Sản xuất nấm paecilomyces sp để phòng trừ tuyến trùng meloidogyne sp gây hại trên cây hồ tiêu

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SẢN XUẤT NẤM PAECILOMYCES SP. ĐỂ PHÒNG
TRỪ TUYẾN TRÙNG MEILODOGYNE SP. GÂY
HẠI TRÊN CÂY HỒ TIÊU.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ HAI
Sinh viên thực hiện :

PHAN ÁNH NGÂN

MSSV: 1211100132

Lớp: 12DSH02

TP. Hồ Chí Minh, 2016.


LỜI CAM ĐOAN
Em xin cam đoan nội dung trong đồ án tốt nghiệp là công trình nghiên cứu

thực sự của cá nhân em dưới sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Hai – giảng viên
Khoa Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công
Nghệ Tp. HCM. Đề tài được thực hiện dựa trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tiến
hành nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học, Khoa
Công Nghê Sinh Học – Thực Phẩm – Môi Trường, trường Đại học Công Nghệ Tp.
HCM. Tất cả các số liệu, hình ảnh, các kết quả là nghiên cứu hoàn toàn trung thực.
Đồ án không sao chép dưới bất kỳ hình thức nào, nếu có phát hiện sự gian
lận em xin hoàn toàn chịu trách nhiệm.
Tp. HCM, ngày 15 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện

Phan Ánh Ngân

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian từ khi bắt đầu học tập tại trường đến nay, em đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của quý Thầy Cô, gia đình và bạn bè. Với lòng
biết ơn sâu sắc nhất, em xin gửi đến quý Thầy Cô ở Khoa Công Nghệ Sinh học –
Thực Phẩm – Môi Trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM đã cùng với tri
thức và tâm huyết của mình để truyền đạt vốn kiến thức quý báu cho chúng em
trong suốt thời gian học tập tại trường. Và đặc biệt, trong học kỳ này. Nếu không có
những lời hướng dẫn, dạy bảo của các thầy cô thì em nghĩ bài thu hoạch này của em
rất khó có thể hoàn thiện được. Một lần nữa, em xin chân thành cảm ơn thầy. Bài
báo cáo đồ án tốt nghiệp thực hiện trong khoảng thời gian 3 tháng. Bước đầu đi vào
thực tế của em còn hạn chế và còn nhiều bỡ ngỡ. Do vậy, không tránh khỏi những
thiếu sót là điều chắc chắn, em rất mong nhận được những ý kiến đóng góp quý báu
của quý Thầy Cô và các bạn học cùng lớp để kiến thức của em trong lĩnh vực này
được hoàn thiện hơn.

Em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các thầy cô của
trường Đại học Công Nghệ Tp. HCM, đặc biệt là TS. Nguyễn Thị Hai, giảng viên
khoa Công Nghệ Sinh học – Thực Phẩm – Môi Trường của trường đã tạo điều kiện
cho em để em có thể hoàn thành tốt bài báo cáo đồ án tốt nghiệp này. Và em cũng
xin chân thành cám ơn các thầy cô ở phòng thí nghiệm, các anh chị, các bạn đã
nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em hoàn thành báo cáo đồ án tốt nghiệp.
Trong quá trình thực hiện đồ án tốt nghiệp, cũng như là trong quá trình làm
bài báo cáo, khó tránh khỏi sai sót đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh
nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót,
em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của Thầy/Cô để em học thêm được nhiều
kinh nghiệm và áp dụng vào công việc sắp tới.
Em xin chân thành cảm ơn !

ii


MỤC LỤC
LỜI

CAM

ĐOAN

..........................................................................................................i

LỜI

ƠN..............................................................................................................
LỤC

ii

CẢM
MỤC

..................................................................................................................

iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................. vi
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................
vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................
viii

ĐẶT

VẤN

ĐỀ

..............................................................................................................1
MỤC ĐÍCH ..................................................................................................................2
NỘI DUNG...................................................................................................................2
CHƯƠNG
1:
.................................................................3

TỔNG

QUAN

TÀI

LIỆU

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp. .....................................................................3
1.1.1. Phân loại khoa học .............................................................................................3
1.1.2. Đặc điểm hình thái .............................................................................................4
1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces..........................................................5
1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến
trùng ..............................................................................................................................6
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.
.................7
Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ tiêu 11
1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật .....................................................11
1.2.2. Phân loại khoa học ...........................................................................................14
Các nghiên cứu nước ngoài về nhân nuôi và sử dụng nấm Paecilomyces sp.
trong phòng từ tuyến trùng hại cây trồng...................................................................19
Các nghiên cứu trong nước về nhân nuôi và sử dụng Paecilomyces sp. trong
phòng trừ tuyến trùng hại cây ....................................................................................22
3


CHƯƠNG 2:

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..................................................24

Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................24

4

Vật liệu nghiên cứu, thiết bị và hóa chất ............................................................24
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu ..........................................................................................24
2.2.2. Thiết bị..............................................................................................................24
2.2.3. Các loại môi trường sử dụng............................................................................25
Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................26
2.3.1. Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomycse sp. ...........................................................27
2.3.2. Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng.....................................................28
2.3.3. Các phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật ...................................28
2.3.4. Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ tiêu (dẫn theo Lê Thị Mai Châm, 2014)29
2.3.5. Khảo sát sự phát triển của nấm Paecilomyces sp. trên các loại môi trường
nhân sinh khối (theo Lê Hữu Phước, 2009)...............................................................30
2.3.6. Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm
Paecilomyces sp..........................................................................................................30
2.3.7. Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của nấm Paecilomyces
sp. ................................................................................................................................31
2.3.8. Khảo sát khả năng kí sinh con cái tuyến trùng Meloidogyne sp. của nấm
Paecilomyces sp..........................................................................................................35
2.3.9. Đánh giá tác động của chế phẩm nấm Paecilomyces sp. trong việc phòng trừ
tuyến trùng Meloidogyne sp. trên cây hồ tiêu ............................................................36
2.3.10. Phương pháp xử lý số liệu..............................................................................37
CHƯƠNG 3:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................38

Kết quả hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp...................................................38
Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm, trừ sâu đến sự phát triển của
Paecilomyces sp..........................................................................................................39

5


3.2.1. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu đến sự phát triển của Paecilomyces sp.
.....................................................................................................................................39
3.2.2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển của Paecilomyces sp.
.....................................................................................................................................41
3.2.3. Khảo sát khả năng đồng sinh trưởng của nấm Trichoderma sp. và
Paecilomyces sp..........................................................................................................43
Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành và
phát triển của nấm Pacilomyces sp. (môi trường lỏng)
.............................................44
3.3.1. Khảo sát môi trường tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm
Paecilomyces sp..........................................................................................................44
3.3.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của 4 loại môi trường dinh dưỡng đến sự hình thành
và phát triển của nấm Paecilomyces sp. (môi trường rắn) ........................................49
Khảo sát khả năng phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu của chế phẩm nấm
Paecilomyces sp..........................................................................................................52
3.4.1. Trong điều kiện phòng thí nghiệm...................................................................52
3.4.2. Trên đồng ruộng ...............................................................................................55
CHƯƠNG 4:

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................58

Kết luận................................................................................................................58
Kiến nghị .............................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................59
Tài liệu tiếng việt ........................................................................................................59
Tài liệu tiếng anh ........................................................................................................59
Tài liệu từ internet ......................................................................................................61

PHỤ LỤC .....................................................................................................................1

6


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CDB: Czapeck – Dox.
CMB: Complete Media
NSC: ngày sau cấy.
NT: nghiệm thức.
PDA: Potato D – Glucose Agar
SDAY1: Sabourand dextrose Yeast
SDAY3: Sabourand dextrose Yeast bổ sung khoáng.

7


DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1. Bố trí thí nghiệm .......................................................................................31
Bảng 2. 2. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thuốc trừ sâu.......................................32
Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng thuốc trừ nấm .............................................33
Bảng 2. 4. Bố trí thí nghiệm khả năng đồng sinh trưởng của Trichoderma sp. và
Paecilomyces sp..........................................................................................................35
Bảng 2. 5. Bố trí thí nghiệm đánh giá tác động của chế phẩm Paecilomyces sp. .....37
Bảng 3. 1. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường trừ nấm. .40
Bảng 3. 2. Ảnh hưởng của các loại thuốc trừ nấm đến sự phát triển nấm
Paecilomyces sp..........................................................................................................40
Bảng 3. 3. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ....................................................41
Bảng 3. 4. Tỷ lệ khuẩn lạc bị ức chế ..........................................................................41
Bảng 3. 5. Đường kính tản nấm Paecilomyces sp. ....................................................43

Bảng 3. 6. Đường kính tản nấm Trichoderma sp. khi cấy đồng thời với nấm
Paecilomyces sp..........................................................................................................43
Bảng 3. 7. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. sau thời gian nuôi cấy trên môi
trường lỏng lắc............................................................................................................44
Bảng 3. 8. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. tính theo logarit ............................46
Bảng 3. 9. Số lượng bào tử sau 14 ngày nuôi cấy ....................................................51
Bảng 3. 10. Mật độ bào tử nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay ngô mảnh và
gạo tấm........................................................................................................................52
Bảng 3. 11. Tỷ lệ phần trăm số tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị nấm
Paecilomyces sp. ký sinh............................................................................................53
Bảng 3. 12. Đánh giá cấp hại của tuyến trùng trên cây hồ tiêu. ................................55

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường PDA. ........4
Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi ..................................5
Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin) ........................................................6
Hình 1.4. Cấu tạo tuyến trùng ký sinh thực vật .........................................................15
Hình 1.5. Vòng đời tuyến trùng Meloidogyne sp. .....................................................17
Hình 1.6. Một số chế phẩm từ nấm Paecilomyces sp. phòng trừ tuyến trùng. .........22
Hình 3.1. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA............................................38
Hình 3.2. Tản nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại
thuốc hóa học. (A: Actara 25WG; B: Sherpa 25EC; C: Plutel 1,8 EC; D: Oshin
20WP; E: đối chứng) ..................................................................................................39
Hình 3.3. Nấm Paecilomyces sp. trên môi trường PDA có bổ sung các loại thuốc
hóa học.. (A: Antracol 70WP; B: Cup 2,9 SL; C: Saizole 5SC; D: Carbenzin
50WP; E: đối chứng) ..................................................................................................42
Hình 3.4. Đĩa nấm khi cấy đồng thời Trichoderma sp. và Paecilomyces sp. ...........44

Hình 3.5. Dịch nuôi cấy nấm Paecilomyces sp. trên 4 loại môi trường. (A: Môi
trường CDB; B: Môi trường CMB; C: Môi trường SDAY1; D: Môi trường
SDAY3). .....................................................................................................................45
Hình 3.6. Mật độ bào tử tính theo logarit trên bốn loại môi trường lỏng. ................48
Hình 3.7. Hình nấm Paecilomyces sp. được nuôi cấy trên 4 loại môi trường rắn(A:
môi trường ngô mảnh, B: môi trường gạo tấm, C: môi trường lúa, D: môi trường
cám) ............................................................................................................................50
Hình 3.8. Mật độ tế bào sau 14 ngày lên men rắn trên 4 loại môi trường. ..............51
Hình 3.9. Nấm Paecilomyces sp. nhân nuôi trên khay. .............................................52
Hình 3.10. Tỷ lệ tuyến trùng cái Meloidogyne sp. bị chết ở các ngày sau khi lây
nhiễm. ........................................................................ Error! Bookmark not
defined. Hình 3.11. Nấm Paecilomyces sp. tấn công con cái và trứng tuyến trùng
Meloidogyne sp.; (A, B: con cái tuyến trùng trước khi lây nhiễm nấm; C, E: con cái
tuyến trùng bị lây nhiễm nấm được soi dưới kính hiển vi; D, F: con cái và con cái

8


mang túi trứng của tuyến trùng bị nhiễm nấm Paecilomyces sp. soi dưới kính hiển
vi sau khi nhuộm Methylene blue).............................................................................54
Hình 3.12. Người dân pha chế phẩm Paecilomyces sp. tưới vào gốc cây hồ tiêu ....56
Hình 3.13. Trước khi tưới. .........................................................................................57
Hình 3.14. Sau khi tưới. .............................................................................................57

9


Đồ án tốt
nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hồ tiêu được xem là một trong những cây trồng chủ lực chính của Việt Nam.
Hồ tiêu (piper nigrumL.) được xem là “vua của các loại gia vị” và trở thành sản
phẩm nông nghiệp quan trọng nhất của Việt Nam. Năm 2015, mặc dù chưa có thống
kê đầy đủ, nhưng dự báo diện tích hồ tiêu cả nước đã vượt con số 100.000 ha (Theo
số liệu Hiệp Hội hồ tiêu Việt Nam, 2015). Tuy nhiên, cũng như các ngành nông
nghiệp khác, ngành hồ tiêu cũng phải đối mặt với các vấn đề về thiệt hại năng suất
gây nên do dịch hại. Do đó, bảo vệ thực vật là một trong những phần rất quan trọng
trong việc nâng cao năng suất hồ tiêu vì dịch hại được xem như nguyên nhân chính
làm giảm năng suất và chất lượng hồ tiêu (Trịnh Thị Thu Thủy và ctv, 2012). Bên
cạn các loại bệnh hại, tuyến trùng là dịch hại nguy hiểm trên cây hồ tiêu. Theo kết
quả điều tra của Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp miền Nam thì tuyến trùng
xuất hiện phổ biến ở tất cả các vùng trồng tiêu trong cả nước với mức độ gây hại
cao. Việc tìm ra giải pháp để kiếm soát tác nhân tuyến trùng gây hại rất quan trọng.
Hiện nay, đa số nông dân thường sử dụng các loại thuốc hóa học để phòng trừ. Tuy
có tác dụng nhanh và hiệu quả nhưng các loại thuốc hóa học lại gây ra tác động xấu
đối với môi trường, để lại tồn dư trong nông sản, tăng tính kháng của sâu bệnh làm
cho việc phòng trừ trở nên khó khăn hơn. Vì vậy, hiện nay, các tác nhân sinh học là
một trong những hướng tiềm năng trong việc phòng trừ tuyến trùng trên cây hồ tiêu.
Trên thế giới hiện nay có rất nhiều nghiên cứu sử dụng tác nhân sinh học để
phòng trừ tuyến trùng. Đặc biệt, nấm Paecilomyces sp. được xem là một trong
những loài nấm diệt tuyến trùng giệu quả cao nhất (Burges H. D., 1998; Butt T. M
và Copping L., 2000). Ở Việt Nam, các công trình nghiên cứu về nấm Paecilomyces
vẫn còn hạn chế. Năm 2014, Phùng Lê Kim Yến thuộc trường đại học Công nghệ
thành phố Hồ Chí Minh, phân lập được chủng nấm Paecilomyces sp. và đã chứng
minh chủng nấm này có hiệu lực trừ tuyến trùng tốt. Tuy nhiên, tác giả chưa đưa ra
được môi trường sản xuất thích hợp đối với chủng nấm này để ứng dụng trên đồng
ruộng. Vì vậy, sinh viên chọn đề tài: “Sản xuất nấm Paecilomyces sp. để phòng
trừ tuyến trùng Meloidogyne sp. gây hại trên cây hồ tiêu”.

1


Đồ án tốt
nghiệp

MỤC ĐÍCH
Chọn môi trường tốt nhất cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm
Paecilomyces sp. và đánh giá khả năng phòng trừ tuyến trùng của chế phẩm nấm
Paecilomyces sp.

NỘI DUNG
❖

Hoạt hóa nguồn nấm Paecilomyces sp.

❖

Khảo sát ảnh hưởng của các loại thuốc trừ sâu, bệnh đến sự phát triển của
nấm Paecilomyces sp.

❖

Khảo sát ảnh hưởng của các loại cơ chất khác nhau lên sự phát triển của nấm

❖

Paecilomyces sp.
Đáng giá khả năng trừ tuyến trùng hại hồ tiêu trong điều kiện in vitro và trên
đồng ruộng.

2


Đồ án tốt
nghiệp

CHƯƠNG 1:

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu về nấm Paecilomyces sp.
1.1.1. Phân loại khoa học
Giới:

Fungi Ngành:

Ascomycota Lớp:
Eurotiomycetes Bộ:
Eurotiales
Họ:

Trichocomaceace

Chi:

Paecylomyces

Chi Paecilomyces do Bainier mô tả năm 1907, sau đó được nhiều tác giả
chấp nhận chi mới này và bổ sung nhiều loài mới. Paecilomyces lilacinum đã được

phân loại trong phần Isarioidea, mà trạng thái hoàn hảo vẫn chưa được tìm thấy.
Nấm Paecilomyces spp. có rất nhiều loài trên thế giới, khoảng 31 loài và phân bố
trên diện rộng trong đó có thể kể đến là Paecilomyces farinosus, Paecilomyces
fumosoroseus, Paecilomyces amoeneroseus, Paecilomyces javanicus, Paecilomyces
tenuipes, Paecilomyces cicadae, Paecilomyces lilacinus (Dilip K. Arora, P. D.
Bridge, Deepak Bhatnagar, 2004).
Nấm Paecilomyces sp. có rất nhiều loài, có phổ ký sinh tuyến trùng rất rộng,
cả ở vùng nhiệt đới và ôn đới (Trần Văn Mão, 2002). Nấm Paecilomyces spp. dễ
dàng tìm thấy ở đất tơi xốp, phân hữu cơ và thức ăn, xác bã hữu cơ, dư thừa thực
vật. Chúng hiện diện ở những nơi ẩm ướt cả trong phòng và ngoài tự nhiên. Một số
loài quan trọng trong phòng trừ sinh học như:
- Paecilomyces carneus: phân lập từ đất và xác chết tuyến trùng
- Paecilomyces farinosus: phân lập từ đất
- Paecilomyces fumosoroseus: phân lập từ đất, bơ, gelatin, tuyến trùng.
- Paecilomyces lilacinus phân lập từ xác bã hữu cơ, đôi khi ở tuyến trùng
chết, rừng cao su, đất trồng tiêu... (Crop Protection Compennium, 2002).

3


Đồ án tốt
nghiệp

1.1.2. Đặc điểm hình thái
Paecilomyces sp. là loài nấm sợi được tìm thấy trong đất hay xác tuyến
trùng. Khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo nấm thường phát triển khá
chậm, có dạng thảm nhung, dạng bó sợi và thường lúc đầu có màu trắng sau đố khi
bào tử phát triển thì chuyển sang màu hồng nhạt, màu tím hay màu lục nhạt (nên
thường được gọi là nấm tím) tùy vào từng loài. Cũng có loài màu nâu hay vàng
sẫm. Sợi nấm mềm, có vách, trong suốt và rộng từ 2,5 - 4 µm (Wikipedia). Cuống

bào tử phân sinh phân nhánh, mức độ phân nhánh của nấm Paecilomyces sp. thường
lớn hơn nấm mốc xanh Penicillium, gốc cuống dạng bình phình to, phía trên nhỏ và
uốn cong. Cuống bình thường sắp xếp dạng vòng hoặc không đồng đều. Bào tử
phân sinh đơn bào, không màu, mọc thành chuỗi, hình bầu dục, bề mặt nhẵn hoặc
có gai (Trần Văn Mão, 2002). Khuẩn lạc mọc theo đường tròn đồng tâm. Có thể
phân biệt các loài khác nhau của Paecilomyces thông qua hình thái đại thể và vi thể.
(Phùng Lê Kim Yến, 2014)

Hình 1.1. Đại thể nấm Paecilomyces sp. được nuôi nấy trên môi trường
PDA.
(Nguồn: />Thể bình gồm một phần đuôi phình to, thon dần ở phần đầu như một cái cổ.
Bào tử trong chuỗi có nhiều dạng từ elip đến hình thoi. Bào tử có thành trơn hoặc
hơi nhám, không có bào tử chống chịu.

4


Đồ án tốt
nghiệp

Hình 1.2. Nấm Paecilomyces sp, được chụp dưới kính hiển vi
(Nguồn: />1.1.3. Cơ chế tiết độc tố của nấm Paecilomyces
Khi được nuôi cấy lên men chìm người ta đã chiết tách được hoạt chất sinh học có
tên gọi là leucinostatins (còn gọi là paecilitoxin). Leucinostatins là một peptide
trung tính với cấu trúc gồm: α - aminoisobutyric acid, L-leucine, β - alanine và theo
sau bởi 3 acid amin bất thường (L – threo – β - hydroxy leucine, 2 – amino – 2 –
hydroxy – 4 – methyl – 8 oxodecanoicacid và cis – 4 – methyl – L - proline (theo
Mori et al. 1982). Leucinostatins có 6 loại đã được mô tả là A, B, C, D, E, F.
Leucinostatins có khả năng kháng khuẩn, chống lại vi khuẩn Gram dương và nhiều
loại nấm (theo Fukushima et al. 1983 a,b). Tuy nhiên trong cơ chế kiểm soát tuyến

trùng không có sự tham gia của loại độc tố này. Tùy từng loài Paecilomyces khác
nhau mà có sinh ra các độc tố khác như: bysochlamic acid, variotin, ferriunbin,
viriditoxin, indole-3-acetic acid, fusigen và patulin. Các hợp chất chuyển hóa thứ
cấp này có thể gây ra tác động diệt tuyến trùng.

5


Đồ án tốt
nghiệp

Hình 1.3. Cấu trúc Leucinostatins (paecilotoxin)
1.1.4. Chu kỳ sống và cơ chế tác động của nấm Paecilomyces spp. đối với tuyến
trùng
Nhiều loài vi nấm được phân lập từ trứng tuyến trùng sần rễ (Stirling và
West, 1991). Được nghiên cứu nhiều nhất là Paecilomyces lilacinus và
Paecilomyces chalmydosporia, chúng được xem là có khả năng ký sinh tuyến trùng
hiệu quả nhất, có thể kí sinh cả trứng lẫn con cái (Siddiqui và Mahmood, 1996).
Có hai rào cản đối với nấm kí sinh tuyến trùng khi xâm nhiễm kí chủ là lớp
biểu bì ấu trùng tuổi 2 (J2) và vỏ trứng. Một trong những yếu tố quan trọng ảnh
hưởng đến quá trình xâm nhiễm là khả năng tiết enzyme protease và chitinase, bởi
vì vỏ trứng được cấu tạo bởi 3 lớp riêng biệt: lớp vitelline bên ngoài, một lớp chitin
và một lớp lipoprotein bên trong. Theo Llorca và Claugher (1990), trong quá trình
xâm nhiễm, ở giai đoạn đầu, một mạng lưới sợi nấm phân nhánh tiếp xúc với vỏ
trứng, sau đó chúng tiết enzyme để phân hủy vỏ trứng dẫn đến sự tan rã của lớp
vitellin, sự phân hủy lớp chitin và lipoprotein (Morton et al., 2004).
Các loài nấm khác nhau có khả năng xâm nhiễm tuyến trùng và trứng theo
các phương thức khác nhau. Ban đầu, các bào tử và sợi nấm tiếp xúc với vỏ trứng.
Nấm kí sinh tuyến trùng sử dụng cả cách thức hóa học (tiết enzyme) và cơ học.
Nấm tiết ra các enzyme làm mềm vỏ trứng và tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử

mộc mầm, thông qua lổ thủng đó mầm của bào tử nấm sẽ xâm nhập vào bên trong

6


Đồ án tốt
nghiệp

trứng tuyến trùng (Perry và Starr, 2009). Khả năng tiết enzyme chitinase và protease
đóng vai trò quan trọng trong quá trình xâm nhập trứng tuyến trùng của các loài
nấm (Tikhonov et al., 20002) do vỏ trứng được cấu tạo từ chitin và protein tạo
thành một cấu trúc sợi nhỏ và vô định hình (Wharton, 1980). Sau khi xâm nhập vào
bên trong chúng hoạt động, tiết ra các độc tố làm tê liệt và phá hủy bên trong cơ thể
tuyến trùng, hút dinh dưỡng để sinh sản, tiêu diệt trứng, ấu trùng, làm thay đổi sự
trao đổi chất, hoạt động sinh lý, dẫn đến cái chết của tuyến trùng.
1.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của nấm Paecilomyces sp.
Các nhà khoa học cũng cho biết rằng nấm Paecilomyces spp. khi tấn công
vào cơ thể tuyến trùng nếu gặp những điều kiện không thích hợp về nhiệt độ và ẩm
độ, ánh sáng thì nấm sẽ tạo nên những thể chịu đựng (resistant structures) để đối
phó lại với môi trường (Penland, 1982).
1.1.5.1 Nguồn dinh dưỡng
Trong quá trình phát triển, nấm Paecilomyces sp. cần nhiều dưỡng chất, nếu
thiếu dinh dưỡng sẽ làm hạn chế khả năng gây bệnh của nấm đối với tuyến trùng
(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Carbon và Nitơ cùng với sự cân bằng
giữa chúng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển cũng như sự hình thành
bào tử của nấm Paecilomyces sp. (theo trích dẫn của Rayati và ctv, 2001). Các
nghiên cứu cho biết, việc bổ sung nguồn đường có ảnh hưởng đến khả năng sinh
enzyme của nấm (dẫn theo Rayati và ctv, 2001). Các tác giả còn cho biết sucrose là
cơ chất tốt nhất (8,725 cm) cho sự tăng trưởng, tiếp theo là glucose (5,625 cm).
Liang, K. (1981) đã cho biết nấm Paecilomyces tenuipes khi thiếu nguồn nitơ động

vật tính gây bệnh giảm xuống rõ rệt (Hill, K. L, 1999, trích dẫn bởi Trần Văn Mão,
2002).
1.1.5.2 Nhiệt độ
Nhiệt độ và độ ẩm tương đối được coi là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự
phát triển, hình thành bào tử và lây nhiễm của các loài nấm kí sinh tuyến trùng
(Ayyasamy và Baskaran, 2005). Nhiệt độ thích hợp cho nấm trong khoảng 20 – 25
0

C, nhưng ở 25 0C nấm phát triển tốt nhất (Lee et al., 1999). Gần đây, Stather và

7


Đồ án tốt
nghiệp

ctv đã công bố những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát
triển của nấm Paecilomyces sp. và xác định nấm Paecilomyces sp. thích hợp ở nhiệt
độ 28 0C. Nếu nhiệt độ cao bào tử dễ bị chết hoặc không hình thành, khi tấn công
tuyến trùng nếu gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ hay ánh sáng không thích hợp thì
nấm Paecilomyces sp. sẽ tạo nên những thể chịu đựng để đối phó lại môi trường
(theo Penland, 1982). Khi nuôi nấm Paecilomyces farinosus ở các điều kiện nhiệt
độ khác nhau cho thấy nhiệt độ 15 0C có lợi cho sự hình thành bào tử hơn là nhiệt
độ 24 0C. Khi nuôi nấm Paecilomyces papillata, nhiệt độ thích hợp nhất là 24 - 26
0

C, nhưng ở nhiệt độ 18 0C tỷ lệ ký sinh cao hơn 18 % so với nhiệt độ 25 0C.

Nguyên nhân có thể là do dưới nhiệt độ thấp sẽ làm giảm quá trình, dị hóa, làm tăng
quá trình đồng hóa, từ đó làm tăng hoạt chất cho cá thể (Trần Văn Mão, 2002). Julio

J. D và ctv. (2004) đã chứng minh rằng rất ít hoặc không có bào tử nấm được tạo
nên ở các nhiệt độ 12 0C, 16 0C và 30 0C.
1.1.5.3 Ẩm độ
Nấm phát triển thích hợp ở ẩm độ 80 – 90% (Phạm Thị Thùy, 2004). Ẩm độ
cao sẽ rất có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, tuy nhiên ẩm
độthấp sẽ có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Bào tử phân sinh của nấm
Paecilomyces sp. có khả năng sống lâu trong điều kiện ẩm độ từ 0 – 34 % hơn là khi
ẩm độ 75 %.
1.1.5.4 pH
pH môi trường được quyết định bởi nồng độ ion H+, chính nồng độ ion H+
có ảnh hưởng đến hệ thống enzyme của tế bào và ảnh hưởng việc hấp thu khoáng,
acid hữu cơ của tế bào nấm cho quá trình phát triển cũng như hình thành bào tử
(Dasrupta, 1994). Nấm thường sống trong phạm vi pH = 3,5 – 8. Nhưng nấm tuyến
trùng ưa pH hơi acid và nấm phát triển thích hợp ở pH = 5,5 – 6. Theo nghiên cứu
của Sung Mi Shim et al., (2003), thì giá trị pH phù hợp cho sự phát triển của P.
fumosoroseus nằm trong khoảng 6 – 9, còn P. japonica phát triển tối ưu ở pH 7
(Choi et al., 1999), P. sinclairii phát triển tối ưu ở pH 8 (Shim et al., 2003).
1.1.5.5 Ánh sáng

8


Đồ án tốt
nghiệp

Các loài nấm ký sinh tuyến trùng, tuyến trùng rất cần ánh sáng cho sự phát
triển và tạo bào tử. Ánh sáng là nhân tố không thể thiếu cho việc hình thành bào tử
(theo trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002). Ánh sáng cũng rất cần thiết cho quá trình
sinh bào tử của nấm Paecilomyces spp. Nếu thiếu ánh sáng thì nấm Paecilomyces
spp. sẽ không tạo nhiều bào tử.

1.1.5.6 Độ thoáng khí
Nấm tuyến trùng đa số đều thuộc loại hiếu khí. Khi nấm phát triển chúng đòi
hỏi có lượng oxy thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi hay trong cả biên độ rộng của
không gian nuôi cấy, nếu phù hợp nấm sẽ phát triển tốt.
1.1.5.7 Môi trường nuôi cấy
Năm 1986, tác giả Jeanne M. M. I. và CS. (1986) đã thử nghiệm nuôi cấy
nấm Paecilomyces sp. bằng phương pháp lên men chìm. Tác giả đã tiến hành thử
nghiệm các điều kiện nhân sinh khối tạo bào tử chồi (Blastospore) bằng các nguồn
nitơ và cacbon khác nhau. Kết quả cho thấy trong các nguồn nitơ thử nghiệm thì
(NH4)2SO4 thích hợp nhất cho nấm Paecilomyces sp. phát triển, tạo bào tử chồi.
nhiều nghiên cứu về sản xuất nấm Paecilomyces sp. trong điều kiện nuôi cấy lỏng
đã chỉ ra rằng để tối ưu hóa cho sản xuất tối đa sinh khối sợi nấm và exo –
polysaccharide của nấm Paecilomyces japonica. Kết quả cho thấy với thành phần
glucose 30g, 20 g cao nấm men, 0,5g KH2PO4 và 0,1 g CuCl2.2H2O và 1 lít nước
cất được cho là môi trường tối ưu để sản xuất nấm Paecilomyces japonica ở nhiệt
độ 27 0C sẽ cho sinh khối sợi nấm và lượng polysaccharide lần lượt là 23,1 g / l và
2,5 g / l (Lee JS, Iung WC, Park SJ, Lee KE, Shin WC, Hong Ex, 2012). Nghiên
cứu của Li Gao (2015) báo cáo về tác động của các yếu tố dinh dưỡng và môi
trường ảnh hưởng đến sản xuất sinh khối và bào tử nấm Paecilomyces lilacunus IPC
– P. Các yếu tố này bao gồm nguồn carbon và nitơ, tỷ lệ C / N, các khoáng chất và
vitamin cùng với nguồn nước, nhiệt độ, chu kỳ sáng / tối và độ pH. Các bào tử đã
được cấy trên môi trường cơ bản (sucrose 19.00 g / l, peptone đậu nành 4.06 g / l,
K2HPO4 1,00 g / l, KCl 0.50 g / l, MgSO4 0.50 g / l, FeSO4 0,01 g / l, agar 13,00 g /
l) trong 4 ngày, trước khi được cấy chuyền qua môi trường hình thành bào tử

9


Đồ án tốt
nghiệp

(dextrin 2.27 g / l, urê 2.13 g / l, CaCl2 3,00 g / l, ZnSO4 · 7H2O 0,01 g / l, agar
13.00 g / l) cho thêm 4 ngày theo các điều kiện môi trường sau đây: -3,9 MPa / pH
7
/ ánh sáng 24 h / nhiệt độ 29 °C; những điều kiện đã được thay đổi để -0,3 MPa / pH
6 / ánh sáng 24 h / nhiệt độ 23 ° C để có được số lượng sinh khối tốt hơn. Số liệu
cung cấp thông tin về nhu cầu dinh dưỡng và môi trường của loại nấm này, đó sẽ là
điều cần thiết cho việc sản xuất chế phẩm thương mại của nó. Môi trường nuôi cấy
lỏng với nồng độ carbon khác nhau và tỷ lệ C / N đã được thử nghiệm để sản xuất
bào tử chịu khô hạn của Paecilomyces fumosoroseus. Trong khi tất cả các môi
trường được thử nghiệm hỗ trợ hình thành bào tử trong môi trường lỏng, nồng độ
bào tử cao (5,8 × 108 bào tử / ml) được sản xuất trong môi trường có chứa 80 g
glucose.l-1 và 13,2 g Casamino axit.l-1 (môi trường MS) và một tỷ lệ cao hơn đáng
kể (79 %) của các bào tử sống sót không khí khô. có chứa nồng độ glucose trong
môi trường lớn hơn 20 g / l và axit Casamino nồng độ từ 13,2 và 40 g / l hỗ trợ sản
xuất tối đa của bào tử chịu khô hạn. Tất cả 23 chủng nấm P. fumosoroseus phân lập
trong trong môi trường MS được sản xuất cho nồng độ cao của bào tử chịu khô hạn.
Khi bảo quản ở nhiệt độ 4 °C, hơn 60 % số bào tử đông khô được sản xuất trong
môi trường MS vẫn còn hoạt tính sau khi bảo quản 7 tháng trong khi ít hơn 25 %
của bào tử khô trong không khí sống sót sau 90 ngày lưu trữ.
Hàng loạt các nghiên cứu về các loại cơ chất, thành phần môi trường để sản
xuất sinh khối nấm Paecilomyces sp. đã được thực hiện. S. Prabhu, S.Kumar và S.
Subranmanian (2008) nghiên cứu sản xuất sinh khối nấm Paecilomyces
lilacinus trên môi trường lỏng để trừ trứng tuyến trùng. Thí nghiệm được thực
hiện trên 4 loại môi trường Potato dextrose broth (PDB), môi trường Richards; 10
% Molasses và môi trường Semi chọn lọc. Kết quả thí nghiệm cho thấy khối lượng
sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (19,82g), tiếp theo là môi trường
10 % Molasses (16.85 g). Khối lượng sợi nấm đạt ít nhất ở môi trường PDB
(10.5g). Sinh khối sợi nấm đạt cao nhất ở môi trường Semi chọn lọc (32.8 x 107
bào tử / g), tiếp theo là môi trường 10% Molasses (28.8 x 107 bào tử / g). Bào tử

10


Đồ án tốt
nghiệp
đạt ít nhất ở môi trường PDB (10.3 x 107 bào tử / g). Năm 2015, Zhen Yu, You –
chi Zhang, Xiang

11


Đồ án tốt
nghiệp

Zhang và Yin Wang đã thực hiện nghiên cứu lên men nấm Paecilomyces lilacinus
bằng chất thải thực phẩm kiểm soát sinh học tuyến trùng sần rễ. Điều kiện môi
trường nuôi cấy nấm P. lilacinus được tối ưu hóa thông qua phương pháp lên men
bề mặt. Kết quả chỉ ra rằng thời gian lên men, lượng chất thải thực phẩm, độ pH ban
đầu và nhiệt độ là các yếu tố quna trọng ảnh hưởng đến sản xuất P. lilacinus. Sinh
khối nấm Paecilomyces lilacinus phát triển ở điều kiện tối ưu cho 109,6±0,3 bào tử /
ml. Sau khi lên men, nhu cầu oxy hóa của chất thải thực phẩm giảm một cách hiệu
quả với 81,92 %. Hoạt tính enzyme protease và khả năng kiểm soát tuyến trùng sần
rễ của P. lilacinus nuôi bằng chất thải thực phẩm được đánh giá cao hơn khi nuôi
bằng môi trường PDA lần lượt là 10,8 % và 27 %.
Lê Hữu Phước và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu nhân sinh khối
nấm Paecilomyces spp. trên bốn loại môi trường CDB, CMB, SDAY1 và SDAY3
qua các thời điểm 2, 4, 6, 9, 12 và 14 ngày. Kết quả thí nghiệm cho thấy rằng Khả
năng tạo bào tử ở 4 môi trường dinh dưỡng cao nhất ở 6 NSKL. Mật số bào tử cao
nhất ở môi trường SDAY3 (5,6 x 108 bào tử / ml) và thấp nhất là môi trường CDB,

chỉ có 0,6 x 108 bào tử / ml. Hai môi trường SDAY1 và CAM cho mật số bào tử lần
lượt là 5,0 x 108 bào tử / ml và 4,8 x 108 bào tử / ml, tuy nhiên giữa chúng không có
sự khác biệt về mặt thống kê.
Tổng quan về tuyến trùng Meloidogyne sp. gây bệnh bướu rễ trên cây hồ
tiêu
1.2.1. Tổng quan về tuyến trùng ký sinh thực vật
Tuyến trùng ký sinh thực vậy có thể gây ra những tổn hại rất lớn, từ những
vết thương nhỏ đến toàn bộ vật chất của thực vật (Sharman et al., 1997). Tổn hại về
mặt kinh tế từ 40-50% hay thậm chí tổn hại còn cao hơn nếu thực vật chịu sự tấn
công bởi những loài tuyến trùng có khả năng gây hại cao (Maqbool và Kerry,
1997).
Vì triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra không biểu hiện rõ ràng nên người
nông dân thường đánh giá thấp ảnh hưởng về mặt kinh tế do chúng gây ra. Thiệt hại
về cây trồng do tuyến trùng gây ra hậu quả cao đặc biệt vào mùa mưa, trong đó bao

12


Đồ án tốt
nghiệp

gồm các loại cây thuộc họ Solanaceae như khoai tây và cà chua bị ảnh hưởng nhiều
nhất. Ở Việt Nam, sản lượng tiêu giảm đáng kể do tuyến trùng Meloidogyne spp.
gây ra bệnh sần rễ. Chúng phá hoại bộ rễ, tạo nhiều vết thương làm cho các loài vi
nấm, vi khuẩn có khả năng xâm nhập và gây bệnh dễ dàng hơn. Khi tuyến trùng gây
hại, cây ngừng sinh trưởng, lá vàng, ra hoa và đậu quả kém. Đặc biệt, khi quan sát
dưới rễ sẽ thấy có những nốt sần xuất hiện, nếu bệnh quá nặng cây sẽ chết. Bệnh
sần rễ không chỉ biểu hiện ở những cây lá vàng mà còn cả những cây xanh tươi do
bệnh mới phát triển ở giai đoạn đầu, rễ vẫn vận chuyển nước và khoáng chất được.
Tuyến trùng ký sinh trên hồ tiêu gồm tuyến trùng ngoại ký sinh và nội ký

sinh, chích hút dinh dưỡng từ rễ làm suy giảm sức khỏe của cây, gây tổn thương rễ,
ngăn cản sự hấp thu dinh dưỡng và nước, gây vàng lá cục bộ hoặc vàng toàn bộ cây,
gây héo tạm thời vào mùa khô khi thiếu nướcvà có nhiều u bướu rễ, vết thâm đen
tại bướu, hoặc bướu bị mục nát, có rất ít rễ non được hình thành. Hội chứng vàng lá
cây tiêu có liên quan đến mức độ rễ bị tổn thương do sự ký sinh của tuyến trùng.
Triệu chứng sưng rễ thường do tuyến trùng nội ký sinh gây ra, hoặc chỉ là vết thâm
nâu, nâu đen trên rễ do tuyến trùng ngoại ký sinh tạo ra.
Tuyến trùng luôn hiện diện trong vùng rễ hồ tiêu và tập trung nhiều từ độ sâu
5 đến 40 cm, vì rễ là nơi cung cấp dinh dưỡng cho tuyến trùng. Cây càng tốt, rễ hút
dinh dưỡng càng nhiều, tuyến trùng càng phát triển nhanh về số lượng. Mật độ
tuyến trùng trên một đơn vị khối lượng đất (50g, 100g) hoặc khối lượng rễ (1g, 5g),
số bướu trên đơn vị khối lượng đất hay khối lượng rễ (1g), số tuyến trùng cái trong
1 bướu rễ, là các chỉ tiêu dùng để đánh giá mức độ nhiễm tuyến trùng của đất trồng
và cây ký chủ. Vì vây, biện pháp kiểm soát số lượng tuyến trùng cần thực hiện vào
thời điểm cây hồ tiêu có tốc độ phát triển cao nhất và lúc tuyến trùng tập trung vào
vùng rễ nhiều nhất.
Tuyến trùng nhanh chóng tiếp cận và xâm nhiễm vào rễ non sau khi cây
được trồng và thiết lập quần thể với nhiều thế hệ cùng tồn tại. Tuy nhiên cơ cấu đất,
nguồn hữu cơ, vi sinh vật đối kháng hoặc ký sinh có ảnh hưởng đến số lượng tuyến
trùng. Tuyến trùng rễ cây hồ tiêu ít định cư ở tầng đât sâu hơn 60 cm, vì vậy kỹ

13


Đồ án tốt
nghiệp

thuật trồng và chăm sóc cho hệ rễ phát triển theo chiều sâu sẽ giúp cây “thoát” sự
xâm nhiễm tuyến trùng.
Tuyến trùng phát tán theo nước mưa, nước tưới, động vật đi lại trong vườn,

cây giống nhiễm tuyến trùng, hoặc do con người đi lại vô tình mang đất nhiễm
tuyến trùng. Tàn dư rễ có tuyến trùng định cư, cây ký chủ, mảng trứng trong đất là
nơi lưu tồn nguồn tuyến trùng trên vườn hồ tiêu hằng năm.
Sự phát triển của bệnh trải qua 3 giai đoạn:
-

Giai đoạn 1: tuyến trùng mới xâm nhập vào rễ và tạo nốt sần, lúc này

rễ chưa bị ảnh hưởng nhiều, rễ vẫn còn màu trắng.
-

Giai đoạn 2: rễ bị đổi màu, chức năng vận chuyển nước và chất dinh

dưỡng bị ảnh hưởng. Rễ bị tổn thương và tạo cơ hội cho các vi sinh vật tấn công
gây nhiều bệnh khác cho cây.
-

Giai đoạn 3: rễ bị đổi màu đen và chức năng vận chuyển đã không

14