Phân lập và tuyển chọn chủng pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

--------------------------

NGUYỄN HUYỀN TRANG

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG
PSEUDOMONAS SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG
VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội – 2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN
SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

---------------------------

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG PSEUDOMONAS
SP. SINH HOẠT CHẤT KHÁNG VIBRIO SP. GÂY BỆNH Ở
TÔM NUÔI

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên

ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN CHÍ THUẬN Học
viên:

NGUYỄN HUYỀN TRANG

Hà Nội – 2014


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS. Nguyễn Chí Thuận Trưởng phòng Công nghệ Phôi - Viện Công nghệ Sinh học đã tận tnh hướng dẫn
và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoàng Uyên, người đã giúp đỡ và tận
tnh chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới phòng Đào tạo - Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật, trường Đại học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ
Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi
hoàn thành luận văn này.
Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã
tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất và tnh thần để tôi có thể
hoàn thành bản luận văn này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 15 tháng 12 năm 2014
Học viên

Nguyễn Huyền Trang


Bảng chữ viết tắt
APW

Alkaline Pepton Water

bp

Base pair

CFU

Colony-Forming Unit

DNA

Deoxyribonucleic acid

IPTG

isopropyl-β-D-thiogalactoside

kb

Kilobase pair

LB

Luria - Bertani

NB

Nutrient broth

PCA

phenazine - 1carboxylic

PCN

Pyocyanin

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

SAM

S-adenosylmethionine

TCA

Trichloroacetic acid

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β galactosidase


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU................................................................................................................... 4
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 6
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .........................................
6
1.1.1. Phân loại........................................................................................................
6
1.1.2 Đặc điểm ........................................................................................................
7
1.1.3. Cấu trúc gen ..................................................................................................
9
1.1.4. Phương pháp xác định vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa .......................
10
1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống...........................................
10
1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn ...............................
10
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa ....................................
11
1.2. Hoạt chất pyocyanin.......................................................................................

12
1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen ..........................................
12
1.2.2.Hoạt tính kháng khuẩn của pyocyanin ........................................................
13
1.2.3. Ứng dụng của hoạt chất pyocyanin ............................................................
14
1.3.Tổng quan về Vibrio sp. gây bệnh ở tôm nuôi............................................... 15
1


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ 1.3.1.Đặc điểm phân loại chủng Vibrio sp gây bệnh trên tômTrang
nuôi .....................

15
1.3.2 Bệnh do vi khuẩn Vibrio sp gây ra trên tôm................................................ 15
1.3.2.1. Lịch sử phát triển bệnh:.........................................................................
15
1.1.2.2 Đặc điểm dịch tễ.....................................................................................
17
1.3.3. Các phương pháp phòng ngừa và điều trị ...................................................
18
1.3.2.1. Biện pháp phòng bệnh tổng hợp ...........................................................
18
1.3.2.2. Điều trị...................................................................................................
19
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................................... 21
2.1 Vật liệu nghiên cứu..........................................................................................

21

2


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................
21
2.1.2 Thiết bị .........................................................................................................
21
2.1.3 Hóa chất .......................................................................................................
22
2.1.3.1 Hóa chất sử dụng cho vi sinh: ................................................................
22
2.1.3.2. Hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử:.............................................
24
2.2 Phương pháp nghiên cứu................................................................................
25
2.2.1. Phương pháp vi sinh ...................................................................................
25
2.2.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn trên môi trường King A..................... 25
2.2.1.2 Phương pháp nhuộm tế bào quan sát hình thái của vi khuẩn.................
26
2.2.1.3 Phương pháp xác định hoạt tnh enzyme của vi khuẩn..........................
26

2.2.1.4. Phương pháp lập kháng sinh đồ ............................................................
27
2.2.1.5. Phương pháp xác định mật độ vi khuẩn:...............................................
27
2.2.1.6. Phương pháp tách chiết và xác định sắc tố pyocyanin - PCN [32]....... 28
2.2.1.7. Phương pháp xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh
khối và nồng độ hoạt chất của vi khuẩn
..................................................................... 28
2.2.1.8. Phương pháp xác định khả năng kháng Vibrio sp: ............................... 28
3


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ 2.2.2 Phương pháp sinh học phân tử.....................................................................
Trang

29
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số...................................................
29
2.2.2.2. Phương pháp PRC khuếch đại gen........................................................
30
2.2.2.3. Phương pháp điện di..............................................................................
32
2.2.2.4. Phương pháp làm sạch sản phẩm PCR .................................................
33
2.2.2.5. Phương pháp tách dòng gen tái tổ hợp (Cloning) .................................
34
2.2.2.6. Phương pháp giải trình tự gen ...............................................................
36

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 38
3.1 Kết quả phân lập và xác định P. aeruginosa bằng phương pháp vi sinh vật
38
3.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn P. aeruginosa trên môi trường King A ............ 38

4


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

3.1.2 Kết quả nhuộm Gram...................................................................................
39
3.1.3. Kết quả nghiên cứu hoạt tnh enzyme ........................................................
40
3.1.4. Kết quả thử hoạt tính kháng kháng sinh .....................................................
41
3.2. Kết quả xác định P. aeruginosa bằng phương pháp sinh học phân tử .....
42
3.2.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số .................................................................
42
3.2.2. Kết quả PCR gen đặc hiệu P. aeruginosa (PA): ........................................ 43
3.2.3. Kết quả PCR gen 16s rRNA ....................................................................... 44
3.2.4. Kết quả tách dòng tái tổ hợp mang đoạn gen 16s rRNA ............................
45
3.2.5. Kết quả giải trình tự gen 16s rRNA và định tên vi khuẩn .......................... 47
3.3. Kết quả nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất kháng Vibrio sp của

P.aeruginosa PS39 .................................................................................................
51
3.3.1. Kết quả xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh khối vi khuẩn
và nồng độ hoạt chất. ............................................................................................
51
3.3.2. Kết quả xác định khả năng kháng Vibrio của dịch nuôi vi khuẩn và hoạt
chất PCN ...............................................................................................................
54
3.3.3.Xác định nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio sp ..................................... 56
3.3.4. Kết quả xác định ảnh hưởng nồng độ hoạt chất PCN ức chế Vibrio in vitro
...............................................................................................................................
58

5


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................... 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 62
Phụ lục 1 .................................................................................................................
74
Phụ lục 2 .................................................................................................................
75

6


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây, việc sử dụng kháng sinh trong nuôi trồng thủy
sản nhằm phòng và hạn chế các bệnh do nhiễm khuẩn ngày càng trở nên
phổ biến. Vì vậy, đề kháng kháng sinh do vi sinh vật đã tăng lên rất nhiều, nhưng
số kháng sinh mới được đưa vào sử dụng để khắc phục vấn đề lại rất giới hạn.
Hiện tượng đa kháng thuốc kháng sinh đang là mối lo không chỉ của người
nuôi mà còn của cả các nhà quản lý sức khỏe cộng đồng bởi nó không chỉ làm
giảm hiệu quả điều trị mà còn tiềm ẩn nhiều nguy cơ đối với sức khỏe con người.
Mặt khác, vì các quan ngại và hạn chế của việc sử dụng kháng sinh trong nuôi
thủy sản nên các nghiên cứu đang hướng sự quan tâm đến các chất thay thế có
nguồn gốc thiên nhiên, do các chất này không gây đề kháng khuẩn và tồn dư
trong vật nuôi cũng như ảnh hưởng tới môi trường.
Pseudomonas sp là vi khuẩn phổ biến được tìm thấy trong đất, nước, hệ
vi sinh vật trên da và các môi trường nhân tạo trên khắp thế giới. Chúng là một
trong những vi sinh vật có giá trị thương mại và công nghệ sinh học. Trong
các chế phẩm sinh học, Pseudomonas được sử dụng như probiotc kiểm soát sinh
học đối với nấm gây bệnh và vi khuẩn trong nông nghiệp, phẩy khuẩn trong
nuôi trồng thủy sản. Các vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng tiết nhiều loại
sắc tố là các hợp chất có tnh kháng khuẩn. Trong đó, các hợp chất phenazine do
Pseudomonas sp tiết ra môi trường là những hợp chất có phổ kháng khuẩn rộng.
Phenazine là nhóm sắc tố do Pseudomonas sp tiết ra bao gồm: pyocyanin

PCN (5-N-methyl-1-hydroxyphenazine),
phenazine-

phenazine-1-carboxylic

(PCA)

và

1-carboxamide. Sắc tố pyocyanin từ Pseudomonas aeruginosa, được chiết bằng
chloroform, là phenazine có sắc tố màu xanh. Nghiên cứu tách chiết, tính chất và
7


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ dụng của pyocyanin đã được tiến hành ở nhiều phòng Trang
ứng
thí nghiệm trên thế

giới:

8


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

Mĩ (Scot Angell-2006); Đức (Kasozi-2012); Iran (Jamileh Nowroozi-2012); Ấn Độ
(Preetha -2010); Thái Lan (Pattamarat Rattanachuay-2010). Sắc tố đã được xác
định là có phổ kháng khuẩn rộng [75], chống nấm [55], các Vibrio sp gây bệnh
trong nuôi trồng thủy sản [66]. Phân lập và điều tra cho thấy pyocyanin có tính
kháng mạnh với vi khuẩn Vibrio sp như V. parahaemolytcus , V. vulnificus , V.
alginolyticus , V. fluvialis , V. Proteolyticus, V. harveyi và do đó nó có thể được
ứng dụng cho các chế phẩm sinh học trong nuôi trồng thủy sản.
Đề tài nghiên cứu: “Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp
sinh hoạt chất kháng Vibrio sp gây bệnh ở tôm nuôi” được thực hiện nhằm
mục đích phân lập được chủng Pseudomonas sp có khả năng sinh hoạt chất kháng
Vibrio gây bệnh trên tôm nuôi, góp phần điều trị bệnh và giúp tăng năng suất tôm
nuôi ở Việt Nam.
Nhiệm vụ đặt ra cho đề tài là:
1.Phân lập và tuyển chọn chủng Pseudomonas sp có khả năng kháng lại vi
khuẩn gây bệnh trên tôm nuôi.
2. Sàng lọc chủng Pseudomonas sp sinh hoạt chất kháng khuẩn.
3.Giải trình tự gen 16s rRNA, định danh vi khuẩn.

9


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas là một chi vi khuẩn xuất hiện ở mọi nơi trong môi trường. Sự
biến dưỡng dễ thay đổi và linh động của chúng làm cho chúng có thể sống
ở nhiều môi trường khác nhau như nước, đất, trên cây và trong các động vật. Vi
khuẩn không chỉ phát triển trong môi trường không khí bình thường, mà còn
có thể sống trong môi trường có ít khí oxy, và do đó có thể cư trú trong nhiều môi
trường tự nhiên và nhân tạo. Vi khuẩn này dinh dưỡng bằng rất nhiều các
hợp chất hữu cơ ở động vật. Trong số những loài Pseudomonas này, có
những loài tiêu biểu có thể được sử dụng trong công nghệ sinh học. Một trong số
đó là loài Pseudomonas aeruginosa.

Hình 1.1: Khuẩn lạc P. aeruginosa trên môi trường King A.
1.1.1. Phân loại
Giới (regnum)

Bacteria

Ngành (phylum)

Proteobacteria
1
0


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

Lớp (class)

Gamma Proteobacteria

Bộ (ordo)

Pseudomonadales

Họ (familia)

Pseudomonadaceae

Chi (genus)

Pseudomonas

Loài (species)

Pseudomonas aeruginosa

1.1.2 Đặc điểm
Đặc điểm hình thái học chung cho Pseudomonas là Gram âm, tế bào
hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử. Các đặc điểm sinh lí là dị
dưỡng, không lên men, linh hoạt về dinh dưỡng, không quang hợp hoặc cố định
nitrogen.
P. aeruginosa là loài điển hình thuộc giống Pseudomonas (Migula) [13]. Tế
bào của chúng có dạng hình que, dài 1-1,5µm, rộng 0,5-1µm. P. aeruginosa
sử dụng hô hấp hiếu khí (oxy) làm sự trao đổi chất tối ưu mặc dù chúng cũng có
thể hô hấp kị khí trên nitrat hoặc nhận điện tử khác thay thế. P. aeruginosa có
thể chuyển hóa một loạt các phân tử hữu cơ, bao gồm các hợp chất hữu cơ như
benzoate, điều này đã giúp P. aeruginosa trở thành một vi sinh vật rất phổ biến

vì nó có thể được tìm thấy trong môi trường như đất, nước, con người, động vật,
thực vật, nước thải và các bệnh viện [59]. Trong tất cả các hệ sinh thái thủy vực có
chứa hàm lượng oxy hòa tan cao nhưng chất dinh dưỡng thực vật thấp, P.
aeruginosa là sinh vật chiếm ưu thế và điều này biến nó trở thành loài sinh vật
phong phú nhất trên trái đất.
Pseudomonas sp có khả năng tiết ra nhiều loại sắc
tố:

1
1


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ - Pyocyanin: là sắc tố phenazine, có màu xanh da trời, tan
Trang
trong nước và tan

trong chloroform, 96% số chủng P. aeruginosa có khả năng sinh sắc tố này.
Pyocyanin sinh ra thuận lợi trong môi trường tếp xúc nhiều với không khí, dễ
dàng phát hiện khi nuôi vi khuẩn trên môi trường canh thang, thạch thường
hoặc

1
2


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

dùng môi trường King A để phát hiện sinh sắc tố. Chỉ có P. aeruginosa sinh sắc tố
pyocyanin.
- Pyoverdin (còn gọi là fluorescent): sắc tố có màu xanh lục, tan trong nước,
nhưng không tan trong chloroform. Môi trường King B được sử dụng để phát hiện
sắc tố pyoverdin. Ngoài P. aeruginosa còn có các vi khuẩn như P. fluorecens, P.
pytida, P. veroni, P. monteilla cũng có khả năng sinh sắc tố này.
- Pyorubin: sắc tố màu hồng nhạt, chỉ 1% số chủng P. aeruginosa sinh ra sắc
tố này.
- Pyomelanin: sắc tố màu nâu đen, chỉ 1-2% số chủng P. aeruginosa sinh sắc
tố này.
Tuy nhiên không phải tất cả các chủng Pseudomonas đều sinh sắc tố, khoảng
5- 10% số chủng Pseudomonas không sinh sắc tố. King, Ward, và Raney đã tìm ra
môi trường thạch Pseudomonas Agar P (môi trường agar King A) để tạo điều kiện
cho vi khuẩn tiết pyocyanin và pyorubin, thạch Pseudomonas Agar F (môi trường
agar King B) tạo điều kiện cho vi khuẩn tiết sắc tố fluorescein.[58]
P. aeruginosa thường được xác định sơ bộ bởi vẻ ngoài óng ánh như hạt
trai và có mùi giống như nho hoặc bánh tortlla khi được nuôi cấy in vitro. Các
dấu hiệu nhận biết sự có mặt của P. aeruginosa trong lâm sàng thường bao
gồm khả năng sinh cả hai sắc tố pyocyanin và fluorescein, cũng như khả năng phát
triển tại nhiệt độ 42°C. P. aeruginosa có khả năng sinh trưởng trong diesel và
nhiên liệu máy bay, nơi mà vi khuẩn này được coi là vi sinh vật sử dụng
hydrocarbon, và gây ra sự ăn mòn vi thể.[14]
Mặc dù được phân loại là một vi sinh vật hiếu khí, P. aeruginosa còn
được xem như là vi sinh vật kị khí tùy nghi, vì vi khuẩn này có thể tăng sinh trong
môi trường thiếu một phần hay toàn phần khí oxy. Nó có thể tăng sinh yếm khí
1
3

Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ
Trangvà thậm chí khi
bằng
cách sử dụng nitrat như là chất nhận điện tử cuối cùng,

thiếu nitrat

1
4


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

nó cũng có thể lên men arginine bằng phosphoryl hóa ở mức cơ chất [23, 24,
41,
94, 95].
1.1.3. Cấu trúc gen
P. aeruginosa có kích thước bộ gen khoảng 5,2 – 7.000.000 cặp bazơ với 65%
nucletide là loại Guanine và Cytosine, bao gồm một lõi chính được bảo tồn và các
phần phụ khác nhau. Bộ gen lõi của các dòng P. aeruginosa phần lớn là giống
nhau, biểu hiện sự đa dạng thấp, và chỉ chứa vài locus quy định những tnh
trạnh nổi bật, như locus pyoverdine, flagella, pilA, và locus sinh tổng hợp kháng

thể O. Những đoạn gen quy định các tnh trạng nằm rải rác khắp bộ di truyền và
khoảng một phần ba trong số chúng nằm kề sát các gen tRNA hay mRNA. Tính đa
dạng di truyền của vi khuẩn được hình thành bởi sự tương tác lẫn nhau giữa các
họ đảo gen pKLC102/PAGI-2 vào các gen tRNALys hay tRNAGly. Các đảo gen riêng
lẻ khác nhau về thứ tự các gen trao đổi chất, nhưng giống nhau về các gen tương
kề truyền lại trực tiếp cho các chủng và các loài. [25, 93].

Hình1.2: Gen P. aeruginosa PA01 [77]

1
5


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ P. aeruginosa có một nhiễm sắc thể dạng vòng duy nhất Trang
và siêu xoắn trong

tế bào chất [33]. Nó cũng mang rất nhiều plasmid nhiễm sắc thể huy động, điều
này

1
6


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

rất quan trọng đối với tập tính sống của sinh vật. Ví dụ như các plasmid, TEM,
OXA, và PSE được mã hóa để sản xuất betalactamase, chất cần thiết cho sức đề
kháng của vi khuẩn với thuốc kháng sinh [28].
1.1.4. Phương
aeruginosa

pháp

xác định

vi khuẩn

Pseudomonas

1.1.4.1.Phương pháp phân lập vi sinh truyền thống
Đây là phương pháp thông dụng được các nhà nghiên cứu sử dụng để
xác định các vi khuẩn nói chung. Trong phương pháp vi sinh vật học, người ta
nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các loài vi khuẩn.
Đặc điểm hình thái của một loài vi khuẩn bao gồm cả các đặc điểm về tế bào
(hình dạng, nội bào tử, tiêm mao, nhuộm Gram) và các đặc điểm về khuẩn lạc
(màu sắc, đường kính, hình dáng). Các đặc điểm về sinh lý và sinh hóa như sự
phát triển của các vi sinh vật ở các nhiệt độ, giá trị pH, nồng độ muối, nguồn năng
lượng, hay các điều kiện môi trường khác. Tiếp đó là sự phát triển của chúng trên
các kháng sinh khác nhau, hoạt động của các loại enzyme, và quá trình trao đổi
chất…
1.1.4.2. Phương pháp sinh học phân tử phân loại vi khuẩn
Phân loại bằng sinh học phân tử là phương pháp mới nhưng có độ chuẩn xác
cao. Phương pháp này có thể phát hiện mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở
mức phân tử, quan hệ giữa các loài và trong phạm vi loài [1].

Ngày nay phương pháp phân loại vi khuẩn bằng phương pháp xác định và so
sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA đang được áp dụng phổ biến. Việc nghiên cứu
phân tử rRNA là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ, tiến hóa
của các vi sinh vật vì rRNA có mặt ở tất cả các loài vi sinh vật, có khả năng xác
định, có tnh bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh
10


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ Tuy nhiên, dựa vào sự khác nhau này, người ta có thểTrang
vật.
đánh giá được mối

quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại vi sinh vật.

11


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

Trong ba gen mã hóa rRNA của vi khuẩn có 5S rRNA, 16S rRNA và 23S rRNA
thì gen 16s rRNA là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại hiện nay. Gen mã
hóa 5S rRNA có kích thước khoảng 120 nucleotde, do có kích thước nhỏ nên
thông tn chứa đựng ít, do đó khó phân biệt được chính xác sự khác nhau giữa chi,
giữa loài và trong loài của vi sinh vật cũng như vị trí phân loại của chúng. Gen mã

hóa 23S rRNA có kích thước khoảng 2900 bp quá lớn cho nên không thuận lợi cho
tách dòng, xác định trình tự và phân loại vi khuẩn. Gen mã hóa 16S rRNA có kích
thước khoảng 1500 nucleotde vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh
vật không gây khó khăn trong các bước xác định trình tự gen và được ưu tiên chọn
lựa trong phân loại vi khuẩn.
Cấu trúc của gen mã hóa 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ
và đã thiết kế rất nhiều các cặp mồi chung dùng cho nhiều nhóm vi khuẩn
cũng như các cặp mồi đặc hiệu riêng cho các chi và loài. Đây là một thuận lợi lớn
cho nghiên cứu phân loại vi khuẩn và xạ khuẩn dựa trên gen mã hóa 16S rRNA
[50].
1.1.5. Ứng dụng của vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa
Vi khuẩn Pseudomonas sp có khả năng làm suy giảm các hydrocacbon thơm
như methylbenzene - những sản phẩm của ngành công nghiệp dầu khí và thường
được sử dụng làm dung môi cho sơn men và sơn cũng như trong sản xuất thuốc
và hóa chất. Methylbenzene được coi là chất gây ô nhiễm môi trường đang hiện
diện trong không khí, đất và trên bề mặt nước [70]. P. aeruginosa có thể phá vỡ
toluene, hình thức đơn giản nhất của methylbenzene. P. aeruginosa thoái hóa
toluene thông qua quá trình oxy hóa của các nhóm methyl cho aldehyde, rượu
và một acid, sau đó được chuyển đổi sang catechol (1,2-dihydroxybenzene). Do
đó, P. aeruginosa có thể được sử dụng trong kiểm soát ô nhiễm [51].

12


Luận văn thạc
Nguyễn Huyền
sỹ P. aeruginosa cũng được ứng dụng trong sản xuất Trang
chế phẩm sinh học

kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản. Vi khuẩn P. aeruginosa giúp gia

tăng sức

13


Luận văn thạc
sỹ

Nguyễn Huyền
Trang

khỏe và hệ miễn dịch của tôm bạc gân Penaeus latsulcatus khi cho tôm ăn với
5

liều lượng 10 CFU/ml. Vi khuẩn P. aeruginosa YC58 cũng liên kết hoạt động với
hệ vi sinh của ấu trùng hàu Cortez, C. Corteziensis, giúp gia tăng tỷ lệ sống và tăng
trưởng của hàu ngọc Pinctada mazatlanica. Ngoài ra, khi kết hợp vi khuẩn P.
aeruginosa và B. cepacia cũng có ảnh hưởng tích cực đến sự tăng trưởng và tỷ
lệ sống của điệp N. subnodosus[97].
1.2. Hoạt chất pyocyanin
1.2.1.Cấu trúc pyocyanin và sự tham gia của các gen
Hợp chất phenazine gồm 6,000 loại là các hợp chất thứ cấp của quá trình
nuôi cấy chủng Pseudomonas sp như: pyocyanin - sắc tố xanh, pyorubrin - sắc tố
nâu, Phenazine-1-carboxylic acid - sắc tố nâu đỏ, những hợp chất này đều có khả
năng kháng khuẩn. Phenazine là một hợp chất dị vòng được sản xuất một cách tự
nhiên như màu đỏ 5-methly-7-amino-1-carboxyphenazium betaine, sau đó được
chuyển đổi thành các phenazine-1carboxylic acid (PCA) màu vàng chanh , và cuối
cùng đến 1-hydroxy-5-methyl phenazine màu xanh (pyocyanin) [37]. Việc sinh
tổng hợp phenazine đã được nghiên cứu rộng rãi ở vi khuẩn Pseudomonas [42,
43, 45, 46]. Shikimic acid được phát hiện là con đường chuyển hóa chính thành

phenazine. Shikimic acid là tiền thân cho tổng hợp phenazine, cung cấp một điểm
phân nhánh cho chorismic acid để tổng hợp phenazine [43, 45, 62].
Pyocyanin là một hoạt chất thứ cấp có màu xanh lá cây, tan trong nước và
chloroform, khuếch tán ra môi trường làm môi trường có màu xanh. Các sắc tố
pyocyanin gồm 2 tiểu đơn vị của Nmethyl -1- hydroxyphenazine. Pyocyanin được
kết tnh ở dạng tinh khiết và được phân loại như một phenazine. Trong quá trình
tổng hợp pyocyanin, bảy gen của P. aeruginosa đã được xác định, cụ thể là phzC,
14