Định danh nấm sợi gây hỏng trứng cá bá chủ (pterapogon kauderni) dựa trên gen its và xác định sự lây nhiễm bằng kĩ thuật sem

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

ĐỊNH DANH NẤM SỢI GÂY HỎNG TRỨNG CÁ BÁ
CHỦ (Pterapogon kauderni) DỰA TRÊN GEN ITS VÀ
XÁC ĐỊNH SỰ LÂY NHIỄM BẰNG KĨ THUẬT SEM

Ngành:

Công Nghệ Sinh Học

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : Ths. Võ Minh Sơn
CN. Ngô Đức Duy
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110524

: Nguyễn Thị Thủy Tiên
Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, năm 2015


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Đồ án này là công trình nghiên cứu thực sự của cá nhân,
được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của ThS. Võ Minh Sơn, CN. Ngô Đức
Duy. Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong đề tài là trung thực, đề tài
không trùng với bất kỳ đề tài nghiên cứu khoa học nào. Những thông tin tham khảo

trong khóa luận đều được trích dẫn cụ thể nguồn sử dụng.

Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 16 tháng 8 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Thủy Tiên


LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đồ án tốt nghiệp ở Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thủ
Đức, được sự hướng dẫn tận tình của các Thầy cô, các anh chị và các bạn , em đã
hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến:
TS. Hoàng Quốc Khánh, trưởng phòng Vi Sinh ứng dụng, Viện Sinh Học
Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, Thầy đã tạo điều kiện cho em
được làm đề tài.
Thầy Ngô Đức Duy, TS. Nguyễn Hoàng Dũng và chị Loan phòng Vi Sinh
ứng dụng, Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã
tận tình chỉ bảo, giảng dạy và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đồ án.
Thầy Võ Minh Sơn đang công tác tại Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản
II thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đã nhiệt tình giúp em trong quá
trình thu nhập mẫu bệnh trên trứng cá, và hỗ trợ giải đáp thắc mắc trong quá trình
làm đề tài.
Cô Nguyễn Hoài Hương, phòng Vi sinh, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực
Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận
tình giúp đỡ em trong quá trình nhận đề tài.
Các bạn lớp 11DSH04 đã luôn đồng hành, chia sẻ và giúp đỡ em trong suốt
thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Cuối cùng, con xin cám ơn Ba Mẹ, đã nuôi nấng, chăm sóc và tạo mọi điều
kiện cho con ăn học thành người có ích cho xã hội và anh hai, người đã luôn bên
cạnh động viên, định hướng cho em những khi em gặp khó khăn trong công việc.

Đồ Án Tốt Nghiệp

MỤC LỤC
MỤC LỤC................................................................................................................... i
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ............................................................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG........................................................................................ vi
DANH MỤC HÌNH ẢNH ....................................................................................... vii
MỞ

ĐẦU

.....................................................................................................................1
1.

Tính cấp thiết của đề tài ..................................................................................1

2.

Tình hình nghiên cứu ......................................................................................1

3.

Mục đích nghiên cứu.......................................................................................2

4.

Nhiệm vụ nghiên cứu ......................................................................................2

5.

Phương pháp nghiên cứu.................................................................................2

6.

Các kết quả đạt được của đề tài.......................................................................3

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................4

1.1. Cá Bá Chủ......................................................................................................4
1.1.1.

Hệ thống phân loại ..............................................................................4

1.1.2.

Đặc điểm sinh thái học ........................................................................5

1.1.2.1. Hình thái ..........................................................................................5
1.1.2.2. Sinh học sinh sản .............................................................................6
1.1.3.

Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ tại Việt Nam ........................................9

1.2. Bệnh nấm thủy sản ........................................................................................9
1.2.1.

Bệnh nấm thủy mi .............................................................................10

1.2.2.

Bệnh do nấm Lagenidium..................................................................10

1.2.3.

Bệnh do nấm Haliphthoros ...............................................................10

1.2.4.

Bệnh do nấm Fusarium .....................................................................11
i


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2.5.

Bệnh do nấm Plectosporium .............................................................11

1.3. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ..........................................11
1.3.1.

Các phương pháp ly trích DNA.........................................................11

1.3.1.1. Nguyên tắc .....................................................................................11
1.3.1.2. Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật ..........................................12
1.3.2.

PCR trong định danh vi sinh vật .......................................................13

1.3.2.1. Kỹ thuật PCR .................................................................................13
1.3.2.2. Gen rDNA......................................................................................14
1.3.2.3. Mồi.................................................................................................14
1.3.2.4. Ứng dụng của PCR trong quá trình định danh loài vi sinh vật......16
1.3.3.

Xây dựng cây phát sinh loài ..............................................................16

1.4. Kỹ thuật khuếch tán đĩa giấy kháng sinh vào môi trường thạch .................17
1.4.1.

Phạm vi áp dụng ................................................................................17

1.4.2.

Kháng sinh.........................................................................................17

1.5. Phương pháp chụp SEM ..............................................................................22
CHƯƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................24

2.1. Vật liệu, thiết bị và hóa chất ........................................................................24
2.1.1.

Dụng cụ và thiết bị ............................................................................24

2.1.2.

Nguồn mẫu ........................................................................................24

2.1.3.

Hóa chất .............................................................................................24

2.1.3.1. Môi trường nuôi cấy ......................................................................24
2.1.3.2. Các hóa chất định danh ..................................................................24
2.1.3.3. Các hóa chất phản ứng PCR ..........................................................24
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................25

ii


Đồ Án Tốt Nghiệp

2.2.1.

Phân lập nấm gây bệnh......................................................................25

2.2.2.

Phương pháp phòng ẩm .....................................................................26

2.2.3.

Định danh bằng sinh học phân tử ......................................................26

2.2.3.1. Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA bằng CTAB ...26
2.2.3.2. Phản ứng PCR................................................................................27
2.2.3.3. Dùng PCR để khuếch đại đoạn gen ITS của nấm bệnh................30
2.2.3.4. Giải trình tự và định danh ..............................................................32
2.2.4.

Kháng sinh đồ....................................................................................32

2.2.4.1. Nguyên lý.......................................................................................32
2.2.4.2. Đĩa giấy kháng sinh .......................................................................32
2.2.4.3. Các bước thực hiện ........................................................................33
2.2.5.

Phương pháp cảm nhiễm ...................................................................33

2.2.5.1. Chuẩn bị .........................................................................................33
2.2.5.2. Bố trí thí nghiệm ............................................................................34
2.2.6.
CHƯƠNG 3.

Phương pháp chụp SEM....................................................................34
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .........................................................35

3.1. Kết quả phân lập và làm thuần của nấm bệnh .............................................35
3.1.1.

Kết quả thu nhận mẫu trứng bệnh .....................................................35

3.1.2.

Kết quả hình thái khuẩn lạc ...............................................................36

3.1.3.

Kết quả quan sát sợi khuẩn ty và bào tử............................................38

3.2. Định danh các chủng nấm bằng vùng gen ITS ............................................40
3.2.1.

Kết quả ly trích, thu nhận bộ gen DNA.............................................41

3.2.2.

Kết quả nhân bản đoạn gen bảo tồn ITS ...........................................41

3


Đồ Án Tốt Nghiệp

3.3. Kết quả so sánh vùng gen ITS của 3 chủng M.1.1, M.1, M.4.1 và thiết lập
cây phát sinh loài dựa trên ngân hàng dữ liệu gen NCBI .....................................42
3.3.1.

Trình tự vùng gen ITS của các chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 .............42

3.3.2.

Thiết lập cây phát sinh loài................................................................43

3.4. Kết quả độ nhạy cảm của các chủng nấm với kháng sinh ...........................45
3.5. Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm giữa nấm và trứng cá bằng kĩ thuật
SEM .....................................................................................................................46
3.5.1.

Kết quả hình ảnh lây nhiễm dưới kính hiển vi quang học ................47

3.5.2.

Kết quả hình ảnh quá trình lây nhiễm bằng kĩ thuật SEM ................49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................51
1.

Kết luận .........................................................................................................51

2.

Kiến nghị .......................................................................................................51

TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................53
PHỤ LỤC A: Thành phần môi trường ........................................................................1
PHỤ LỤC B: Kết quả trình tự vùng gen bảo tồn ITS .................................................2
PHỤ LỤC C: Kết quả trình tự vùng gen của các chủng so sánh trên NCBI ..............5
PHỤ LỤC D: Kết quả hình ảnh kĩ thuật SEM quá trình lây nhiễm giữa nấm và
trứng cá Bá Chủ...........................................................................................................7

4

Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Bp

Base Pair

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

DNA

Deoxyribonucleotide Acid

EDTA

Ethylene- diamine-Tetraacetic-Acid

ITS

Internal transcribed spacer

PCR

Polymerase Chain Reation

PDA

Potato Dextrose Agar

PDB

Potato Dextrose Broth

PYGSA

Peptone Yeast extract Glucose Salt Agar

SEM

Scanning Electron Microscope

TAE

Tris-Acetic acid- Ethylenediamine- Tetraacetae

TE

Tris- Ethylenediamine- Tetraacet

5


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các trình tự đoạn mồi vùng gen ITS [22]. ...............................................15
Bảng 3.1. Kết quả độ nhạy cảm của chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 với kháng sinh ...45
Bảng 3.2. Kích thước đường kính vòng kháng khuẩn và kháng nấm sau 72 giờ.....46

6


Đồ Án Tốt Nghiệp

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1. Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28]. ....................................................5
Hình 1.2. Con đực đang nuốt trứng vào miệng để ấp [29]. ........................................7
Hình 1.3. Trứng cá Bá Chủ sau khi thụ tinh [21]. ......................................................8
Hình 1.4. Hệ thống bể ươm [4]. .................................................................................9
Hình 1.5. Bản đồ mồi trong vùng gen ITS [22]. ......................................................15
Hình 1.6. Hình thái bên ngoài của vật kí sinh chụp bằng SEM [14]........................23
Hình 1.7. Sự thay đổi hình thái xảy ra trên bề mặt tế bào chụp bằng SEM [14]. ....23
Hình 3.1. Trứng cá Bá Chủ ......................................................................................35
Hình 3.2. Trứng cá Bá Chủ bị nhiễm bệnh ..............................................................35
o

Hình 3.3. Khuẩn lạc chủng M.1.1 trên môi trường PDA ở 28 C trong 72 giờ. .......36
o

Hình 3.4. Khuẩn lạc chủng M.1 trên môi trường PDA ở 28 C trong 72 giờ. ..........36
o

Hình 3.5. Khuẩn lạc chủng M.4.1 trên môi trường PDA ở 28 C .............................37
Hình 3.6. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1.1 (40X).................38
Hình 3.7. Sợi khuẩn ty và sự hình thành bào tử của chủng M.1 (100X)..................39
Hình 3.8. Sợi khuẩn ty và bào tử của chủng M.4.1 (100X). ....................................40
Hình 3.9. Kết quả điện di sản phẩm ly trích bộ gen DNA của 3 chủng M.1.1, M.1

và M.4.1 trên gel agarose 1%. ...................................................................................41
Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm PCR của 3 chủng M.1.1, M.1 và M.4.1 trên
gel agarose 1%. .........................................................................................................42
Hình 3.11. Cây phát sinh loài dựa trên phân tích trình tự vùng gen ITS các chủng
M.1.1, M.1, M.4.1 với các chủng nấm trên ngân hàng gen NCBI............................43

vii


Đồ Án Tốt Nghiệp

Hình 3.12. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.4.1 dưới kính hiển vi quang học
(100X). ......................................................................................................................47
Hình 3.13. Kết quả mẫu đối chứng dưới kính hiển vi quang học (100X). ...............48
Hình 3.14. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1.1 dưới kính hiển vi quang học
(100X). ......................................................................................................................48
Hình 3.15. Kết quả mẫu trứng cảm nhiễm chủng M.1 dưới kính hiển vi quang học
(100X). ......................................................................................................................49
Hình 3.16. Bề mặt trứng mẫu đối chứng chụp bằng SEM. ......................................49
Hình 3.17. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (100X và 500X)
...................................................................................................................................50
Hình 3.18. Bề mặt mẫu trứng nhiễm chủng M.4.1 chụp bằng SEM (500X và
1000X).......................................................................................................................50

viii


Đồ Án Tốt Nghiệp

MỞ ĐẦU

1. Tính cấp thiết của đề tài
Ở Việt Nam có tiềm năng lớn cho phát triển cá cảnh do có khí hậu nhiệt đới,
nguồn lợi thủy sinh tự nhiên phong phú và sự đa dạng của các hệ thống sông và
kênh rất thuận lợi cho sự phát triển nghề cá cảnh, đặc biệt phù hợp cho sự sinh sản
và phát triển các loài cá cảnh nhiệt đới. Người chơi cá cảnh ở nước ta đang có xu
hướng chuyển dần sang chơi các loài cá cảnh biển do chúng có nhiều màu sắc đẹp,
đa dạng về thành phần loài. Nguồn cá cảnh biển đa số được khai thác từ tự nhiên
hoặc nhập từ nước ngoài.
Hiện nay, cá Bá Chủ là loài có giá trị kinh tế cao, chúng có màu sắc đẹp và dễ
nuôi nên đang được người chơi cá cảnh ngày càng ưa chuộng. Cá Bá Chủ đang
trong quá trình nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình sản xuất giống cá Bá Chủ
trong điều kiện nuôi nhốt tại Việt Nam. Việc phát triển quy trình sản xuất trong điều
kiện nuôi nhốt sẽ giúp cho loài cá này được sinh sản nhân tạo tại chỗ, không cần
phải mua và vận chuyển từ nguồn đánh bắt ngoài tự nhiên. Điều này sẽ giúp gia
tăng số lượng cá Bá Chủ được sinh sản nhân tạo và làm giảm áp lực cho nguồn cá
tự nhiên, đồng thời đem lại nguồn lợi to lớn cho nghề nuôi trồng cá cảnh của nước
ta.
Tuy nhiên, trong quá trình xây dựng quy trình sinh sản và ương nuôi cá bột
thành cá giống, nấm bệnh gây hư hỏng trứng cá làm tỉ lệ trứng nở giảm mạnh, làm
chậm tiến trình gia tăng số lượng cá Bá Chủ, ảnh hưởng nghiêm trọng đến quy trình
sản suất. Cho nên việc xác định chủng nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ nhằm
tìm ra biện pháp khắc phục mang tính cấp thiết.
2. Tình hình nghiên cứu
Nghiên cứu ứng dụng quy trình sản xuất giống cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni
Koumans, 1933) tại Việt Nam của Thạc sĩ Võ Minh Sơn được công bố năm 2013
[4] và đang được triển khai với mục đích xây dựng quy trình sản xuất giống cá Bá

1

Đồ Án Tốt Nghiệp

Chủ trong điều kiện nuôi nhốt tại Việt Nam. Trong phạm vi đề tài, quan tâm đến
quy trình sinh sản và trứng cá bị nhiễm nấm bệnh gây hư hỏng.
Cá Bá chủ được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1996 và được xem là một loài cá
có khả năng kháng bệnh rất tốt. Tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu về bệnh trên loài
cá này, nhưng đến nay vẫn chưa có nghiên cứu về sự nhiễm nấm bệnh trên trứng
của cá Bá Chủ.
3. Mục đích nghiên cứu
Mục đích của đề tài là xác định được nấm gây bệnh trên trứng cá Bá Chủ, sau
khi xác định được nấm gây bệnh sẽ dựa vào những đặc điểm và những nghiên cứu
về nấm bệnh rồi đưa ra các biện pháp khắc phục kịp thời, đảm bảo quy trình sản
xuất đạt kết quả cao nhất.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Phân lập và làm thuần chủng nấm từ mẫu trứng bị nhiễm nấm bệnh.

-

Quan sát hình thái học (khuẩn lạc, khuẩn ty, bảo tử).

-

Định danh bằng sinh học phân tử.

-

Khảo sát khả năng kháng nấm của một số loại kháng sinh.

-

Cảm nhiễm bệnh bằng phương pháp Robert Koch.

-

Quan sát sự xâm nhiễm bằng phương pháp chụp SEM (kính hiển vi điện tử
quét).

5. Phương pháp nghiên cứu
-

Phương pháp phân lập và làm thuần nấm bệnh.

-

Phương pháp phòng ẩm (xem sợi khuẩn ty và bào tử).

-

Phương pháp tách chiết và thu nhận bộ gen DNA (theo phương pháp CTAB).

-

Phương pháp PCR dựa trên đoạn mồi ITS1F và ITS4R.

-

Phương pháp sinh tin học dựa trên các phần mềm (ChromasPro 1.5.0.0,
MEGA5 5.0.1.120, seaview4 4.32.0.0).

-

Phương pháp kháng sinh đồ (theo phương pháp đĩa thạch).

2


Đồ Án Tốt Nghiệp

-

Phương pháp cảm nhiễm (theo phương pháp Robert Koch).

-

Phương pháp chụp SEM.

6. Các kết quả đạt được của đề tài
-

Kết quả phân lập và làm thuần được các chủng nấm gây bệnh trên trứng cá
Bá Chủ.

-

Kết quả thu nhận được bộ gen DNA.

-

Kết quả nhân bản được vùng gen ITS bằng phương pháp PCR.

-

Kết quả kháng sinh có khả năng kháng nấm bệnh.

-

Kết quả cảm nhiễm

-

Kết quả hình SEM

3


Đồ Án Tốt Nghiệp

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Cá Bá Chủ

1.1.1. Hệ thống phân loại
Theo Koumans, 1933 cá có hệ thống phân loại như sau [4].
Giới (Kingdom)

Animalia

Ngành (Phylum)

Chordata

Lớp (Class)

Actinopterygii

Bộ (Order)

Perciformes

Họ (Family)

Apogonidae

Giống (Genus)

Pterapogon

Lòai (Species)

Pterapogon kauderni

Tên tiếng Anh: Banggai Cardinalfish, Cardinalfish, Highfin Cardinalfish,
Banner Cardinalfish, Outhouse Cardinal và tên tiếng Việt gọi là cá Bá Chủ.
Cá Bá Chủ là loài cá thuộc họ cá Sơn Apogonidae, tuy nhiên về di truyền
loài cá này tiến hoá một nhánh khác và có tên khoa học riêng biệt. Đa số các loài
thuộc họ cá Sơn là nhóm cá ăn đêm (nocturnal diet) và đóng vài trò quan trọng
trong hệ sinh thái san hô. Tuy nhiên, chỉ riêng loài cá Bá Chủ thuộc họ này có tập

tính ăn ban ngày (diurnal diet). Là loài ăn các động vật phù du và giáp xác nhỏ bao
gồm chủ yếu là nhóm giáp xác chân chèo (copepod) và nhóm giáp xác Crustacean
(tôm, cua). Chúng luôn luôn được tìm thấy sống cùng với các sinh vật khác bao
gồm hải quỳ (anemone), san hô (branching coral), cầu gai (sea urchin), sao biển (sea
star) và rễ cây ngập mặn. Khảo sát cho thấy vị trí cư trú của cá Bá Chủ có liên quan
tuyến tính với sự hiện diện của của mật độ cầu gai và mật độ cá Bá Chủ. Theo khảo

4


Đồ Án Tốt Nghiệp

sát cho thấy khi khai thác cá Bá Chủ đã dẫn đến quần thể động vật không xương
sống cũng giảm theo [7].
Hiện nay, cá Bá Chủ được ưa chuộng và đã xuất đi nhiều nước thuộc Châu
Âu, Mỹ và Châu Á với mục đích phục vụ cho người chơi cá cảnh. Do nhu cầu tiêu
thụ loài cá này càng tăng trên thế giới, cá Bá Chủ đã được nhiều nước sinh sản
thành công như Hawai (Mỹ) và Indonesia [4].
1.1.2. Đặc điểm sinh thái học
1.1.2.1. Hình thái
Cá Bá Chủ có hình thái vẻ ngoài rất đặc biệt, toàn thân màu trắng bạc rực rỡ
với những đường kẻ sọc màu đen. Cơ thể của nó còn được bao phủ bằng những
đốm nhỏ màu trắng và rất dễ nhận thấy những đốm này trên các vây lưng, vây hông,
vây đuôi và vây hậu môn. Sự bố trí, kích thước và số lượng của các đốm trắng nhỏ
này hết sức độc đáo và riêng biệt, có thể sử dụng để xác định mẫu vật. Ngòai ra, vây
lưng đầu tiên của cá Bá Chủ có núm tua và đuôi được chẻ nhánh sâu. Mắt của cá Bá
Chủ (loài ăn ngày) rất to, thậm chí khi so sánh với cả những thành viên ăn đêm
trong cùng một họ. Trọng lượng lớn nhất của loài cá này quan sát là khoảng 6,5 g
[18].

Hình 1.1. Cá Bá Chủ (Pterapogon kauderni) [28].

5


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.1.2.2. Sinh học sinh sản
Trong điều kiện phòng thí nghiệm, cá Bá Chủ đạt kích cỡ có thể tham gia
sinh sản khoảng 8 – 9 tháng tuổi với chiều dài chuẩn từ 3,5 cm khi được nuôi ở
o

o

nhiệt độ 25 – 26 C. Trong tự nhiên, khi nhiệt độ môi trường từ 29 – 31 C, con cái
có khả năng sinh sản đạt chiều dài chuẩn từ 3,4 – 3,5 cm tương đương với 6 tháng
tuổi. Trong khi đó, con đực nhỏ nhất có thể ấp trứng trong miệng được tìm thấy
trong tự nhiên có chiều dài chuẩn là 3,1 cm.
Cá Bá Chủ là loài cá sinh sản theo chu kỳ. Chu kì phát triển của noãn bào
tương thích với kiểu phát triển đồng bộ theo nhóm, trong đó có ít nhất hai nhóm
noãn bào có thể phân biệt được rõ ràng cùng một lúc, một nhóm noãn bào lớn phát
triển một cách đồng bộ và một nhóm noãn bào nhỏ hơn phát triển không đồng bộ từ
buồng trứng đang được phục hồi. Mỗi một chu kì sinh sản, con cái cần ít nhất là 20
ngày để buồng trứng có thể phát triển hoàn thiện. Tần suất sinh sản cao nhất được
o

quan sát là mỗi 25 ngày cho cá Bá Chủ được nuôi ở nhiệt độ 26 C. Kích thước lớn
nhất của noãn bào trưởng thành là khoảng 0,27 cm và trọng lượng trung bình là
0,013 g ở con cái có chiều dài lớn hơn 4,6 cm chiều dài chuẩn. Số lượng trứng trung
bình trong mỗi lần ấp trứng (được tách ra khỏi miệng con đực) là 40 trứng với

đường kính trung bình cỡ 0,03 cm. Trứng được kết dính với nhau bởi nhiều sợi đan
xen lẫn nhau giúp cho trứng không bị tách ra khi con đực xoay khối trứng để cung
cấp oxy.
Ngoài ra, cá Bá Chủ là loài ít sinh sản nhất so với các loài khác trong họ
Apogonidae và không thể hiện mối liên hệ giữa kích thước và sự mắn đẻ. Chiều dài
chuẩn của con cái trưởng thành là từ 3,8 – 5,8 cm và số lượng trứng sinh ra là dao
động từ 60 – 70 trứng. Khi kích thước của noãn bào càng lớn thì sức sinh sản sẽ
giảm đi. Thêm vào đó, khả năng sinh sản của cá Bá Chủ trong điều kiện phòng thí
nghiệm thường thấp hơn so với khả năng thực tế của nó. Nguyên nhân của hiện
tượng này là do số lượng trứng bị mất đi trong suốt quá trình chuyển từ con cái sang
con đực (khoảng 10 – 20 trứng) và một số trứng không được thụ tinh hoặc không

6


Đồ Án Tốt Nghiệp

phát triển được tìm thấy trong khoan miệng của cá đực trong vòng một giờ sau khi
thụ tinh.

Hình 1.2. Con đực đang nuốt trứng vào miệng để ấp [29].
Một điều thú vị nữa là cá Bá Chủ có chu kì sinh sản theo chu kì của trăng.
Trong đó, 60 % trứng được đẻ trong thời kì trăng tròn, 30 % ở tuần trăng cuối và 10
% ở tuần trăng đầu. Do đó, khi tính toán thời gian đẻ trứng và thời gian phóng thích
cá con nên dựa vào chu kì trăng.
Khác với các loài cá ôn đới khác, quá trình sinh sản chỉ diễn ra vào các tháng
ấm, cá Bá Chủ sinh sản quanh năm. Quá trình bắt cặp và ve vãn thường diễn ra vào
buổi sáng, quá trình thụ tinh xảy ra từ 13:00 giờ đến 15:30 giờ. Quá trình giải phóng
trứng diễn ra trong vòng 2 giây, khi cá cái giải phóng chùm trứng, cá đực lập tức
bơi vòng quanh, thụ tinh và ngậm trứng vào miệng. Thời gian diễn ra của quá trình

thụ tinh này không quá 3 giây. Sau khi thụ tinh, con cái thể hiện vai trò là người bảo
vệ cho con đực nhưng biểu hiện này không dài quá 30 phút. Con đực sau khi ngậm
trứng thường xuyên mở rộng miệng và xoay khối trứng, hành động này thường thu
hút sự chú ý của những con đực khác và bị tấn công dành trứng nếu được nuôi
chung một bể.
Trứng của cá Bá Chủ có đường kính trứng lớn (trung bình 0,3 cm), nhiệt độ
o

tại thời điểm sinh sản là 26 C, tuổi biến thái vào ngày thứ 20 - 25 sau khi nở (tương

7


Đồ Án Tốt Nghiệp

ứng chiều dài 0,10 – 0,11 cm). Loài cá này sinh sản tự nhiên trong bể nuôi cá cảnh
o

ở nhiệt độ 27 C. Con đực ấp trứng trong miệng và tiếp tục giữ cá bột cho đến ngày
o

thứ 21 – 24. Thời gian ấp trứng từ khoảng 25 - 28 ngày ở nhiệt độ 26 C, trong thời
gian này con đực không ăn. Tuy nhiên, với các điều kiện nuôi không tốt, bị ép bắt
cặp và sức khỏe con đực kém sẽ dẫn đến tình trạng con đực nuốt trứng. Trong quá
trình ấp trứng, con đực có thể phát hiện ra trứng chết và tống nó ra ngoài. Điều này
hạn chế quá trình nhiễm nấm và vi khuẩn từ trứng chết đồng thời tránh lây lan cho
những trứng khỏe. Tỉ lệ thụ tinh đạt trung bình 60 % khi trứng được ấp trong miệng
con đực. Tuy nhiên, trong điều kiện phòng thí nghiệm tỉ lệ thụ tinh đạt thấp hơn vào
khoảng 40 – 60 % trong điều kiện tách riêng từng cặp sinh sản và khoảng 15 – 25 %
khi nuôi chung trong bể nhiều con.

Hình 1.3. Trứng cá Bá Chủ sau khi thụ tinh [21].
Sau khi nở từ 6 đến 8 ngày, cá con được phóng thích ra khỏi miệng con đực.
Thời gian phóng thích thường vào lúc gần sáng, khi trời còn tối. Ngay sau đó, lập
tức chúng bơi theo từng đàn nhỏ và có thể bắt đầu ăn thức ăn có kích thước lớn như
ấu trùng Artermia. Chúng cũng bắt đầu tìm kiếm nơi để trú ngụ từ các giá thể có sẳn
như đá, nhưng nếu có nhím biển Diadema, chúng lập tức lẫn vào giữa các ống gai
của nhím hoặc các giá thể nhân tạo có hình dáng giống nhím biển hay bãi cỏ biển,...

8


Đồ Án Tốt Nghiệp

kích thước của cá con sau khi được phóng thích là 0,8 cm và noãn hoàn hầu như đã
được hấp thụ hết [19].
1.1.3. Quy trình ấp trứng cá Bá Chủ tại Việt Nam
Ấp trứng ngoài cơ thể cá đực: Trứng sau khi thụ tinh vài ngày và được con
đực ấp trong miệng, trứng được tách ra từ con đực, ấp trong hệ thống nước chảy
o

tràn với độ mặn 30 ppt, nhiệt độ 28 C cho đến khi trứng nở thành cá bột. Hệ thống
ấp hình phiễu được đặt chìm trong bể ương [4].

Hình 1.4. Hệ thống bể ươm [4].
1.2.

Bệnh nấm thủy sản
Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh nấm ở động vật thủy

sản như một số loài nấm bất toàn thuộc các giống như Fusarium, Acremonium,
Plectosporium, Ochroconis, Phoma, Exophiala và nhóm nấm thủy mi như
Saprolegnia, Achlya, Leptolegnia và Aphanomyces là tác nhân gây bệnh ở động vật
thủy sản [3].

9


Đồ Án Tốt Nghiệp

1.2.1. Bệnh nấm thủy mi
Tác nhân chủ yếu gồm các giống Saprolegnia, Aphanomyces và Achlya.
Nấm có dạng sợi, cấu tạo các sợi nấm đa bào và không có vách ngăn ngang. Các sợi
nấm dầy và bện vào nhau trông giống như túi bông gòn bên ngoài cơ thể vật chủ,
chúng có khả năng sinh sản vô tính và hữu tính. Nấm Saprolegnia là tác nhân cơ hội
gây bệnh ở cá chép Cyprinus carpio, cá lóc Chanos chanos và cá Odonthetes
bonariensis ở Nhật Bản. Loài S. diclina nhiễm ở trứng cá hồi Oncorhynchus mykiss
ở Nhật Bản, trứng cá chép ở Thái Lan và S. salmonis sp. nov. nhiễm ở cá hồi O.
nerka [20].
1.2.2. Bệnh do nấm Lagenidium
Nấm khi nuôi cấy trên môi trường PYGSA khuẩn lạc có màu trắng và đường
o

kính 3,5 - 4,0 cm sau 5 ngày, ở 25 C. Sợi nấm không vách ngăn và không phân
nhánh, có nhiều hạt nhỏ bên trong, đường kính 5 - 40 µm. Dấu hiệu nhận biết là
xuất hiện đốm trắng bên ngoài vật chủ, đồng thời quan sát tiêu bản tươi cho thấy có
sự hiện diện của sợi nấm. Tỷ lệ gây chết do nấm Lagenidium trên ấu trùng cua có
thể lên đến 100 %. Loài L. callinectes gây bệnh ở giai đoạn trứng và ấu trùng ghẹ
xanh Callinectes sapidus và Portunus pelagicus, ở ấu trùng cua biển Scylla serrata
và ở tôm biển Pandalus hypsinotus. Loài nấm khác là L. thermophilum nhiễm ở giai

đoạn trứng và ấu trùng cua biển và tôm sú và L. myophilum nhiễm ở tôm Pandalus
o

hypsinotus. Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển tốt là 25 C và độ mặn khoảng
0 - 50‰ [2].
1.2.3. Bệnh do nấm Haliphthoros
Nấm khi nuôi cấy trên môi trường PYGSA khuẩn lạc có màu trắng và đường
o

kính 2,0 - 2,5 cm sau 5 ngày ở 25 C. Sợi nấm có nhiều hạt nhỏ sáng bên trong,
không có vách ngăn, nhưng phân nhánh, đường kính 7,5 - 30 µm. Sợi nấm có điểm
mấu tạo thành túi bào tử. Động bào tử có kích thước 6,5 x 8,5 µm, hình quả thận
hay đế giày với hai tiên mao ở hai đầu. Loài nấm H. milfordensis và H.

10


Đồ Án Tốt Nghiệp

philippinensis nhiễm ở hàu Urosalpinx cinerea, tôm hùm Homarus americanus, bào
ngư Haliotis sieboldii, ấu trùng cua S. serrata, ghẹ P. pelagicus và tôm he P.
o

japonicas. Nhiệt độ tối ưu cho nấm phát triển từ 25- 30 C, pH 4 - 11 và độ mặn
khoảng 10-50‰ [3].
1.2.4. Bệnh do nấm Fusarium
Một số loài như Fusarium solani, F. moniliforme và F. oxysporum là tác
nhân gây bệnh đen mang ở tôm he P. japonicus. Tác nhân gây bệnh đen mang ở tôm
sú P.monodon và trên tôm hùm Homarus americanus do nấm F. incarnatum. Ngoài
ra, nấm F. solani nhiễm trên rùa biển Caretta caretta và nấm Fusarium sp. nhiễm

trên tôm càng xanh [10].
1.2.5. Bệnh do nấm Plectosporium
Nấm Plectosporium khuẩn lạc phát triển rất chậm trên môi trường PYGSA,
o

đường kính 1,0 - 1,3 cm sau 14 ngày ủ ở 25 C, bề mặt nhẵn có màu trắng đục hoặc
hơi vàng. Sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn đường kính 1 - 4 µm. Cuống sinh bào
tử dạng thể bình không phân nhánh, có vách ngăn ở phần gốc. Bào tử dạng ellip, trụ
hơi cong, có 0, 1, hoặc 3 vách ngăn, đường kính 12 - 16 x 3 - 4 µm. Loài
Plectosporium oratosquillae trên môi trường PYGSA, khuẩn lạc 0,9 - 1,7 cm sau 15
o

ngày ở 25 C, có nguồn gốc từ nước mặn vì chúng phát triển tốt ở môi trường có 100
% nước biển và không phát triển trong môi trường nước ngọt. Nấm P.oratosquillae
là tác nhân gây bệnh nâu mang ở tôm tít O. oratoria và loài này có khả năng gây
bệnh đen mang ở tôm he P.japonicus trong điều kiện thí nghiệm [3].
1.3.

Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử

1.3.1. Các phương pháp ly trích DNA
1.3.1.1. Nguyên tắc
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu
nhận một lượng nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch để tiến hành các thí nghiệm tiếp

11


Đồ Án Tốt Nghiệp

theo. Mối quan tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận
được các phân tử này ở trạng thái nguyên vẹn tối đa không bị phân hủy bởi các tác
nhân cơ học (phân tử bị gãy do nghiền, lắc mạnh) hay hóa học (phân tử bị thủy giải
bởi các enzyme nội bào giải phóng ra môi trường khi tế bào bị phá vỡ). Các nucleic
acid cần được tách chiết trong điều kiện nhiệt độ thấp để ức chế hoạt động của các
enzyme nội bào (desoxyribonuclease - DNase và ribonuclease - RNase).
1.3.1.2. Phương pháp ly trích DNA vi sinh vật
Vi sinh vật trong tự nhiên rất đa dạng, mức độ đa dạng của vi sinh vật thay
đổi theo từng môi trường. Những vi sinh vật tìm thấy thường là những tế bào đơn
hoặc là những quần thể vi sinh vật. Sự phức tạp tính di truyền của cộng đồng vi sinh
vật được đánh giá thông qua việc xác định bởi sự tổ hợp DNA, chưa kể sự có mặt
của những bộ gen hiếm và những vi sinh vật chưa được khám phá. Do đó, việc tách
chiết DNA vi sinh vật để phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng là rất cần thiết. Quá
trình ly trích DNA cần phải đảm bảo về độ tinh khiết và độ nguyên vẹn về cấu trúc
để có thể thực hiện được các khâu nghiên cứu tiếp theo. Có rất nhiều phương pháp
ly trích DNA tổng số, tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu mà lựa chọn các phương
pháp ly trích DNA tổng số cho phù hợp.
Những phương pháp ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên
thường được sử dụng:
-

Phương pháp Sodium Dodecyl Sulfate (SDS): được xem là phương pháp
thích hợp nhất, đơn giản và nhanh chóng thu nhận DNA của vi sinh vật với
hiệu quả cao, phục vụ cho quá trình PCR tiếp theo. Phương pháp ly trích sử
dụng nồng độ muối cao 11 (1,5 M NaCl) và ủ mẫu trong 2 - 3 giờ trong sự
hiện diện của SDS, hexadecyltrimethylammonium bromide, và proteinase K.

-

Phương pháp Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide (CTAB): Đây là phương

pháp dùng trong chiết xuất acid nucleic có hiệu quả cao, CTAB là một dung
môi có khả năng hòa tan cao acid nucleic, vì vậy mà CTAB được dùng với

12


Đồ Án Tốt Nghiệp

vai trò là chất chính trong tách chiết acid nucleic. Ly trích DNA cần phải có
cả hai yếu tố là hiệu suất và độ tinh khiết.
-

Phương pháp Benzyl chloride: Đây là phương pháp ly trích DNA tương đối
hiệu quả, có thể phá vỡ thành tế bào vi khuẩn kết hợp với việc gia nhiệt đến
0

65 C. Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh chóng và mang lại
kết quả khá cao.
-

Phương pháp đóng băng và tan băng: Phương pháp này sử dụng kỹ thuật
o

đóng băng và tan băng ở - 65 C trong ba chu kỳ nhằm ức chế phá vỡ vách tế
bào, giải phóng các thành phần bên trong tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho
việc ly trích DNA tổng số vi sinh vật từ môi trường tự nhiên.
1.3.2. PCR trong định danh vi sinh vật
1.3.2.1. Kỹ thuật PCR
Đây là một kĩ thuật sinh hóa và sinh học phân tử hiện đại cho sự khuếch đại
nhanh đoạn DNA thông qua con đường sao chép của enzyme bên ngoài sinh vật

sống. Hiện nay, PCR đã trở thành một kĩ thuật thông dụng được sử dụng rộng rãi
trong các phòng thí nghiệm sinh học và y dược để phát hiện các bệnh di truyền, tạo
ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh truyền nhiễm, tạo dòng gen.
PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNA dựa
trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản
sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase
và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này. Primer là những đoạn DNA
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt
động của DNA polymerase, đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới.
Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của DNA polymerase, đoạn
DNA nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức
có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn
DNA này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel. Như vậy, để
khuếch đại một trình tự DNA xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về

13


Đồ Án Tốt Nghiệp

trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các
primer bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược [11].
1.3.2.2. Gen rDNA
Gen rDNA là nhóm gen mã hóa RNA của ribosome, đóng vai trò quan trọng
trong các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó
là một gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao
của gen nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa.
Hơn nữa, ribosome hầu như tồn tại ở mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa.
Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương
đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa

trên những oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật
nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer
và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng trình tự không bảo tồn dùng trong
phát hiện và định danh vi sinh vật.
Gen rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen,
khuếch đại và đọc trình tự, người ta đã đọc được rất nhiều trình tự rDNA. Đặc biệt
phương pháp đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR ra đời tạo rất nhiều thuận lợi cho
các nghiên cứu liên quan đến rDNA. Các nghiên cứu sinh học phân tử nhằm phân
loại nấm trên cơ sở rDNA được phát triển những năm đầu của thập niên 90 đã tìm
được quan hệ di truyền của nhiều loài nấm sợi.
1.3.2.3. Mồi
Internal transcribed spacer (ITS) là vùng phiên mã bên trong, có rất nhiều sự
biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng trong nghiên cứu tiến hóa của vi
sinh tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ thường sử dụng ở mức độ xác
định các biệt hóa trong cùng loài [9].
Các mồi vùng ITS được thiết kế dựa trên vùng bảo tồn của các gen 18S, 5,8S
và 28S. ITS1 là trình tự bổ sung của NS8. Mồi ITS2 và ITS3 được thiết kế và sàng

14