Xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Bộ y tế
viện dinh dỡng
ZY


báo cáo tổng kết đề tài

xác định d lợng penicillin g và v
trong thực phẩm bằng phơng pháp
sắc ký lỏng hiệu năng cao



Chủ nhiệm đề tài: ThS. Trần quang thủy














7106
16/02/2009

Hà Nội - 2008
1
MỞ ĐẦU

An toàn vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong công tác bảo vệ sức
khoẻ con người. Trong tiến trình gia nhập WTO, thị trường hàng hoá của Việt nam được
mở rộng, đặc biệt trong lĩnh vực xuất khẩu các mặt hàng nông sản, thuỷ sản. Tuy nhiên,
do việc kiểm soát dư lượng hoá chất kháng sinh có hại đến sức khoẻ người tiêu dùng
chưa được thực hiện nghiêm túc nên một số lô hàng bị thị trường nhập khẩu phát hiện
kháng sinh có hại vẫn còn cao. Tình trạng trên không chỉ gây thiệt hại lớn về kinh tế cho
các doanh nghiệp mà còn ảnh hưởng nghiệm trọng đến uy tín chất lượng hàng Việt nam
trên thị trường thế giới.
Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều
trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh
học. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc
kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép, người sử dụng loại thực phẩm
này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ.
Penicillin là kháng sinh thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với
nhiều loại vi khuẩn. Ban đầu, nó được hoan nghênh như một thứ thuốc thần kì và đã cứu
sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ hai. Mặc dù Penicillin đóng một vai trò
hết sức quan trọng trong việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật,
nhưng việc lạm dụng nó trong chăn nuôi có thể dẫn đến hiện tượng nhờn thuốc, giảm khả
năng kinh tế của vật nuôi, gây thiệt hại cho người chăn nuôi. Hơn thế nữa tồn dư
Penicillin trong sản phẩm chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như: ngộ
độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dung hoặc làm cho người tiêu dung cũng bị
kháng thuốc…
Việc phát triển các kĩ thuật xác định lượng tồn dư Penicillin trong thực phẩm phù
hợp với điều kiện phòng thí nghiệm trong nước sẽ trở thành công cụ

hữu hiệu giúp các cơ
quan chức năng kiểm soát tốt hơn vấn đề đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm.
Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu phương pháp xác định dư lượng Penicillin trong
thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Phương pháp có độ nhạy, độ
chọn lọc và độ chính xác cao.





2
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu về kháng sinh nhóm Penicillin
1.1.1 Đại cương
Năm 1928, Alexander Fleming phát hiện một nấm mốc thuộc giống Penicillium ức
chế sự phát triển của vi khuẩn. Fleming gọi chất kháng khuẩn chưa được biết tới này là
Penicillin. 10 năm sau, một nhóm các nhà khoa học thuộc trường Đại học Oxford bắt
đầu nghiên cứu chất này trên chuột thí nghiệm. Penicillin được hoan nghênh như một
thứ thuốc thần kỳ và đã cứu sống vô số người trong chiến tranh thế giới thứ II [5]
Penicillin là kháng sinh thể hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất mạnh đối với nhiều
loại vi khuẩn. Penicillin được chiết ra từ dịch nuôi cấy nấm Penicillium chrysogenum.
Penicillin lần đầu tiên phát hiện có tác dụng chống vi khuẩn gram dưng Staphylococcus,
Diplococcus nhưng hầu như không có tác dụng chống vi khuẩn gram âm và nấm men.
Vài thập niên trở lại đây đã phát hiện ra nhiều loại pencillin mới trong đó một số có hiệu
quả chống lại vi khuẩn gram âm và nấm men như Saccharomyces cerevisae đơn bội và
E.coli [5]
1.1.2 Phân loại
Pencillin gồm nhiều loại, chúng có cấu tạo
gần giống nhau, bao gồm một vòng tiasolidin, một
vòng β-lactam, một nhóm amino có gắn với CO

2

và một mạch bên (R). Hai loại Penicillin được
tổng hợp đầu tiên là benzylpenicillin(PenicillinG;
R = C
6
H
5
CH
2
-) và Phenoxymethylpenicillin
(PenicillinV; R = C
6
H
5
OCH
2
-). Và một số loại bán
tổng hợp: Amoxycillin, Ampicillin, Oxacillin,
Cloxacillin [5]

Hình 1: Cấu trúc chung của các penicillin
Sự khác biệt rõ ràng giữa các penicillin bao gồm khác biệt trong phổ hoạt động
của chúng. Penicillin trong các muối và các dạng liều khác nhau, ampicillin, và
amoxicillin có hoạt tính chống lại các vi khuẩn hiếu khí gram dương và một số vi khuẩn
kỵ khí. Các chất này dễ bị beta-lactamase phá huỷ và do đó không có hiệu quả chống tụ
cầu và các vi khuẩn kỵ khí sản sinh beta-lactamase. Ampicillin và amoxicillin có hoạt
tính chống lại một số vi khuẩn hiếu khí gram âm. Amoxicillin đã thay thế penicillin V
làm loại penicillin lý tưởng để phòng viêm nội tâm mạc do sinh khả dụng ưu việt của nó.

M
¹
ch bªn
Vßn
g
thiazolindine
Vßng β-lactam
3
1.1.3 Tác dụng của Penicillin
Giống như các họ kháng sinh khác, penicillin có tác dụng kìm hãm hoặc tiêu diệt
vi sinh vật gây bệnh.
Cơ chế tác dụng chung như sau:
Peptidoglycan là thành phần cơ bản tạo nên tính vững chắc của vách tế bào vi
khuẩn. Quy trình tổng hợp peptidoglycan được thực hiện nhờ enzym D-alanin
transpeptidase. Do là axit, các penicillin có khả năng acyl hoá các D-alanin transpeptidase,
làm cho các enzym này không thể tham gia vào quá trình tổng hợp peptidoglycan. Sinh
tổng hợp vách tế bào bị gián đoạn, vi khuẩn không thể tồn tại.
Mặt khác, các penicillin còn hoạt hoá enzym tự phân giải murein hydroxylase làm
tăng phân huỷ vách tế bào vi khuẩn, kết quả là vi khuẩn bị tiêu diệt.
1.1.4 Tác hại của penicillin khi tồn dư trong thực phẩm
Phần lớn các kháng sinh an toàn khi sử dụng đúng. Tuy nhiên dù ít hay nhiều
chúng đều có thể gây ra các tác dụng không mong muốn và tai biến.
Penicillin là kháng sinh ít độc, ít tác dụng không mong muốn, ngoại trừ phản ứng
dị ứng. Các sản phẩm phân huỷ kết hợp với protein tạo thành các kháng nguyên là
nguyên nhân của dị ứng và tuỳ theo cơ địa từng người phản ứng ở mức độ nào.
¾ Những nguyên nhân tồn dư kháng sinh trong thực phẩm như sau:
Một là, có thể nhiễm lẫn vào thức ăn do tiếp xúc với môi trường có chứa kháng sinh và
có thể tồn dư do lỗi kỹ thuật sử dụng thường xuyên kháng sinh trong chăn nuôi
+ Kháng sinh cho vào thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng cho gia súc.
+ Kháng sinh cho vào nước uống để phòng bệnh trong mùa dịch bệnh

+ Kháng sinh cho vào nước uống để chữa bệnh gia súc.
+ Kháng sinh cho thêm vào thức ăn cho gia súc để bảo quản súc sản lâu hư.
+ Kháng sinh tiêm vào súc vật hoặc cho súc vật uống trước khi giết thịt với mục đích kéo
dài thời gian, tránh hư hỏng thịt tươi.
Hai là, có thể cho thẳng vào thực phẩm với mục đích ức chế, tiêu diệt vi sinh vật để bảo
quản thực phẩm. Do vận chuyển sản phẩm đi xa, cho kháng sinh vào thực phẩm để bảo
quản.
Tất cả những nguyên nhân trên làm cho sản phẩm chăn nuôi, thủy sản tồn dư
kháng sinh, có ảnh hưởng không tốt đối với người tiêu thụ.
1.2 Giới thiệu về Penicillin G và Penicillin V
1.2.1 Thông tin chung

4
Bảng1: Thông tin chung về penicillin G và V
Penicillin
(KLPT)
Danh pháp
(IUPAC)
Cấu trúc hóa học pKa
T
1/2

Penicillin G
(334,4)
(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-
oxo-6-[(2-
phenylacetyl)amino]-4-
thia-1-
azabicyclo[3.2.0]heptane-2-
carboxylic acid

2,76
Penicillin V
(350,39)
(2S,5R,6R)-3,3-dimethyl-7-
oxo-6-[[2-
(phenoxy)acetyl]amino]-4-
thia-1-
azabicyclo[3.2.0]heptane-2-
carboxylic acid

2,73
30 -
40
phút
1.2.2 Tính chất và tác dụng
Penicillin G và Penicillin V là hai penicillin tự nhiên thu được từ môi trường nuôi
cấy nấm penicillium chrysogenum.
Chúng được chỉ định trong bệnh nhiễm khuẩn thông thường: nhiễm khuẩn đường
hô hấp, tai mũi họng, nhiễm khuẩn huyết…
Penicillin G và V có độc tính thấp, nhưng cũng giống như các penicillin khác dễ
gây dị ứng thuốc: mẩn ngứa, mày đay, ngoại ban, hội chứng Stevens- johnson và Lyell,
nguy hiểm nhất là shock phản vệ.
Ngoài ra có thể gây viêm t
ĩnh mạch huyết khối, thiếu máu tan máu, giảm bạch cầu.
1.2.3 Tình hình sử dụng Penicillin
Mặc dù thuốc kháng sinh đóng một vai trò hết sức quan trọng trong việc chống lại
nhiều bệnh tật cho con người và các loài gia súc, gia cầm cũng như các loài thủy sinh,
nhưng việc sử dụng bừa bãi trong chăn nuôi có thể gây ra nhiều vấn đề nghiêm trọng như
gây độc, biến đổi hệ vi khuẩn của người tiêu dùng hoặc làm cho người tiêu dùng cũng bị

kháng thuốc.
Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong
chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu Pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh
5
nhóm Lonophore và Arsen chiếm nhiều nhất (47,5%) Tetracycline (15,67%), Penicillin
(4,26%), và các loại khác (32,57%).
Theo một báo cáo của Uỷ ban sử dụng dược phẩm trong thức ăn chăn nuôi trực
thuộc Hội đồng Nghiên cứu Quốc gia( NRC) (Mỹ), thiệt hại do lệnh cấm sử dụng kháng
sinh trong thức ăn chăn nuôi có thể lên tới 2,5 tỷ USD mỗi năm. Tổ chức Y tế Thế giới
(WHO) đã cảnh báo những hiểm hoạ mà loài người có thể phải đối mặt do sự kháng
kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh gây ra và WHO đang thúc đẩy một chương trình
khuyến cáo tất cả các nước tiến tới cấm hoàn toàn việc sử dụng kháng sinh như chất kích
thích sinh trưởng.
Tại Việt Nam, theo kết quả điều tra sơ bộ của Viện khoa học Kỹ thuật Nông
nghiệp Việt Nam cho thấy: có tới 75% số mẫu thịt và 66,7% số mẫu gan của gia súc, gia
cầm bán ở các chợ có mức tồn dư kháng sinh vượt ngưỡng cho phép.
1.2.4 Giới hạn cho phép
Trước tình hình các chất kháng sinh được sử dụng tràn lan dẫn đến tồn dư trong
thực phẩm có nguy cơ gây hại cao cho sức khỏe người tiêu dùng, nhiều nước trên thế giới
đã đưa ra giới hạn cho phép của dư lượng penicillin trong các loại thực phẩm như sau:
Bảng 2: Giới hạn cho phép tồn dư penicillin G và V trong thực phẩm
Quốc gia EU
Việt nam [6]
(46/2007/QĐ-BYT)
TCN thuỷ
sản
Sũa
Gan,
bầu
dục

Thịt Thịt Gan Thận Sũa
Penicillin G
(ppb)
4 50 50 50 50 50 4
50
Thịt
Penicillin V
(ppb)
25

1.3 Các phương pháp xác định Penicillin
1.3.1 Trong nước
Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5147-90 [9] đã qui định phương pháp gián tiếp sử
dụng quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS xác định Penicillin tổng số trong thịt và sản
phẩm thịt, dùng làm thực phẩm cho người và thức ăn gia súc. Phương pháp này dựa vào
phản ứng tạo phức đặc trưng và hoàn toàn định lượng của cadimi với thuốc thử
phenaltrolin-cadimi sinh ra phức bền. Chiết phức này bằng nitrobenzen và đo phổ hấp thụ
6
nguyên tử AAS của kim loại cadimi trong phức ở pha hữu cơ, hay phân hủy pha hữu cơ
lấy cadimi vào dung dịch HCl 1% và đo phổ của cadimi. Phương pháp này phức tạp,
không đặc trưng và chỉ xác định được lượng tổng Penicillin.
Tiêu chuẩn ngành thuỷ sản TCN 197-2004 [8] qui định phương pháp định lượng
Penicillin trong sản phẩm thuỷ sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. Penicillin trong sản
phẩm thuỷ sản được tách ra khỏi n
ền mẫu bằng dung dịch đệm phosphat, pH 9, làm sạch
và cô đặc dịch chiết trên cột Bond Elut C18, dẫn xuất hoá và định lượng bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao với detector PDA. Qui trình này trải qua quá trình dẫn xuất phức tạp và
mới chỉ dừng lại ở phạm vi thuỷ sản.
1.3.2 Thế giới
a) Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC/MS

Tác giả Titus A.M.Msagati [13] và cộng sự đã xác định dư lượng các β
-lactam
trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng - khối phổ. Các tác giả đã chiết và làm sạch mẫu sử
dụng hỗn hợp đệm phosphat, tetraethylammonium clorua Et
4
NCl và acetonitril. Sau đó,
các β-lactam sẽ được tách và định lượng bằng sắc ký lỏng khối phổ chế độ ion dương
(LC-PI-ESI-MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp này đối với Penicillin G và
penicillin V trong gan và bầu dục là 1 ng/kg ; trong sữa là 0,7 µg/L.
b) Phương pháp sắc ký lỏng cặp ion với detector UV
Tác giả Yuko Ito [14] và cộng sự thuộc Viện sức khỏe cộng đồng (Nhật Bản) đã
ứng dụng kĩ thuật làm sạch qua cột trao đổi ion để xác định 6 penicillin: Penicillin G,
Penicillin V, Oxacillin, Cloxacillin, Nafcillin, và dicloxacillin trong thịt. Các penicillin
được chiết ra khỏi nền mẫu thịt lợn với nước, nền mẫu thịt bò với NaCl 2%, làm sạch
qua cột chiết pha rắn trao đổi ion và xác định bằng sắc ký lỏng cặp ion với detectơ tử
ngoại. Hiệu suất thu hồi của phương pháp từ 73 - 95%. Giới hạn phát hiện của phương
pháp cho các penicillin là 0,02 mg/kg.
c) Phương pháp sắc ký lỏng hiệu nă
ng cao
Tác giả E.Benito-Pena [11] và cộng sự thuộc trường đại học Madrid (Tây Ban
Nha) đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại – diot
aray (UV-DAD) để xác định đồng thời các kháng sinh nhóm beta-lactam (Penicillin G,
amoxicillin, ampicillin, Penicillin V, axacillin, dicloxacillin, và nafcillin) trong nước thải.
Hai kĩ thuật SPE được so sánh cho quá trình làm sạch và làm giàu mẫu: cột silica pha đảo
C18 và cột trao đổi anion hỗn hợp MAX. Các penicillin được định lượng bằng sắc ký
lỏng sử dụng cột tách C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện với detectơ tử
ngoại tại bước sóng 220nm. Cột MAX cho hiệu suất thu hồi cao hơn, nằm trong khoảng
82 – 97% và giới hạn phát hiện từ 8 – 24 ng/L
7
Tác giả Lambert K. Sorensen [12] và cộng sự ( Đan Mạch ) đưa ra quy trình xác

định đồng thời 7 penicillin trong thịt, gan, bầu dục gia súc và lợn bằng phương pháp
HPLC. Các penicllin được tách ra khỏi mẫu bằng H
2
O, loại các tạp chất hữu cơ với hỗn
hợp acid sulphuric và natri tungstat. Dịch chiết được làm sạch qua cột chiết pha rắn Oasis
HLB, được dẫn xuất hoá với anhydric benzoic, 1, 2, 4 - triazole và HgCl
2
. Các penicillin
được tách và định lượng trên cột C18, chương trình rửa giải gradient và phát hiện bằng
detectơ tử ngoại tại bước sóng 323nm. Giới hạn phát hiện LOD của phương pháp là từ
8,9-11,1 µg/kg đối với amoxicillin, penicillin G, ampicillin, oxacillin, nafcillin và 18,3-
20,9 µg/kg cho đicloxacillin.
8
CHƯƠNG II
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
Trong chăn nuôi hiện nay, vấn đề sử dụng thuốc kháng sinh (trong thức ăn, điều
trị bệnh gia súc, gia cầm) là rất phổ biến và được coi là một tiến bộ của công nghệ sinh
học, nhằm làm vật nuôi mau lớn. Thế nhưng, việc tuỳ tiện sử dụng thuốc kháng sinh dễ
dẫn đến hậu quả: Lượng thuốc kháng sinh tồn dư trong sản phẩm vượt ngưỡng cho phép,
người sử dụng loại thực phẩm này trong thời gian dài có thể gây nguy hại cho sức khoẻ.
Mục tiêu của đề tài là: Xây dựng được phương pháp xác định penicillin G và V với độ
nhạy và độ chính xác cao. Phân tích một số mẫu thực tế để thẩm định lại qui trình.
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Việc phát triển các kỹ thuật xác định dư lượng penicillin G và V trong thực phẩm
là rất cần thiết giúp cho các cơ quan chức năng kiểm soát tốt hơn việc sử dụng kháng sinh
trong chăn nuôi. Để phù hợp với điều kiện của hầu hết các phòng thí nghiệm trong nước,
chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại để
phát hiện và định lượng penicillin G và V. Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt

dưới đây:
2.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC
Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha
động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn)[4].Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới
dạng dung dịch. Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa
pha động và pha tĩnh. Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất
lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha
động khác nhau. Do v
ậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau

Hình 2: Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC
9
Cũng như tất cả các thiết bị sắc ký khác, thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần
chính:
- Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích.
- Phần tách: là phần trung gian của hệ sắc ký bao gồm cột tách, đôi khi có cột phụ
trợ.
- Phần phát hiện và xử lí số liệu: phần này bao gồm các detector, phần khuếch đại,
computer và phần mềm xử lí số liệu, bộ phận ghi tín hiệu.
• Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc
ký lỏng pha liên kết; sắc ký trao đổi ion; sắc ký cặp ion, sắc ký điện di mao quản;
sắc ký phân bố lỏng-lỏng; sắc ký rây phân tử Phương pháp được sử dụng rộng
rãi nhất là sắc ký lỏng pha liên kết.
2.2.2 Phân tích định tính và dịnh lượng trong HPLC
Một trong các đại lượng đặc trưng cho sự tách sắc ký của các chất trong một hệ
pha đã chọn là thời gian lưu của các chất. Nghĩa là trong một hệ pha và trong các điều
kiện tách HPLC đã chọn thì mỗi chất phân tích sẽ có thời gian lưu khác nhau và cố định.
Chính đại lượng này là một tính chất hay thông số để định tính các chất trong một hỗn
hợp mẫu.
Vì vậy, sau khi đã chọn được các điều kiện tối ưu cho quá trình sắc ký, tiến hành

ghi sắc đồ của mẫu phân tích, và xác định thời gian lưu của từng pic ứng với mỗi chất
trong sắc đồ. Sau đó so sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu của chất
chuẩn, từ đó sẽ xác định được trong mẫu phân tích có những chất nào.
Trong HPLC có thể dùng một trong 2 phương pháp là phương pháp đường chuẩn
hoặc phương pháp thêm tiêu chuẩn để định l
ượng. Việc dùng phương pháp nào trong hai
phương pháp đó tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất phân tích
H
i
= k
1.
C
i

S
i
= k
2
. C
i

H
i
, S
i
là chiều cao pic và diện tích pic tương ứng của chất i
C
i
là nồng độ chất i
K

1
, k
2
là các hằng số thực nghiệm
Phương pháp đường chuẩn có ưu điểm là có thể phân tích hàng loạt mẫu của cùng
một đối tượng, nhanh, đơn giản, dễ làm. Tuy nhiên khi thành phần mẫu phân tích phức
tạp, việc pha dung dịch chuẩn để phù hợp với mẫu phân tích về thành phần nền, thành
10
phần hoá học và vật lý dễ mắc sai số lớn. Trong trường hợp này để loại trừ ảnh hưởng
của nền, người ta dùng phương pháp thêm tiêu chuẩn.
2.3. Hoá chất dụng cụ dùng trong nghiên cứu
2.3.1 Dụng cụ
- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detectơ PDA hoặc UV-VIS
- Cột sắc ký C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)
- Hệ chiết pha rắn
- Cột chiết pha rắn Strata X-polymeric (500mg, 6ml)
- Máy cất quay chân không
- Máy lắc vortex
- Máy li tâm
- Máy đồng nhất mẫu
- Máy đo pH
- Bể điều nhiệt
- Cân phân tích điện tử (độ chính xác 0,00001g)
- Cân phân tích (độ chính xác 0,0001g)
- Cân kĩ thuật (độ chính xác 0,01g)
- Cốc có mỏ các loại dung tích 50, 100, 250 ml
- Bình định mức thuỷ tinh các loại dung tích 10, 20, 100 ml, 1 lít và 2 lít
- Vial loại 1,8 ml
- Pipetman loại 200, 1000 ml và đầu tuyp.
- Ống li tâm dung tích 50 ml.

2.3.2 Hoá chất
Các loại hóa chất dùng trong phương pháp đều thuộc loại tinh khiết phân tích
- Chuẩn Benzyl penicillin (Penicillin G) (từ Sigma) Penicillin G sodium salt
(C
16
H
17
N
2
NaO
4
S)
- Chuẩn phenoxymetyl penicillin Kali (Penicillin V) (viện kiểm nghiệm thuốc trung
ương) C
16
H
17
KN
2
O
5
S (98,90%)
- Acetonitril
11
- Methanol
- Natri tungstat
- Thuỷ ngân (II) clorid
- 1,2,4- triazole
- Natri thiosulfat
- Natri hydroxid

- Natri clorid
- Kali dihydro photphat
- Dikali hydro photphat
- Acid sulfuric
2.3.3 Chuẩn bị dung dịch chuẩn và dung dịch thử
2.3.3.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin G
- Dung dịch chuẩn gốc Penicillin G 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin G, hoà
tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml.
- Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin G 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn
gốc penicillin G 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng
nước cất.
2.3.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn Penicillin V
- Dung dịch chuẩn gốc Penicillin V 1000mg/l: cân chính xác 0,1g chuẩn Penicillin V, hoà
tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml.
- Dung dịch chuẩn trung gian Penicillin V 10 mg/l: hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn
gốc penicillin V 1000 mg/l cho vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng
nước cất.
2.3.3.3 Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc của 2 penicillin 2µg/ml: hút chính xác 1ml
dung dịch chuẩn trung gian 10 mg/l của mỗi penicillin vào bình định mức 5ml và định
mức
đến vạch bằng nước cất
Các dung dịch chuẩn penicillin được bảo quản lạnh (nhiệt độ 2 – 4
o
C), tránh ánh sáng.
2.3.3.4 Đệm photphat 0,1M pH 6.5
Cân 7,98 gam K
2
HPO
4
.3H

2
O; 8,84 gam KH
2
PO
4
và 3,89 gam Na
2
S
2
O
3
. Hoà tan hỗn hợp
trên vào nước và chuyển vào bình định mức 1000 ml, định mức đến vạch bằng nước cất.
2.3.3.5 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký.
12
- Kênh A: Lấy 240ml acetonitril, 60 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và định
mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5.
- Kênh B: Lấy 300ml acetonitril và 200 ml metanol cho vào bình định mức 1000 ml và
định mức đến vạch bằng đệm photphat pH 6,5.
2.3.3.6 Chuẩn bị dung dịch Natri tungstat 0,68M
Cân 22,43 gam Na
2
WO
4
.2H
2
O, hoà tan và định mức bằng nước cất đến 100 ml.
2.3.3.7 Chuẩn bị dung dịch acid sulfuric 0,68M
Hút 3,8 ml dung dịch H
2

SO
4
đặc vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng
nước cất
2.3.3.8 Chuẩn bị dung dịch đệm photphat 25mM, pH 9
Cân 0,34 gam KH
2
PO
4
, hoà tan vào nước. Chỉnh đến pH 9 bằng NaOH 5M; 0,5M. Sau
đó chuyển vào định mức 100ml và định mức đến vạch bằng nước cất.
2.3.3.9 Chuẩn bị dung dịch HgCl
2
0,1M
Cân 0,2715 gam HgCl
2,
hoà tan và định mức bằng nước cất đến 10ml.
2.3.3.10 Chuẩn bị dung dịch dẫn xuất
Cân 13,78 gam 1,2,4 – triazol, thêm vào 60 ml H
2
O và 10ml HgCl
2
0,1M. Dùng NaOH
0,5 M chỉnh đến pH 9,0 ± 0,05. Sau đó chuyển sang bình định mức 100ml và định mức
đến vạch bằng nước cất. Để yên 24 giờ trước khi sử dụng.
Bảo quản trong bình màu nâu. Chỉ sử dụng phần dịch trong phía trên.

13
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Tối ưu các điều kiện xác định penicillin G và V bằng HPLC
3.1.1 Chọn bước sóng phát hiện
Detectơ là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp.
Penicillin G và V hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn
detectơ PDA để phát hiện và định lượng 2 penicillin này. Tham khảo tài liệu [11] với các
điều kiện sau:
- Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)
- Detectơ PDA: 220nm
- Nhiệt độ buồng cột: 35
o
C
- Tốc độ dòng: 1,5ml/phút
- Pha động: A: H
2
O (0,01% TFA); B: ACN (0,01% TFA) với chương trình gradient:
Bảng 3: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (không dẫn xuất)
Thời gian %A %B
0 100 0
3 100 0
8 63 37
19 63 37
20 100 0
25 100 0
Bơm hỗn hợp chuẩn 2 penicillin: PenG 25ppm, PenV 56ppm thu được sắc đồ sau:
Minutes
0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0 25 50 75 100
mA
U
0
25
50
75
100
PenG 13.643 435014 35626
PenV 15.083 1498533 90893

Hình 3: Sắc đồ chạy chuẩn PenG 25ppm – Pen V 56ppm (không dẫn xuất)
14
Bơm mẫu thịt lợn thêm chuẩn thu được sắc đồ sau:
Minutes
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
mAU
0
20 40
mA
U
0
20
40
PenG 13.824 57738 4211
PenV 15.339 87391 7740

Hình 4: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn
(thêm chuẩn ở mức 1mg/kg đối với Pen G và 2,2mg/kg đối với Pen V) (không dẫn xuất)
Có thể sử dụng detectơ PDA tại bước sóng 220nm để xác định các penicillin. Tuy
nhiên giới hạn phát hiện của phương pháp này không cao (LOD ~ 2ppm). Mặt khác, có
rất nhiều chất hấp thụ tại vùng bước sóng 220nm, nên sắc đồ thu được chứa nhiều tạp
chất gây khó khăn cho việc phát hiện và định lượng chất phân tích. Tức là phương pháp
này có độ nhạy và độ chọn lọc kém. Do vậy, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp dẫn xuất
hoá các penicillin để mở rộng vùng bước sóng UV làm tăng độ chọn lọc của phương
pháp, giảm tối đa ảnh hưởng độ hấp thụ của nền mẫu. Tác nhân dẫn xuất được sử dụng ở
đây là hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid. Sản phẩm của quá trình dẫn xuất
hấp thụ cực đại tại bước sóng 225nm và 323nm. Chúng tôi lựa chọn bước sóng 323nm để
phát hiện và định lượng các penicillin.

Hình 5: Sắc đồ 3D của hỗn hợp chuẩn Penicillin G 0,4ppm – Penicillin V 0,8ppm.
15
3.1.2 Chọn pha động
Sau pha tĩnh thì pha động là yếu tố thứ hai quyết định đến hiệu quả tách sắc ký.
Nhìn chung, pha động có thể ảnh hưởng đến: độ chọn lọc của hệ pha, thời gian lưu trữ,
hiệu lực của cột tách, độ phân giải, độ rộng của pic sắc ký.
Trong HPLC, pha động phân cực được sử dụng phổ biến với thành phần chủ yếu
là n
ước mang lại tính kinh tế cao. Để tách 2 penicillin ra khỏi các chất cản trở trong nền
mẫu và định lượng nó một cách dễ dàng và chính xác, pha động sử dụng phải phân cực.
Để đảm bảo sự ổn định của kết quả, đặc biệt là thời gian lưu, chúng tôi sử dụng hệ đệm.
Hệ đệm được lựa chọn ở đây là đệm photphat 0,1M; pH 6,5. Khảo sát chương trình pha
động trên 3 kênh:
A: Đệm photphat 0,1M; pH 6,5; B: ACN; C: MeOH
C
ố định các điều kiện:
- Cột Symmestry waters C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)

- Detectơ: PDA 323nm
- Nhiệt độ buồng cột: 40
o
C
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm.
Khảo sát các thành phần pha động khác nhau, thu được kết quả sau:
Bảng 4: Ảnh hưởng của thành phần pha động đến thời gian lưu của 2 penicillin.
Thành phần pha
động
Kết quả
%A %B %C Thời gian lưu của Pen G (phút) Thời gian lưu của Pen V (phút)
90 0 10 Không tìm thấy Không tìm thấy
65 35 0 2,581 2,869
70 20 10 Không rõ Không rõ
60 30 10 3,669 4,107
60 25 15 4,843 5,440


16
Minutes
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
mAU
0 5 10
mAU
0
5
10
3.669 57621

4.107 33212
1: 323 nm, 8 nm
Pens
std mix 200_60-30-10.dat
Name
Retention Time
Area

Hình 5: Sắc đồ chạy chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
tại thành phần pha động A: B: C = 60 : 30 : 20
Từ bảng kết quả trên, chúng tôi nhận thấy, với chế độ chạy isocractic: nếu thành
phần pha động chỉ gồm đệm photphat và MeOH thì chất phân tích không được rửa giải;
nếu thành phần pha động chỉ gồm đệm photphat và ACN thì thời gian lưu của 2 penicillin
thấp và chúng không tách khỏi nhau được. Thành phần pha động có cả đệm photphat,
ACN và MeOH với các tỉ lệ khác nhau thì thời gian lưu có cao hơn nhưng khả năng tách
của 2 chất ra khỏi nhau vẫn chưa tốt. Do vậy, chúng tôi sử dụng chế độ gradient với
chương trình rửa giải như sau:
A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200
Bảng 5: Chương trình gradient rửa giải các penicillin (dẫn xuất)
Thành phần pha động
Thời gian (phút)
%A %B
0 100 0
20 0 100
21 100 0
25 100 0

Ban đầu, giữ ổn định ở 100%A. Từ 0-20 phút, thành phần pha động thay đổi
tuyến tính từ 100%A đến 100%B. Trong khoảng thời gian này, chất phân tích được rửa

giải. Đến 21 phút, quay trở lại 100%A. Từ 21-25 phút, duy trì ổn định ở 100%A. Đây là
thời gian ổn định và hoạt hóa cột để chạy mẫu tiếp theo.
17
Minutes
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18
mAU
0 1 2 3
mA
U
0
1
2
3
PenG 8.512 53587 2414
PenV 9.557 24359 1225

Hình 6: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
(chương trình rửa giải gradient)
3.1.3 Chọn cột tách
Cột tách là trung tâm của phép tách sắc ký. Penicillin G và V có tính phân cực,
pha động phân cực. Do vậy, cột tách sử dụng phải là cột pha đảo. Phù hợp với điều kiện
của phòng thí nghiệm, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát trên một số loại cột
C18. Cố định các điều kiện sau:
- Pha động: chương trình gradient như trên
- Detectơ: PDA 323nm
- Nhiệt độ buồng cột: 40
o
C
- Tốc độ dòng: 1ml/phút

- Mẫu phân tích: dung dịch chuẩn hỗn hợp 2 penicillin 0,4ppm

Thu được các kết quả sau:
Minutes
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
mAU
1 2 3
mAU
1
2
3
PenG 8.309 28513 1385
PenV 9.461 22263 1022

Hình 7: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
(cột Symmestry waters: 150mm × 4,6mm × 5µm)
18
Minutes
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
1 2 3 4
mAU
1
2
3
4
PenG 12.640 45263
PenV 14.016 34526

Hình 8: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
(cột Symmestry waters: 250mm × 4,6mm × 5µm)
Minutes
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
mAU
0 2 4 6
mA
U
0
2
4
6
4.032 55994 4502
4.427 35132 2492

Hình 9: Sắc ký đồ chuẩn hỗn hợp 2 penicillin nồng độ 0,4ppm
(cột ODS: 150mm × 4,6mm × 5µm)
Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy, cột Symmestry waters phù hợp để tách và
định lượng penicillin G và penicillin V. Sử dụng cột với chiều dài 250mm thời gian lưu
được kéo giãn và khả năng tách cũng tốt hơn. Do vậy, chúng tôi lựa chọn cột tách với các
thông số như sau:
- Loại cột: Symmestry waters C18
- Chiều dài cột: 250mm
- Đường kính cột: 4,6mm
- Cỡ hạt: 5µm
Tuy nhiên, hiện nay có rất nhiều loại cột với cỡ hạt và đường kính cột nhỏ hơn, khả năng
tách của chất phân tích sẽ tốt hơn. Một số tài liệu [12] đã sử dụng loại cột C18 (150mm ×
3,9mm × 4µm ).
Tóm lại, các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký là:

- Cột Symmestry waters C18 (250mm × 4,6mm × 5µm)
- Pha động: chương trình gradient
A: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 700 : 240 : 60
B: đệm photphat 0,1M, pH 6,5 : ACN : MeOH = 500 : 300 : 200
19
Thành phần pha động
Thời gian (phút)
%A %B
0 100 0
20 0 100
21 100 0
25 100 0

- Detectơ: PDA 323nm
- Nhiệt độ buồng cột: 40
o
C
- Tốc độ dòng: 1ml/phút

3.2 Tối ưu hoá các điều kiện xử lí mẫu
Nguyên tắc: Penicillin G và V được tách ra khỏi nền mẫu bằng nước cất, loại các
tạp chất hữu cơ bằng hỗn hợp acid sulphuric và natri tungstat, làm sạch qua cột chiết pha
rắn SPE, dẫn xuất với hỗn hợp 1,2,4-triazole và thuỷ ngân (II) clorid, phát hiện và định
lượng bằng săc ký lỏng hiệu năng cao với detectơ tử ngoại.

QUY TRÌNH DỰ KIẾN CHIẾT PENICILLIN G VÀ V

20

5ml đ

ệ
m
p
hot
p
hat 25mM
Mẫu (~5g)/ống li tâm 50ml
+ 20ml H
2
O
+ 2ml H
2
SO
4
0,68M
+ 2ml Natri tun
g
stat 0
,
68M
Lắc vortex, để yên 5 phút
Đồng nhất
Lọc / bình nón 50ml
Li tâm 6000 v/ph, 5 phút
bã
Chỉnh đến pH phù hợp
SPE
ho
ạ
t hoá

Rửa giải bằng 10ml ACN/bình cất quay
HPLC
Rung siêu âm ở 55
o
C, 30 phút
Cô quay đến cạn, 40
o
C
+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9
+ 500µL hỗn hợp dẫn xuất
3ml MeOH
3ml H
2
O
r
ửa
t
ạ
p
Hút khô 1 phút
21
3.2.1 Khảo sát cột chiết pha rắn SPE
Khảo sát hiệu lực chiết penicillin G và V trên hai loại cột: cột SPE C18 và cột
SPE Polymeric. Sử dụng nền mẫu thịt lợn không phát hiện penicillin, thêm cùng một mức
chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg , mỗi loại cột làm lặp 3 lần. Tiến hành phân tích
như qui trình trên, tiêm vào hệ thống HPLC và lấy kết quả trung bình:
Bảng 6: Ảnh hưởng của loại cột SPE đến hiệu lực chiết các penicillin
Loại cột SPE
Diện tích Pen G
(mAU)

Diện tích Pen V
(mAU)
Polymeric 13422 6530
C18 9882 4870

Minutes
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0 1 2
mAU
0
1
2
PenG 12.800 12964
PenV 14.208 6003

Hình 10: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn thêm chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg
(sử dụng cột Polymeric)
Minutes
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0 1 2
mAU
0
1
2
PenG 12.779 9287
PenV 14.165 4877

Hình 11: Sắc đồ chạy mẫu thịt lợn thêm chuẩn: PenG 40mg/kg, Pen V 60mg/kg
(sử dụng cột C18)
Về bản chất, hai loại cột này khác nhau không nhiều, chúng đều là cột pha đảo. Cột C18
bao gồm các gốc C18 gắn trên bề mặt của silica. Cột Polymeric bao gồm các mạch
polime gắn lên bề mặt silica. Tuy nhiên, với cấu tạo của Penicillin G và V, cột Polymeric
22
có khả năng lưu giữ tốt hơn do lực tương tác Vandevan mạnh hơn. Do đó, làm sạch mẫu
sử dụng cột Polymeric cho nền mẫu sạch hơn và hiệu quả chiết tốt hơn.
3.2.2 Khảo sát pH của dịch chiết trước khi qua SPE
pH của dịch chiết trước khi qua SPE ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết
các penicillin. Sau khi li tâm, pH của dịch chiết nằm trong khoảng 4 – 5. Chúng tôi tiến
hành khảo sát ảnh hưởng của pH trong khoảng 4 – 11. Sử dụng mẫu thịt lợn không phát
hiện penicillin, thêm cùng một nồng độ chuẩn: Pen G 50mg/kg, Pen V 200mg/kg, tại mỗi
mức làm lặp 3 lần và lấy kết quả trung bình thu được bảng sau:
Bảng 7: Ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết qua SPE
pH 4,4 6,43 7,71 8,23 8,56 9,15 10,01 11,07
Diện tích
pic PenG
(mAU)
14902 15039 17596 18853 19563 17755 13493 5236
Diện tích
pic PenV
(mAU)
23225 26534 30868 31859 32785 31396 25267 15334

Vẽ đồ thị mối quan hệ giữa diện tích pic penicillin G và V vào pH thu được đồ thị sau:
0
5000
10000
15000

20000
25000
30000
35000
4681012
pH
area

Hình 12: Đồ thị sự ảnh hưởng của pH đến hiệu quả chiết qua SPE
Từ các kết quả trên chúng tôi nhận thấy, trong khoảng nồng độ pH từ 8-9, hiệu quả chiết
đạt giá trị cực đại, giảm ít khi pH < 8 và giảm mạnh khi pH > 9. Điều này có thể giải
thích như sau: trong môi trường acid, nhóm –OH trên các penicillin kết hợp với H
+
tạo
thành dạng cation, độ phân cực tăng, khả năng lưu giữ trên cột polymeric giảm (nên bị
mất trong quá trình nạp mẫu hoặc rửa tạp). Mặt khác, penicillin G kém bền trong môi
trường pH thấp. Nó tồn tại không quá 5 phút ở môi trường pH < 3 [12]. Trong môi trường
bazơ, các penicillin ở dạng nguyên thể với độ phân cực kém và tương tác tốt hơn với cột
polymeric. Tuy nhiên, nếu môi trường bazơ quá mạnh, các penicillin dễ bị phân huỷ và
hiệu l
ực của cột SPE cũng giảm. Do đó hiệu suất chiết giảm đáng kể. Cũng từ đồ thị trên
23
nhận thấy, tương tác giữa penicillin G và penicillin V với cột SPE khá giống nhau. Một
số tài liệu đã sử dụng penicillin V làm nội chuẩn khi xác định các penicillin khác.
Minutes
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
mAU
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
mAU
0.5

1.0
1.5
2.0
2.5
PenG 13.269 15596
PenV 14.709 26868

Hình 13: Sắc đồ mẫu thịt lợn thêm chuẩn Pen G 50mg/kg, Pen V 200mg/kg
(điều chỉnh pH = 6,43 trước khi qua SPE)

QUY TRÌNH CHIẾT PENICILLIN G VÀ V TRONG THỰC PHẨM
24
Mẫu (~5g)/ống li tâm 50ml
+ 20ml H
2
O
+ 2ml H
2
SO
4
0,68M
+ 2ml Natri tun
g
stat 0
,
68M
Lắc vortex, để yên 5 phút
Đồng nhất
Lọc / bình nón 50ml
Li tâm 6000 v/ph, 5 phút

bã
Chỉnh pH = 8 – 9 với NaOH 4N, NaOH 0,4N
SPE
ho
ạ
t hoá
Rửa giải 10ml ACN/bình cất quay
HPLC
Bề điều nhiệt 55
o
C, 30 phút
Cô quay đến cạn, 40
o
C
+ 500µL đệm photphat 25mM, pH 9
+ 500µL hỗn hợp dẫn xuất
3ml MeOH
3ml H
2
O
5ml đ
ệ
m
p
hot
p
hat 25mM
r
ửa
t

ạ
p
Hút khô 1 phút