Phân lập gen ORCA3 liên quan đến sự tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (catharanthus roseus (l ) g don)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THANH HƯƠNG

PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don)

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

- 8/ 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TRẦN THỊ THANH HƯƠNG

PHÂN LẬP GEN ORCA3 LIÊN QUAN ĐẾN SỰ
TỔNG HỢP ALKALOID TỪ CÂY DỪA CẠN
(Catharanthus roseus (L.) G. Don)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

- 8/ 2014
tnu.edu.vn/


i
LỜI CAM ĐOAN

. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ
nguồn gốc. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa
từng ai công bố trong một công trình nào khác.

Thái Nguyên, ngày 20 tháng 8 năm 2014
Tác giả

Trần Thị Thanh Hương

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


ii
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận
tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành công trình

nghiên cứu này.

- KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá
trình học tập và hoàn thành luận văn.

.

.

-

.

Tác giả

Trần Thị Thanh Hương

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


3

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ORF: Open read frame
ORCAs: Octadecanoid - responsive Catharanthus AP2/ERF domain
MIA: Monoterpenoid indole alkaloids
DNA: Deoxyribonucleic acid

RNA: Ribonucleic acid
TIA: Terpenoid indole alkaloids
FDA: Food and Drug Administration
JA: Jasmonic acid
MeJA: Methyl ester jasmonic acid
JRE: Jasmonate responsive element
ERF: Ethylene response factor
PCR: Polymerase chain reaction

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


4

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


5

MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan........................................................................................................i
Lời cảm ơn ...........................................................................................................ii
Những chữ viết tắt ................................................................................................iii

Mục lục.................................................................................................................iv
Danh mục các bảng trong luận văn ......................................................................vi
Danh mục các hình trong luận văn.....................................................................vii
MỞ ĐẦU .............................................................................................................1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................3
1.1. CÂY DỪA CẠN ...........................................................................................3
1.1.1. Giới thiệu chung .........................................................................................3
.................................................4
1.2. NGHIÊN CỨU ALKALOID Ở THỰC VẬT VÀ Ở CÂY DỪA CẠN .......5
1.2.1. Alkaloid ở thực vật.....................................................................................5
1.2.1.1. Trạng thái thiên nhiên .............................................................................5
1.2.1.2. Sự phân bố...............................................................................................5
.......................................................6
............6
1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn...............................................................................8
1.2.2.1. Các vinca alkaloid chính .........................................................................8
1.2.2.2. Một số gen chức năng liên quan đến quá trình tổng hợp alkaloid ở cây
dừa cạn ...............................................................................................................11
1.2.2.3. A

........................................12
3 ........................................................16

1.3.1. ORCA3.....................................................................................................16
1.3.1.1. Con đường sinh tổng hợp TIA ..............................................................17
1.3.1.2. Cơ chế điều khiển của ORCA3 ............................................................19
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/

1.3.1.3. Cấu trúc protein ORCA3.......................................................................21
3
................................22
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................27
...................................................27
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ..................................................................................27
2.1.2. Hóa chất và thiết bị ..................................................................................27
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...............................................................27
2.2.1. Phương pháp thu mẫu ..............................................................................27
2.2.2. Các phương pháp sinh học phân tử ..........................................................27
2.2.2.1. Phương pháp tách chiết mRNA ............................................................27
......................................................28
2.2.2.3. Phương pháp nhân gen ORCA3 bằng kĩ thuật RT-PCR.......................28
2.2.2.4. Kĩ thuật tách dòng gen ..........................................................................29
3...31
........................................................................31
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................32


DỪA
ÊN ....................................32
ORCA3 ...............................................................................................................32
3.1.2. Kết quả nhân đoạn gen ORCA3 từ mRNA ..............................................33
3.1.3. Kết quả tách dòng đoạn gen ORCA3 .......................................................34
..................................................................................................................35
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..............................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................43

DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR nhân gen ORCA3 ................................... 28
Bảng 2.2. Thành phần ph

................. 29

Bảng 2.3. Thành phần phản ứng colony – PCR ................................................. 30
Bảng 3.1. Cặp mồi nhân gen ORCA3 ................................................................. 33
Bảng 3.2.
ORCA3 ................................................................................. 37
Bảng 3.3. Tỷ lệ và số lượng từng loại amino acid
1.............................................................................................................. 39
Bảng 3.4. Các vị trí sai khác giữa trình tự amino acid
96899, ABW77571 .... 40


vii


vii
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sinh tổng hợp vinca alkaloid ...............................................................10
Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp TIA ở dừa cạn ............................................19
Hình 1.3. Mô hình biểu hiện gen STR được cảm ứng bởi JA thông qua yếu tố
phiên mã ORCA3 ở cây dừa cạn..........................................................................20
Hình 1.4. Tổng quan về các phân tử tín hiệu thực vật .......................................21

3.1.
(TN1) ............................................33
3.2.

...........................................................................35

Hình 3.3.
.36
Hình 3.4.
Thái Nguyê
...................................................................................................38
Hình 3.5. Vùng AP-2 của protein ORCA3 bám DNA ........................................41


8

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, cả thế giới đang phải đối mặt với bệnh ung thư, một căn bệnh
đang trở thành hiểm họa cho cuộc sống chúng ta và có xu hướng ngày càng gia
tăng. Theo thống kê, thế giới sẽ có 21,4 triệu người được phát hiện mới mắc
bệnh ung thư và hơn 13,2 triệu người chết vì căn bệnh này vào năm 2030. Tỷ lệ
này sẽ có nguy cơ tăng dần so với thời gian. Trong khi đó, các loại thuốc chữa trị
ung thư chưa nhiều và giá thành của chúng khá đắt. Xu hướng của thế giới hiện
nay là nghiên cứu phương pháp
.
Thực vật bậc cao được coi là nguồn nguyên liệu quý giá có thể cung cấp
các hợp chất thứ cấp, đặc biệt là các alkaloid. Những chất này đóng vai trò quan
trọng đối với ngành công nghiệp dược phẩm trong việc sản xuất các loại thuốc có

giá trị, trong số đó quan trọng nhất là nhóm dược phẩm điều trị ung thư. Trong
những năm gần đây, tình hình nghiên cứu về hợp chất thứ cấp thực vật ngày càng
phát triển. Các hợp chất thứ cấp được chiết xuất từ thực vật có hoạt tính và rất có
giá trị đối với cuộc sống. Một số hợp chất thuộc các nhóm alkaloid, terpenoid,
phenolic, saponin được biết đến như là các hợp chất có khả năng trị bệnh ung thư.
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus (L.) G. Don) là một trong các loại thực
vật có khả năng sản xuất các alkaloid - có dược tính quan trọng trong chế tạo
thuốc chữa ung thư như vinblastine và vincristine. Các alkaloid này trong cây
dừa cạn có hàm lượng rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá dừa cạn khô đối với
vinblastin còn đối với vincristin thì ít hơn 10 lần nữa) và không thể tổng hợp
bằng con đường hóa học do có cấu trúc phức tạp [1]. Do vậy, tiếp cận con đường
tổng hợp các alkaloid từ góc độ

là một hướng nghiên cứu đầy


9

triển vọng, đã và đang được quan tâm nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa học trên
thế giới.
Trong những năm gần đây, nhờ sự phát triển của kỹ thuật di t

đường sinh
vụ điều hòa biểu hiện gen và truyền tín hiệu.
Gen ORCA3 (Gen vùng AP2 đáp ứng với dẫn xuất octadecanoid) thuộc
nhóm gen quy định nhân tố phiên mã, được công bố và phân lập đầu tiên bởi
Van der Fits và Memelink (2000) trên đối tượng cây dừa cạn (Catharanthus
roseus L). Các nghiên cứu về gen ORCA3 tập trung vào

mối liên

quan giữa gen ORCA3 tới quá trình sinh tổng hợp alkaloid trong cây dừa cạn.

.
chúng tôi lựa chọn đề tài: “Phân lập gen
ORCA3 liên quan đến sự tổng hợp alkaloid từ cây dừa cạn (Catharanthus
roseus (L.) G. Don)”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

ORCA3
.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU


10

ORCA3
.K
và tách dòng cDNA
của gen ORCA3.


11

(2) Phân tích trình tự cDNA của gen ORCA3 và so sánh với trình tự gen ORCA3
phân lập được

.

1

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY DỪA CẠN

1.1.1. Giới thiệu chung
Giống Catharanthus gồm có 8 loài, hầu hết là cây thân thảo lâu năm.
Trong đó, có loài Catharanthus pusillus có nguồn gốc từ Ấn Độ, còn tất cả các
loài còn lại có nguồn gốc từ Madagasca, số lượng nhiễm sắc thể cho tất cả các
loài Catharanthus đều là 2n=16. Dừa cạn có tên khoa học là Catharanthus
roseus (L) G. Don, tên gọi khác là bông dừa, hoa hải đằng, trường xuân
hoa…thuộc họ Apocynaceae, bộ Gentianales [1].
Ngoài việc được biết đến như một loài cây cảnh, từ lâu dịch chiết alkaloid
từ Catharanthus roseus đã được sử dụng trong y học dân gian như một loài thuốc
chống đái tháo đường, lợi tiểu, chữa tiêu chảy, xuất huyết, giúp vết thương mau
lành… và ngày nay người ta còn tìm được một công dụng hết sức quan trọng của
loài Catharanthus roseus đó là khả năng trị bệnh ung thư rất hiệu quả [1].
Catharanthus roseus là nguồn giàu alkaloid thuộc chủng loại alkaloid
terpenoid indole, gồm 3 giống cây khác nhau: „roseus‟ với hoa màu tím hoặc
màu hồng, „albus‟ với hoa trắng, „ocellatus‟ với hoa màu trắng nhị đỏ [1].
Thân cỏ nhỏ, mọc đứng, phân nhiều cành, cao 40-60 cm. Lá đơn nguyên,
mọc đối chéo chữ thập, hình trứng, đầu hơi nhọn, dài 4-7 cm, rộng 2-3 cm, mặt
trên sẫm, mặt dưới nhạt, có lông…Cụm hoa: hai hoa ở kẽ lá. Hoa đều, lưỡng tính,
mẫu 5. Bao phấn hình mũi tên, hướng trong, khai dọc, đính đáy, các bao
phấn chụm trên đầu nhụy. Hạt phấn rời, hình chữ nhật, có rãnh dọc. Quả gồm
hai đại, dài 2-4 cm, rộng 2-3 cm, mọc thẳng đứng, hơi ngả sang hai bên [1].
Chi Catharanthus G. Don có nguồn gốc ở Madagascar. Loài dừa cạn được
di nhập sang nhiều nước nhiệt đới ở Nam Á cũng như Đông Nam Á. Trong đó

2

có Việt Nam và Đảo Hải Nam Trung Quốc. Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang
dại, có vùng phân bố tự nhiên tương đối đặc trưng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên
Giang dọc theo vùng ven biển, tập trung ở các tỉnh thành miền Trung như Thanh
Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên.
Dừa cạn còn được trồng khắp nơi trong nước để làm cảnh và làm thuốc [1].
Trong tất cả các bộ phận của cây dừa cạn đều chứa alkaloid, alkaloid toàn
phần có ở lá dừa cạn với hàm lượng 0,37-1,15%, thân 0,4%, rễ chính 0,7-2,4%,
rễ phụ 0,9-3,7%, hoa 0,14%, hạt 0,18%. Người ta đã chiết, phân lập ra trên 70
alkaloid khác nhau [1]. Căn cứ vào cấu tạo hóa học, alkaloid trong cây dừa cạn
được chia làm ba nhóm chính:
(1) Nhóm alkaloid nhân indol: perivine, peviridine, perosine, catharanthine,
cavicine, ajmalicine...
(2) Nhóm alkaloid nhân indolin: vindoline, ajmaline, lochnericine, lochneridine,
lochrovine...
(3) Nhóm alkaloid có 2 vòng indol hoặc một vòng indol và một vòng indolin
như leurosine, leubcosidine... và đặc biệt là các alkaloid có tác dụng chữa bệnh
ung thư nhưng có hàm lượng rất thấp như: vinblastine (vincaleucoblastine)
0,005-0,015% trong lá, vincristine (leucocristine) 0,003-0,005% trong lá [9].
Sự phân bố các alkaloid khác nhau ở các bộ phận khác nhau của cây dừa
cạn tùy thuộc vào nhiều yếu tố liên quan đến sinh tổng hợp của cây. Sự hình
thành alkaloid ở lá, thân, rễ tùy thuộc vào bước sóng ánh sáng chiếu vào cây. Quá
trình tạo alkaloid trong rễ không có phản ứng quang hợp như các bộ phận trên
mặt đất của cây nên các alkaloid trong rễ là indol alkaloid không chứa nhóm
methoxy

như

ajmalicin,

cathidine,

tretrahydroalstonin. Các alkaloid ở

lá

anhydrovinblastine, catharanthine, leusosine,

serpentine,
có

chứa

perivin,
nhóm

alstonin,

methoxy

như


3

leurosidin, vinblastine, vincristine, vindoline, ở hạt thì có vinsedicin,
vincedine, còn có ở hoa chỉ có vinblastine dạng vết [27].

1.2. NGHIÊN CỨU ALKALOID Ở THỰC VẬT VÀ Ở CÂY DỪA CẠN
1.2.1. Alkaloid ở thực vật
1.2.1.1. Trạng thái thiên nhiên
Alkaloid phân bố ở cả động vật và thực vật, phần lớn alkaloid có trong
thực vật. Ở cây hai lá mầm alkaloid tập trung ở một số họ như họ cà phê, họ
thuốc phiện, họ mã tiền, họ trúc đào, họ cà…; ở cây một lá mầm phần lớn
alkaloid tập trung ở họ hành tỏi; trong thực vật bậc thấp alkaloid tập trung ở một
số loài nấm [29].
Alkaloid tập trung ở một số bộ phận nhất định của cây như: ở hạt của cây
mã tiền, cà phê, cola…; ở quả ớt, hồ tiêu, thuốc phiện…; ở hoa cà độc dược; ở lá
chè, thuốc lá…; ở thân và vỏ thân ma hồng, canhkina…; ở rễ: lựu, ba gạc…; ở
củ: bình vôi, ô dầu… Trong cây thường chứa hỗn hợp alkaloid, rất ít khi chỉ có
một alkaloid duy nhất [9].
Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp cỡ 1-3% trừ một số trường
hợp như trong cây thuốc phiện hàm lượng cỡ 20-30%, trong cây canhkina hàm
lượng cỡ 7-10%. Hàm lượng alkaloid trong cây phụ thuộc vào nhiều yếu tố như
khí hậu, thổ nhưỡng, ánh sáng, giống cây, bộ phận của cây và thời kỳ thu hái [9].
1.2.1.2
Alkaloid thường chứa trong các bộ phận của cây như hoa, lá, rễ, hạt, vỏ.
Đôi khi trong cùng một cây thì bộ phận này giàu alkaloid nhưng bộ phận khác lại
không có. Lượng alkaloid và tỷ lệ thành phần các alkaloid trong cây có thể thay
đổi tùy theo mùa thu hái, tuổi của cây, điều kiện khí hậu thổ nhưỡng… [9].
Trong một cây thường chứa các alkaloid có cấu trúc hóa học gần giống
nhau, đặc biệt trong một số cây có chứa vài chục alkaloid như cây thuốc phiện,


4

cây canhkina. Các alkaloid trong cây tồn tại dưới dạng muối với các hợp chất
hữu cơ như succinic, acid oxalic, acid malic, acid meconic. Tỷ lệ phần trăm các

alkaloid trong các bộ phận của cây có thể rất cao từ 10% đến 15% hoặc rất thấp
vài phần nghìn thậm chí vài phần vạn [9].
Trước đây người ta cho rằng nhân cơ bản của các alkaloid là do các chất
đường hay thuộc chất của đường kết hợp với amoniac để có nitơ mà sinh ra.
Ngày nay bằng phương pháp dùng các nguyên tử đánh dấu (đồng vị phóng xạ)
người ta chứng minh được các alkaloid tạo ra từ các amino acid và đã có nhiều
nghiên cứu tổng hợp alkaloid từ amino acid. Ngoài các alkaloid là dẫn xuất của
các amino acid, một số alkaloid khác lại bắt đầu từ một số tiền chất riêng. Bằng
phương pháp dùng amino acid có nguyên tố đồng đánh dấu người ta đã chứng
minh rõ ràng về các tiền chất alkaloid [36].
Có thể nói giai đoạn quan trọng đầu tiên trong sự chuyển hóa amino acid
thành alkaloid là sự khử cacboxyl thành một amin và tiếp đến là sự oxy hóa amin
này thành aldehyt bởi enzyme oxydaza amin. Việc ngưng tụ một nhóm amin bởi
aldehyt dẫn đến tạo các vòng đặc trưng cho alkaloid [36].
Qua định tính và định lượng các alkaloid trong các bộ phận khác nhau của
cây và theo dõi sự phát triển của chúng trong quá trình phát triển của cây người
ta thấy nơi tạo ra alkaloid không phải là nơi tích tụ alkaloid. Nhiều alkaloid được
tạo ra ở rễ lại vận chuyển lên phần trên mặt đất của cây, sau khi thực hiện những
biến đổi thứ cấp chúng được tích lũy ở lá, quả và hạt. Ngoài ra, hàm lượng của
alkaloid trong cây cũng phụ thuộc vào nhiều yếu tố như khí hậu, ánh sáng, chất
lượng đất, giống cây và bộ phận thu hái [24].
Ngay từ những năm 1971, Wani và cộng sự đã tìm ra một diterpen amide
mới có khả năng chống ung thư gọi là taxol chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


5

brevifolia) [2]. Đến năm 1983, taxol được Cục Quản lý Dược phẩm và Thực
phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung
thư buồng trứng [19]. Sau đó FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các
trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol còn có tác dụng
đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác
và nó được xem là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư
[19]. Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách được một
lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Do đó cần có những nguồn khác để
thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuôi
cấy tế bào các loài Taxus được xem là một trong các phương pháp ưu thế để
cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxal. Fett-Netto và cộng sự (1994) đã
nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích
lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. Cuspidata. Srinivasan và cộng sự (1995) đã
nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. Baccata [2].
Yel và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế
bào huyền phù của cây Dioscorea doryophola. Phương pháp này được sử dụng
như một cách để thay thế quá trình tổng hợp steroid [2].
Miyasaka và cộng sự (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ
nuôi cấy callus cây Salvia miltiorhiza. Nồng độ cao nhất của cryptotanshinone
thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0.2 mg/l BA trong 6 ngày là
4.59 mg/g khối lượng khô [2].
Shikonin, một loại sắc tố có khả năng diệt khuẩn, có trong rễ cây
Lithospermum erythrrorhizon. Người ta đã tạo được dòng tế bào rễ cây
Lithospermum có khả năng tích lũy đến 15% shikonin và đã hoàn chỉnh công
nghệ nuôi cấy tế bào sản xuất shinkonin [2].
Việc sản xuất các hợp chất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa
học thực vật. Việc phát triển và sử dụng các công cụ di truyền cũng như sự hiểu
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


6

biết ngày càng sâu sắc hơn về bản chất của tế bào và các phương thức điều hòa
quá trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp là cơ sở cho việc sản xuất chúng ở
quy mô thương mại [19].
Ở Việt Nam, công nghệ tách chiết các hợp chất thứ cấp chủ yếu gắn liền
với công nghệ nuôi cấy tế bào và chúng phát triển vào những năm 1970. Từ đó
đến nay đã đạt được nhiều thành công, đáng kể nhất là quy trình sản xuất sâm
Ngọc Linh do Học viện Quân y khai thác. Phương pháp sản xuất sinh khối tế bào
rễ nhân sâm Ngọc Linh được cấp bằng độc quyền sáng chế số 7523 vào ngày
11/2/2009 tại Việt Nam [2].
Việt Nam cũng đang triển khai các dự án nuôi cấy và chiết xuất taxol từ
cây thông đỏ ở Lâm Đồng. Ngoài ra còn có nghiên cứu sản xuất arteminisin dùng
kỹ thuật nuôi cấy tế bào từ cây thanh hao hoa vàng của Viện sinh học Nhiệt đới
trong nghị định thư hợp tác với Malaysia (2007-2010) hay Đại học Huế nghiên
cứu khả năng tích lũy glycoalkaloid ở callus cây cà gai leo Solanum hainanense.
Tuy nhiên, những dự án nói trên vẫn ở quy mô phòng thí nghiệm [2].
1.2.2. Alkaloid ở cây dừa cạn
1.2.2.1. Các vinca alkaloid chính
Ở cây dừa cạn vinblastine và vincristine là hai vinca alkaloid chính có giá
trị điều chế thuốc chống ung thư. Vinblastine và vincristine là các terpenoid
indole alkaloid (TIA). TIA là một nhóm bao gồm hơn 300 hợp chất có hoạt tính
sinh học mạnh và là tiềm năng ứng dụng trong y học. TIA gồm có hai thành
phần: một nhóm indole lấy từ tryptamine và một nhóm terpenoid có nguồn gốc
secologanin. Đối với thực vật, các TIA đóng vai trò quan trọng trong cơ chế bảo
vệ cây chống lại sâu hại và các mầm bệnh [3].

Vinbastine
Công thức nguyên: C46H58O9N4 [27].
Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/


7

o

Đặc điểm là tinh thể hình kim (kết tinh từ methanol), điểm chảy 211-216 .
Không tan trong nước, ether dầu hỏa, tan trong alcol, aceton, ethyl acetat,
chloroform [27].
Vincristine
Công thức nguyên: C46H56N4O10 [27].

Đặc điểm: là tinh thể hình phiến, điểm chảy: 218-2200 [27].
Vinblastine và vincristine được tạo thành từ sự ghép nối của hai
monomer alkaloid: catharanthine (indole) và vindoline (dihydroindole), cả hai
đều xuất hiện tự do trong cây. Vincristine cũng có cấu trúc tương tự như
vinblastine nhưng thay nhóm formyl bằng một nhóm methyl trên phân tử
nitrogen indole của vindoline. Những alkaloid này được hình thành bởi sự kết
hợp của hai nửa: một nửa là indole và một nửa là dihydroindole. Vì thế, chúng
được biết đến với tên gọi là “dimer alkaloid” hoặc “bisindole alkaloid”. Sự khác
nhau của Catharanthus alkaloid phụ thuộc vào loại alkaloid terpenoid indole.
Chúng gồm hai nửa bắt nguồn từ hai quá trình chuyển hóa riêng biệt - quá
tnu.edu.vn/
Số hóa bởi Trung tâm Học

liệu


8

trình mevalonate cho nửa không chứa tryptophan và nửa tryptophan nhận được
từ quá trình tryptophan. Cấu trúc phức tạp của những alkaloid này luôn có mặt
hai nguyên tử nitơ. Một là indole nitơ (nửa bắt nguồn từ tryptophan) và nguyên
tử nitơ thứ hai được tạo thành từ sự tách rời của hai carbon tại vị trí β của vòng
indole. Nửa không có tryptophan bắt nguồn từ acid mevalonic và nó là một C10
- geraniol (monoterpenoid). Geraniol được tạo thành thông qua một chuỗi
chuyển hóa sẽ chuyển thành dạng loganin và sau đó là secologanin (một
monoterpenoid glucoside) [15].
Chìa khóa trung gian trong thuyết phát sinh sinh học của những
alkaloid monoterpene indole là 3α (S)-strictosidine tạo thành từ sự ngưng hoạt
tính enzyme của trytamine và secologanin. Enzyme chịu trách nhiệm cho phản
ứng quan trọng này là strictosidine synthase. Strictosidine sau đó sẽ hình thành
cấu trúc cathenamine (alkaloid loại coryanthe). Enzyme liên quan ở đây là
cathenamine synthase. Cathenamine sau đó phải trải qua một chuỗi các phản ứng
để dẫn đến sự hình thành catharanthin (alkaloid loại iboga) và vindoline
(alkaloid loại aspidosperma). Catharanthine và vindoline là các alkaloid
monomeric indole, xuất hiện tự do trong cây. 3‟,4‟-anhydrovinblastine là
chìa khoá trung gian từ sự ghép nối của catharanthine và vindoline, các enzyme
liên quan là những peroxidase. Sau đó nó được chuyển thành vinblastine [29].

Số hóa bởi Trung tâm Học
liệu

tnu.edu.vn/