Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo (stachys affinis)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI
HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY SÙNG THẢO (STACHYS AFFINIS)

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Hoàng Quân
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1311100026

: Nguyễn Thị Thanh Hằng
Lớp: 13DSH01

TP. Hồ Chí Minh, năm 2017


LƠI CẢM ƠN
Qua thời gian làm đề tài tốt nghiệp tại Trung tâm, em xin gửi lời cám ơn đến
Trung Tâm Công nghệ Sinh Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và hỗ trợ
trang thiết bị giúp em hoàn thành đề tài.
Em xin gửi lời cám ơn chân thành đến Ban Giám Hiệu Trường Đại Học
Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là gửi lời cám ơn đến tất cả các thầy
cô khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường – Thực phẩm đã tạo điều kiện tốt nhất

cũng như dạy bảo và truyền đạt nhiều kiến thức bổ ích giúp em hoàn thành khóa học
cùa mình.
Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến TS. Hà Thị Loan – Phó Giám đốc
Trung tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM và ThS. Nguyễn Hoàng Quân đã tận tình
hướng dẫn và chỉ bảo kiến thức cho em trong suốt thời gian làm đồ án tốt nghiệp.
Em xin cảm ơn toàn thể anh chị đang làm việc tại Trung tâm và các bạn sinh
viên cùng làm đề tài tại Trung tâm đã giúp đỡ em trong suốt quá trình làm đề tài.
Con xin cám ơn ba mẹ đã có công sinh thành và nuôi dưỡng con khôn lớn.
Cám ơn anh chị em và người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn ở bên cạnh
giúp đỡ và luôn cổ vũ tinh thần cho em.
Em xin chân thành cảm ơn.
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 7 năm 2017
Sinh viện thực hiện
Nguyễn Thị Thanh Hằng


MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... i
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. ii
DANH MỤC BIỂU ĐỒ........................................................................................... iii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................. iv
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài ......................................................................................1
2. Ý nghĩa của đề tài ...............................................................................................1
3. Đôi tương va pham vi nghiên cưu ......................................................................2
4. Mục đích nghiên cứu ..........................................................................................2
5. Nội dung nghiên cứu...........................................................................................2
6. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................3
7. Kết quả đạt được .................................................................................................3
8. Bố cục đồ án .......................................................................................................3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..................................................................4
1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật ......................................................4
1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật................4
1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật ......................................5
1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro .................................8
1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật ...............9
1.2. Giới thiệu về chi Stachys ...............................................................................17
1.3. Giới thiệu về cây sùng thảo (Stachys affinis) ................................................19
1.3.1. Phân loại ...............................................................................................19


1.3.2. Đặc điểm sinh học và công dụng .........................................................19
1.3.4. Thành phần hóa học .............................................................................21
1.3.5. Giá trị dinh dưỡng ................................................................................22
1.4. Một số nghiên cứu về chi Stachys .................................................................23
1.4.1. Kháng viêm và giảm đau......................................................................24
1.4.2. Chống oxy hóa .....................................................................................24
1.4.3. Chống lo âu ..........................................................................................25
1.4.4. Kháng khuẩn .......................................................................................26
1.5. Các nghiên cứu nhân giống in vitro chi Stachys............................................27
CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................29
2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................29
2.2. Vật liệu và phương pháp ................................................................................29
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..............................................................................29
2.2.2. Trang thiết bị, dụng cụ và hóa chất ......................................................29
2.2.3. Môi trường nghiên cứu.........................................................................30
2.2.4. Điều kiện phòng nuôi cấy ....................................................................30
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu....................................................................30
2.3. Nội dung nghiên cứu......................................................................................30
2.4. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................31

2.4.1. Pha môi trường nuôi cấy ......................................................................31
2.4.2. Các thao tác trong phòng cấy ..............................................................32
2.4.3. Bố trí thí nghiệm ..................................................................................32


2.4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA đến khả năng
nhân chồi từ đoạn thân cây sùng thảo. ......................................................................32
2.4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của
cây sùng thảo
.............................................................................................................33
2.4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của gía thể đến sự sinh trưởng của
cây sùng thảo ngoài vườn ươm .................................................................................35
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................37
3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây
sùng thảo. ..................................................................................................................37
3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo .........................42
3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn vườn
ươm ...........................................................................................................................47
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.........................................................52
4.1. Kết luận ..........................................................................................................52
4.2. Kiến nghị........................................................................................................52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................53
1. Tài liệu Tiếng Việt ............................................................................................53
2. Tài liệu Tiếng Anh ............................................................................................53
PHỤ LỤC ...................................................................................................................1
Phu luc A: Thành phần môi trường MS .................................................................1
Phụ lục B: Quy trình nhân giống cây sùng thảo (Stachys affinis) ..........................2
Phụ lục C: Bảng số liệu được xử lí thống kệ bằng phần mềm SAS 9.4 .................3

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây sùng thảo ............................................................................................19
Hình 1.2. Củ sùng thảo..............................................................................................20
Hình 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................39
Hình 3.2. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình ra rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi
cấy. ............................................................................................................................46
Hình 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................51

i


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng ........................10
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi .......33
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ ...................................34
Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai
đoạn vườn ươm .........................................................................................................35
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy. ............................................................................38
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nồng độ IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4
tuần nuôi cấy. ............................................................................................................43
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................48

ii


DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến tỷ lệ tạo mẫu tạo chồi sau 4 tuần
nuôi cấy .....................................................................................................................39
Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân
cây sùng thảo sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................................39
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo sau 4 tuần
nuôi cấy .....................................................................................................................44
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây sùng thảo giai đoạn
vườn
ươm sau 4 tuần trồng .................................................................................................48
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai đoạn
vườn ươm sau 4 tuần trồng .......................................................................................49

3


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid

2,4,5-T

Trichlorophenoxyacetic acid

ABA

Abscisic acid

BA

Benzyl Adenine

CNSH

Công Nghệ Sinh Học

ĐC

Đối chứng

GA

Gibberellin

IAA

3-Indole acetic acid IBA

3-Indole butyric acid MS
Murashige – Skoog NAA
Napthalene Acetic Acid
PhG

Phenylpropanoid Glycosides

TP.HCM

Thành phố Hồ Chí Minh

4


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam có một tiềm năng lớn về tài nguyên cây dược liệu, trong số hơn 12.000
loài thực vật tại Việt Nam thì có gần 4.000 loài có công dụng làm thuốc với vùng phân
bố rộng khắp cả nước, có nhiều loài dược liệu được xếp vào loài quý hiếm trên thế giới
như: Sâm ngọc linh, Sâm vũ diệp, Tam thất hoang, Bách hợp, Thông đỏ, Vàng đắng,
Hoàng liên ô rô, Hoàng liên gai, Thanh thiên quỳ, Ba gạc Vĩnh Phú,… Theo kết quả
điều tra và đánh giá tại một số vùng, trồng cây dược liệu đem lại giá trị kinh tế to lớn
hơn bất kỳ loại cây lương thực, thực phẩm nào (có thể thu nhập trên 100 triệu đồng/ha).
Tuy nhiên theo báo cáo tháng 9/2016 của Cục Quản lý Y, Dược cổ truyền (Bộ Y
tế) cho biết hàng năm, ngành dược Việt Nam sử dụng khoảng 60.000 tấn dược liệu các
loại, nhưng Việt Nam mới chỉ tự cung cấp được khoảng 20% nguyên liệu để phục vụ
việc sản xuất thuốc trong nước, còn khoảng 80 - 85% vẫn phải nhập khẩu từ nước ngoài
(chủ yếu nhập từ Trung Quốc) và mới chỉ có 1.400 tấn dược liệu nhập khẩu có nguồn
gốc rõ ràng, rất ít so với nhu cầu sử dụng dược liệu hiện nay.
Cây sùng thảo là một loại cây đã được trồng làm thực phẩm ở nhiều nơi trên thế
giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Pháp…. Củ sùng thảo giàu dinh dưỡng và chứa nhiều
hoạt tính sinh học có lợi cho sức khỏe. Các bộ phận của cây và các chiết xuất từ cây
sùng thảo đã được sử dụng như một phương thuốc cổ truyền điều trị nhiễm trùng, cảm
lạnh, bệnh tim, bệnh lao và viêm phổi ở Trung Quốc. Các nghiên cứu về các loài cùng
chi và nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của Stachys affinnis đã chứng minh
chúng chứa nhiều hoạt chất thứ cấp có nhiều công dụng như kháng viêm, chống oxy
hóa, ngừa loãng xương, điều trị ung thư, bệnh tiểu đường,….
Nắm bắt những cơ sở khoa học thực tiễn và nhu cầu của thị trường, nhóm nghiên
cứu đã tiến hành thực hiện đề tài: Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây sùng thảo
(Stachys affinnis).
2. Ý nghĩa của đề tài

1


• Ý nghĩa khoa học
- Giúp sinh viên củng cố lại kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học.
- Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học nhằm bổ sung
thông tin về cây sùng thảo, kỹ thuật nhân giống in vitro cây sùng thảo.
- Kết quả nghiên cứu có thể là nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu
tiếp theo của cùng đối tượng hoặc một số giống cây có giá trị khác.
- Biết được phương pháp nghiên cứu một số vấn đề khoa học, xử lý và phân
tích số liệu, biết cách trình bài một bài báo khoa học.
• Ý nghĩa thực tiễn
- Xây dựng quy trình nhân giống cây sùng thảo, tạo ra cây giống có chất
lượng cao đáp ứng nhu cầu sản xuất tại Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM.
3. Đôi tương va pham vi nghiên cưu
Đôi tương nghiên cưu đươc sư dung trong đê tai nay la cây sùng thảo vitro
đươc cung câp tư phong nuôi cây mô tai phong Thực nghiêm cây trồng thuộc Trung
tâm Công nghệ Sinh học TP. HCM.
Pham vi nghiên cưu trong đê tai nay la tâp trung khao sat anh hương cua
chất điều hòa sinh trưởng BA, NAA, IBA lên quá trình nhân chồi, tạo rễ của cây
sùng thảo và khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể: mụn xơ dừa, tro trấu,… đến sự
sinh trưởng của cây sùng thảo.
4. Mục đích nghiên cứu
- Đánh giá sự ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên khả năng nhân chồi
và tạo rễ nhằm thiết lập môi trường thích hợp để nhân nhanh cây sùng thảo trong vi
nhân giống in vitro.
- Đánh giá sự ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo ở
giai đoạn vườn ươm.
5. Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA đến khả năng nhân chồi từ đoạn
thân cây sùng thảo.

2


- Khảo sát ảnh hưởng của IBA đến quá trình tạo rễ của cây sùng thảo.
- Khảo sát ảnh hưởng của giá thể đến sự sinh trưởng của cây sùng thảo giai
đoạn vườn ươm.
6. Phương pháp nghiên cứu
Cac thi nghiêm đươc bô tri theo kiêu hoan toan ngẫu nhiên, đơn yêu tô. Mỗi
thi nghiêm gôm 3 – 5 nghiêm thưc, cac nghiêm thưc thi nghiêm đươc lăp lai ba lân.
Cac sô liêu thu thâp đươc xư ly thông kê băng phân mêm SAS 9.4 va chương trinh
MicroSoft Excel 2016®.
7. Kết quả đạt được
- Xác định được nồng độ BA thích hợp kết hợp với NAA cho quá trình nhân
chồi từ đoạn thân cây sùng thảo.
- Xác định được nồng độ IBA thích hợp cho quá trình tạo rễ cây sùng thảo.
- Xác định được loại giá thể thích hợp để trồng cây sùng thảo khi trồng cây
con in vitro ngoài vườn ươm.
8. Bố cục đồ án
Kết cấu của đồ án gồm 4 chương:
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 3: Kết quả và thảo luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị

3

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Sơ lược về nuôi cấy mô và tế bào thực vật
1.1.1. Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Nuôi cấy mô và tế bào đã trả qua một lịch sử phát triển lâu dài và được đánh
dấu bằng những sự kiện chính sau:
Năm 1665, Robert Hooke quan sát thấy tế bào sống dưới kính hiển vi và đưa
ra khái niệm tế bào.
Năm 1838, Matthias Schleiden và Theodore Schwann đề xướng học thuyết tế
bào.
Năm 1883, Wilhelm Roux lần đầu tiên lý giải về phân bào giảm nhiễm ở cơ
quan sinh dục.
Năm 1902, Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm
nhưng không thành công.
Năm 1904, Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài
họ Cải Crucifers.
Năm 1922, Knudson và Bot. Gaz. Cho hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1924, Blumenthal và cộng sự tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy hình
thành callus tử rễ cà rốt trong môi trường có acid lactic.
Năm 1925, Knudson L, Bot. Gaz làm hạt phong lan nảy mầm in vitro.
Năm 1929, Laibach sử dụng nuôi cấy phôi để khắc phục hiện tượng bất hoà
hợp khi lai ở Linum spp.
Năm 1934, Kogl và cộng sự lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, một
phytohormone thực vật đầu tiên thuộc có khả năng kích thích sự tăng trưởng và
phân chia tế bào.
Năm 1936, LaRue và Bull đã nuôi cấy phôi các loài cây hạt trần khác nhau.
Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo
thành
công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá.

4

Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấy phôi
non ở cà rốt.
Năm 1942, Gautheret lần đầu theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp
trong nuôi cấy mô sẹo thực vật.
Năm 1944, Skoog lần đầu tiên nghiên cứu sự hình thành chồi phụ từ nuôi cấy
mô thuốc lá in vitro.
Năm 1950, Morel lần đầu tiên nuôi cấy thành công cây một lá mầm bằng nước
dừa.
Năm 1951, Skoog nghiên cứu sử dụng các hoá chất điều hoà sinh trưởng và
phát sinh cơ quan.
Năm 1952, Morel và Martin đã tạo ra cây sạch bệnh virus của 6 giống khoai
tây từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, lần đầu tiên thực hiện vi ghép in vitro thành công.
Năm 1955, Miller và cộng sự đã phát minh cấu trúc và sinh tổng hợp của
kinetin - một cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hoá chồi ở
mô nuôi cấy.
Năm 1957, Skoog và Miller đã khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chất
auxin: cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi).
Năm 1962, Murashige và Skoog phát minh ra môi trường nuôi cấy mô tế bào
thực vật – môi trường MS.
Năm 1964 – 1998, hàng loạt các công trình thành công trong nuôi cấy mô tế
bào thực vật như cải tiến môi trường và phương pháp nuôi cấy, chuyển gen để lai
tạo giống mới, thương mại hóa sản phẩm nuôi cây mô (Dương Tấn Nhựt, 2011).
1.1.2. Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Dương Công Kiên (2003), có một số phương pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật như:
1.1.2.1. Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
Phương pháp thuận lợi có thể đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào
thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm mô phân sinh đỉnh và mô phân sinh

bên).


Sau khi vô trùng, mẫu được nuôi cấy trên môi trường thích hợp. Từ một đỉnh
sinh trưởng sau một thời gian nuôi cấy nhất định phát triển thành một chồi hay nhiều
chồi. Sau đó chồi tiếp tục vươn dài hình thành thân, lá, ra rễ để trở thành một cây
hoàn chỉnh. Đây là một chu trình ngắn nhất và tiện lợi hơn các phương thức nhân
giống thông thường khác.
1.1.2.2. Nuôi cấy mô sẹo
Trong điều kiện môi trường nuôi cấy có chứa nhiều auxin, mô sẹo được hình
thành. Mô sẹo là một khối tế bào phát triển không có định hướng, thường có màu
trắng. Trong môi trường phù hợp, mô sẹo có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những loài thực vật không có khả năng
nhân giống đỉnh sinh trưởng, hoặc với các loại mẫu nuôi cấy không thể trực tiếp
hình thành
chồi.
Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ và từ một cụm tế bào mô
sẹo có thể tái sinh cùng một lúc cho nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuy
nhiên mức độ biến dị tế bào soma rất cao trong quá trình nuôi cấy để tạo mô sẹo.
1.1.2.3. Nuôi cấy tế bào đơn
Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt tên máy lắc có
tốc độ điều chỉnh thích hợp. Khối mô sẹo dưới tác dụng của cơ học và các hóa chất
hỗ trợ tách ra nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi
cấy trong môi trường đặc biệt và tăng sinh khối. Hệ thống nuôi cấy tế bào đơn giống
như hệ thống nuôi cấy vi sinh. Với các cơ chất phù hợp được bổ sung môi trường, tế
bào có khả năng sản xuất các chất có hoạt tính sinh học (alkloid, steoid,…).
Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơn được
tách ra và trải trên môi trường thạch, tế bào đơn được phát triển thành từng cụm tế
bào mô sẹo khi môi trường có auxin hoặc có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh trên
môi trường có tỷ lệ cytokinin/auxin thích hợp. Sử dụng các tế bào đơn để xử lý đột

biến bằng tia phóng xạ, hóa chất, có ý nghĩa lớn trong chọn tạo giống cây trồng.


1.1.2.4. Nuôi cấy tế bào trần
Tế bào trần thực chất là tế bào đơn được tách lớp vỏ cellulose, có sức sống và
duy trì đầy đủ các chức năng sẵn có. Tế bào trần có thể tách trực tiếp từ các bộ phận
của thực vật (lá, rễ) bằng cơ học (nghiền mẫu và enzyme) trong điều kiện nuôi cấy
thích hợp, tế bào trần có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh
thành cây hoàn chỉnh (tính toàn năng di truyền). Khi mất thành tế bào, hai tế bào
trần có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện
cây trồng. quá trình dung hợp tế bào trần có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng
loài hoặc khác loài (khoai tây, cà chua).
Ở trạng thái không có màng tế bào bao bọc, tế bào trần dễ dàng hấp thu các
AND ngoại lai mang các đặc điểm di truyền khác nhau: cải thiện đặc tính kháng
bệnh, năng suất và chất lượng cây trồng. Hiện nay kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào
trần đang được nghiên cứu và hoàn thiện .
1.1.2.5. Nuôi cấy hạt phấn
Nuôi cấy bao phấn là kỹ thuật nuôi cấy in vitro. Bao phấn chứa các bào tử
hoặc hạt phấn chưa chín nuôi trong môi trường dinh dưỡng xác định nhằm mục đích
tạo cây đơn bội. Sau đó dùng colchicin lưỡng bội hóa tạo thành cây lưỡng bội. Nuôi
cấy bao phấn được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả trong việc tạo ra các dòng,
giống thuần ở các cây tự thụ phấn vì đã rút ngắn được thời gian tạo ra giống mới.
Nuôi cấy bao phấn tạo giống mới được ứng dụng thành công ở một số loài cây như:
lúa mì, lúa nước, thuốc lá, ngô,…
1.1.2.6. Nuôi cấy protoplast
Nagata và Takebe (1930) đã thành công trong việc làm cho các protoplast
tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một huyền phù tế bào
trong môi trường lỏng. Những năm gần đây kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần đang mở ra
nhiều triển vọng trong nghiên cứu di truyền soma, cải tạo, phục tráng và tạo giống
cây mới ở thực vật bậc cao nói chung. Phương pháp này được ứng dụng thành công

trên nhiều đối tượng khác nhau. Năm 1971, Takebe đã nhận được cây Thuốc lá nhị
bội từ tế bào trần, sau đó Ohiama và Nitch nhận được cây thuốc lá đơn bội từ tế bào
trần đơn bội.


Đến nay, kỹ thuật nuôi cấy và tái sinh protoplast đã hoàn thiện đối với cây hai lá
mầm cũng như nhiều loại cây một lá mầm và trở thành một trong những công cụ
quan trọng trong nghiên cứu di truyền nói chung và di truyền tế bào chất nói riêng
cũng như trong công tác giống cây trồng .
1.1.3. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro
Cho tới nay việc sử dụng phương pháp nhân giống in vitro đã được áp dụng
cho nhiều loại cây trồng (trên 400 loài). Giáo sư Murashige (1974) đã chia quy
trình nhân giống in vitro làm ba giai đoạn và một giai đoạn tiếp sau in vitro:
1.1.3.1. Tạo vật liệu nuôi cấy khởi đầu in vitro
Giai đoạn này là bước thuần hoá vật liệu nuôi cấy. Các mẫu đã được khử
trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để tạo ra các chồi mới. Giảm tỷ
lệ mẫu nhiễm bệnh, tăng khả năng tái sinh có vai trò quan trọng ở giai đoạn này.
Theo Yildiz (2012), mô lấy từ cây non có khả năng tái sinh cao hơn từ cây trưởng
thành. Giai đoạn này thường kéo dài từ 4 – 6 tuần.
1.1.3.2. Nhân nhanh chồi, cụm chồi in vitro
Là giai đoạn then chốt của toàn bộ quá trình nhằm tạo ra hệ số nhân cao nhất.
Ở giai đoạn này các chồi được kích thích phát sinh thành nhiều chồi, mầm nhằm
cung cấp cho các lần cấy chuyển tiếp theo. Hệ số nhân phụ thuộc nhiều vào vai trò
của các loại phytohoocmon (thường là cytokynin).
1.1.3.3. Tạo cây hoàn chỉnh, huấn luyện cây con
Tạo cây hoàn chỉnh: Các chồi in vitro đủ tiêu chuẩn được chuyển sang môi
trường tạo rễ để tạo ra cây giống in vitro hoàn chỉnh với đầy đủ thân, lá, rễ. Trong
giai đoạn này, nồng độ cytokynin được giảm xuống và tăng nồng đô auxin nhằm
kích thích sự hình thành rễ.
Huấn luyện cây con: Là giai đoạn chuấn bị cho cây con chuyển ra ngoài hệ

thống vô trùng khi đã đạt kích thước nhất định.
1.1.3.4. Chuyển cây ra trồng ngoài điều kiện tự nhiên
Đây là giai đoạn chuyển cây in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống
hoàn toàn tự dưỡng và thích nghi với điều kiện tự nhiên (Hazarika, 2003). Sự biến


động của các yếu tố như: thời tiết, đất đai, sâu bệnh,… gây nhiều khó khăn trong
việc đưa cây in vitro ra trồng ngoài tự nhiên.
Như vậy, cả bốn giai đoạn trong quy trình nhân giống in vitro đều có vai trò
quyết định đến khả năng ứng dụng thành công các quy trình nhân giống in vitro
vào thực tiễn. Tuy nhiên, đối với cây hoa chuông do toàn thân được phủ một lớp
lông tơ dày, thân lá chứa nhiều nước nên giai đoạn tạo vật liệu khởi đầu gặp nhiều
khó khăn (số lượng mẫu nhiễm và chết rất cao). Vì vậy, để tăng hiệu quả của giai
đoạn này cần lựa chọn được hóa chất khử trùng, thời gian khử trùng và cơ quan
sinh dưỡng đưa vào nuôi cấy.
1.1.4. Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật
1.1.4.1. Sự lựa chọn mẫu cấy
Theo Mantell và cộng sự (1985) mẫu cấy thích hợp nhất cho nuôi cấy mô
phải có mô phân sinh hay những tế bào có khả năng biểu hiện tính toàn năng. Mô
non như đỉnh chồi nách, chồi ngọn hay chồi bất định sẽ tái sinh tốt hơn mô già của
cùng một cây (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Thời vụ và giai đoạn sinh trưởng của
cây mẹ có ảnh hưởng hoàn toàn khác nhau tới khả năng tái sinh, phát sinh hình thái
của mô nuôi cấy (Mamaril và Lopez, 1997).
1.1.4.2. Khử trùng mô thực vật
Các mô cấy hầu hết là các bộ phận khác nhau của thực vật như hạt giống, lá,
rễ, thân, củ,… tùy theo sự tiếp xúc của môi trường bên ngoài, các bộ phận này chứa
ít hay nhiều vi khuẩn và nấm. Để chuyển mô thực vật từ môi trường tự nhiên vào
môi trường nuôi cấy in vitro, các mô thực vật phải trải qua giai đoạn khử trùng để
loại bỏ hết các nguồn tạp nhiễm (Bhojwani và Razdan, 1996)
Khử trùng mẫu cấy là một việc làm khó vì mẫu sống không thể khử trùng

bằng nhiệt độ cao mà phải giữ được bản chất sinh học của nó. Do đó mẫu cấy thực
vật phải được khử trùng bằng dung dịch khử trùng. Các dung dịch khử trùng thường
dùng là hypochlorite calcium, hypochlorite sodium, oxy già,… Các mẫu cấy sau
khi chọn phải rửa phải ngâm rửa mẫu bằng xà phòng dưới dòng chảy rồi mới cho
vào ngâm trong dung dịch khử trùng. Hiệu quả xử lý các chất phụ thuộc vào thời
gian, nồng độ


và khả năng xâm nhập vào các khe của tế bào và khả năng đẩy hết bọt khí trên bề
mặt các mô cấy. Để tăng tính linh động và khả năng hoạt động của các chất khử
trùng trước tiên người ta thường ngâm tế bào mô thực vật trong cồn 70 o trong 30
giây, sau đó mới xử lý dung dịch diệt khuẩn.
Việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm phần lớn phụ thuộc vào kỹ thuật xử
lý trong nuôi cấy vô trùng. Các nguồn gây nhiễm phần lớn là bụi tóc, tay, quần áo vì
vậy trong khi cấy phải rửa tay bằng xà phòng, lau cồn 70 o tới khuỷa tay,…
Bảng 1.1. Nồng độ và thời gian sử dụng của một số chất khử trùng
Chất khử trùng

Nồng độ (%)

Thời gian xử lý (phút)

Hiệu quả

Hypochorite calcium

9 – 10

5 – 30

Rất tốt

Hypochorite sodium

0,5 - 5

5 – 50

Rất tốt

Hydro peroxide

10 – 12

5 – 15

Tốt

Nước bromie

1–2

2 – 10

Rất tốt

HgCl2

0,1 – 1

2 – 10

Trung bình

Chất kháng sinh

4 – 50 mg/l

30 – 60

Khá tốt

1.1.4.3. Carbon và nguồn năng lượng
Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phương thức dị
dưỡng, vì vậy cần phải bổ sung nguồn carbon vào môi trường nuôi cấy để cung cấp
năng lượng (Nguyễn Quang Thạch, 2001). Hai loại đường thường được sử dụng là
sucrose và glucose nhưng hiện nay sucrose được sử dụng phổ biến hơn. Nồng độ
sucrose thay đổi từ 2 – 3 % hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống, tuổi mẫu cấy, giai
đoạn sinh trưởng và yêu cầu thí nghiệm (Laneri; Franconi; Altavista, 1990).


1.1.4.4. Các khoáng đa lượng
Nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây
trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố đa lượng gồm N, P, K, S, Ca và Mg
được bổ sung vào môi trường nhằm cung cấp chất khoáng để cấu tạo tế bào, mô
thực vật được sử dung với nồng độ trên 30 ppm (Torres, 1989).
- Nguồn Nitơ (N): mô tế bào thực vật trong nuôi cấy có thể sử dụng các dạng
nitơ khoáng như amon và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ
như amino acid. Nitrate được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO3)2.4H2O, KNO3,
NaNO3 hoặc NH4NO3. Amonium được cung cấp dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc

NH4NO3. Trong một số ít trường hợp có thể cung cấp dưới dạng urea. Tổng nồng độ
của NO3+ và NH4+ trong môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo đối tượng nuôi cấy
và mục đích nghiên cứu.
- Nguồn Phospho (P): Phospho là nguyên tố quan trọng trong đời sống thực
vật. Nó tham gia vào việc vận chuyển năng lượng, sinh tổng hợp protein, nucleic
acid và tham gia cấu trúc màng. Hai dạng P thường được dùng nhất là
Na2H2PO4.7H2O và KH2PO4 (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2011).
- Nguồn Kali (K): K giup tăng kha năng thâm thâu qua mang tê bao, điêu
chinh pH va lương nươc ơ khi không, hoat hoa enzyme, co liên quan đên quang hơp
va tông hơp hydrate carbon, giup vân chuyên hydrate carbon, tông hơp protein, cai
thiên kha năng sư dung anh sang khi găp điêu kiên bât lơi. K thường được cung cấp
cho môi trường nuôi cấy ở dạng kali nitrat (KNO3), kali clorua (KCl2), kali
phosphat( KH2PO4) (Dương Công Kiên, 2003).
- Nguồn Canxi (Ca): Canxi có thể liên kết các phân tử sinh học lại với nhau
do đó nó góp phần vào trong cấu trúc và hoạt động sinh lí của màng tế bào và ở
phiến giữa của thành tế bào (Trần Văn Minh, 1997). Sự hoạt động của nhiều
enzyme của thực vật cũng phụ thuộc vào Ca2+ vì canxi là đồng yếu tố với những
enzyme phân giải ATP. Trong nuôi cấy tế bào, Ca2+ có vai trò trong sự phát sinh
hình thái đồng thời với sự cảm ứng của các chất điều hòa sinh trưởng đặc biệt là


auxin và cytokinin. Ca2+ là thành phần quan trọng của thành tế bào và màng tế bào.
Số lượng lớn Ca2+


gắn trên thành tế bào đóng vai trò chủ yếu trong củng cố độ vững chắc cho thành tế
bào và điều hoà cấu trúc màng tế bào.Canxi được cung cấp dưới dạng muối canxi
nitrat Ca(NO3)2. 4H2O, canxi clorua CaCl2. 6H2O (Dương Tấn Nhựt, 2009).
- Nguồn Magie (Mg): Magie là nguyên tố cần thiết cho sự sinh tổng hợp diệp
lục tố và nó cũng tham gia vào cấu trúc của một số enzyme vận chuyển phosphate.

Ion Mg+ là một ion linh động, có thể khuyếch tán vào trong tế bào như K+ vì vậy có
vai trò như một cation trung hòa các cation và các acid hữu cơ. Magie được cung
cấp dưới dạng magie sulphat MgSO4.7H2O (Dương Tấn Nhựt, 2011).
1.1.4.5. Các khoáng vi lượng
Các nguyên tố vô cơ cần một lượng nhỏ nhưng không thể thiếu cho sinh
trưởng của mô và tế bào thực vật còn được gọi là các nguyên tố vi lượng. Các
nguyên tố vi lượng cần cung cấp là: Fe,Zn, B, Mn, Cu, I, Mo, Ni,… (Torres, 1989).
1.1.4.6. Vitamin
Thực vật cần vitamin để xúc tác các quá trình biến dưỡng khác nhau. Thông
thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng trưởng và phát triển của
chúng (White, 1943).
Các vitamin được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1),
acid nicotinic (PP), pyridoxine (B6) và myo-inositol. Thiamin là một vitamin căn
bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào. Thiamin thường được sử dụng
với nồng độ biến thiên từ 0,1 – 10 mg/l. Acid nicotinic thường được bổ sung vào
môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,1 – 5 mg/l, pyridoxine được sử dụng với nồng
độ 0,1
– 10 mg/l. Myo-inositol có vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp tế bào,
thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô và tế bào thực vật ở nồng độ cao
50 - 100 mg/l (Dương Công Kiên, 2003).
1.1.4.7. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Bên cạnh các chất cung cấp dinh dưỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung một
hoặc nhiều chất điều hòa sinh trưởng như auxin, cytokinin và giberellin là rất cần
thiết để kích thích sự sinh trưởng, phát triển và phân hoá cơ quan, cung cấp sức sống
tốt cho mô và các tổ chức (Torres, 1989). Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này


thay đổi tuỳ theo loài thực vật, loại mô, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng nội
sinh của chúng. Các chất điều hoà sinh trưởng thực vật được chia thành các nhóm
chính sau đây.

a. Auxin
Auxin là nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường gặp trong tự nhiên,
có ở mô phân sinh chồi, lá mầm và rễ do Went và Thimann (1937) phát hiện ra.
Auxin vận chuyển hướng cực: từ đỉnh chồi ngọn tới cơ quan khác.
Auxin có khả năng kích thích sự tăng trưởng và giãn nở của tế bào đặc biệt
theo chiều ngang làm tế bào phình ra. Bên cạnh đó auxin còn kích thích sự phân
chia và kéo dài tế bào. Tuy nhiên các ảnh hưởng đến sự giãn nở và phân chia tế bào
trong tác động hỗ trợ với các phytohoocmon khác (Skoog và Miller, 1957).
Auxin cũng gây ra tính hướng động của cây (hướng sáng và hướng đất), gây
ra hiện tượng ưu thế ngọn, kích thích sự hình thành rễ, sự sinh trưởng của quả và tạo
quả không hạt. Ngoài ra auxin còn kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả; ảnh hưởng đến sự
vận động của chất nguyên sinh; ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp và trao đổi
chất.
Những auxin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô là: IBA (3indolebutiric acid), IAA (3-indole acetic axid), NAA (Napthaleneaxetic acid), 2,4D (2,4-D- dichlorophenoxyaxetic acid) và 2,4,5-T (Trichlorophenoxyacetic acid).
Trong số các auxin, IBA và NAA chủ yếu sử dụng cho môi trường ra rễ và phối hợp
với cytokinin sử dụng cho môi trường ra chồi. 2,4-D và 2,4,5-T rất có hiệu quả đối
với môi trường tạo và phát triển callus (Hoàng Minh Tấn, Nguyễn Quang Thạch,
1993).
b. Cytokinin
Cytokinin là nhóm phytohormone có mặt ở tất các các loại cây trồng, hình
thành chủ yếu trong hệ thống rễ. Cytokinin vận chuyển không hướng cực, có thể
hướng ngọn hoặc hướng gốc.
Cytokinin có ảnh hưởng rõ rệt và rất đặc trưng lên sự phân hóa cơ quan của
thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi. Trong môi trường nuôi cấy tỷ lệ


auxin/cytokinin có ý nghĩa quyết định trong sự phân hóa của tế bào theo hướng tạo
mô sẹo, tạo rễ, tạo

chồi hay tạo phôi vô tính. Cytokinin cũng có ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất
như quá trình sinh tổng hợp nucleic acid, protein, chlorophyll và ảnh hưởng đến các
hoạt động sinh lý của cây. Có ba loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy
mô là BA, kinetin và zeatin (Trần Văn Minh, 1997).
Kinetin đươc Skoog (1957) phat hiên ngẫu nhiên trong khi chiêt xuât acid
nucleic, kinetin hình thành và phát triển trong điều kiện nhiệt độ cao từ chế phẩm
DNA có tác dụng kích thích sự phát sinh chồi. Zeatin thực chất là một dẫn xuất của
adenine có tác dụng kích thích sự tạo chồi nhưng giá thành cao nên ít sử dụng. BA
tuy la cytokinin tông hơp nhân tao nhưng co hoat tinh manh hơn kinetin và bền nhiệt
với độ cao hơn zeatin.
c. Gibberellin (GA)
Gibberellin được phát hiện vào những năm 1930. Lịch sử phát hiện nhóm
hormone này bắt đầu từ 1895 khi người Nhật nói về bệnh lúa von. Năm 1926, xác
định được bệnh đó là do loài nấm Gibberella fujikuroi gây ra. Đến những năm 30,
mới phân lập và tinh chế được hoạt chất, được gọi là gibberellin. Mãi sau chiến
tranh thế giới thứ II năm 1950, người Anh và người Mỹ mới biết đến công trình này
của người Nhật. Tới nay, người ta đã phát hiện được trên 60 loại thuộc nhóm
gibberellic acid. Loại gibberellic acid thông dụng nhất trong nuôi cấy mô thực vật là
GA3.
Hiệu quả sinh lý rỏ rệt nhất của gibberellin là kích thích mạnh mẽ sự sinh
trưởng kéo dài của thân bằng cách kích thích sự phân cắt tế bào và sự tăng dài của tế
bào. Gebberellin cũng kích thích sự nảy mầm của hạt và củ, do đó nó có tác dụng
đặc trưng trong việc phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng. Trong nhiều trường hợp
gibberellin kích thích sự ra hoa rõ rệt. Ảnh hưởng đặc trưng của gibberellin lên sự ra
hoa là kích thích sự sinh trường kéo dài và nhanh chóng của cụm hoa. Đối với sự
sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt thì gibberellin có vai trò gần giống với
auxin, nó làm tăng kích thước quả và tạo nên quả không hạt (Hoàng Minh Tấn;
Nguyễn Quang Thạch, 1993).