Nghiên cứu thu nhận và khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids qua quá trình lên men chủng candida bombicola

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ
HOẠT TÍNH CỦA SOPHOROLIPIDS QUA QUÁ
TRÌNH LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀNG DŨNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110044

: HUỲNH THỊ DIỄM TRINH
Lớp: 11DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2015


LỜI CAM ĐOAN
Người thực hiện đề tài: Huỳnh Thị Diễm Trinh
Sinh viên trường: Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh
Khoa: Công nghệ Sinh học - Thực phẩm - Môi Trường
Ngành: Công nghệ Sinh học
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

Lớp: 11DSH01
MSSV: 1151110044
Người thực hiện đề tài xin cam đoan những nội dung trong đồ án tốt nghiệp này
là do người thực hiện đề tài làm tại Viện Sinh học Nhiệt đới, dưới sự hướng dẫn của
TS. Nguyễn Hoàng Dũng. Các số liệu thu thập được và kết quả phân tích trong bài là
trung thực, không sao chép từ bất cứ bài báo cáo nào đã được công bố trước đây. Một
số nội dung trong đồ án tốt nghiệp có tham khảo và sử dụng dữ liệu, thông tin được
đăng tải trên các trang web, tác phẩm, bài báo theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ
án.
Nếu có bất cứ sự sao chép và không trung thực trong bài báo cáo này, người
thực hiện đề tài xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước khoa Công nghệ Sinh học – Thực
phẩm - Môi trường, trước ban giám hiệu trường Đại học Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh
Ngày ….tháng….năm…
Sinh viên thực hiện
(ký và ghi rõ họ tên)


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm và giúp đỡ
nhiệt tình của các thầy cô, các anh chị và các bạn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành
của mình đến:
Các thầy cô Bộ môn trong khoa Công nghệ Sinh học – Thực phẩm – Môi trường
cùng các thầy cô trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã trực tiếp giảng dạy
và truyền đạt kiến thức cho tôi khi học ở trường.
Thầy Nguyễn Hoàng Dũng, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện Sinh học Nhiệt đới,
một người thầy, người anh đã tận tình hướng dẫn và luôn động viên tôi trong quá trình
thực hiện đồ án tốt nghiệp.
Thầy Hoàng Quốc Khánh và thầy Ngô Đức Duy, phòng Vi sinh ứng dụng, Viện
Sinh học Nhiệt đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp.
Chị Nguyễn Lương Hiếu Hòa, chị Lê Quỳnh Loan, bạn Trần Lê Việt Hà, bạn Lê

Văn Tâm đã luôn bên cạnh giúp đỡ, chia sẻ kiến thức, kinh nghiệm cũng như những
niềm vui nỗi buồn cùng tôi. Tất cả các anh chị, các bạn đang nghiên cứu ở phòng Vi
sinh ứng dụng, Viện Sinh học nhiệt đới đã nhiệt tình giúp đỡ và chỉ dạy cho tôi nhiều
điều trong suốt quá nghiên cứu.
Tập thể lớp 11DSH01, trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh, đã sát
cánh bên tôi trong suốt những năm tháng trên giảng đường đại học.
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn Ba, Mẹ và các em trong gia đình đã chăm
sóc, lo lắng và luôn dõi theo từng bước con đi. Sẵn sàng bên cạnh động viên và khích
lệ những lúc con khó khăn nhất, để con có thể vững tin và bước tiếp trên con đường đã
chọn.
Huỳnh Thị Diễm Trinh


MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT........................................................................................iv
DANH

MỤC

BẢNG

.......................................................................................................v DANH MỤC HÌNH
.......................................................................................................vi

MỞ

ĐẦU

.........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .............................................................................................1

2. Tình hình nghiên cứu .................................................................................................2
3. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................................2
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .................................................................................................2
5. Phương pháp nghiên cứu............................................................................................3
6. Các kết quả đạt được ..................................................................................................3
7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp ......................................................................................4
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................................5
1.1. Tổng quan về nấm men ...........................................................................................5
1.1.1. Đặc điểm hình thái tế bào nấm men...................................................................5
1.1.2. Cấu tạo tế bào nấm men .....................................................................................5
1.1.3. Sinh sản ở nấm men ...........................................................................................5
1.1.4. Ứng dụng của nấm men .....................................................................................6
1.1.5. Sơ lược về nấm men Candida bombicola ..........................................................7
1.2. Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) ................................8
1.2.1. Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học ....................................................8
1.2.2. Khái quát về sophorolipids (SLs) ....................................................................10
1.2.2.1. Giới thiệu chung về SLs ...........................................................................10
1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs .........................................................................11
1.2.2.3. Sinh tổng hợp SLs ....................................................................................12
1.2.2.4. Hoạt tính của SLs .....................................................................................13
1.2.2.5. Ứng dụng của SLs ....................................................................................15
i


1.3. Tình hình nghiên cứu về SLs ................................................................................17
1.3.1. Nước ngoài .......................................................................................................17
1.3.2. Trong nước .......................................................................................................18
1.4. Thực trạng nguồn dầu thải ở Việt Nam.................................................................18
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .......................................................20
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................20

2.2. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................20
2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................20
2.2.2. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu ........................................................................20
2.2.3. Hóa chất ...........................................................................................................21
2.3. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................22
2.3.1. Tăng sinh và bảo quản chủng C.bombicola ATCC 22214 ..............................23
2.3.2. Nuôi cấy và thu nhận Sophorolipids từ chủng C.bombicola ATCC 22214 ....23
2.3.3. Định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC) ......................25
2.3.4. Xác định thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC)............................................................................................................26
2.3.5. Khảo sát một số hoạt tính của SLs thu được ..................................................27
2.3.5.1. Khả năng nhũ hóa .....................................................................................27
2.3.5.2. Khả năng kháng oxy hóa ..........................................................................28
2.3.5.3. Khả năng kháng khuẩn .............................................................................29
2.4. Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................32
3.1. Kết quả thu nhận sophorolipids từ nguồn dầu thải và glucose .............................32
3.2. Kết quả ảnh hưởng của thời gian nuôi lên quá trình thu nhận Sophorolipids ......32
3.3. Kết quả định tính SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (TLC)...............33
3.4. Kết quả khảo sát thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng
cao (HPLC)............................................................................................................35
ii


3.5. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của SLs thu được .........................................37
3.6. Kết quả khảo sát khả năng kháng oxy hóa của SLs thu được...............................37
3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được..................................38
3.7.1. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp
khuếch tán trên đĩa thạch. ...............................................................................38
3.7.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương pháp

xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
........................................................39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ..............................................................41
4.1. Kết luận .................................................................................................................41
4.2. Kiến nghị ...............................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................42
PHỤ LỤC

3


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CHĐBM

Chất hoạt động bề mặt

CHĐBMHH

Chất hoạt động bề mặt hóa học

CHĐBMSH

Chất hoạt động bề mặt sinh học

CMC

Critical micelle concentration

DMSO

Dimethyl sulfoxide

DPPH

2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

HPLC

High performance liquid chromatography

IC

Inhibitory concentration

IC50

Inhibitory concentration 50%

OD

Optical density (mật độ quang học)

LB

Luria bertani

MIC

Minimum inhibitory concentration

SLs

Sophorolipids

SDO

Soybean dark oil

TLC

Thin layer chromatography

YM

Yeast malt medium

4


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình ..............9
Bảng 1.2. Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ
nước. .............................................................................................................14
Bảng 3.1. Kết quả khảo sát khả năng nhũ hóa của hỗn hợp SLs thu được. ..................37
Bảng 3.2. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch ...39
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được bằng phương
pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) .............................................40

5

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola.........................................................................7
Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid..............................................................................11
Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids ..........................................................12
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................22
Hình 2.2. Quy trình thu nhận sophorolipids ..................................................................24
Hình 2.3. Quy trình phân tích mẫu SLs trong sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) .......27
Hình 2.4. Cơ chế phản ứng DPPH.................................................................................28
Hình 3.1. Sophorolipids thu được .................................................................................32
Hình 3.2. Biểu đồ sản lượng SLs thu được ở những thời gian lên men lên men khác
nhau...............................................................................................................33
Hình 3.3. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được .........................................................................34
Hình 3.4. Sắc ký đồ mẫu SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao........36
Hình 3.5. Sắc ký đồ mẫu SLs chuẩn 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate. .................36
Hình 3.6. Biểu đồ thể hiện khả năng bắt các gốc tự do DPPH của hỗn hợp SLs thu
được. .............................................................................................................38
Hình 3.7. Kết quả khảo sát khả năng kháng khuẩn của SLs thu được trên đĩa thạch ...39

6


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Chất hoạt động bề mặt (CHĐBM) đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống hằng
ngày của con người. Chúng có mặt trong hầu hết các sản phẩm thiết yếu, trong mọi
ngành công nghiệp, góp phần phát triển và mang lại lợi nhuận vô cùng to lớn cho
ngành công nghiệp hóa chất. Chất hoạt động bề mặt là một trong những nhóm hóa chất
công nghiệp được sản xuất nhiều nhất hiện nay, với tổng sản lượng trên toàn thế giới
vượt quá 15 triệu tấn/năm và đang tăng dần theo thời gian. Chất hoạt động bề mặt được

ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chất tẩy rửa, mỹ phẩm, dược phẩm, thưc phẩm,
nông nghiệp, sản xuất giấy, tăng hiệu suất thu hồi dầu thô… Phần lớn chất hoạt động
bề mặt được sản xuất bằng con đường tổng hợp hóa học và từ dầu mỏ. Việc này
thường gây ảnh hưởng xấu đến môi trường bởi khả năng phân hủy sinh học của chất
hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) kém. Vì vậy, việc tổng hợp và ứng dụng các
chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học đang được quan tâm nhiều trong những
năm gần đây. Trong đó sophorolipids (SLs) – một dạng chất hoạt động bề mặt sinh học
(CHĐBMSH) thuộc nhóm glycolipid - được xem là rất có triển vọng bởi nhiều nguyên
nhân:
1. Vi sinh vật sản xuất không phải tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản
phẩm.
2. Những đặc tính ưu việt của SLs so với các chất hoạt động bề mặt hóa
học như khả năng phân hủy sinh học tốt hơn, độc tính thấp, thân thiện với
môi trường.
3. SLs có hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khác nhau về nhiệt độ,
pH và nồng độ muối cao.
Hiện nay, một vấn đề đặt ra trong việc sản xuất sophorolipids bằng phương
pháp sinh học là chi phí sản xuất còn khá cao không thể cạnh tranh với chất hoạt động
bề mặt hóa học. Để giải quyết vấn đề trên, hướng sản xuất sophorolipds từ các nguyên

1


liệu rẻ tiền đang được quan tâm hiện nay. Vì lý do đó, đề tài nghiên cứu thu nhận
sophorolipids qua quá trình lên men chủng Candida bombicola từ nguồn dầu thải đã
được thực hiện.
2. Tình hình nghiên cứu
Một số công trình nghiên cứu thu nhận SLs từ quá trình lên men C.bombicola đã
được công bố. Kim và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thu nhận SLs bởi chủng
C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải phụ phế phẩm của ngành công nghiệp

chế biến dầu nành (SDO) và đạt sản lượng 90 g/l. Tương tự, Daverey và Pakshirajan
(2009) công bố rằng họ thu được lượng 63,7 g/l SLs thông qua lêm men C.bombicola
ATCC 22214.
Hiện nay tại Việt Nam, một số công trình đề cập đến việc phân lập, nghiên cứu
khả năng tạo CHĐBMSH của một số chủng vi khuẩn đã được công bố. Đa số các
chủng được phân lập từ môi trường nước mặn nhằm mục đích xử lý ô nhiễm dầu. Tuy
nhiên, những công trình liên quan đến việc sản xuất và ứng dụng SLs vẫn chưa được
nghiên cứu thấu đáo.
3. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu thu nhận sophorolipids qua quá trình lên men của chủng
C.bombicola ATCC 22214 từ nguồn dầu thải.
Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
-

Lên men chủng C.bombicola ATCC 22214 trên môi trường chứa glucose và dầu
thải.

-

Thu nhận sophorolipids từ dịch lên men.

-

Định tính và xác định thành phần sophorolipids.

-

Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian lên men đến sản lượng sophorolipids

-

Khảo sát một số hoạt tính của sophorolipids như khả năng kháng khuẩn, chống
oxy hóa, khả năng nhũ hóa.


5. Phương pháp nghiên cứu
-

0

Thu nhận SLs thông qua nuôi cấy chủng C.bombicola ở điều kiện 30 C, pH6,
lắc 180 vòng/phút.

-

Định tính SLs bằng kỹ thuật sắc ký bảng mỏng (Thin Layer Chromatography –
TLC).

-

Phân tích thành phần SLs thu được bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC - High Performance Liquid Chromatography).

-

Xác định khả năng kháng khuẩn của SLs bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa
thạch và phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu.

-

Khả năng chống oxy hóa của SLs cũng được xác định thông qua khả năng bắt
các gốc tự do DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).

-

Khả năng nhũ hóa của SLs được xác định bằng phương pháp đo tỷ lệ hệ nhũ
tương được tạo thành so với hệ dung dịch ban đầu.

6. Các kết quả đạt được
Sản lượng SLs thu được sau quá trình lên men đạt 21,9 g/l. Thời gian lên men
thu nhận SLs từ chủng C.bombicola thích hợp nhất là 7 ngày.
Trong hỗn hợp SLs thu được có khoảng 10 cấu trúc SLs khác nhau. Bước đầu
xác định được sự hiện diện của 1′,4″-Sophorolactone 6′,6″-diacetate.
Khả năng kháng oxy hóa của SLs ở nồng độ 20 mg/ml là 84,32 % và IC50 cũng
được xác định 4,4531 mg/ml. Nồng độ ức chế tối thiểu đối với một số vi khuẩn cũng
được xác định S.aureus (1,25 mg/ml), P.aeruginosa (2,5 mg/ml), B.subtilis (0,6
mg/ml). Chỉ số nhũ hóa (E24) của SLs từ 39,39 – 65,45 % đối với các loại dầu hạt cải,
dầu nành và xăng.


7. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
Kết cấu của đồ án tốt nghiệp gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1.

Tổng quan về nấm men

1.1.1.

Đặc điểm hình thái tế bào nấm men

Nấm men thường có hình cầu hoặc hình bầu dục, một số loại hình que và một số
hình dạng khác. Kích thước trung bình của nấm men là 2,5 – 10 µm x 4,5 – 21 µm. Có
loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả. Khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt mà chỉ
là nhiều tế bào nối với nhau thành chuỗi dài. Có loài có thể tạo thành váng khi nuôi cấy
trên môi trường dịch thể [1].
1.1.2.

Cấu tạo tế bào nấm men

Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp, gần giống như tế bào thực vật. Tế bào
nấm men có đầy đủ các thành phần: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, ty thể,
ribosome, nhân, không bào và các hạt dự trữ.
Thành tế bào nấm men dầy khoảng 25 nm, được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao
gồm 90 % là hợp chất glucan và mannan, phần còn lại là protein, lipid và glucosamine.
Màng nguyên sinh chất của tế bào nấm men dày khoảng 8 nm có cấu tạo tương
tự như màng nguyên sinh chất của vi khuẩn.
Ty thể nấm men có hình bầu dục, được bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong
gấp khúc thành nhiều tấm răng lược hợc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của
màng trong tăng lên. DNA của ti thể nấm men là một phân tử dạng vòng có khối lượng
6

phân tử 50x10 Da, chiếm khoảng 15-23 % tổng lượng DNA của toàn tế bào nấm men

[1].
1.1.3.

Sinh sản ở nấm men

Nấm men sinh sản bằng hai hình thức: vô tính và hữu tính.
Sinh sản vô tính bằng cách nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến và điển hình
của tế bào nấm men. Khi tế bào trưởng thành, nhân sẽ dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa.
Trên tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con, hoặc cùng một lúc tế bào mẹ có thể tạo
ra nhiều tế bào con ở nhiều hướng khác nhau (tùy theo giống, loài). Mỗi chồi con sẽ


nhận một phần chất nhân và chất nguyên sinh từ tế bào mẹ. Khi chồi con trưởng thành,
nó sẽ hình thành một vách ngăn để tách khỏi tế bào mẹ và sống độc lập. Có trường
hợp, tế bào con không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy chồi tạo một tập hợp tế bào
nấm men có dạng xương rồng hay còn gọi là khuẩn ty giả. Ngoài ra, nấm men còn sinh
sản vô tính bằng hình thức phân cắt như ở vi khuẩn, chỉ thấy ở chi nấm men
Schizosaccharomyces và sinh sản bằng bào tử như: bào tử đốt ở chi Geotrichum, bào tử
bắn ở chi Sporobolomyces; bào tử áo ở nấm Candida albicans [1].
Sinh sản hữu tính ở nấm men là do sự tiếp hợp giữa hai tế bào nấm men với
nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử túi nằm trong nang (túi),
nang chín sẽ vỡ bào tử được phát tán ra bên ngoài, gặp điều thuận lợi phát triển thành
một tế bào nấm men mới [1].
1.1.4.

Ứng dụng của nấm men

Nấm men đóng vai trò quan trọng trong đời sống con người, một số ứng dụng
của nấm men như:
Tế bào nấm men cũng như những sản phẩm mà chúng sản sinh ra giàu protein,

vitamin, các acid amin cần thiết, chất khoáng… Nên nấm men được sử dụng trong thực
phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm… Sản phẩm của
nấm men còn được sử dụng như chất điều vị trong công nghệ thực phẩm.
Trong nông nghiệp: dịch chiết của nấm men có khả năng giúp thực vật chống lại
một số bệnh do vi khuẩn và nấm gây ra.
Trong chăn nuôi: nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men bổ sung vào thức ăn
của vật nuôi sẽ tăng cường hệ vi sinh vật đường ruột, giúp vật nuôi kháng lại các bệnh
đường ruột. Ngoài ra các nghiên cứu cũng nhận thấy sự tăng trọng, tăng sản lượng
trứng, sữa… khi bổ sung nấm men hoặc các sản phẩm từ nấm men vào thức ăn của vật
nuôi.
Bên cạnh đó cao nấm men giàu nitrogen, vitamin, chất khoáng và các hợp chất
kích thích tăng trưởng nên được sử dụng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vât.


1.1.5.


Sơ lược về nấm men Candida bombicola
Phân loại nấm men Candida bombicola

Giới: Nấm
Ngành: Ascomycota
Ngành phụ: Saccharomycotina
Lớp: Saccharomycetes
Bộ: Saccharomycetes
Họ: Incertae sedis
Giống: Candida
Loài: Candida bombicola
Chủng: Candida bombicola ATCC 22214
Nấm men Candida bombicola, trước đây được gọi là Torulopsis bombicola,

được phân lập từ mật của loài ong nghệ (bumble-bees) thuộc chi Bombus sp [47] .
Candida bombicola cùng với một số nấm men như Candida magnolia, Candida
apicola,

Candida

bororiensis,

Wickerhamiella domericqiae

và

Rhodotorula

bogoriensis được biết đến với khả năng sản xuất SLs – một glycolipid ngoại bào [12]
[19][20] [23][47] [48].

Hình 1.1. Tế bào nấm men C.bombicola
Nguồn: Kurtzman và Fell, (2001).


Tế bào nấm men Candida bombicola có dạng hình oval đến hình thon dài,
thường tồn tại riêng rẽ hoặc dính thành cặp, với kích thước tế bào là1,5 – 2,5 µm x 3 –
5 µm (Hình 1.1) [28].
0

Khi nuôi cấy đĩa trên môi trường bột bắp agar sau 7 ngày ở 25 C, tế bào nấm
men Candida bombicola không xuất hiện khuẩn ty giả hoặc tế bào bao gồm rất nhiều
các chuỗi ngắn phân nhánh dày đặc. Phát triển trong điều kiện hiếu khí thì khuẩn lạc có
màu kem đến màu xám tro, trơn, bóng, lồi và ria mép khuẩn lạc có dạng răng cưa [28].

Nấm men Candida bombicola có thể lên men glucose, sucrose và có khả năng
đồng hóa glucose, galactose, sucrose, ethanol, glycerol, D – Mannitol, D – Glucitol.
Chúng có thể phát triền ở nồng độ đường cao 100 g/L hoặc cao hơn [49].
Ngày nay, Candida bombicola thường được gọi là Starmerella bombicola C.A
Rosa & Lachance [14].
1.2.

Tổng quan về chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH)
1.2.1.

Khái quát về chất hoạt động bề mặt sinh học

Chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất có cấu trúc đa
dạng về hoạt tính bề mặt được tổng hợp bởi vi sinh vật. Tất cả CHĐBMSH là hợp chất
lưỡng cực, có cấu tạo gồm một nhóm ưa nước (thường là phân tử đường hoặc amino
acid) và một nhóm kị nước (thường là acid béo). Do cấu tạo phân cực, CHHBMSH có
xu hướng co cụm tại bề mặt và mặt phân cách giữa hai chất (có thể là chất lỏng - chất
lỏng, chất lỏng - chất rắn), kết quả là làm giảm sức căng bề mặt (giữa chất lỏng và
không khí) và giảm sức căng giữa 2 chất (chất lỏng - chất lỏng và chất lỏng - chất rắn)
[30][33] . Không giống như chất hoạt động bề mặt hóa học (CHĐBMHH) thường
phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHĐBMSH được phân loại dựa vào thành
phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra. Nhìn chung, CHĐBMSH được chia làm
các nhóm chính: glycolipid; lipopeptid và lipoprotein; phospholipid và acid béo;
CHĐBM trùng hợp và CHĐBM dạng hạt (Bảng 1.1) [6].


Bảng 1.1. Phân loại CHĐBMSH và các chủng vi sinh vật tổng hợp điển hình
CHĐBMSH
Rhamnolipids

Vi sinh vật sản xuất
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas sp.
Candida bombicola

Glycolipids

Sophorolipids

Candida apicola
Candida petrophilum
Rhodococcus erythropolis

Trehalolipids

Mycobacterium tuberculosis
Arthrobacter sp.

Lipopeptides và

Surfactin

Bacillus subtilis

lipoproteins

Lichenysin

Bacillus licheniformis

Phospholipids,

Acid béo

Corynebacterium lepus

acid béo và

Lipid trung tính

Nocardia erythropolis

lipid trung tính

Phospholipids

Thiobacillus thiooxidans

Alasan

Acinetobacter radioresistents KA-53

CHĐBMSH

Biodispersan

Acinetobacter calcoaceticus A2

dạng trùng hợp

Emulsan

Acinetobacter calcoaceticus RAG-1

(polymer)

Liposan

Candida lipolytica

Mannoprotein

Saccharomyces cerevisiae

CHĐBMSH

Vesicles và fimbriae

Acinetobacter calcoaceticus

dạng hạt

Whole cells

Nhiều loại vi khuẩn

Nguồn: Desai và Banat, (1997)
Các CHHBMSH thường tiết ra bên ngoài tế bào (extracellular) như các chất
glycolipid, axit béo, photpholipid, polysacarit lipid, lipopetic – lipoprotein, hay chính
bản thân bề mặt tế bào vi sinh vật. Ngoài đặc tính làm giảm sức căng bề mặt nó còn có

đặc tính kháng sinh như chất gramicidin S hay polymicin. Các CHHBMSH được tạo ra
cả ở trên các cơ chất không tan trong nước lẫn tan trong nước. Nó được tạo ra do phản
ứng thích nghi với môi trường không thuận lợi, độc hại và có xu hướng tạo ra nhiều
trên các cơ chất không tan trong nước [6].
Trên thị trường chất hoạt động bề mặt hiện nay, CHĐBMSH được quan tâm
nhiều hơn bởi một số đặc tính ưu việc như: độc tính thấp, khả năng phân hủy sinh học
cao, thân thiện với môi trường hơn, tính chọn lọc cao và khả năng hoạt động cao trong
môi trường có nhiệt độ, pH và nồng độ muối khắc nghiệt [27].
1.2.2.

Khái quát về sophorolipids (SLs)

1.2.2.1. Giới thiệu chung về SLs
SLs được xem như là chất hoạt động bề mặt ngoại bào, là sản phẩm được tiết ra
bởi nấm men Candida sp và Wickerhamiella domercqiae. SLs là một dạng CHĐBMSH
thuộc nhóm glycolipids có trọng lượng phân tử thấp, đang được quan tâm nhiều hiện
nay cho mục đích thương mại [42].
SLs được mô tả lần đầu tiên vào đầu những năm 60 như là một glycolipid
ngoại bào được tổng hợp bởi nấm men Torulopsis magnolia [20]. Sau đó vào năm
1968, Tulloch và Spencer đã báo cáo rằng chủng sản xuất SLs thực tế là Torulopsis
apicola, hiện nay được gọi là Candida apicola. Một nghiên cứu khác của Spencer và
cộng sự (1970) cho thấy rằng SLs cũng được sản xuất bởi nấm men Candida
bombicola. Trong đó, nấm men Candida bombicola ATCC 22214 được chú ý và
nghiên cứu nhiều hơn cả do nó có khả năng sản xuất với sản lượng cao SLs (400 g/l) và
không phải là tác nhân gây bệnh [49]. Không những thế C.bombicola ATCC 22214
còn có khả năng sử dụng dầu thải nhà hàng như là nguồn lipid cho quá trình tổng hợp
SLs [17]
SLs được xem là một CHĐBMSH có triển vọng bởi vì vi sinh vật sản xuất

không phải là tác nhân gây bệnh, dễ dàng thu hồi sản phẩm, có năng suất và chuyển
hóa cơ chất cao [38].


1.2.2.2. Cấu trúc hóa học của SLs
Về cấu trúc hóa học, SLs gồm phần ưa nước là disaccharide sophoroses (2-O-βD-glucopyranosyl-D-glucopyranose) liên kết với gốc hydroxyl của carbon kế cuối hoặc
cuối trong chuỗi acid béo C16-C18 (phần kỵ nước) bằng liên kết β-glucosidic ở vị trí
C1’ (Hình 1.2) [25].
Trong phân tử SLs, nhóm carboxyl của chuỗi acid béo hoặc ở trạng thái tự do
(cấu trúc SLs dạng mở hay dạng acid) hoặc là phản ứng este hóa nội sinh với nhóm
hydroxyl ở vị trí C 4” của phần sophorose (cấu trúc SLs dạng vòng hay dạng lacton)
[41]. Đây là hai dạng cấu trúc chính trong thành phần cấu tạo của SLs. Các cấu trúc
này có sự khác biệt về mức độ acetyl hóa (ở vị trí 6’ và 6”) của phần sophorose và
thành phần acid béo (chiều dài chuỗi, mức độ bão hòa, vị trí của nhóm hydroxyl) phụ
thuộc vào chủng sản xuất, điều kiện sinh trưởng và nguồn carbon kỵ nước [29].
Các phân tử SLs có cấu trúc khác nhau sẽ dẫn đến một vài sự khác nhau trong
các đặc tính sinh học và hóa lý của chúng và có thể được ứng dụng chuyên biệt trong
các lĩnh vực khác nhau [29]. Các sophorolipid lacton có hiệu quả hơn trong việc làm
giảm sức căng bề mặt và khả năng kháng khuẩn tốt hơn, trong khi sophorolipid acidic
tạo bọt và hòa tan tốt hơn.

Hình 1.2. Cấu trúc của sophorolipid
Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011)


1.2.2.3. Sinh tổng hợp SLs

Hình 1.3. Quá trình sinh tổng hợp sophorolipids
(1) lipase, (2) cytochrome P450 monooxygenase, (3) alcohol-dehydrogenase,(4)
aldehyde-dehydrogenase, (5) desaturase, (6) cytochrome P450 monooxygenase,

(7) glucosyltransferase I, (8) glucosyltransferase II, (9) lactonesterase, (10)
acetyltransferase.
Nguồn: Van Bogaert và cộng sự (2011)


Con đường sinh tổng hợp SLs được trình bày ở hình 1.3. Tiền chất lý tưởng cho
quá trình tổng hợp SLs là glucose và acid béo. Ngoài ra, các dạng methyl, ethyl esters
của acid béo hay triglycerides cũng có thể được sử dụng. Trong trường hợp này,
esterases sẽ thủy phân dần dần những chất này để tạo ra các acid béo. Do các chủng
như C.bombicola, C.apicola có thể tăng trưởng trên alkan nên chúng có hệ enzyme cần
thiết cho quá trình oxy hóa các alkan này để tạo nên các acid béo. Ở bước đầu tiên, các
acid béo được hydroxyl hóa ở vị trí cuối (ω) hay kế cuối (ω -1) bằng enzyme
cytochrome P450 monoxygenase. Ở C.bombicola, 5 gen cytochrome P450
monoxygenase khác nhau thuộc nhóm CYP52 đã được xác định. Ở bước thứ 2, glucose
thứ nhất được gắn vào vị trí C1’ của nhóm hydroxy bằng enzyme glycosyltransferase I.
Ở bước thứ 3, glucose thứ hai được gắn vào vị trí C2’ của glucose thứ nhất nhờ
enzyme glycosyltransferase II. Sản phẩm được tạo thành trong quá trình này chỉ là các
SLs dạng acid. Tuy nhiên, sau đó chúng thường được biến đổi tiếp thông qua quá trình
ester hóa để tạo nên SLs dạng lacton bằng enzyme lactonesterase và acetyl hóa đầu
carbohydrate bằng enzyme acetyltransferase để tạo nên các dạng acetyl [50].
1.2.2.4. Hoạt tính của SLs
Sophorolipids là CHĐBMSH thuộc nhóm glycolipids, có chỉ số cân bằng ưa
nước – ưa béo (HLB) khá rộng từ 8 – 10. Vì vậy, chúng được ứng dụng rộng trong
nhiều lĩnh vực như: mỹ phẩm, dược phẩm, chất tẩy rửa…
Tiêu chuẩn để đánh giá khả năng hoạt động của một CHĐBM là sức căng bề
mặt và nồng độ micelle tới hạn (CMC). SLs sản xuất từ nấm men Candida bombicola
trên môi trường chứa: mật rỉ đường mía, dịch chiết nấm men, ure và dầu đậu nành
được báo cáo là có khả năng làm giảm sức căng bề mặt nước và nồng độ micelle tới
hạn (CMC) tương ứng là 34,15 N/m và 59,43 mg/l [14]. Trong nghiên cứu sản xuất
SLs bởi nấm men Candida bombicola từ glucose và một số loại dầu như: dầu đậu nành

đen (SDO – phụ phẩm của ngành chế biến dầu nành), dầu bắp, dầu nành như là các
nguồn carbon, Kim và cộng sự (2005) đã xác định được giá trị CMC và sức căng bề


mặt tối thiểu trong dung dịch nước của SLs tương ứng là 150 mg/l và 48 mN/m; 82
mg/l và 41 mN/m; 88 mg/l và 40,5 mN/m. Tương tự, Otto và cộng sự (1999) cũng đã
báo cáo rằng 130 mg/l cho CMC và 39 m.N/m cho sức căng bề mặt tối thiểu của SLs
được sản xuất bởi nấm men sử dụng deproteinized whey và dầu hạt cải dầu như là các
nguồn carbon.
Bên cạnh khả năng làm giảm sức căng bề mặt thì khả năng nhũ hóa của SLs
cũng là một hoạt tính quan trọng giúp SLs ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola là một chất nhũ hóa kém, không thể ổn
định nhũ tương có chứa nước và một trong hai chất hydrocarbon hoặc dầu thực vật
[13][36] Tuy nhiên, một nghiên cứu của Daverey và Pakshirajan (2009) chứng minh
được rằng SLs được sản xuất bời nấm men C.bombicola ATCC 22214 sử dụng mật rỉ
đường mía như nguồn carbon, đã thể hiện hoạt tính nhũ hóa tốt hơn và ổn định hơn
(Bảng 1.2). Trong một nghiên cứu của Ma và cộng sự (2012) về hoạt tính sinh học và
bề mặt của phân tử SLs được sản xuất bởi Wickerhamiella domercqiae đã cho thấy
rằng SLs có khả năng nhũ hóa mạnh mẽ đối với các cơ chất kỵ nước được chọn cụ thể
là paraffin lỏng, dầu hạt cải dầu và sự nhũ hóa trở nên yếu hơn đối với dầu thô. Hơn
nữa, các nhũ tương được tạo thành ổn định ngay cả khi để yên trong hơn 1 tuần.
Bảng 1.2. Khả năng nhũ hóa của SLs được sản xuất bởi C.bombicola với cơ chất kỵ
nước.
Non – aqueous phase liquids

Emulsification activity

Kerosene

1,584

Xylene

2,016

Benzene

26,784

Hexadecane

2,880
Nguồn: Daverey và Pakshirajan (2009)

SLs cũng được chứng minh là có khả năng ức chế sự phát triển của một số
chủng vi khuẩn. Kết quả kiểm tra hoạt tính kháng khuẩn của SLs của Kim và cộng sự


(2005) cho thấy: nồng độ ức chế (IC) của SLs đối với vi khuẩn Bacillus subtilis và
Propionibacterium acne lần lượt là 4,0 mg/l và 0,5 mg/l. Điều đó chỉ ra rằng SLs có
thể được sử dụng trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe như là một tác nhân diệt
khuẩn. Năm 2013, Joshi-Navare và Prabhune đã tiến hành nghiên cứu hoạt tính kháng
khuẩn của SLs trong sự kết hợp với kháng sinh để tăng cường hiệu quả kháng khuẩn và
thu được kết quả: nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tetracycline với Staphylococcus
aureus (ATCC-29.737) được xác định là 150 g/ml và SLs là 400 g/ml.
Bên cạnh đó, SLs thô và SLs acid còn cho thấy có tác dụng đáng kể trong việc
chống lại các gốc tự do hydroxyl (OH). Theo đó, SLs thô và SLs acid ở nồng độ
0,028%, 0,083 % khối lượng khô (w/v) sẽ bắt được các gốc tự do tương ứng lên đến 97
%, 100 % và 98 %, 100 % [22].
Ngoài ra, SLs còn có những hoạt tính chuyên biệt trong các điều kiện khắc

nghiệt về nhiệt độ, pH và nồng độ muối. Kết quả nghiên cứu của Chandran và Das
(2011) đã cho thấy SLs hoạt động ổn định trong một phạm vi rộng của pH từ 2 – 10,
0

0

nhiệt độ từ 10 C – 100 C và ở nồng độ muối (NaCl) cao 8 – 10%.
1.2.2.5. Ứng dụng của SLs
SLs cho thấy có nhiều khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Hiện
nay, việc nghiên cứu phát triển sản phẩm từ SLs đang được nhiều nhóm nghiên cứu
tiến hành, đăng ký bằng sáng chế và một số đã được thương mại hóa. Một trong những
ứng dụng quan trọng nhất của SLs là làm chất hoạt động bề mặt. Công ty Saraya ở
Nhật đã tiến hành thương mại hóa sản phẩm sophoron, một loại nước rửa chén chứa
SLs [18]. SLs cũng có thể được sử dụng trong bột giặt với vai trò là chất tẩy rửa [21].
Vì SLs là một phân tử không mang điện tích nên chúng có thể duy trì được đặc tính có
sức căng bề mặt thấp ngay cả trong điều kiện nồng độ muối cao. Khả năng tạo nhũ
(emulsifying) của SLs cũng được ứng dụng trong các ngành hóa dầu. Chúng có thể
được sử dụng trong việc thu hồi các sản phẩm dầu thứ cấp, loại bỏ thành phần
hydrocarbon trong dầu thô. SLs còn được sử dụng để xử lý đất và nước bề mặt bị


nhiễm hydrocarbon; hấp thu các kim loại nặng có trong trầm tích [7][32] Ngoài ra, đặc
tính tạo nhũ của SLs cũng được áp dụng trong trong công nghiệp thực phẩm để làm
tăng chất lượng của bột mì hay trong các khoang chứa lạnh của máy bay để tránh tạo
các tinh thể đá [5][34].
Bên cạnh đó, SLs cũng được ứng dụng nhiều trong mỹ phẩm. Công ty Soliance
ở Pháp đã thương mại hóa các sản phẩm chăm sóc da, dưỡng thể chứa SLs. Một công
ty của Hàn Quốc cũng đang trong quá trình thương mại hóa các sản phẩm chứa SLs
trong mỹ phẩm. Ngoài vai trò tạo nhũ, SLs còn đóng vai trò kháng khuẩn trong việc trị
mụn, trị gàu và mùi hôi cơ thể [31]. SLs còn cho thấy có nhiều tác động hữu hiệu trong

việc bảo vệ da và tóc. Chúng kích thích sự biến dưỡng của các tế bào fibroblast trong
lớp biểu mô và kích thích quá trình tổng hợp collagen, nhân tố làm cho da săn chắc [9].
Chúng còn có khả năng ức chế các gốc tự do, ức chế hoạt động của enzyme elastase
gây ra lão hóa, thúc đẩy quá trình làm liền da và làm trắng da [22]. SLs cũng cho thấy
có khả năng tổng hợp leptin qua đó làm giảm sự tích tụ mỡ thừa ở dưới da [39]. SLs
còn là nguồn cơ chất cho các acid béo khó tổng hợp ( ,

-1) ứng dụng trong công

nghiệp tạo mùi và nước hoa.
Khả năng kháng khuẩn của SLs còn được sử dụng như là một tác nhân sinh học
làm sạch trái cây [40]. Ngoài khả năng kháng khuẩn, SLs còn có khả năng kháng lại
một số loại nấm như các loài Phytophtora, Phythium và một số loài tảo biển gây hại
[51]. Ngoài ra, các nghiên cứu còn cho thấy SLs có nhiều tiềm năng ứng dụng trong
dược phẩm. Chúng có khả năng chống lại sự suy giảm miễn dịch do virus gây ra [43].
SLs cũng có khả năng ức chế quá trình phát triển của tế bào ung thư bạch cầu (dòng tế
bào HL60 leukemia) bằng cách ức chế hoạt tính của protein kinase C [24]. Các diacetyl
lacton SLs có khả năng tiêu diệt nhiều dòng tế bào khác nhau như dòng tế bào ung thư
gan H7402 [12]. SLs cũng làm giảm tỷ lệ chết do shock nhiễm khuẩn (septic shock)
trên mô hình chuột [8].