một phương pháp hiệu quả
giúp cung cấp nguồn mẫu dự trữ dồi dào và có chất lượng ổn định cho nghiên cứu, cũng như các
xét nghiệm thường quy trong bệnh viện và chẩn đoán dịch tễ học phân từ trên quymô lớn. Trong đó
tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản mô ung thư cố định bằng íòrmalin trong thể vùi paraíìn
(formalin-fixed, paraffin-embedded tissue, gọi tắ t là mô ung th ư FFPE) là bước đi đầu tiên giúp
phát hiện các dấu ấn phân từ liên quan đến ung thư sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như: giải

trình tự gen, Real time PCR... nhàm xác định chính xác các đột biến gen hay định lượng mức độ
biểu hiện của gen chỉ thị ung thư giúp các bác sỹ lâm sàng tiên lượng được bệnh, chân đoán chính
xác hơn và chỉ định điều trị thuốc hướng đích hiệu quả (Ahmad-Neiad et al., 2015; Gilbert et al.,
2007). Hiện nay việc tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản mô ung thư FFPE còn gặp nhiều khó
khăn, hàm lượng ADN/ARN thấp và ADN/ARN bị đứt gãy sau khi tách chiết, gây trở ngại cho các
kỹ thuật chẩn đoán sinh học phân từ khi sử dụng ADN/ARN tách chiết làm khuôn của phản ứng
(Masuda et al., 1999; Macabeo-Ong et al., 2002; Shi el al., 2004; McSherry et al., 2007). Dựa trên
- 1-


nền tảng nguyên lý của phương pháp Boom (Boom et al., 1990), nhiều công ty sinh phấm trên thế
giới đã tạo ra các bộ kit tách chiết ADN/ARN từ mẫu mô ung thư FFPE dựa trên công nghệ cột
màng silica. Một số bộ sinh phẩm hiện đang sử dụng phổ biến tại các khoa xét nghiệm bệnh viện có
thể kể đến là ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep System, ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep
System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratect)...Tuy vậy, hạn chế của phương pháp
này là thời gian thực nghiệm dài với số lượng mẫu lớn, không tự động hóa được quy trình tinh sạch
nên có khả năng nhiễm chéo cao giữa các mẫu trên cùng 1 lần thao tác. Để khắc phục nhược điểm
này, các công ty sinh phẩm hóa chất phát triển các bộ kit sử dụng hạt oxit sắt từ tính bọc silica
(Fe3 0 4 /SiC>2 ) kích thước micromet. Các phân tử nucleic acid sau khi liên kết với hạt micro từ bọc
silica sẽ được giữ lại và tách riêng ra khỏi protein, các hợp chất khác nhờ nam châm. Nucleic acid
sẽ thu được dưới dạng tinh sạch khi được tách ra khỏi hạt micro từ bọc silica bằng dung dịch đệm
có nồng độ muối thấp hoặc bằng nước cất (Stephane et al., 2004). Một số kit thương mại sử dụng
hạt micro từ tính bọc silica như MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiíic, Mỹ),
Maxwell 16 FFPE Tissue LEV DNA Puriíication kit (Promega, Mỹ), SaMag™ FFPE DNA
Extraction Kit (Sacace, Ý)... với quy trình đơn giản và thời gian tách chiết rút ngắn còn khoảng 3
tiếng cho 24-96 mẫu tùy vào số giếng trên giá nam châm của hệ thống tách chiết tự động.
Ở Việt Nam hiện nay chưa có công ty nào sản xuất bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô
ung thư FFPE. Vi vậy, các khoa xét nghiệm thuộc các bệnh viện tuyến Trung ương vẫn phải sử
dụng các kit nhập ngoại với giá thành cao (100-150 nghìn đồng/phản ứng) cho các bệnh nhân tự
nguyện chi trả xét nghiệm. Do vậy, việc chủ động tạo ra các bộ kit này là rất cần thiết để chuyển

giao công nghệ, sản xuất và ứng dụng các bộ kit có chất lượng tương đương với bộ kit ngoại nhập,
giá thành cạnh tranh, phục vụ việc chẩn đoán tại các bệnh viện.
2. Mục tiêu: nghiên cứu tạo bộ kit tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định mẫu mô ung thư
trong thể vùi paraíĩn (gọi tắt ]à ADN và ARN từ mô ung thư FFPE) bằng công nghệ hạt nano từ bọc
silica với các ưu điểm: hiệu suất tách chiết cao, thời gian tách chiết ngắn, giá thành giảm khoảng 3
lần so với kit nhập ngoại.
3. Phương pháp nghiên cứu
Tổng hợp hạt nano từ tỉnh FejŨ 4@ SỈO 2 : Đầu tiên, lỗi hạt nano từ tính Fe3 Ơ4 được tổng
hợp bàng phương pháp đồng kết tủa bằng cách hòa tan FeCl2 .4 H 2 0 với FeCỈ3 trong nước khử ion,
khuấy đều trên máy khuấy từ (IKA RW 20 digital) ở nhiệt độ 60°c. Sau đó, NH 4 OH 11% được
tiếp tục thêm vào dung dịch phản ứng và khuấy trong 90 phút để tạo mầm tinh thể. Sau khi đưa về
nhiệt độ phòng, hỗn dịch chứa mầm tinh thể Fe 3 Ơ4 được rửa với cồn ethanol 6 lần và với nước
khử ion 1 lần. Trong bước tiếp theo tạo lớp bọc silica, hỗn dịch hạt nano từ Fe3 0 4 được đưa vào
dung dịch gồm ethanol, nước khử ion, ammonia solution NH 3 28% và TEOS với tỷ lệ khác nhau
của TE 0 S:Fe3 0 4 NPs là 1; 8,9 và 17,8. Hỗn họp được rung sóng siêu âm (Elmasonic S15H) với
thời gian 5, 1 0 , 15 30, 45, 60, 90 và 1 2 0 phút để tạo các hạt nano Fe3 Ơ4 @ S 1O2 phân tán tốt trong
nước-cồn và có độ dày của lóp silica khác nhau, cấu trúc của hạt được phân tích bàng phổ nhiễu
xạ tia X (X Bruker D5005 X-ray), kỹ thuật kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM JEM1010,
JEOL), phổ hồng ngoại (FT/IR-6300, JASCO, và đo từ độ thông qua thông số đường cong từ trễ
(VSM) để chọn lựa ra 3 loại hạt đại diện: có sự khác biệt về độ dày của lớp S1 O2 và từ độ
(Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017).
Pha c h ế các bộ đệm : Các bộ đệm được pha chế tham khảo từ nghiên cứu trước đây (N guyen et

al., 2014). và cải tiến, tối ưu cho phù họp cho việc tách chiết ADN/ARN từ mô ung thư FFPE. Các
muối, acid hữu cơ (Guanidin HC1, Guanidin SCN, Tris-HCl, EDTA, Natricitrat, acid citric, Kali
-2-


acetat, SDS) và các muối, acid vô cơ (NaCL CaCỈ2 , HCL.) cùng với các nguyên liệu khác như
Proteinase K, cồn ethanol được sừ dụng làm nguyên liệu để pha chế nên các đệm gồm: đệm ]y giải

mô (Lysis Buffer 1, 2, 3 gọi tắt là LB1-01, LB2-01, LB3-01 cho ADN; LB1-02, LB2-02, LB3-02
cho A R N ), đệm gắn lên c ộ t s ilic a ( B in d in g B u ffe r 1, 2, 3 g ọi tắt là B B 1 -0 1 , B B 2 -0 1 , B B 3-01 cho

ADN; BB1-02, BB2-02, BB3-02 cho ARN), đệm rửa mẫu (Washing Buffer 01-1. 01-2, 02-1, 02-2
gọi tắt là WB01-1, WB01-2 cho ADN, WB02-1, WB02-2 cho ARN), đệm chiết đẩy (Elution Buffer
1, 2 gọi tắt là EB1 cho ADN, EB2 cho ARN). Trong đó, hai loại đệm quan trọng nhất là Lysis và
Binding buffer được thử nghiệm, so sánh để chọn ra bộ đệm phù họp nhất cho bộ kit tách chiết
ADN và ARN từ mô ung thư FFPE. Các đệm vvashing và elution không có nhiều sự thay đổi so với
các bộ đệm từ nghiên cứu trước nên thừa hường từ nghiên cứu trước của nhóm (Nguyen et al.,
2014; Nguyen et al., 2017).
- Thu thập mẫu mô ung thư FFPE: 10 mẫu mô FFPE nghi ung thư vòm mũi họng (UTVMH)
được cung cấp bởi Khoa Sinh lý bệnh,-Học viện Quân Y; 30 mẫu mô FFPE nghi ung thư đại trực
tràng (ƯTĐTT) được cung cấp bởi Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein - Đại học Y Hà Nội; 30
mẫu mô FFPE nghi ung thư tuyến giáp (UTTG) được cung cấp bời bệnh viện TWQĐ 108.
- Tách chiết AD N và A R N từ mẫu mô ung thư FFPE sử dụng hạt nano từ bọc silỉca và hệ đệm
phù họp: việc tách chiết được tiến hành trên giá nam châm 12-giếng và 24-giếng (cũng là sản phẩm
được tạo ra trong đề tài này), gồm có 2 bước chuẩn bị và 1 quy trình tách mẫu, tóm tắt như sau:
Chia mẫu: Mầu mô vùi paraíin được cắt thành từng lát mỏng có độ dày khoảng lmm, dài khoảng
20-50 mm. Dùng cân tiểu ly cân các lát cắt mô khoảng 10 mg/phản ứng; Xử lý parâíìn: mẫu được
xử lý với dung dịch dầu khoáng để loại bỏ lóp paraíĩn. Sau đó, sừ dụng cồn và nước để rửa sạch
lượng dầu khoáng còn sót lại, chỉ giữ lại mô; Quy trình tách ADN và ARN từ mẫu mô vùi
paraíìa: Đầu tiên, 20 |il proteinase K và 200 |il LB (là LB1-01, LB2-01, LB3-01 cho ADN; LB102, LB2-02, LB3-02 cho ARN) được bổ sung vào 10 mg mẫu mô ung thư đã được loại bỏ paraíĩn
bằng dầu khoáng. Nếu tách chiết ADN , mẫu được ủ ở 60°c trong 1 giờ đế ly giải mô giải phóng
ADN, và tiếp tục ủ ở 90°c trong 1 giờ để loại bỏ liên kết chéo. Nếu tách chiết ARN, mẫu được ủ ờ
60°c trong 15 giờ để ly giải mô giải phóng ARN, và tiếp tục ủ ở 80°c trong 30 phút để loại bỏ liên
kết chéo. 400 ụ\ BB (BB1-01, BB2-01, BB3-01 cho ADN; BB1-02, BB2-02, BB3-02 cho ARN),
200 ụ\ isopropanol và 50 Ịil hạt nano từ bọc silica (hạt MagSi nano) (M l, M2, M3) được bổ sung
vào mẫu để ADN hoặc ARN được gắn lên hạt MagSi nano. Mầu được đặt lên giá nam châm để tập
trung phức hệ hạt gắn ADN hoặc ARN và loại bỏ các tạp chất. 500 |il WB1-1 và 500 |il WB2-1 lần
lượt được bổ sung vào hạt để rửa bỏ các tạp chất còn sót lại trước khi chiết đẩy ADN ra khỏi hạt

bằng 50 ụ.1 EB1. 500 Ịil WBl-2 và 500 |il WB2-2 lần lượt được bổ sung vào hạt để rửa bỏ các tạp
chất còn sót lại trước khi chiết đẩy ARN ra khỏi hạt bằng 50 |il EB2. ADN/ARN được bảo quản ở 20°c hoặc sử dụng ngay cho phản ứng PCR, real time PCR, real time RT-PCR tiếp theo. Kit thương
mại dùng để so sánh là MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiíĩc, Mỹ), ReliaPrep™
FFPE DNA Miniprep System (Promega), Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (Stratec) và
ReliaPrep™ FFPE Total ARN Miniprep System (Promega).
Đánh giá nồng độ và độ tinh sạch ADN/ARN: được thực hiện bàng phương pháp đo độ hấp
thụ ờ bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy quang phổ kế Nanodrop 2000. Đánh giá mức độ đứt
gãy cùa ADN sau khi tách chiết được thực hiện bằng phương pháp điện di ADN tách chiết trên gel
agarose 1,5-2% (Nguyen et al., 2014; Nguyen et al., 2017).
- Đánh giá chất lượng A D N sau khi tách chiết có thể sử dụng cho các ứng dụng tiếp theo được
thực hiện bàng các phương pháp kiểm định (assay) sau:
-3-


•
PCR nhân bản đặc hiệu đoạn gen 252 bp gen dấu chuân ung thư BRAF trong hỗ trợ xét
nghiệm ung thư đại trực tràng sử dụng ADN tinh sạch bởi bộ kit làm khuôn (DeRoock et al.,
2010). Trình tự mồi gồm: BRAF-Fw 5 - TCATAATGCTTGCTCTGATAG- 3’ và BRAF-Rv 5’CTTTCTAGTAACTCAGCAGC - 3’. Chu trình nhiệt gồm 95°c 5 phút; 35 chu kỳ gồm các
bước: 95°c 30 giây, 58°c 30 giây, 72°c 30 giây ; 72°c 5 phút
•
Giải trình tự gen của sản phẩm PCR để phát hiện một số đột biến trên các gen dấu chuẩn
BRAF. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen đặc hiệu BRAF được điện di trên gel agarose 1,5-2% để
kiểm tra độ sáng và vị trí của băng sau đó được tinh sạch bởi ANAPURE PCR & Gel
Purifícation kit (ANABIO R&D), và gửi mẫu đi giải trình tự (IDT, Mỹ). Trình tự ADN được
phân tích bởi phần mềm ApE (Đại học Uta, Mỹ) kết họp cơ sở dữ liệu tin sinh học NCBI
( />•
Real time PCR Taqman probe để phát hiện các đột biến gen dấu chuẩn ung thư BRAF
(V600E), KRAS-1, KRAS-2 (G12A/D/R/V/C/S; G13D), HRAS (G12V, G13R, G61R), NRAS
(Ọ61H/K/R/L) bàng bộ Thyroid Cancer Mutation Analysis Kit (Entrogen), phát hiện các virus gây
bệnh ung thư như Epstein-Barr-EBV kết họp định lượng gen giữ nhà P-globin để đánh giá tính

toàn vẹn của ADN tách chiết (Niesters et al., 2000). Trình tự mồi và probe phát hiện EBV gồm:
EBV-Fw 5’- GGAACCTGGTCATCCTTGC- 3’, EBV-Rv 5’- ACGTGCATGGACCGGTTAAT 3’, EBV-Probe 5 ,-(FAM)-********TCGTACTGCTCGCT-(TAMRA)-3 ,. Chu trình nhiệt gồm
95°c 10 phút; 45 chu kỳ gồm các bước: 95°c 30 giây, 60°c 45 giây.
•
Nested real time SYBR kết họp với giải trình tự gen để phát hiện genotype của Human
Papillomavirus-HPV (DeRoda Husman et al., 1995; Herraez-Henandez et al., 2013). Trình tự
mồi và probe phát hiện HPV gồm: HPV- Fw l, 5’- TTT AAT AAR CCA TAT TGG YTR CA 3 ’, HPV- R vl, HPV-Fw2 5’- ATT CAT AGT ATG WAT ATA KGY CAT - 3’, HPV- Rv2 5’GAA AAA TAA ACT GTA AAT CAT ATT c - 3 \
- Đánh giá chất lượng A R N sau kh i tách chiết: ARN được đánh giá sừ dụng làm khuôn cho các
ứng dụng tiếp theo thông qua phương pháp kiểm định tiêu chuẩn cơ sở (assay) định lượng mức
độ biểu hiện mARN của gen dấu chuẩn ung thư (TSHR) kết họp định lượng gen nội chuẩn
GAPDH để đánh giá tính toàn vẹn của ARN tách chiết. Các mồi và probe sử dụng trong nghiên
cứu được tham khảo theo các nghiên cứu trước đây (Tanaka et al., 2000; Roddiger et aỉ., 2002;
Barber et al., 2005) và cải tiến để đạt được độ nhạy tốt hơn, bao gồm: GAPDH- Fw 5’TCATAATGCTTGCTCTGATAG- 3 ’, GAPDH- Rv 5’- CTTTCTAGTAACTCAGCAGC -3%
GAPDH- Probe 5’-HEX-TCCGACGCCTGCTTCACCACCTTCT-MGBNFQ-3', TSHR- Fw 5'CCTTCACCTCACACGGGCT-3', TSHR- Rv 5'-TGCTCTCATTACACATCAAGGACTC-3',
TSHR- Probe 5’-FAM- ********CACTGCTGTGCC-BHQ-3\ Chu trình nhiệt gồm 50°c 30
phút; 95°c 10 phút; 45 chu kỳ gồm các bước: 95°c 30 giây, 60°c 45 giây.
4. Tổng kết kết quả nghiên cứu
4.1. Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kit tách chiết DNA từ các tiêu bản cố định mẫu
mô ung thư
4.1.1. Tổng họp và xác định cấu trúc, tính chất của hạt nano từ tính từ bọc silica FeỉƠ 4@ SìOị
Quy trình chế tạo hạt phù họp nhất cho việc tách chiết ADN/ARN từ tiêu bản mô ung thư
FFPE được mô tả chi tiết ở Phụ lục 1. Tuy nhiên, trước khi lựa chọn được hạt phù họp, chúng tôi
đã thực hiện tổng họp các loại hạt có tính chất khác nhau theo phương pháp đã mô tả ở trên, và dưới
đây là kết quả phân tích của 03 loại hạt nano Fe3 Ơ4 @ S1 O2 đại diện (ký hiệu là M l, M2, M3) được
lựa chọn để sử dụng cho việc thử nghiệm tách chiết ADN/ARN.
-4-


Hình. 1A là phổ nhiễu xạ của mẫu hạt nano Fe3 Ơ 4 (a), Fe3 Ơ4 @Si0 2 với tỉ lệ mol
TEOS:Fe3 Ơ 4 là 17,8 và thời gian siêu âm là 10 phút (b) và 60 phút (c). Các đỉnh phổ nhiễu xạ tại

các góc 20 = 30,4°, 35,7°, 43,3°, 53,9°, 57,3°, 62,9° tương ứng với các mặt (220), (311), (400),
(422), (511) và (440). Kết quả chỉ ra rằng hạt nano Fe3 Ơ4 NPs có cấu trúc “cubic spinel” đảo với
hằng số mạng a = 8,36 Â khi so sánh với phổ chuẩn JCPDS Card No. (79 - 0417). Vị trí đỉnh tại
góc 20 khoảng 20°-30° của hạt nano Fe3 0 4 @SiƠ 2 được xác định là của lớp vô định hình silica.
Kích thước trung bình của tinh thể Fe3 0 4 được tính bằng công thức Debye-Sherrer có giá trị là 10,7
nm. Hình. 1B là phổ FTIR của SĨƠ2 , hạt nano Fe3 Ơ 4 và Fe 3 Ơ 4 @Si0 2 được chế tạo với tỉ lệ
TEOS:Fe3 Ơ 4 là 17,8 dưới điều kiện siêu âm trong thời gian 10 p h ú t, 30 phút and 60 phút. Trong
tất cả các phổ, vùng xung quanh 1600 and 3400 ciĩT 1 là dao động của liên kết H-O-H hoặc hấp thụ
của nước (TLTK). Trong phổ của hạt nano Fe3 0 4 và Fe3 0 4 @SiC>2 có vùng hấp thụ tại 500 Cĩĩf 1 là
dao động của liên kết F e-0 . Vùng tại 1060 cm~' là dao động của o trong liên kết Si-O-Si trong
S 1O2 . Két quả này chứng tỏ Fe3 0 4 NPs được bọc thành công bởi S1O 2 .

2

Theta (degree)

Wavenumber(cm ')

(A)

(B)

Hình 1: Phổ nhiễu xạ tia X và phổ FTIR của các mẫu. (A): Phổ nhiễu xạ tia X của hạt nano Fe30 4 tổng hợp
(a), Fe3 0 4 @ Si 0

2

với tỷ lệ mol 17,8 và thời gian siêu âm 10 phút (b) và 60 phút (c), (B): phổ FTIR của S i0 2,

hạt nano Fe30 4 và Fe30 4@Si02 được chế tạo với tỷ lệ mol TE0S:Fe30 4 là 17,8 theo phương pháp siêu âm

trong 10 phút, 30 phút và 60 phút.

Hìah 2 là ảnh TEM của hạt nano Fe3 Ơ4 (a) và Fe3 0 4 @Si0 2 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3 C>4 là 17,8
chế tạo với thời gian siêu âm là 10 phút, 30 phút and 60 phút. Phân bố kích thước hạt được chỉ ra
lần lượt trong Hình 2 (b), (h), (j) and (1). Kích thước trung bình của hạt nano Fe 3 0 4 là 10,7 nm và
của hạt lano Fe3 0 4 @SiƠ2 dưới điều kiện siêu âm 10 phút là 23,4 nm và cả hai loại hạt cỏ dạng gần
hình cầu. Khi thời gian siêu âm tăng lên 30 và 60 phút, kích thước trung bình của hạt nano
Fe3 0 4 (§Si0 2 tăng lần lượt là 34,9 nm 43,1 nm. Tăng thời gian siêu âm sẽ làm tăng kích thước hạt
nano hoặc tăng lượng silica bọc hạt. Kết quả nhiễu xạ tia X chỉ ra rằng bề mặt hạt nano Fe3 0 4 đã
được bcc thành công nhờ sử dụng sóng siêu âm. Điều này có thể quan sát trong ảnh TEM của hạt
nano Fe;C>4 @Si0 2 với tỉ lệ mol TEOS:Fe3 C>4 lần lượt là 1 (Hình. 2c), 8,9 (Hình. 2e) và 17.8 (Hình.
2i) chế -ạo dưới điều kiện siêu âm 20 phút. Phân bố kích thước được thể hiện tương ứng lần lượt
trong các trong hình 2d, 2f và 2j. Khi tỉ lệ mol TEOS:Fe3 Ơ 4 tăng từ 1 đến 8,9 và 17,8, kích thước
hạt trung, bình Fe3 0 4 @SiC>2 tăng lần lượt từ 14,5, 24,4 và 34,9 nm. Có thể kết luận tăng thời gian
siêu âm sẽ làm tăng kích thước hạt nano hoặc tàng lượng silica bọc hạt.
-5-


55 [—
50
45
40
35 ■ầ
30

(0

(b)

=24.4mn

1

25-ĩ

20
15
10
50

a Sizc distribưtion
- G aussian F ittin g

d=10.7nm
k£'Si Sizc distribution
— (iỉussian KỊtting

-

20 25 30 35 40 45 50 55

15 20 25 30 35 40 45
Particles si/c(nm)

Particlcs size(nin)

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Particles size(nra)

100 nm

55
50
45
40
35
30
25

(h)

23.4nm
Size distnbution

20

15

Gaussian Pitting I

10

0

5

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Particles sizc(titn)

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Partiđes size(nm)

15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Particles size(nm)

1lình 2: Hình ảnh TEM của NPN Fei0 4 (a) và Fe3 0 4 @ SÌO2 NP với tỷ lệ mol TEOS: Fe3 Ơ4 lần lượt là 1 (c),
8,9 (e) và 17.8 (i) được chế tạo với thời gian siêu âm là 30 phút. Sự phân bố kích thước của chúng được thể
hiện tương ứng trong Hình 2 (b), (d), (í) và (j). Fe3 Ơ4 @ SÌO2 NPs với tỷ lộ mo! TEOS: Fe3 0 4 NPs là 17,8
được che tạo với thời gian siêu âm 10 phút (g), 30 phút (i) và 60 phút (k). Sự phân bố kích thước của chúng
được thê hiện lương ứng trong Hình 2 (b), (h), (j) và (1).
Hình 3A thế hiện đường cong từ hóa của của hạt nano Fe3 Ơ4 và Fe3 C>4 @Si0 2 với ti lệ mol
TEOS:Fe3 0 4 17,8 cùng thời gian siêu âm lần lượt là 10, 30 và 60 phút tại nhiệt độ 300 K. Tất cả các
đường cong cho thấy tính chất siêu thuận từ với lực kháng từ rất nhỏ . Từ độ bão hòa của hạt nano
Fe. 3 0 4 là 60,9 emu/g ở 11 kOe sau đó giảm xuống khi lớp silica được phủ lên bề mặt của hạt. Lý do
của sự giảm hấp thụ bão hòa được quan sát có thể được giải thích bàng sự có mặt của vỏ silica xung
quanh hạt đã làm suy yếu tính chất từ của lõi hạt từ của từ bên trong. Hình 3B cho thấy từ độ bão
-6-


hòa của hạt nano Fe3 Ơ4 và Fe3 0 4 @Si0 2 với tỷ lệ mol TEOS:Fe3 Ơ 4 là 1 , 8,9 và 17,8 với thời gian
siêu âm đến 120 phút ở 300 K. Kết quả cho thấy từ độ bão hòa ở các mol tỷ số của TEOS: Fe3 Ơ 4
NPs có khuynh hướng giảm với thời gian siêu âm gia tăng, sau đó đạt đến giá trị không thay đổi ở
khoáng 30 phút.

Time (min)
(B)

(A)

Hình 3: Các đường cong từ hóa và từ độ bão hòa cùa các hạt nano Fe30 4 và Fe30 4 @ SĨƠ2 , (A): Các

đường cong từ hóa của hạt nano Fe30 4 và Fe30 4 @Si 0 2 với tỷ lệ mol TE0S:Fe30 4 là 17,8 theo với thời gian
siêu âm là 10, 30 và 60 phút ở 300 K. Trong hình con của hình A cho thấy các đường từ hóa với từ trường
trong khoảng từ -100 Oe đến 100 Oe. (B) Từ độ bão hòa của hạt nano Fe30 4 và Fe30 4 @Si 0 2 với ti lệ mol
TEOS:Fe3 Ơ4 là 1, 8,9 và 17,8 với thời gian siêu âm 120 phút ở nhiệt độ 300 K.

Từ các kết quả này, chúng tôi chọn các hạt nano Fe3 0 4 @Si0 2 (mẫu M l, M2 và M3) cho các
ứng dụng như trong Bảng 1, ừong đó MI là Fe3 Ơ4 @ S 1O2 chế tạo với tỉ lệ mol TEOS: Fe3 0 4 NPs
là 1 với thời gian siêu 30 p h ú t; M2 là Fe3 0 4 @ S 1O 2 NPs chế tạo với tỷ lệ mol TEOS Fe3 Ơ4 NPs là
8,9 với thời gian siêu âm 30 phút; M3 là Fe3 Ơ4 @ S 1O2 NPs chế tạo với tỷ lệ mol TEOS: Fe3 Ơ 4 NPs
là 17,8 với thời gian siêu âm 30 phút.
Bảng 1: Dặc điểm của 03 loại hạt nano từ Fc 30 4 @Si0
No

Tính chất

2

bọc silica

Giá trị
MI

M2

M3

1

Nồng độ (mg/ml)

25, 50, 75

25

25

2

Từ độ bão hòa của hạt nano lõi Fe30 4 (emu/g)

60.9

60.9

60.9

3

Từ độ bão hòa của hạt nano Fe30 4@Si02 (emu/g)

50.2

18.6

10.3

4

Đường kính trung bình của hạt nano lõi Fe30 4 (nm)

10,7

10,7

10,7

5

Đường kính trung bình của hạt nano Fe30 4@Si02 (nm)

14.5

24.4

34.9

4.1.2. Tối ưu đệm Lysis và Binding Buffer p h ù hợp với tách chiết A D N từ mô FFPE
Trong quá trình tối ưu kít tách chiết ADN từ mô ung thư FFPE, đầu tiên chúng tôi thực hiện tối
ưu đệm Lysis và Binding buffer vì đây là 2 đệm quan trọng nhất quyết định thành công của các bộ
kit tách chiết. Ba loại bộ đệm Lysis và Binding được pha chế, có thành phần được kí hiệu là LB1-01
+ BB1-01 (bộ đệm 1-DNA), LB2-01 + BB2-01 (bộ đệm 2-DNA), LB3-01 + BB3-01 (bộ đệm 3-7 -


DNA). Để phục vụ cho thí nghiệm này, chúng tôi ngẫu nhiên chọn hạt nano mã số MI đê kết họp
với các bộ đệm trong quá trình tách chiết ADN. Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu mô của 5 bệnh
nhân ung thư đại trực tràng (ký hiệu BN 1-5), sử dụng ba loại đệm khácnhau với cùng một loại hạt
M l. Mỗi thí nghiệm đều sử dụng 10 mg lát cắt mô FFPE, lặp lại 3 lần.

Nồng độ ADNcủa 5 bệnh

nhân khi tách chiết bởi ba bộ đệm được trinh bày trên Hình 4.

250 0 0 -

ĩ
ơ>
c
<
z
Q
q>
c
,z

□ BN 1

□ BN 2

Đ BN3

□ BN 4

■ BN 5

200.00

4

150.00

I

*

i

1

Bộ đệm 1

Bộ đệm 2

■

Bộ đệm 3

Hình 4 : So sánh nồng độ ADN tách từ 10 mg mẫu mô ung thư FFPE của 5 bệnh nhân khi sử dụng 3
loại bộ đệm (n = 3).

Kết quả trình bày trên Hình 4 cho thấy nồng độ ADN khi tách bởi bộ đệm 2-DNA cho giá trị
cao nhất ở cả 5 bệnh nhân (102,8 ± 6,94 ng/ịil ở mẫu BN 1, 84,1 ± 4,99 ngẠil ở mẫu BN 2, 201,67 ±
15,09 ng/^1 ờ mẫu BN 3, 163,0 ± 11,7 ng/|il ở mẫu BN 4 và 107,33 ± 5,29 ng/ị^l ở mẫu BN 5), cao
hơn khoảng 2 lần so với hai bộ đệm còn lại. ADN tách chiết bằng cả ba bộ đệm đểu cho độ tinh
sạch tốt với giá trị A 2 6 0 /A 2 8 0 trong khoảng 1,9- 2,2 (Bảng 2).
Bàng 2: Kết quả đo độ tinh sạch ADN của 5 bệnh nhân tách bời 3 bộ đệm khác nhau.
Độ tinh sạch (A 160/A 180)
Bộ đệm

BN 1

BN 2

BN 3

BN 4

BN 5

1-D N A

2,00 ± 0,02

2,03 ± 0,04

2,15 ± 0,05

2,04 ± 0,08

2,03 ±0,11

2 -D N A

1,95 ± 0 ,0 5

1,97 ±0,03

2,02 ±0 ,1 0

1,95 ±0,10

2,11 ±0,05

3 -D N A

2,21 ± 0,18

2,04 ± 0,07

2,03 ± 0,02

2,10 ± 0 ,0 7

2,08 ±0 ,1 7

n = 3

ADN tách chiết của 5 bệnh nhân này khi sử dụng bởi cả 3 bộ đệm sử dụng được để làm
khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn gen BRAF. Kêt quả điện di sản phâm PCR (Hình 5) chỉ ra răng
phản ứng PCR lấy khuôn là ADN tách chiết từ 3 bộ đệm đêu nhân thành công gen đặc hiệu BRAF,
có khích thước khoảng 252 bp, trong đó phản ứng PCR sử dụng khuôn là DNA tách bởi bộ đệm 2DNA cho tín hiệu sáng rõ nét nhât ở 3 mâu đại diện. Kêt quả này tương đông với kêt quả đo nông
độ ADN ở Hình 4, khẳng định thêm việc lựa chọn đệm 2-DNA là phù hợp nhất.


lOObp (-) (+)

IB1+B81

IB2+B62

LB3+B83

300

200

100

252 bp

Hình 5 : Kết quả điện di PCR nhân đoạn gen Braf từ mẫu ADN của Bệnh nhân 2 tách bởi ba bộ đệm tương
ứng (Bộ đệm 1-DNA: LB1 + BB1: Bộ đệm 2-DNA: LB2 + BB2; Bộ đệm 3-DNA: LB3 + BB3); lkb: lkb
ladder, lOObp: lOObp DNA ladder, đối chứng (-t): plasmid TOPO chứa đoạn gen đặc hiệu kích thước 252 bp
của gen Braf.

4.1.3. Lựa chọn hạt Magsi nano phù hợp với tách chiết A D N từ mô ung thư FFPE
Sau khi lựa chọn được bộ đệm 2-DNA (LB2-01 + BB2-01) là bộ đệm phù hợp nhất, chúng
tôi dùng bộ đệm 2 này đế tiếp tục lựa chọn hạt Magsi nano từ 3 loại hạt Magsi nano ban đầu M 1,
M2, M3. Vì lượng mô của mỗi bệnh nhân chỉ đủ sử dụng cho khoảng 9-10 lần lặp lại, thí nghiệm
lựa chọn hạt nano phù hợp buộc phải tiến hành trên mẫu mô vùi paraíìn của 5 bệnh nhân tiếp theo
(ký hiệu BN 6-10) và mỗi bệnh nhân được lặp lại ba lần (n = 3). ADN của 5 bệnh nhân tách chiết
bởi ba loại hạt Magsi nano khác nhau được đem đi đo nồng độ và độ tinh sạch bàng phương pháp
quang phố kể sử dụng máy Nano Drop ND-1000. Nồng độ ADN khi tách chiết bởi ba loại hạt được
trình bày trên Hình 6 .
□ B N tí

_ 200.00

□ BN l

& tiN o

□ tỉN

y

■ b N 1U

/■—V

ĩ
e 150.00

<
§ 100.00
<©•

r i -

SJ3 50.00

'<ộ©

0.00
M1

I

ấHU

M2

Hình 6 : So sánh nồng độ ADN tách từ 10 mg mẫu mô ung thư FFPE của 5 bệnh nhân sử dụng ba loại hạt
Magsi nano Ml, M2, M3 khác nhau (n = 3).
Bảng 3: Kết quà áo độ tinh sạch ADN của 5 bệnh nhân tách hởi 3 loại hạt khác nhau
Độ tinh sạch (A,60/A^80)
Hạt

BN6

BN 7

BN 8

BN 9

BN 10

M1

1.84 ±0.03

1,93 ±0,05

1.87 ±0.13

2,03 ± 0.05

2,03 ± 0,02

M2

1,83 ± 0.22

1,97 ±0,10

1,95 ±0,05

2,10 ±0.04

2,08 ± 0,08

M3

1,82 ± 0,06

1.89 ±0.14

1,93 ±0,08

2,08 ± 0.02

2,05 ±0,10

n

ỉ

-9-

Kết quả nồng độ ADN thê hiện trên Hình

6

cho thấy ADN tách chiết bới hạt M 1 cho nồng độ

cao nhất (34,47 ± 3,2 ngẠil ở BN 6 , BN7 là 76,23 ± 5,39 ng/|il, 122,4 ± 5,5 ng/|il đối với BN

8

,

173,7 ± 4,9 ng/ịil BN9 và 66,7 ± 13,5 ng/|il ở BN 10) gấp 5 lần so với hạt M2 (5,67 ± 0,8 ng/|il ơ
BN 6 , BN7 là 16,5 ± 1,18 ngẠil, 30,6 ± 5,8 ngẠíỉ đối với BN 8 , 41,6 ± 3,5 ngẠil BN9 và 12,2 ± 6,3
ng/(.u ở BN 10) và gấp 2 lần so với hạt M3 (16,6 ± 1,5 ng/ul ơ BN 6 , BN7 là 40,5 ±4,17 ng/|il, 69,6
± 14,3 tig/ịil đối với BN 8 , 94,8 ± 1,4 ng/|il BN9 và 32,4 ± 4,5 ng/|.il ở BN 10). Điều này có thể lý
giải là ADN có nhiều nhỏm chức phosphate có khả năng bám tốt lên bề mặt silica nên chỉ cần lớp
bọc silica mỏng cũng đủ giữ lại ADN trên bề mặt hạt. Việc chọn hạt MI có lớp SÍƠ2 mỏng nhất
nhưng bù lại có từ độ cao nhất sẽ giúp giữ được nhiều hạt nano gắn ADN lên giá nam châm và cho
hiệu quả tách cao. Độ tinh sạch của ADN tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano trình bày ở Bảng 3
cho thấy ADN tách chiết bởi cá ba loại hạt đều có độ tinh sạch tốt không lẫn nhiều protein hay ARN
vì giá trị A2 6 0 /A 2 8 0 năm trong khoảng 1,8 - 2,2.
Tiếp tục sử dụng ADN tách chiết từ ba loại hạt để làm khuôn cho phản ứng PCR nhân đoạn
gen đặc hiệu BRAF, sau đó điện di kết quả PC'R trên gel agarose 1,5% (Hình 7). Kết quả điện di
cho thấy ADN tách chiết bởi ba loại hạt Magsi nano đều có khả năng sử dụng làm khuôn nhân thành
công đoạn gen đặc hiệu BRAF. Trong đó sử dụng ADN tách bởi hạt MI cho kết quả PCR rõ nét
nhất, độ dày của băng lớn nhất, tín hiệu sáng nhất so với băng PCR nhân bản từ ADN tách bới hai
loại hạt còn lại. Kết quá này tương đồng với kết quá đo nồng độ ADN tổng số ớ trên Hình 7.
lOObp (-) (+)

MI

VI2

M3

300

200

♦

100

252 bp

Hình 7: Ảnh diện di kết quả PCR nhân đoạn gen BRAF từ mẫu ADN của bệnh nhân 6 tách bởi ba loại hạt
nano từ bọc silica Ml, M2, và M3. lOObp: lkb: lkb ladder, lOObp: lOObp DNA ladder, đối chứng (+):
plastnid TOPO chứa đoạn aen đặc hiệu kích thước 252 bp của gen BRAF.
Sau khi tách được ADN từ các mẫu mô FFPE của ba bệnh nhân và nhân thành công đoạn gen
đặc hiệu BRAF từ sản phẩm ADN tách chiết được, chúng tôi đã tiến hành gửi mẫu giải trình tự đoạn
gen BRAF của hai bệnh nhân số 1 và số 2 và thu được tín hiệu các đính peak của trình tự rõ ràng
(kết quả không trình bày ở đây), chứng tỏ ADN tách chiết bởi bộ đệm 2 và hạt nano từ bọc silica
MI đã loại bở được hoàn toàn các liên kết chéo, sử dụng tốt cho các thí nghiệm PCR và giải trình tự
sau đó. Từ các kết quả trình bày trong Hình 6 , 7 và Bảng 3, chúng tôi lựa chọn hạt nano từ bọc silica
MI vì hạt này cho phép tách được ADN với hàm lượng cao nhất, băng PCR có độ sáng rõ nét nhất
và có thè ứng dụng cho việc giải trình tự gen chỉ thị ung thư.

- 10-

4.1.4. Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kit tách chiết ADIS tù’ các tiêu bán cố định mẫu
mô ung thư và sản xuất 15 bộ kìt
Tổng hợp các dừ liệu vê bộ đệm 2-DNA (LB2-01 + BB2-01) và hạt nano M 1, chúng tôi dã xây dựng
được quy trình chế tạo bộ kit bao gồm quy trình sản xuất, phương pháp kiểm định và tiêu chuân cơ
sở đánh giá chất lượng bộ kit, hướng dẫn sử dụng bộ kit. Toàn bộ thông tin được trình bày chi tiết ơ
Phụ lục 1. Dưới đày là công thức (Bảng 4) và hình ánh bộ kit bên cạnh giá nam châm (Hình 8 ).
Bảng 4: Các thành phần trong MAGPURE FFPE DNA nano kit (100 pứ)
Thành phần

Mã hóa

Lượng

Proteinase K 20 mg/ml

PK

1 ml

MagSi nano 75 mg/ml

MI

4 ống X 1,25 ml

Lysis Buffer

LB-01

20 ml

Binding Buffer

BB-01

50 ml

Washing Buffer 1

WB1-01

50 ml (đậm đặc)

Washing Buffer 2

WB2-01

100 ml

Elution Buffer

EB-01

20 ml

Với quy trình sản xuất này, chúng tôi phối hợp với công ty ANABIO R&D là đơn vị nhận
chuyến giao công nghệ tạm tính giá thành thương mại của 01 bộ kit 100 pứ là 4 triệu đồng (chi phí
hóa chất-nguyên vật liệu cho sản xuất, kiếm định: 2 triệu, chi phí nhân công-điện nước-hao phí máy

móc-quản lý phí: 1 triệu; chi phí quảng cáo-bán hàng: 1 triệu). Giá thành bộ kit MagPure chỉ bằng
khoảng 1/3 giá bán của các kit nhập ngoại, ví dụ như MagMAX FFPE DNA isolation kit (96 pứ)
của Thermo Scientiíic là 12 triệu, ReliaPrep™ FFPE Total DNA Miniprep System (100 pứ) của
Promega là 11 triệu; và Invisorb® Spin Tissue Mini Kit (50 pứ) của Stratect: 5,5 triệu. Quy trình
tách chiêt ADN của MagPure kit có thời gian tương đương (khoảng 3 giờ) với kit thương tnại
MagMAX FFPE DNA isolation kit (Thermo Scientiííc, Mỹ) và ReliaPrep™ FFPE DNA Miniprep
System.

Hình 8 : Hình ảnh MagPure FFPE DNA nano kit và giá nam châm
4.2. Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kỉt tách chiết ARN từ các tiêu bản cố định mẫu
mô ung thư
4.2.1. Lựa chọn hại M agsi nano phù hợp với tách chiết A R N từ mô ung thư FFPE
Với bộ kit tách ARN, trước hết chúng tôi tạm thời sử dụng bộ đệm LB02-01 + BB02-01 đã
được tối ưu cho ADN và chỉ thay đổi 3 loại hạt MagSi Nano M l, M2, M3 đế thứ nghiệm tách chiết
ARN với mục đích tìm ra loại hạt phù hợp nhất. Các khối mô ung thư tuyến giáp dạng thể vùi
-1 1 -


paraíĩn được thu thập đủ cho việc lặp lại thí nghiệm tối thiểu 9 lần (3 loại hạt X 3 lần lặp) trên mẫu
nghiên cứu của BN1. Do tinh chất ARN tách chiết từ mẫu mô ung thư FFPE bị đứt gãy nhiều và
hàm lượng thu được rất thấp (vấn đề gặp phải tương tự với các kit thương mại, không chỉ với kit tối
ưu trong nghiên cứu này), việc đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm và 280 nm để tính ra nồng độ
ARN và độ tinh sạch ARN cho kết quả dao động và không phản ánh chính xác chất lượng ARN sau
tách chiết. Vì vậy chúng tôi tham khảo những nghiên cứu trước đây (Masuda et al., 1999; Tanaka et
al., 2000) và chọn phương pháp đánh giá chất lượng và hàm lượng ARN chủ đạo là Real time RTPCR sử dụng primer được thiết kế vắt chéo qua 2 exon cho phép chỉ khuếch đại ARN của gen nội
chuẩn GAPDH mà không khuếch đại ADN của GAPDH.
B.

A.
.

4->
u

28

Cto

26

1CầO

24

c

c

3
u

JC

22
20
MI

M2

M3

Mẩu bệnh số 1
Hình 9: Biểu đồ so sánh giá trị C( của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR (n = 3)
sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3 loại hạt MagSi nano M l, M2 và M3 (A) và đường biểu diễn khuếch
đại ARN của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR sử dụng khuôn ARN tách chiết
bởi 3 loại hạt MagSi Nano M l, M2, và M3 (B) trên mẫu bệnh số 1.

Với cách tiếp cận như vậy ARN tổng sổ tách chiết được từ 3 loại hạt khác nhau đã được
dùng là khuôn cho phản ứng Real time RT- PCR nhân bản đoạn gen nội chuẩn GAPDH. Dựa trên
biểu đồ so sánh giá trị chu kỳ ngưỡng (Thresold cycle; Ct) và tín hiệu huỳnh quang nhân lên của
phản ứng Real time RT- PCR sử dụng ARN tách chiết từ 3 loại hạt MagSi nano được trình bày ở
Hình 9, chúng tôi thấy ARN tách chiết bởi ba loại hạt MagSi nano đều có khả năng sử dụng làm
khuôn nhân thành công đoạn gen GAPDH với giá trị Ct có sự khác biệt, nhưng không quá lớn.
Trong đó, ARN tách bởi hạt M3 cho giá trị chu kỳ ngưỡng thấp nhất (Ct = 24) với tín hiệu huỳnh
quang cao nhất (RFU = 400), còn hạt MI và M2 cho giá trị chu kỳ ngưỡng tương ứng là 25 và 26
với tín hiệu huỳnh quang tương ứng RFU khoảng 210 và 110. Điều này có thể lý giải là do ARN có
kích thước phân tử nhỏ và số nhóm chức phosphate ít hơn so với ADN nên lực tương tác với silica
yếu hơn ADN và cần hạt nano từ có lớp silica dày hơn để bám lên. Từ các kết quả trên chúng tôi
chọn lựa hạt M3.
4.2.2. Tổi ưu đệm Lysis và Bindíng Buffer phù hợp với tách chiết A R N từ mô FFPE
Sau khi đã chọn lựa được hạt M3 phù hợp nhất, áp dụng quy trình đánh giá chất lượng ARN
sau tách chiết như trên chúng tôi giữ lại đệm LB02-1 của bộ đệm tách chiết ADN và thử nghiệm
thay đổi đệm Binding bằng cách tiến hành pha chế 3 bộ đệm Binding Buíĩer (BB1-02, BB2-02,
BB3-02) với thành phần hóa học, nồng độ các chất (GuHCL, Tris HCL...) cũng như pH khác nhau.
Thí nghiệm được tiến hành trên mẫu mô ung thư FFPE số 2 và lặp lại 3 lần để tìm ra đệm BB cho
hiệu quả tách chiết ARN tốt nhất.


28
'52 26

c

‘5
5
&ọ

24

r

h

1

c

22
3

£o

20

1

BB1

BB2

i

BB3

Mầu bệnh số 2
Hình 10: Biểu đồ so sánh giá trị c t của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR (n 3) sù dụng khuônARN tách chiết bởi 3 loại đệm BB1-02, BB2-02, và BB3-02 (A) và đường biểu diễn
khuếch đại ARN của gen GAPDH trong phản ứng Real time RT-PCR sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3

loại đệm BB1, BB2, và BB3 (B) trên mẫu bệnh số 2.
Dựa trên biểu đồ so sánh giá trị chu kỳ ngưỡng (Thresold cycle; Ct) và tín hiệu huỳnh quang
nhân lên của phản ứng Real time RT- PCR sử dụng RNA tách chiết từ 3 loại hạt MagSi nano được
trình bày ở Hình 10, chúng tôi thấy ARN tách chiết bởi ba loại đệm đều có khả năng sử dụng làm
khuôn nhân thành công đoạn gen GAPDH với giá trị Ct có sự khác biệt khá đáng kể. Trong đó,
ARN tách bởi đệm BB3-02 cho giá trị chu kỳ ngưỡng thấp nhất (Ct = 23) với tín hiệu huỳnh quang
cao nhất (R FU = 1400), còn đệm BB1 và BB2 cho giá trị chu kỳ ngưỡng tương ứng là 25,5 và 27 với
tín hiệu huỳnh quang tương ứng RFU khoảng 800 và 700.

Như vậy chúng tôi đã chọn được hạt M3 và đệm BB3-02 phù hợp cho tách chiết ARN. Tương
tự, chúng tôi tiếp tục thay đổi đệm Lysis buíĩer bằng cách pha chế 3 bộ đệm LB1-02, LB2-02,
LB3-02 với thành phần hóa học, nồng độ các chất (SDS, Tris HCL...) khác nhau. Thí nghiệm được
tiến hành trên mẫu mô ung thư FFPE số 3 và lặp lại 3 lần. Lượng mô ung thư FFPE sử dụng cho 1
phản ứng tách chiết là 10 mg để tìm ra đệm LB cho hiệu quả tách chiết ARN tốt nhất.
B.

A.
31.0

o
UI
c

30.0

29.0

io* 28.0
c
'>• 27.0
3
■C
o

26.0

I4 "

25.0
LBl

i
LB2
Mẩu bệnh số 3

II
■
LB3

Hình 11: Biểu đồ so sánh giá trị c t của gen GAPDH được nhân lên trong phản ứng Real time RT-PCR (n =
3) sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3 loại đệm LB1-02, LB2-02, và LB3-02 (A) và đường biểu diễn
khuếch đại ARN của gen GAPDH trong phản ứng Real time RT-PCR sử dụng khuôn ARN tách chiết bởi 3
loại đệm BB1, BB2, và BB3 (B) trên mẫu bệnh số 3.

Từ các kết quả trình bày trong Hình 11, chúng tôi lựa chọn đệm LB 1-02 cho kết quả tách được
A R N chu kỳ ngưỡng thấp nhất (Ct= 27) với tín hiệu huỳnh quang cao nhất nhất (RFU = 1200) so
với 2 loại đệm LB 2-02 và L B 3-02 , đồng thời hiệu quả ly giải m ô trong thời gian xử lý của đệm
LB1 là tốt nhất.

4.2.3. Xây dựng quy trình chế tạo và sử dụng bộ kít tách chiết A R N từ các tiêu bản cố định mẫu
mô ung thư và sản xuất 10 bộ kit
Tổng hợp các dữ liệu về hạt M3, bộ đệm LB1-02, BB3-02, WBl-02, WB2-02, chúng tôi đã xây dựng
được quy trình chế tạo bộ kit bao gồm quy trình sản xuất, phương pháp kiểm định và tiêu chuẩn cơ sở
đánh giá chất lượng bộ kit. Thông tin được trình bày chi tiết ở Phụ lục 2. Dưới đây là công thức
(Bảng 5) và hình ảnh bộ kit bên cạnh giá nam châm (Hình 13) được sản xuất trong đề tài.
Bảng 5: Các thành phần trong MAGPURE FFPE RNA nano kit (100 pứ)
Thành phần

Mã hóa

Lượng

Proteinase K 20 mg/ml

PK

1 ml

MagSi nano 50 mg/ml

M3

4 ống

Lysis Buffer

LB-02

20 ml

Binding Buffer

BB-02

50 m l

Washing Buffer 1

W B l-0 2

50 m l (đậm đặc)

Washing Buffer 2

WB2-02

100 ml

Elution Buíĩer

EB-02

21 ml

X

1,25 m l

Với quy trình sản xuất này, chúng tôi phối hợp với công ty ANABIO R&D là đom vị nhận
chuyển giao công nghệ tạm tính giá thành thương mại của 01 bộ kit 100 pứ là 5 triệu đồng (chi phí
hóa chất-nguyên vật liệu cho sản xuất, kiểm định: 2,5 ừiệu, chi phí nhân công-điện nước-hao phí
máy móc-quản lý phí: 1,25 triệu; chi phí quảng cáo-bán hàng: 1,25 triệu). Giá thành bộ kit
MagPure chỉ bằng khoảng 1/3-1/4 giá bán của các kit nhập ngoại, ví dụ như MagMAX FFPE RNA
isolation kit (96 pứ) của Thermo Scientiííc là 24 triệu, ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep
System (100 pứ) của Promega là 18 triệu). Quy trình tách chiết ARN của MagPure kit cỏ thời gian
tương đương (khoảng 2 giờ) với kit thương mại ReliaPrep™ FFPE RNA Miniprep System.

Hình 12: Hình ảnh MagPure FFPE RNA nano kit và giá nam châm

4.3. Đánh giá chất lượng của các bộ kỉt tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cổ định mẫu
mô ung thư
Các bộ kit được chúng tôi thực hiện nội kiểm định chất lượng trên các mẫu ung thư vòm mũi họng
FFPE cung cấp bởi Bộ môn sinh lý bệnh, Học viện Quân Y trước khi gửi đi đánh giá chất lượng tại
02 đơn vị y tế là Trường ĐH Y Hà Nội và Bệnh viện QĐTW108.
-14-


4.3.1. Thử nghiệm tách chiết mô UTVH FFPE
Nghiên cứu thử nghiệm khả năng tách chiết mô UTVH FFPE được thực hiện trong khuôn khổ hợp
tác với nhóm nghiên cứu của PGS. Nguyễn Lĩnh Toàn, thuộc Khoa Sinh lý Bệnh, học viện Quân Y,
trên 10 mẫu bệnh phẩm và so sánh với kit MagMAX của hãng Thermo Scientiíic. Kit thử nghiệm
được bảo quản trong vòng 12 tháng kể từ ngày sản xuất đến lúc thừ nghiệm. Ket quả trên Hình 13
cho thấy cả hai bộ kit đều đã tách thành công ADN từ mẫu mô FFPE với độ tinh sạch cao trong
khoảng 1,8-2,1. Hàm lượng ADN tinh sạch bởi kit MAGPURE thậm chí cao hơn kit MagMAX từ 2

cho tới 5 lần, đạt nồng độ khoảng 20-220 ng/|al và hàm lượng ADN tổng khoảng 2-200 Ịig.
250 1
ũ MagMax

□ Magpure

5 - 200 1
ỌỊ>
s

<
p

150 -

Ậ

50

<©• 1 0 0 M
z

-□ s a BN7

tSL

KL
BN8

BN9

SSL

ES1~

BN10

BN11

BN12

BN13

BN14

BN15

BN16

Hình 13: Hàm lượng ADN cùa 10 mẫu bệnh phẩm tách bằng kit MagPure và MagMAX

Bảng 6: Kết quả real-time PCR phát hiện EBV và real-time nested PCR phát hiện HPV sử dụng ADN
khuôn tác từ 2 bộ kit MagPure và MagMAX trên 10 bệnh nhân

STT

Chu kì ngưỡng (Ct) tín

Chu kì ngưỡng (C() tín hiệu

hiệu FA M

HEX

(E B V )

Beta globin)

Bênh
nhân

Chu kì ngưỡng (Ct) tín
hiệu SBGR Greến (HPV)

MagPure

M agMax

MagPure

MagMax

MagPure

MagMax

1

BN7

25

28,5

25

31

12.0

25.0

2

BN8

28

31.5

28.5

32.5

16.0

26.0

3

BN9

27.5

30

25

29

NA

NA

4

BN10

29

32.5

27

33

NA

NA

5

BN11

30

36

27.5

35.5

NA

NA

6

BN12

28,2

24,5

27,01

30,1

27

30

7

BN13

31,5

33,7

33

35,6

NA

NA

8

BN14

NA

NA

30

32,4

25

32

9

BN15

NA

NA

31,5

32,7

NA

NA

10

BN16

34,26

NA

27,84

29,5

NA

NA

Kết quả trình bày ở Bảng 6 cho thấy đối với EBV, ADN tách bằng MagPure và MagMAX cùng
phát hiện được 8 / 1 0 mẫu dương tính (chiếm 80%), trong đó tín hiệu phát hiện đưọ'c của kit
MagPure thường sớm hơn khoảng 3-4 chu kỳ so với kit MagMAX. Điều này chứng tỏ chất lượng
và hàm lượng ADN tách bằng kit MagPure tốt hơn hẳn so với MagMAX. Tương tự với HPV, kết
quả chỉ ra 2 kit MagPure và MagMAX tương đồng 100%, khi cùng phát hiện được 4/10 mẫu dương
tính 9 (chiếm 40%). Từ các kết quả trình bày ở trên, có thể kết luận cả 2 bộ kit MagPure và
-15-


MagMAX đều tách thành công ADN từ mẫu mô FFPE với hàm lượng và độ tinh sạch cao và kit
MagPure cho phép tách chiết ADN với hàm lượng cao hơn so với MagMAX kit. ADN tách chiết là
ADN tông số, bao gồm cả ADN của người và ADN virus nhiễm trong mô UTVH, do đó mẫu có thể
sừ dụng cho nhiều ứng dụng khác nhau như phát hiện đột biến gen chỉ thị ung thư cũng như virus
gây bệnh.
4.3.2. Thử nghiệm kit tách MagPure FFPE AD N và A R N nano kit tại bệnh viện Q Đ TƯ 108
Nhóm nghiên cứu của TS. Hoàng Quốc Trường tại bệnh viện QĐTƯ 108 đã tiến hành thử
nghiệm, đánh giá hiệu quả tách chiết và chất lượng ADN khi tách bằng bộ kit MagPure với
Invisorb® Spin Tissue Mini Kit, đạt tiêu chuẩn CE-IVD của Châu Âu, của hãng Stratec (Đức) trên
cùng đối tượng 20 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến giáp. Kit thử nghiệm được bảo quản trong vòng
8 tháng kể từ ngày sản xuất đến lúc thử nghiệm. ADN tinh sạch sau khi tách bằng 2 bộ kit được
dùng làm khuôn cho phản úng real time PCR để phân tích một số đột biến trên gen chỉ thị ung thư
như BRAF (V600E), KRAS-1, KRAS-2 (G12A/D/R7V/C/S; G13D), HRAS (G12V, G13R, G61R),
NRAS (Q61H/K/R/L) hiện đang bắt đầu đưa vào sử dụng cho việc chẩn đoán sớm ung thư biểu mô
tuyến giáp thể nhú tại Khoa Sinh học phân từ bệnh viên QĐTƯ 108. MagPure FFPE DNA nano kit

sử dụng hạt nano từ tính cho hiệu quả tách chiết ADN cao hơn Invisorb® Spin Tissue Mini Kit, thể
hiện bời nồng độ ADN cao gấp 1,5-15 lần, tuy nhiên độ tinh sạch thấp hơn kit thương mại (giá trị
A 2 6 0 /A 2 8 0 trong khoảng 1,2-1,6 (do thao tác tách chiết của kỹ thuật viên không hút sạch hoàn toàn
vvashing buffer). Nồng độ ADN tách bằng MagPure kit đạt khoảng 20-100 ng/ịil và hàm lượng
ADN tổng khoảng 2-100 jag, và ADN cho phép phát hiện đột biến trên gen BRAF ở mô ung thư
tuyến giáp với độ nhạy cao hơn (18/20 mẫu dương tính) so với Invisorb® spin Tissue Mini Kit
(13/20 mẫu dương tính), và cho kết quả tương đồng 90-100% ở 4 gen còn lại KRAS-1, KRAS-2,
NRAS và HRẨS. Kết quả chi tiết xem tại Phụ lục 3.
Hiệu quả tách chiết và chất lượng ADN khi tách bằng bộ kit MagPure FFPE RNA nano kit
được so sánh với ReliaPrep™ FFPE Total ARN Miniprep System của hãng Promega. Việc so sánh
được tiến hành trên cùng đối tượng 10 mẫu mô ung thư biểu mô tuyến giáp và 10 mẫu mô lành tính.
ARN tinh sạch sau khi tách bằng 2 bộ kit sẽ được dùng làm khuôn cho phản ứng real time RT- PCR
để phân tích mức độ biểu hiện marker gen Thyroid Stimulating Hormone Receptor (TSHR) và gen
nội chuẩn Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Hai loại MagPure FFPE RNA
nano kit sử dụng hạt nano từ tính cho hiệu suất thu hồi ARN tổng số kém hơn từ 2-3 lần so với kit
ReliaPrep™ FFPE Total RNA Miniprep System của hãng Promega, tuy nhiên cho độ tinh sạch và
chất lượng của ARN tách bằng 2 bộ kit là tương đương. Nồng độ ARN tách bằng MagPure kit đạt
khoảng 22-100 ng/|J và hàm lượng ARN tổng khoảng 2,2-100 |j.g, giá trị A2 6 0 /A 2 8 0 trong khoảng
1,9-2.1, và ARN đảm bảo chất lượng làm khuôn cho phản ứng real time RT-PCR phân tích mức độ
biểu hiện gen TSHR ở các bệnh nhân nghi ung thư biểu mô tuyến giáp với độ sai lệch kết quả dưới
10% so với Promega kit. Ket quả chi tiết xem tại Phụ lục 4.
4.3.3. Thử nghiệm kit tách MagPure FFPE DNA nano kit tại Trucmg Đ H Y Hà Nội
MagPure FFPE DNA nano kit được đánh giá tiếp tục bởi nhóm nghiên cứu của PGS. Trần
Vân Khánh thuộc Trung tâm nghiên cứu Gen và Protein thuộc Trường ĐH Y Hà Nội, so sánh với
kit MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientiĩic) trên cùng đối tượng 20 mẫu mô ung thư
đại trực tràng. Kit thử nghiệm được bảo quản trong vòng 6 tháng kể từ ngày sản xuất đến lúc thử
...... ...... ~ ..... -....... -..—.-.... .....— ... ...... ..... -.

-16-

...................................... -....................................


nghiệm. ADN tinh sạch sau khi tách bằng 2 bộ kit được dùng làm khuôn cho phản úng real time
PCR để phân tích một số đột biến trên gen chỉ thị ung thư như BRAF (V600E), hiện đang bắt đầu
đưa vào sừ dụng cho việc chẩn đoán và điều trị ung thư đại trực tràng tại Trung tâm nghiên cứu
Gen- Protein, Đại học Y Hà Nội. Hai loại kit sử dụng hạt từ bọc silica MagPure FFPE DNA nano
kit và MagMAX FFPE DNA Isolation kit (Thermo Scientiíic) cho hiệu quả tách chiết ADN từ mẫu
mô đúc paraíin, khả năng khuếch đại gen bằng phản ứng PCR và giải trình tự là tương đương nhau.
Một số mẫu tách chiết bằng MagPure FFPE DNA nano kit cho nồng độ và độ tinh sạch cao hơn hai
loại kit nhập ngoại. Nồng độ ADN tách bàng MagPure kit đạt khoảng 50-400 ng/(_tl và hàm lượng
ADN tổng khoảng 5-40 |ag, giá trị A2 6 0 /A 2 8 0 trong khoảng 1,8-2,0. ADN tách chiết bởi MagPure
FFPE DNA nano kit hoàn toàn có thể áp dụng trong tách chiết ADN từ mẫu mô đúc parafíìn để
phục vụ chẩn đoán phát hiện đột biến gen ung thư đại trực tràng bằng phương pháp PCR kết họp
giải trình tự gen vì tín hiệu giải trinh tự thu được đều rõ nét và chính xác. Kết quả chi tiết xem tại
Phụ lục 5.

5. Đánh giá về các kết quả đạt được và kết luận
Đe tài đã đạt được 2 mục tiêu đề ra là (i) tạo được các bộ kit tách chiết ADN và ARM từ các
tiêu bản cố định bằng parafin/formalin các mẫu mô ung thư, và (ii) đánh giá chất lượng của các bộ
kít tách chiết ADN and và ARN từ các tiêu bản cổ định mẫu mô ung thư. Các kết quả đạt được bám
sát theo đăng ký trong thuyết minh và họp đồng của đề tài. v ề cơ bản, có 04 kết quả chính như sau:
- Đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ADN từ mô ung thư FFPE với tên thương
mại là MagPure FFPE DNA nano kit dựa trên các thành phần chính được tối ưu: Hạt Fe3 Ơ4 @
S1O2 Magsi nano MI (10,7 nm lõi từ Fe3 Ơ4 , 14,7 nm Fe3 0 4 @Si0 2 , từ độ bão hòa 50,2 emu/g),
bộ đệm ly giải và gắn DNA lên hạt ký hiệu LB2-01 + BB2-01 với giá thành khoảng 4 triệu
đồng/100 pứ, bằng 1/3 so với kit thương mại nhập ngoại.
- Đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ARN từ mô ung thư FFPE với tên thương
mại là MagPure FFPE RNA nano kit dựa trên các thành phần chính được tối ưu: Hạt Fe3 C>4 @
S1O2 Magsi nano MI (10,7 nm lõi từ Fe3 0 4 , 34,9 nm Fe3 0 4 @SiC>2 , từ độ bão hòa 10,3 emu/g),

bộ đệm ly giải và gắn ARN lên hạt ký hiệu LB1-02 + BB3-02, với

giáthành khoảng 5 triệu

đồng/100 pứ, bằng 1/3-1/4 so với kit thương mại nhập ngoại.
- Bộ kit MagPure FFPE DNA nano kit được kiểm nghiệm nội bộ và thử nghiệm tại 02 đơn vị y tế
và kết quả đánh giá cho thấy ADN tách bởi bộ kit có hiệu quả và thời gian tách chiết tương
đương với kit nhập ngoại có uy tín, và thậm chí lượng ADN tách chiết còn cao hơn khoảng 2-15
lần trên một số mẫu thử nghiệm. Hàm lượng ADN tách từ 10 mg mô ung thư FFPE đạt khoảng
2-40 ịig, với nồng độ ADN trong khoảng 20-400 ng/ml tùy mẫu môung thư FFPE, vàgiá trị
A 2 6 0 /A2 8 0 phản ánh độ tinh sạch của ADN nằm trong khoảng 1,8-2,2.
- Bộ kit MagPure FFPE RNA nano kit được thử nghiệm tại 01 đơn vị y tế và kết quả đánh giá
cho thấy ARN tách bởi bộ kit có hiệu suất thu hồi kém 2-3 lần so với kit Promega, tuy nhiên độ
tinh sạch, chất lượng và thời gian tách chiết là tương đương. Hàm lượng ARN tách từ 10 mg mô
ung thư FFPE 2-10 (_ig, với nồng độ ARN trong khoảng 20-100 ng/ml tùy mẫu mô ung thư
FFPE, và giá trị A2 6 0 /A 2 8 0 phản ánh độ tinh sạch của ARN nằm trong khoảng 1,9-2,1.

OOOGOOOOA 64


6. Tóm tắt kết quả
Tiếng Việt
Tách chiết ADN và ARN từ các tiêu bản cố định bằng íòrmalin trong thể vùi paraíìn (mô ung thư
FFPE) là bước quan trọng giúp phát hiện các dấu ấn phân tử liên quan đến ung thư. Trong nghiên
cứu này, chúng tôi chế tạo các bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE sử dụng hạt
nano từ tính bọc silica và các bộ đệm phù hợp và đánh giá chât lượng các bộ kit tạo thành. Cụ thê,
chúng tôi đã xây dựng được quy trình sản xuất bộ kit tách chiết ADN và ARN từ mô ung thư FFPE
với tên thương mại là MagPure FFPE DNA nano kit và MagPure FFPE RNA nano kit dựa trên các
thành phần chính được tối ưu: (i) Hạt Fe3 Ơ4 @ SiO? Magsi nano ký hiệu MI (14,7 nm Fe3Ơ4@Si02,
từ độ bão hòa 50,2 emu/g) để tách chiết ADN và ký hiệu M3 (34,9 nm Fe3 0 4 @Si0 2 , từ độ bão hòa

10,3 emu/g ) để tách chiết ARN; (ii) bộ đệm ly giải và gắn ADN lên hạt ký hiệu LB2-01 + BB2-01
và bộ đệm ly giải và gắn ARN lên hạt ký hiệu LB1-02 + BB3-02. MagPure FFPE DNA nano kit
được đánh giá có hiệu quả và thời gian tách chiết tương đương vói kit nhập ngoại có uy tín, và thậm
chí lượng ADN tách chiết cao hơn 2-15 lần trên một số mẫu thử nghiệm. Trong đó hàm lượng ADN
đạt 2-40 p.g/10 mg mô, nồng độ ADN 20-400 ng/p.1, độ tinh sạch 1,8-2,2. MagPure FFPE RNA
nano kit được đánh giá có hiệu suất thu hồi ARN kém 2-3 lần so với kit Promega, tuy nhiên độ tinh
sạch, chất lượng và thời gian tách chiết là tương đương. Hàm lượng ARN tách từ 10 mg mô ung thư
FFPE là 2-10 Ịig, nồng độ ARN 20-100 ng/p.1, độ tinh sạch 1,9-2,1. ADN/ARN tách chiết bởi các
bộ kit MagPure đã được thử nghiệm tại 02 đơn vị y tế và đã được chứng minh có khả năng sử
dụng làm khuôn cho các phản ứng PCR kết hợp giải trình tự gen, real time PCR trong phát hiện các
đột biến gen chỉ thị ung thư và các virus gây bệnh liên quan tới ung thư đại tràng, mũi họng, và
tuyến giáp. Kết quả thừ nghiệm cũng cho thấy sự tương đồng cao với các bộ kit đã thương mại. 02
bộ MagPure kit có giá thành thấp hợp 1/3-1/4 lần so với kit thương mại, và đã được chuyển giao
công nghệ cho công ty ANABIO R&D để sản xuất và thương mại hóa trong thời gian tới.
Tiếng A nh
Extraction of DNA and RNA from íòrmalin íixed paraffm embedded (FFPE) cancer tissue is
critical important for down-stream molecular reactions to detect pathogens and biomarker’s
mutations relating to cancer diseases. In this study, we developed DNA and RNA extraction kit
from FFPE cancer tissues using silica-coated magnetic nano particles and suitable buffers. We built
up protocol to produce FFPE tissue DNA and RNA extraction kit and produced MagPure FFPE
DNA nano kit and MagPure FFPE RNA nano kit based on the major components: (i) Fe3 Ơ4 @ SĨƠ2
Magsi nano MI (14.7 nn diameter, 50.2 emu/g) for DNA extraction, and MagSi nano M3 (34.9 nm
diameter, 10.3 emu/g ), (ii) lysis and binding buffer for DNA including LB2-01 and BB2-01, lysis
and binding for RNA including LB1-02 and BB3-02. The MagPure FFPE DNA nano kit was
quality controlled in comparison to commercial kits and the data shows that DNA recovery of
MagPure kit was equal, and even 2-15 fold higher than the commercical ones on several tested
samples. The DNA recovery was 2-80 |ig/10 mg tissue, DNA concentrations were 20-400 ng/|al,
and the value A 2 6 0 /A 2 8 0 were within 1,8-2,2. The MagPure FFPE RNA nano kit was quality
controlled in comparison to commercial kits and the data shovvs that RNA recovery of MagPure kit
was about 2-3 fold less than the commercical One on several tested samples. The RNA recovery was

2-20 í^g/10 mg tissue, RNA concentrations were 20-100 ng/|al, and the value A 2 6 0 /A 2 8 0 were within
1,9-2,1. As quality control data períbrmed at two hospital laboratories, DNA and RNA extracted by
the MagPure kits could be used as templates for PCR-DNA sequencing and real time PCR in
detection of biomarker gene mutations and pathogenic viruses relating to naphasolyn, colon, and
thyroid cancers. The data shows high similarities between the MagPure kít and commercial kits.
Both DNA/RNA MagPure kits had competitive prices compared to commercial available kits, and
the technology of producing these two kits has been tranfered to ANABIO R&D for production and
commercialization in near future.
-18-


Tài liệu tham khảo

1.
Ahmad-Neiad p., Duda A., Sucker A., Wemer M., et aỉ. (2015) Assessing quality and
funct:0 nality of DNA isolated from FFPE tissues through extemal quality assessment in tissue
banks Clinl Chem Lab Med, 53, 1972-1934.
2.
Barber R.D., D. w . Harmer , R. A. Coleman , B. J. Clark (2005) GAPDH as a
housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues Physỉoì
Genomics, 21, 389-395.
3.
Boom R, J. A. Sol, M. M. M. Salimans, c . L. Jansen, p. M. E. Wertheim (1990) Rapid and
simple method for purifícation of acid nucleics J Clìn Microbiol, 28, 495-503.
4.
De Roda Husman, A.M., Walboomers, J.M., Van den Brul, A.J., Meijer, C.J., Snijders, C.J.
(1995) The use of general primers GP5 and GP6 elongated at their 3' ends with adjacent highly
conserved sequences improves human papillomavirus detection by PCR. J, Gen, Viroỉ, 76, 10571062.
5.
De Roock w ., B. Claes, D, Bemasconi, (2010) Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and

PIK3CA mutations on the effícacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory
metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis Lancet Oncoỉ, 11, 753-762.
6.
Gilbert M. T. p, T. Haselkom, M. Bunce, J. J. Sanchez, s. B. Lucas, L. D. Jewell, E. Van
Marck, M. Worobey (2007) The isolation of acid nucleics from íixed, paraffin-embedded tissueswhicli methods are useful when?, PLoS ONE, 2, e537.
7.
Henle G., Henle w ., AND Horowitz c . A. (1997) Epstein-Barr Virus Spesiíic diagnosis:
Test in Infectious Mononucleosis, HumPathol, 5,551-558.
8.
Herraez-Hemandez E., Preda o ., Alonso s., Pardo R. s., Olmo A. (2013) Detection and
Genotyping of Human Papillomavirus DNA in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens
with the HPV Direct Flow CHIP System, Open Virol J, 7, 91-95.
9.
Macabeo-Ong M., D. G. Ginzinger , N. Dekker , A. McMillan , J. A. Regezi , D. T. Wong
, R. c. Jordan (2002) Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase
chain reaction analyses, Modernpathology, 15, 979-987.
10.
Masuda N., T.Ohnishi, s. Kawamoto, M. Monden & K. Okubo (1999) Analysis of chemical
modification of RNA from formalin-fíxed samples and optimization of molecular biology
applications for such samples”, N/AResearch, 27, 4436-4443.
11.
McSherry E. A., McGoldrick A., Kay E. w ., Hopkins A. M., Gallagher w . M., Dervan p.
A. (2007) Formalin-Fixed Paran-Embedded Clinical Tissues Show Spurious Copy Number
Changes in Array-CGH Proles Cỉin Genet, 72, 441-447.
12.
Niesters HG, Van Esser J., Fries E., Wolthers KC., Comelissen J., Osterhaus AD. (2000)
Development of a real-time quantitative assay for detection of Epstein-Baư virus J, Mỉcrobỉol,, 38,
712-715.
13.
Nguyen T. H., V. Q. Dao, H. N. Nguyen, H. L. Nguyen, T. V. K. Tran, T. V. A. Nguyen

(2014) Efficient puriíĩcation of DNA from blood cells using silica- coated magnetic nanoparticles
and suitable buffers VNU Journaỉ o f Science: Natural Sciences and Technology, 30 (3S), 158-166.
14.
Nguyen MH, Nguyen HN, Nguyen TH, Nguyen TVA, Phan TN, Nguyen BK, Nguyen LT,
Ngirven HL (2017) Synthesis of Si02-Coated Fe3 Ơ4 Nanoparticles Using Ultrasound and Its
Application in DNA Extraction from Formalin-Fixed, Parafin-Embedded Human Cancer Tissues.
Jouraal o f Elec Materỉal, doi: 10.1007/sl 1664-017-5282-6.
.......

..........- -...... ..........

........ ...............

-19-

..............................- —

- - — ........... -


15.
Roddiger s. J., J. Bojunga, V. Klee, M. Stanisch, H. Renneberg, E. Lindhorst, K. H. Usadel,
K. Kusterer, p. M. Schumm-Draeger and R. Kurek (2002) Detection of thyroid peroxidase
mRNA inperipheral blood of patients with malignant and benign thyroid diseases, Journal o f
Molecular Endocrinology, 29, 287-295.
16.
Shi s. R., Datar R„ Liu c „ Wu L„ Zhang z., Cote R. J„ Taylor c. R. (2004) DNA
extraction from archival formalin-fĩxed, paraffm-embedded tissues: heat induced retrieval in
alkaline solution Histochem Cell Bioỉ, 122, 211- 218.
17.

Stéphane M., V. Sébastien, G. Fabie and D. Etienne (2004) Magnetic nanoparticle design for
medical diagnosis and therapy", Journal ofMaterial Chemistry, 14, 2161-2175.
18.
Tanaka K., H. Sonoo, Y. Yamamoto, et al (2000) Changes of expression level of the
differentiation markers in papillary thyroid carcinoma under thyrotropin suppression therapy in
vivo immunohistochemical detection of thyroglobulin, thyroid peroxidase, and thyrotropin receptor
Journal ofSurgical Oncoỉogy, 75, 108-116.
PHẢN III. SẢN PHẨM, CÔNG BỐ VÀ KẾT QUẢ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI
3.1. Kết quả nghiên cún
Yêu cầu khoa học hoặc/và chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật
TT

Tên sản phẩm
Đăng ký

Đạt được

1

01 Quy trình chế tạo và Quy trình đạt yêu cầu về mặt Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa
01 hướng dẫn sử dụng bộ khoa học và kỹ thuật, được học và kỹ thuật, được nghiệm thu
kit tách chiết DNA từ các nghiệm thu bởi hội đồng cấp bởi hội đồng cấp cơ sờ và cấp
ĐHQGHN
tiêu bản cố định mẫu mô cơ sở
Hướng dẫn sử dụng rõ ràng, Hưởng dẫn sử dụng rõ ràng, dễ
ung thư.
thực hiện
dễ thực hiện

2

01 Quy trình chế tạo và
01 hướng dẫn sử dụng bộ
kit tách chiết ARN từ các
tiêu bản cố định mẫu mô
ung thư.

3

Quy trình đạt yêu cầu về mặt
khoa học và kỹ thuật, được
nghiệm thu bởi hội đồng cấp
cơ sở

Quy trình đạt yêu cầu về mặt khoa
học và kỹ thuật, được nghiệm thu
bởi hội đồng cấp cơ sở và cấp
ĐHQGHN

Hướng dẫn sử dụng rõ ràng,
dễ thực hiện

Hướng dẫn sừ dụng rõ ràng, dễ
thực hiện

chiết Lượng ADN tách từ 10-20 Vượt yêu cầu về sổ lượng: tổng
phản mg mô đúc trong khối nến > cộng 15 bộ, trong đó 05 bộ thử
được sử dụng cho thử nghiệm và
250 ng
trưng bày triển lãm; 10 bộ lưu

Trong đó 05 bộ được sử Nồng độ ADN > 5 ng/ịa.1;
dụng cho thử nghiệm và Độ tinh sạch: A 2 6 0 /A 2 8 0 trong mẫu.
Lượng ADN tách từ 10 mg mô
5 bộ lưu mẫu.
khoảng 1,7-2,4
đúc trong khối nến đạt 2-40 ịig;
DNA tinh sạch sử dụng
được để nhân bản đoạn gen nồng độ ADN đạt 20-400 ng/|_il;
đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR. Độ tinh sạch: A 2 6 0 /A 2 8 0 trong
khoảng 1,8-2,2.
Bộ kit được sản xuất theo
Bộ kit đạt yêu cầu về chất lượng
các tiêu chuân cơ sở.
theo tiêu chuẩn cơ sở thiết lập.
10 bộ kit tách
ADN
(100
ứng/bộ).

- 20-


4

(100 phản ứng/bộ)

Lượng ARN tách từ 10-20 Đạt yêu cầu về số lượng: tông
mg mô đúc trong khối nến > cộng 10 bộ, trong đó 05 bộ thử

Trong đó 05 bộ được sử

250 ng

được sử dụng cho thử nghiệm và

dụng cho thử nghiệm và

Nồng độ ARN > 5 ng/ịil;

trưng bày triển lãm; 05 bộ lưu

5 bộ lưu mẫu.

Độ tinh sạch: A2 6 C)/A2 8 0 > 1,8

10 bộ kit tách chiết ARN

ARN tinh sạch sử dụng
được để nhân bản đoạn gen

mẫu.
Lượng ARN tách từ 10 mg mô đúc
trong khối nến đạt 2-20 Jj.g; nồng

đặc hiệu bằng kỹ thuật RT-

độ ARN đạt 20-100 ng/|al; Độ tinh

PCR;

sạch: A2 6 0 /A 2 8 0 trong khoảng 1,9-

Bộ kit được sản xuất theo
các tiêu chuẩn cơ sở.

2,0.
Bộ kit đạt yêu cầu về chất lượng
theo tiêu chuẩn cơ sở thiết lập.

5

Báo cáo kết quả đánh giá

Báo cáo kết quả đánh giá 02 •

Báo cáo kết quả đánh giá

thừ nghiệm 02 loại bộ kit loại kit đã chế tạo so sánh kit MagPure DNA nano kit tương
tạo ra (mục 3 và 4) so với kit thương mại nhập đương và có phần vượt trội về hàm
sánh với các bộ kit nhập ngoại trên 20-30 mẫu/bệnh lượng DNA so với kit thương mại
ngoại tại một số bệnh viện tại 02 bệnh viện

của hãng Thermo Scientiíic và

viện.

Promega trên 20-30 mẫu/bệnh viện
tại Trường ĐH Y Hà Nội và Bệnh
viện QĐTƯ108.
•

Báo cáo kết quả đánh giá

MagPure RNA nano kit gần tương
đương với kit thương mại của hãng
Promega trên 20 mẫu/bệnh viện tại
bệnh viện QĐTU 108.

hữu ích quy trình sản

Đăng ký giải pháp hữu ích Giải pháp hữu ích được chấp nhận
được chấp nhận đơn hợp lệ đơn hợp lệ ngày 23/10/2017, số

xuất kit

tại Cục Sở hữu trí tuệ, Bộ

01 đơn đăng ký giải pháp

đơn 2017-2-00303.

KHCN
01 hợp đồng chuyển giao

Hợp đồng chuyển giao công

• 01 họp đồng chuyển giao công

công nghệ

nghệ được ký kết với mức

nghệ cho công ty ANABIO

kinh phí chuyển giao công

R&D trị giá 50 triệu.

nghệ tối thiểu ban đầu là 30-

• 01 họp đồng dịch vụ kiểm định

50 triệu đồng kèm theo 1-2%

chất lượng sản phẩm với trị giá

doanh số bán sản phẩm hàng

1-2% doanh số bán sản phẩm

năm.

hàng năm.


3.2. H ình thức, cấp độ công bố kết quả

TT

Sản phâm

Tình trạng
(Đã in/ chấp nhận in/ đã nộp
đơn/ đã được chấp nhận đơn
hợp lệ/ đã được cấp giấy
xác nhận SHTT/ xúc nhận
sử dụng sản phẩm)

Ghi địa chỉ 1 Đánh giá
và cảm on
chung
(Đạt,
sự tài trọ'
không
của
đạt)
ĐHQGHN
đúng quy
định

1

Công trình công bô trên tạp chí khoa 1ỌC quôc tê theo hệ thông ISI/Scopus

1.1

Nguyên MH, Nguyen HN, Nguyen
TH, Nguyen TVA, Phan TN,
\lguyen BK, Nguyen LT, Nguyen
-IL (2017) Synthesis of S1 O2 Coated Fe304 Nanoparticles Using

Ultrasound and Its Application in
DNA Extraction from FormalinFixed, Parafin-Embedded Human
Cancer Tissues. Journal o f Elec
Material, doi:10.1007/s 11664-0175282-6 (tạp chí ISI, IF = 1,29)

2

Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đông xuât bản

3

Đăng ký sờ hữu trí tuệ

Đã in

3.1 Kit tách chiêt DNA và/hoặc RNA từ Đã được châp nhận đơn
hợp lệ ngày 23/10/2017,
tiêu bản mô cố định bang íòrmalin
sổ đơn 2017-2-00303
vùi trong paraíin và quy trình sản
xuất kit này
4

Đã ghi và
cảm ơn đúng
quy định

Vượt yêu
cầu

Không có
mục ghi cảm
ơn

Đạt yêu
cầu

Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus

Bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp chí khoa học chuyên ngành
quốc gia hoặc báo cáo khoa học đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Đã ghi và
Đã in
5.1 Nguy en Thi Huy en, Le Duc Linh,
cảm ơn đúng
Pham Thi Thu Huong, Nguyen Minh
quy định
Hieu, Nguyen Hoang Nam, Tran Thi
5

My, Nguyen Hoa Anh, Phan Tuan
Nghia, Nguyen Thi Van Anh (2016'
Development of DNA Extraction Kit
Based on Silica-Coated Magnetic
Nanoparticles for Formalin-Fixec
and
Paraĩin-Embedded
Cancei
Tissues. VNU Journal o f Science.
Naíuraỉ Sciences and Technology,

32,277-285.
-22-

Đạt yêu
cầu


6
Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt hàng của dơn vị sử dụng
6.1 Pham Thi Thu Huong et al. Puriíĩcation of DNA/RNA from íormalin íìxed
paraffĩn embedded tissues using silica-coated magnetic nanoparticles and its
application in diagnostics, Wonkwang University's 70th Celebration Symposium,
13 Oct 2016, Korea. Invited talk.
6.2 Nguyen Thi Van Anh et al. (2017) Magnetic silica-coated nanoparticles for DNA
extraction from FFPE cancer tissues: application in detection of viruses and
biomarker gene mutations. Korean_Vietnam Joint-seminar on Tropical Diseases
and Zoonosis, 15 Dec. 2017, Hanoi. Invited talk.
7
Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính sách hoặc cơ sở
ứng dụng KH&CN
02 bộ kit ứng dụng công nghệ hạt nano từ bọc silica là sản phâm chính của đê tài đã
được chuyển giao công nghệ cho công ty ANABIO R&D. Bên cạnh đó, nhóm tác giả
cũng phối hợp với công ty tạo ra 02 bộ kit theo nguyên lý tương tự nhưng sử dụng
công nghệ màng cột silica của công ty (sản phẩm phụ, không đưa vào báo cáo số
liệu). Tổng cộng có 04 bộ kit được chuyển giao đưa vào sản xuất và thương mại hóa
với tên thương mại
• MagPure FFPE DNA nano kit
• MagPure FFPE RNA nano kit
• AnaPure FFPE DNA nano kit
• AnaPure FFPE RNA nano kit

Vượt yêu
cầu

Vượt yêu
cầu

3.3. Kết quả đào tạo

TT

Họ và tên

Học viên cao học
1 Nguyên Thị Huyên

Công trình công bô liên
Thòi gian và kinh phỉ
quan
tham gia đề tài
Đã bảo vệ
(Sản phẩm KHCN, luận án,
(số tháng/số tiền)
luận văn)
18 tháng, được trả kinh
phí tham gia đề tài
tương đương với 5
tháng.

01 luận văn thạc sĩ, 01

bài báo quốc tế, 01 bài
báo chuyên ngành, 01
giải pháp hữu ích được
chấp nhận đon họp lệ

Bảo vệ
ngày
18/12/2017,
đang chờ
nhận bằng

01 báo cáo khoa học giải
ba poster cấp Trường,
khoá luận tốt nghiệp/01
bài báo khoa học
01 báo cáo sinh viên
nghiên cứu khoa học đạt
giải 3 poster cấp Khoa,
khoá luận tốt nghiệp, 01
giải pháp hữu ích được
chấp nhận đơn hợp lệ

06/2016

Cử nhân và hướng dân nghiên cứu khoa học
1

CN. Lê Đức Linh

6 tháng, không có kinh

phí tham gia

2

CN. Chu Văn Sơn

12 tháng, không có
kinh phí tham gia

- 23 -

06/2017


PHẦN IV. TỎNG HỢP KÉT QUẢ CÁC SẢN PHẨM KH&CN VÀ ĐÀO TẠO CỦA ĐÈ TÀI
TT

Sản phâm

1

Bài báo công bô trên tạp chí khoa học quôc tê theo hệ thông
ISI/Scopus
Sách chuyên khảo được xuât bản hoặc ký hợp đông xuât bản
Đăng ký sở hữu trí tuệ
Bài báo quôc tê không thuộc hệ thông ISI/Scopus
Sô lượng bài báo trên các tạp chí khoa học của ĐHQGHN, tạp
chí khoa học chuyên ngành quốc gia hoặc báo cáo khoa học
đăng trong kỷ yếu hội nghị quốc tế
Báo cáo khoa học kiên nghị, tư vân chính sách theo đặt hàng

của đơn vị sử dụng
Kêt quả dự kiên được ứng dụng tại các cơ quan hoạch định chính
sách hoặc cơ sở ứng dụng KH&CN

2
3
4
5

6
7

8
9

Đào tạo/hỗ trợ đào tạo NCS
Đào tạo thạc sĩ

Sô lượng
đăng ký
0

Sô luọng đã
hoàn thành
01

0
01

0

01

01

01

01 hợp
đồng
CGCN

01 hợp đông
CGCN và 01
thỏa thuận
họp tác

01

01 cao học
bảo vệ ngày
18/12/2017

PHẦN V. TÌNH HÌNH s ử DỤNG KINH PHÍ
Kinh phí đã được thực hiện theo như phê duyệt trong thuyết minh đề tài và các chứng từ đã được
nộp đầy đủ ở phòng kế hoạch tài chính. Các mục chi đã được thực hiện theo như bảng dưới đây:
Kinh phí
đươc duyệt
(triệu đồng)

TT

Nôi dung chi

A
1
2
3
4
5
6
7
8

Chi phỉ trực tiêp
Thuê khoán chuyên môn
Nguyên, nhiên vật liệu, cây con..
Thiêt bị, dụng cụ
Công tác phí
Dịch vụ thuê ngoài
Hội nghị, Hội thảo, kiêm tra tiên độ, nghiệm thu
In ân, Văn phòng phâm
Chi phí khác (xây dựng đê cương, viêt tông
quan tư liệu)
Chi phí gián tìêp
Quản lý phí
Chi phí điện, nước
Tông sô

B
1
2

Kinh phí
thưc hiện
(triệu đồng)

316,0603
262

316,0603
261,225

13,9397
25,5

13,9397
26,275

32,5

32,5

650

650

Ghi chú

PHẰN V. KIẼN NGHỊ (về phát triển các kết quà nghiên cứu cùa đề tài; về quản ỉỷ, tổ chức thực
hiện ở các cấp)
•

•

Tiếp tục thử nghiệm 02 bộ kit với số lượng mẫu lớn hon tại các bệnh viện tuyến Trung
Ương để đánh giá chính xác hơn chất lượng bộ kit (độ tái lặp, độ bền-ổn định...)
Phối họp với công ty ANABỈO R&D đăng ký dự án sản xuất thử nghiệm bộ kit trong các
chương trình KHCN của ĐHQGHN và Bọ KH-CN.
- 24-