Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh aflatoxin aspergillus spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VI KHUẨN LACTIC TỪ THỰC PHẨM LÊN
MEN TRUYỀN THỐNG CÓ KHẢ NĂNG KHÁNG NẤM
MỐC SINH AFLATOXIN Aspergillus spp.

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1211100167

: LƯU ĐẠI KIM PHƯỢNG
Lớp: 12DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2016


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu, kết quả nêu
trong đồ án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác.

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được
cám ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn

Lưu Đại Kim Phượng

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, con xin gửi lời cám ơn đến bố mẹ. Cám ơn bố mẹ đã không quản khó
khăn nuôi dưỡng con từng ngày, dạy cho con những điều hay lẽ phải. Bố mẹ luôn là
chỗ dựa vững chắc nhất của con, là nguồn động viên to lớn cho con mỗi khi con vấp
ngã và cũng là động lực để con tiếp tục phấn đấu trong công việc cũng như trong cuộc
sống.
Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cám ơn toàn thể quý Thầy Cô bộ
môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường, cùng
toàn thể quý Thầy Cô trường Đại học Công nghệ TP.HCM đã nhiệt tình giảng dạy và
truyền đạt cho em những kiến thức quý báu về cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Hoài Hương – Trường bộ môn
Công Nghệ Sinh Học, khoa Công Nghệ Sinh Học – Thực phẩm – Môi trường Trường
Đại học Công Nghệ TP.HCM, người cô đáng kính, đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ,
cung cấp thông tin cũng kiến thức thật hữu ích cho em trong suốt quá trình thực hiện
đồ án.
Em cũng xin cảm ơn các Thầy Cô phụ trách phòng thí nghiệm Trường Đại học
Công Nghệ TP.HCM đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho em hoàn tất phần thực nghiệm
của đồ án.

Xin chân thành cảm ơn các bạn học cùng lớp 12DSH đã gắn bó, chia sẻ, giúp đỡ
và đóng góp ý kiến cho em trong suốt bốn năm đại học.
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã
dành thời gian đọc, nhận xét đồ án tốt nghiệp này.
TP.HCM, tháng 8 năm 2016.
SVTH: Lưu Đại Kim Phượng

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT.......................................................................................vii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH...................................x
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
1. Tính cấp thiết của đề tài .........................................................................................1
2. Tình hình nghiên cứu .............................................................................................2
2.1. Ngoài nước .........................................................................................................2
2.2. Trong nước .........................................................................................................3
3. Mục tiêu nghiên cứu ...............................................................................................3
4. Mục đích nghiên cứu ..............................................................................................3
5. Nhiệm vụ nghiên cứu ..............................................................................................3
6. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................4
6.1. Phương pháp luận ..............................................................................................4
6.2. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................4
7. Kết quả đạt được của đề tài ...................................................................................4
8. Kết cấu đồ án ...........................................................................................................5
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN..........................................................................................6

1.1. Tổng quan về nấm ...............................................................................................6
1.1.1. Giới thiệu chung ..............................................................................................6
1.1.2. Độc tố nấm ......................................................................................................6
1.1.3. Tác hại của nấm ..............................................................................................7
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật ...................................................7
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật ......................................................................8
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm ............................................................8
1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic ..............................................................................9
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic ................................................................................9

3


Đồ án tốt nghiệp

1.2.1.1. Giới thiệu chung ............................................................................................................9
1.2.1.2. Khái niệm ..................................................................................................................... 10
1.2.1.3. Đặc tính chung ........................................................................................................... 12
1.2.1.4. Đặc điểm hình thái giống Lactobacillus chủ yếu .............................................. 14
1.2.2. Đặc điểm sinh lý – sinh hóa ..........................................................................24
1.2.2.1. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic ............................................................. 24
1.2.2.2. Qúa trình trao đổi chất............................................................................................. 26
1.2.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men, quá trình sinh trưởng và
phát triển của vi khuẩn lactic ................................................................................................ 31
1.2.3. Các phương pháp xác định, phân loại vi sinh vật vừa phân lập...................32
1.2.3.1.Định danh vi sinh vật theo phương pháp cổ điển (Owen R. Fennema et al.
2004) ............................................................................................................................................. 32
1.2.3.2. Sự phân loại LAB đến cấp giống (Owen R. Fennema et al. 2004) ............... 33
1.2.3.3. Định danh vi sinh vật theo phương pháp hiện đại ............................................ 37
1.2.4. Sản phẩm trao đổi chất và ứng dụng của vi khuẩn lactic .............................38

1.2.4.1. Sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic ....................................................... 38
1.2.4.2. Ứng dụng của vi khuẩn lactic ................................................................................. 40
1.2.5. Khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic ..........................................40
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................46
2.1. Địa điểm nghiên cứu ..........................................................................................46
2.2. Thời gian thực hiện............................................................................................46
2.3. Vật liệu ................................................................................................................46
2.3.1. Thiết bị và dụng cụ ........................................................................................46
2.3.2. Hóa chất ........................................................................................................46
2.3.3. Giống nấm .....................................................................................................50
2.4. Phương pháp luận..............................................................................................50
2.5. Phương pháp thí nghiệm ...................................................................................53

4


Đồ án tốt nghiệp

2.5.1. Thu thập mẫu .................................................................................................53
2.5.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn lactic .........................................................53
2.5.2.1. Tăng sinh ...................................................................................................................... 53
2.5.2.2. Phân lập ....................................................................................................................... 53
2.5.3. Các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn lactic. ......................................55
2.5.3.1. Nhuộm Gram ............................................................................................................... 55
Kết quả: ........................................................................................................................................ 55
2.5.3.2. Nhuộm bào tử .............................................................................................................. 55
2.5.3.3. Thử nghiệm Catalase ................................................................................................ 56
2.5.3.4. Thử nghiệm khả năng sinh acid ............................................................................. 56
2.5.3.5. Thử nghiệm khả năng di động ................................................................................ 57
2.5.3.6. Thử nghiệm khả năng lên men đường và khả năng sinh khí .......................... 57

2.6. Xác định hàm lượng acid tổng..........................................................................58
2.7. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt
thạch khuếch tán của chủng Lactobacillus sp. với nấm bệnh
...............................59
2.8. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic trong bảo quản hạt .63
2.8.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo quản hạt đậu phộng: ......................................63
2.8.2. Kiểm nghiệm vi sinh sản phẩm......................................................................65
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ................................................................66
3.1. Kết quả phân lập................................................................................................66
3.2. Định danh các chủng phân lập .........................................................................68
3.2.1. Thử nghiệm Catalase.....................................................................................68
3.2.2. Nhuộm Gram .................................................................................................69
3.2.3. Thử nghiệm khả năng di động bằng phương pháp thạch mềm. ....................76
3.2.4. Nhuộm bào tử ................................................................................................77
3.2.5. Thử nghiệm kiểm tra khả năng lên men đường và khả năng sinh khí...........79
3.3. Xác định Hàm lượng acid tổng .........................................................................83
5


Đồ án tốt nghiệp

3.4. Khảo sát khả năng kháng nấm của chủng vi khuẩn lactic bằng phương
pháp khuếch tán........................................................................................................86
3.5. Ứng dụng sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn phân lập được trong bảo
quản hạt
.....................................................................................................................92
3.5.1. Ứng dụng tạo màng bao bảo vệ đậu phộng ..................................................92
3.6.2 Kiểm tra vi sinh chất lượng của sản phẩm: ...................................................97
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ...................................................................................102
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................104

6


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
FDA

Fructose-bisphosphate aldolase

ATP

Adenosin triphosphat

LAB

lactic acid bacteria /Lactobacillales

DNA

Deoxyribonucleic acid

rRNA

ribosomal Ribonucleic acid

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

PDA

Potato Detrose Agar

DMSO

Dimethyl sulfoxide

Bacillus sb.

Bacillus subtilis

E. coli

Escherichia coli

vii


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Phân loại khoa học giống Lactobacillus ...................................................... 14
Bảng 1.2: Phân loại Lactobacillus (Sharpe 1981, Kandler và Weiss, 1986)................ 17
Bảng 1.3: Phân loại khoa học giống Streptococcus...................................................... 19
Bảng 1.4: Phân loại khoa học giống Leuconostoc........................................................ 22
Bảng 1.5: Phân loại khoa học giống Pediococcus........................................................ 23
Bảng 1.6. Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) ........................................................................................... 42

Bảng 1.7. Phân lập vi khuẩn lactic với khả năng ức chế độc tố sinh trưởng của nấm
mốc và nấm men ........................................................................................................... 43
Bảng 1.8. Các sản phẩm trao đổi chất của vi khuẩn lactic có tính kháng sinh.
(Holzapfel và cộng sự, 1995) ........................................................................................ 44
Bảng 2.1: Kí hiệu các nguồn phân lập.......................................................................... 53
Bảng 3.1: Bảng kí hiệu các chủng vi khuẩn phân lập .................................................. 68
Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc dưới kính hiển vi x4 và hình thái vi khuẩn dưới kính
hiển vi x100 ................................................................................................................... 73
Bảng 3.3: Kết quả của các thí nghiệm dùng để định danh vi khuẩn ............................ 81
Bảng 3.4: %Acid lactic của 17 chủng vi khuẩn phân lập được................................... 83
Bảng 3.5: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Nem chua .................................................................................................................. 84
Bảng 3.6: Bảng xử lý số liệu khả năng sinh acid và giá trị OD của các chủng phân lập
từ Cơm mẻ ..................................................................................................................... 85
Bảng 3.7: Phân nhóm các chủng vi khuẩn lactic.......................................................... 85
Bảng 3.8: Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .................................... 89
Bảng 3.9: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Nem
chua ............................................................................................................................... 90
8


Đồ án tốt nghiệp

Bảng 3.10: Bảng xử lý số liệu khả năng kháng nấm của các chủng phân lập từ Cơm
mẻ .................................................................................................................................. 91
Bảng 3.11: Kí hiệu các thành phần của thí nghiệm ...................................................... 92
Bảng 3.12: Khả năng kháng nấm của Nghiệm thức 1 – Canh trường nuôi cấy và
Nghiệm thức 2 – Canh trường nuôi cấy + Chitosan 0.4% ứng dụng trên đậu phộng... 93
Bảng 3.13: Kết quả kiểm nghiệm Tổng số vi sinh vật hiếu khí và Coliform ............... 97

9


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ, ĐỒ THỊ, SƠ ĐỒ, HÌNH ẢNH
Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004) ..... 12
Hình 1.2: Lactobacillus (L. acidophilus)...................................................................... 15
Hình 1.3: Lactobacillus salivarius ............................................................................... 15
Hình 1.4: Streptococcus ............................................................................................... 19
Hình 1.5: Leuconostoc.................................................................................................. 22
Hình 1.6: Pediococcus.................................................................................................. 24
Hình 1.7: Con đường lên men Glucose ........................................................................ 30
Hình 2.1: Sơ đồ các bước phân lập và định danh vi khuẩn lactic ................................ 54
Hình 2.2: Cách pha loãng mẫu ..................................................................................... 54
Hình 2.3 : Sơ đồ khảo sát khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic phân lập
được với nấm bệnh theo phương pháp đục thạch khuếch tán ....................................... 60
Hình 2.4: Hình mô tả phương pháp đặt thạch .............................................................. 62
Hình 2.5: Cách đo đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh theo
phương pháp đặt thạch khuếch tán................................................................................ 63
Hình 3.1: Hình thái của vi khuẩn lactic ........................................................................ 67
Hình 3.2: Các khuẩn lạc có vòng phân giải CaCO3 ..................................................... 67
Hình 3.3: Chủng Bacillus sb. Có Catalase dương tính (Trái). Chủng phân lập có
Catalase âm tính (Phải) ................................................................................................. 69
Hình 3.4: Mẫu đối chứng với nước cất (Trái). Chủng phân lập có Catalase âm tính
(Phải) ............................................................................................................................. 69
Hình 3.5: Vi khuẩn Bacillus sb. Gram dương bắt màu tím.......................................... 70
Hình 3.6: Vi khuẩn E.Coli Gram âm bắt màu hồng ..................................................... 70
Hình 3.7: Kiểm tra tính di động của vi khuẩn .............................................................. 77
Hình 3.8: Vi khuẩn Bacillus sb. sinh bào tử................................................................. 78

Hình 3.9: Vi khuẩn E.Coli không sinh bào tử .............................................................. 78
Hình 3.10: Mẫu Vi khuẩn phân lập không sinh bào tử ................................................ 79

1
0


Đồ án tốt nghiệp

Hình 3.11: Thử nghiệm khả năng lên men đường........................................................ 80
Hình 3.12: Vi khuẩn Lactobacillus L5 có khả năng lên men đường ........................... 81
Hình 3.13: Đồ thị biểu hiện % acid lactic của 17 chủng khuẩn sau 24 giờ nuôi cấy ... 84
Hình 3.14: Khả năng đối kháng nấm CĐP2 của LN4-2 sau 3 ngày ............................ 87
Hình 3.15: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LN4-2 sau 3 ngày .............................. 87
Hình 3.16: Khả năng đối kháng nấm ĐN3 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.17: Khả năng đối kháng nấm ĐN2 của LC1-1 sau 3 ngày .............................. 88
Hình 3.18: Đồ thị biểu thị Tổng khả năng kháng nấm của các chủng vi khuẩn .......... 89
Hình 3.19: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L9B-LC1-1 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................
95
Hình 3.20: Sự phát triển của nấm mốc qua các ngày của Chủng L11-LN4-2 (Từ trái
qua: Ngày 1, ngày 3, ngày 5, ngày 7, ngày 9, ngày 13) ................................................
96
Hình 3.21: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ trái
-2

-3

-4

qua: Nồng độ pha loãng 10 , 10 , 10 ) ....................................................................... 98
Hình 3.22: Kết quả tổng số vi sinh vật hiếu khí của TN2-canh trường nuôi
-2

-3

-4

cấy+Chitosan 0.4% (Từ trái qua: Nồng độ pha loãng 10 , 10 , 10 ).......................... 98
Hình 3.23: Kết quả Coliform trên môi trường VRB của TN1-canh trường nuôi cấy (Từ
-2

-3

-4

trái qua: Nồng độ pha loãng 10 , 10 , 10 ) ................................................................. 99
Hình 3.24: Kết quả thử nghiệm Coliform của TN1-Canh trường nuôi cấy (Từ trái qua:
-2

-3

-4

Nồng độ pha loãng 10 , 10 , 10 ) ............................................................................... 99
Hình 3.25: Kết quả kiểm tra sự phát triển của nấm mốc trên môi trường MRS Agar100
Hình 3.26: Thử nghiệm Catalase với NT1 (Canh trường nuôi cấy) và NT2 (Canh
trường nuôi cấy và Chitosan 0,4%)............................................................................. 101

1

1


Đồ án tốt nghiệp

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ngày xưa, con người chỉ quan tâm đến việc ăn sao cho no, mặc sao cho đủ. Thế
nhưng, ngày nay, cùng với sự phát triển của xã hội, nhu cầu của con người cũng được
nâng cao. Con người bắt đầu đặc biệt quan tâm đến sức khỏe hơn, thay vì ăn cho no thì
họ bắt đầu lựa chọn những thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, có lợi cho sức khỏe.
Vì vậy, vấn đề về vệ sinh an toàn thực phẩm là vấn đề quan trọng hàng đầu ở mỗi quốc
gia, nó liên quan đến đời sống hàng ngày cũng như sức khỏe của con người. Theo
thống kê gần đây của ngành Y tế, ngộ độc thực phẩm có nguy cơ tăng dần và ngày
càng phức tạp. Nguyên nhân chính dẫn đến ngộ độc thực phẩm phần lớn có nguồn gốc
từ các vi sinh vật hoặc nấm gây bệnh hiện diện trong thực phẩm, nước uống…
Xã hội ngày càng phát triển nên con người luôn phải chạy theo sự phát triển đó.
Cuộc sống của họ trở nên bận rộn hơn, họ bắt đầu “sống vội” hơn. Thay vì sử dụng các
thực phẩm xanh, sạch thì con người lại chọn những thực phẩm chế biến sẵn mà không
biết hầu hết chúng đều được bảo quản bằng chất hóa học. Bản thân thực phẩm cũng có
thể chứa các mầm bệnh là nguyên nhân trực tiếp gây ra các dịch bệnh hiện nay. Mặc dù
áp dụng tiến bộ kỹ thuật trong công nghệ và quy phạm vệ sinh an toàn thực phẩm
(GMP, HACCP…), nhưng nguy cơ nhiễm các vi sinh vật gây bệnh trong quá trình chế
biến thực phẩm ngày càng gia tăng (Besselink, et al., 2008). Chính vì thế, các cơ sở sản
xuất thực phẩm phải dùng đến các chất bảo quản hóa học. Mặc dù, nếu chúng được sử
dụng với liều lượng cho phép nhưng các chất phụ gia này vẫn gây ra các tác dụng
không mong muốn cho người tiêu dùng. Nhưng còn có rất nhiều trường hợp, do lợi
nhuận, các nhà sản xuất còn sử dụng các loại hóa chất bị nghiêm cấm để có thể tăng
hương vị sản phẩm hoặc kéo dài được hạn sử dụng hơn. Có thể nói: Hiện nay con
người dường như đang sống cùng hóa chất và sức khỏe con người đang đứng trước bờ

vực thẳm.

1


Trước tình trạng đó, con người luôn tìm kiếm những sản phẩm vừa đầy đủ các
chất dinh dưỡng vừa bảo vệ được sức khỏe. Từ xưa, ông bà ta đã sử dụng các phương
pháp lên men truyền thống để bảo quản thực phẩm. Các phương pháp này không
những giữ cho thực phẩm không bị hư hỏng mà còn làm tăng giá trị dinh dưỡng của
thực phẩm. Khi lên men thực phẩm là tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lactic phát
triển. Các nghiên cứu trong những thập niên gần đây cho rằng nhóm vi khuẩn sinh acid
lactic (LAB) có tiềm năng bảo quản thực phẩm nhờ khả năng sản sinh các chất kháng
vi sinh vật trong quá trình sinh trưởng và phát triển (Bernet-Camard, et al., 1997). Và
việc nghiên cứu sản xuất các chất bảo quản thực phẩm theo hướng sinh học phần lớn
đều tập trung vào các hoạt chất kháng khuẩn (Bacteriocin) cũng như kháng nấm mốc
thực phẩm của LAB trong đó những nghiên cứu kháng nấm vẫn còn mới mẻ. Vì các
LAB đặc biệt các chủng đóng vai trò lên men thực phẩm truyền thống đã được chứng
minh là an toàn.
Do ở Việt Nam có rất nhiều các thực phẩm lên men truyền thống, tuy nhiên vẫn
chưa có nhiều nghiên cứu về khả năng kháng nấm mốc của các chủng vi sinh vật trong
đó.
Hiểu được những lợi ích mà các sản phẩm lên men truyền thống mang lại và để
đảm bảo sức khỏe cho người tiêu dùng bằng cách sử dụng các lợi khuẩn từ vi khuẩn
lactic để ức chế khả năng phát triển của nấm trong các loại thực phẩm. Do đó, người
thực hiện đề tài xin trình bày đề tài về: “Phân lập vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên
men truyền thống có khả năng kháng nấm mốc sinh Aflatoxin Aspergillus spp.”
2. Tình hình nghiên cứu
2.1. Ngoài nước
Phân lập các chủng Lactobacillus fermentum từ bột ngô có khả năng phân giải
tinh bột (Agati et al.., 1998)

Phân lập và chọn lọc dòng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 21B có khả năng
kháng nấm. (Lavermicocca et al.., 2000)


Khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic (Magnusson J., 2003)
Hoạt động kháng nấm của vi khuẩn Lactobacillus paracasei (Hassan et al.., 2008)
Ngoài ra còn có nhiều công trình nghiên cứu về hoạt động kháng nấm của vi
khuẩn lactic ở nhiều nước trên thế giới.
2.2. Trong nước
Nguyễn Hoài Hương, Đoàn Kim Như (2013). Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic
từ nem chua truyền thống làm giống khởi động lên men nem chua. Tạp chí Khoa học
và công nghệ (Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam), 51: 200-204
Phân lập và khảo sát vài đặc điểm phân loại của vi khuẩn lactic, muối chua nấm
rơm (Hồng Thị Hiền, 1998)
Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học và chế phẩm
tỏi trong sản xuất thịt lên men (nem chua- xúc xích lên men) (Nguyễn Thị Lan Phương,
2012)
Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng sinh chất kháng khuẩn (Ngô
Thị Phương Dung, 2011)
Phân lập vi khuẩn Lactobacillus thuần từ tự nhiên để sản xuất măng tre lên men
chua (Nguyễn Văn Chương, 2008)
3. Mục tiêu nghiên cứu
Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ thực phẩm lên men truyền thống có khả
năng kháng nấm nhiễm thực phẩm. Mục tiêu cuối cùng là tuyển chọn được chủng vi
khuẩn lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng nấm tốt.
4. Mục đích nghiên cứu
Cung cấp chủng vi khuẩn lên men lactic có khả năng tăng sinh mạnh và kháng
nấm cao được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống cho phòng thí nghiệm bộ
môn Công nghệ sinh học, khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi trường.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu

 Phân lập vi khuẩn lactic có nguồn gốc từ thực phẩm lên men truyền thống.


 Khảo sát khả năng lên men lactic và tăng sinh khối của các chủng vi khuẩn
lactic.
 Khảo sát khả năng đối kháng nấm của các chủng vi khuẩn lactic.
 Khảo sát sơ bộ khả năng ứng dụng của vi khuẩn lactic trong bảo quản đậu
phộng.
6. Phương pháp nghiên cứu
6.1. Phương pháp luận
 Chọn nguồn phân lập đại diện cho các thực phẩm lên men truyền thống từ Việt
Nam như nem chua, cơm mẻ…
 Phân lập chủng thuần khiết, áp dụng phương pháp phân lập và định danh sơ bộ
với vi khuẩn lên men lactic.
 Khảo sát khả năng lên men lactic qua theo dõi sinh khối và acid tổng tạo thành.
 Khảo sát khả năng kháng nấm in vitro của các chủng phân lập áp dụng phương
pháp đặt thạch khuếch tán – Agar Plug Diffusion Method (Mounyr Balouiri,
2011)
 Khảo sát khả năng kháng nấm in vivo qua thí nghiệm bảo quản đậu phộng.
6.2. Phương pháp xử lý số liệu
 Sử dụng phần mềm excel để vẽ đồ thị
 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lý số liệu
7. Kết quả đạt được của đề tài
 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn lactic có khả năng tăng sinh khối và có
hoạt tính kháng nấm tốt từ các chủng vi khuẩn lactic phân lập được từ 2 nguồn
thực
phẩm lên men truyền thống là cơm mẻ và nem chua.
 Đánh giá tỉ lệ ức chế của nấm trong thực phẩm của canh trường vi
khuẩn lactic.

 Đánh giá sơ bộ khả năng kháng nấm của vi khuẩn lactic khi ứng dụng trên đậu
phộng.
8. Kết cấu đồ án
Mở đầu
Chương 1: Tổng quan tài liệu – nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – nội dung chương đề cập đến
các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
Chương 3: Kết quả và biện luận – nội dung chương đưa ra những kết quả mà đề
tài thực hiện được và đưa ra những biện luận cho kết quả thu được.
Kết luận và kiến nghị – nội dung chương tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cải thiện thêm trong đề tài.


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về nấm
1.1.1. Giới thiệu chung
Giới nấm (tên khoa học: Fungi) bao gồm những sinh vật nhân chuẩn tự dưỡng có
thành tế bào bằng chitin. Phần lớn nấm phát triển dưới dạng các dạng sợi đa bào được
gọi là sợi nấm (hyphae) tạo nên hệ sợi (mycelium). Nấm thường sinh sản qua bào tử
hoặc qua hình thức sinh sản tự dưỡng. Quá trình sinh sản có thể là vô tính hay hữu tính.
Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm lớn (nấm quả
thể). Phần lớn các nấm thường không quan sát được bằng mắt thường. Đa phần chúng
sống trong đất, chất mùn, xác sinh vật chết, cộng sinh hoặc kí sinh trên cơ thể động vật,
thực vật và nấm khác. Vi nấm đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân
hủy các chất hữu cơ và không thể thiếu được trong chu trình chuyển hóa và trao đổi vật
chất.
1.1.2. Độc tố nấm
Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa đạng, có khối

lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối
với động vật có vú, cá, gia cầm và con người.
Hiện nay có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ
có khoảng 20 loài độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến
an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium,
Alternaría và Claviceps, chúng bao gồm:


Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, G1, G2, M1, M2),
ochratoxin A, stermatocystin, acid cyclopianxoic.

 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và
axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon.




Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2
toxin. - Các độc tố của Alternaria: Acid tenuazoic, alternarion, methyl
ether alternarion.



Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà

Các độc tố gây độc chủ yếu và nguy hại là Aflatoxin. Chúng là độc tố vi nấm do
nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh, thường gây ô nhiễm trên một số
hạt (như lạc). Phản ứng gây độc của chúng chủ yếu là trong gan. Nếu mức độ ô nhiễm
thấp sẽ tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật và về dài
lâu sẽ gây ung thư.

Ngoài Aflatoxin, một số độc tố vi nấm thường gặp là ochratoxin Penicillium và
Aspergillus tiết ra. Độc tố zearalemon và tricothecenes chủ yếu do nấm Fusarium tiết,
độc tố patulin lại do nấm Penicillium và Fumonisin tiết.
1.1.3. Tác hại của nấm
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho người và động vật
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hoặc tiếp xúc với nấm.
Có khoảng 70 loài nấm sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là
nấm mốc trong nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi như các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium, Fusarium...,
chỉ có vài loài là nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula,có một số loài là nấm lớn
như Agaricus, Coprinus, Fomes, Ganoderma...Bào tử nấm có thể gây ra những chứng
như hen suyễn, viêm mũi dị ứng, các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá
mẫn. Ngộ độc do ăn phải nấm độc, có thể từ rối loạn tiêu hoá, ảo giác, hoặc trầm trọng
có thể tử vong.
 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp.
Những loài có thể gây bệnh cho người thuộc các chi như Aspergillus, Candida,
Cryptococcus, Histoplasma và Pneumocystis. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở
người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,… cho đến những bệnh


nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm Cryptococcus) hay viêm
phổi do nấm Pneumocystis carinii.
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật
Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho ngành nông
nghiệp và lâm nghiệp.Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe oryzae)gây bệnh cho
lúa.Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi Fusarium, Ustilago, Alternaría và
Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm
giảm năng suất hoặc chất lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây độc trong thực phẩm
Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (fungal flora) có 3 chủng giống nấm

mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus, Fusarium và
Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm. Một trong những nguyên nhân
được nhắc đến là do con người đã ăn thực phẩm có nấm mốc chứa aflatoxin, một độc
tố vi nấm đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Vậy aflatoxin
là gì?
Aflatoxin là một mycotoxin được tiết ra từ nấm Aspergillus và A.parasiyicus. Các
chủng nấm này phát triển mạnh ở các loại thực phẩm nông sản, thức ăn gia súc, gia
cầm như ngô, lạc, đậu… trong các điều kiện thuận lợi nóng và ẩm, nhất là điều kiện
thời tiết ở Việt Nam. Tác hại của độc tố vi nấm này đối với động vật đã được biết đến
từ lâu và đã được chứng minh có thể gây ung thư gan trên thực nghiệm. Người có thể
bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc bị ô nhiễm hoặc ăn thịt các động vật
được nuôi bằng ngũ cốc ô nhiễm aflatoxin. Các trường hợp bị ngộ độc do chất độc tự
nhiên có trong thực phẩm thường xảy ra trong tình trạng cấp tính rất nặng, tỷ lệ tử vong
khá cao hoặc nếu bị nhiễm lâu dài có thể ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe con người.
Trên thực tế nếu bị nhiễm độc tố aflatoxin của vi nấm có trong thực phẩm có thể
gây nên bệnh ung thư gan, giảm năng suất sinh sữa và trứng ở các động vật nuôi như


bò, cừu, gia cầm... Loại độc tố này khá bền vững ở nhiệt độ cao, đun nóng thường
không phá hủy được chúng.
Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính với các biểu hiện chính là suy chức năng gan
cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư
gan ở người cũng còn rất nhiều tranh cãi. Tuy nhiên ở một số nghiên cứu, các nhà khoa
học đã tìm thấy có sự gắn kết của aflatoxin B1 với DNA của tế bào gan cũng như có sự
đột biến gen mà đặc biệt là gene p53 – một gene kiểm soát sự chết tế bào, ở những
bệnh nhân mắc ung thư gan.
Có 4 tác động chính gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây đột
biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan, rối loạn chức năng hoạt
động của thận và có thể gây tử vong đối với trường hợp nặng. Ngoài ra, các độc tố vi
nấm còn tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê liệt động vật và ở nồng độ

cao có thể gây tổn thương não và chết. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã
xác định có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép DNA và gây hậu quả là
đột biến hoặc quái thai.
1.2. Tổng quan về vi khuẩn lactic
1.2.1. Giới thiệu vi khuẩn lactic
1.2.1.1. Giới thiệu chung
Từ lâu vi khuẩn lactic đã được con người ứng dụng rộng rãi để chế biến các loại
thức ăn chua (sữa chua, muối dưa, muối cà,...), ủ chua thức ăn cho gia súc hoặc để sản
xuất acid lactic và các loại muối của acid lactic. Từ năm 1780, lần đầu tiên nhà hóa học
người Thụy Điển Scheele đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1875,
L.Pasteur đã chứng minh được rằng việc làm sữa chua là kết quả hoạt động của một
nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. 21 năm sau đó (1878), Lister đã phân
lập được vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic (ngày nay gọi là Streptococcus
lactic) và đến năm 1881 ngành công nghiệp lên men nhờ vi khuẩn lactic đã được hình
thành.


Vi khuẩn lactic có vai trò quan trọng trong công nghiệp sữa, muối chua rau quả,
làm yaourt,... cũng như trong nông nghiệp và dược phẩm. Và một đặc tính quan trọng
khác của vi khuẩn lactic là chúng có khả năng tạo ra bacteriocin (chất kháng khuẩn)
như lactacin, brevicin, lacticin, helveticin, sakacin, plantacin,... có tác dụng ức chế một
số vi sinh vật gây bệnh, ngăn chặn sự phát triển của các nguồn bệnh trong thực phẩm
(Batt, 1999; Dubernet et al., 2002).
Vi khuẩn lên men lactic gọi là vi khuẩn lactic, chúng được Pasteur tìm ra từ sữa
bị chua và hiện nay chúng được công nhận là an toàn sinh học (generally recognized as
safe - GRAS), được sử dụng thường xuyên trong thực phẩm và có đóng góp trong hệ vi
sinh vật có ích của con người.
1.2.1.2. Khái niệm
Vi khuẩn lactic là một nhóm các vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, có khả
năng lên men đường để tạo acid lactic, có một sự thống nhất về hình thái, đặc điểm

sinh lí, sinh hóa và sự trao đổi chất. Nhóm vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ
Lactobacteriaccae và được xếp vào năm giống: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus và Leuconostoc, Aerococcus. Nhóm vi khuẩn này có rất nhiều hình dạng
khác nhau, chẳng hạn như chúng là trực khuẩn ngắn hay que (rod) dài ở dạng đơn, đôi
hoặc xếp thành chuỗi và cầu khuẩn (cocci) không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng
thường được tìm thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic được tạo ra
như là sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men
carbohydrate. Vì vậy LAB được dùng trong thực phẩm lên men, acid hóa ức chế sự
tăng trưởng của tác nhân gây hư hỏng. Một số chủng LAB có thể sinh bacteriocins ức
chế sinh vật gây bệnh (Klaenhammer, 1987). Hơn nữa, acid lactic và các sản phẩm trao
đổi chất khác góp phần vào tăng giá trị cảm quan và cấu trúc của thực phẩm.
Khuẩn lạc của vi khẩn lactic tròn nhỏ, trong bóng; có màu môi trường, màu trắng
đục hoặc màu vàng kem ; hoặc khuẩn lạc có kính thước to hơn tròn lồi trắng đục. Đặc
biệt khuẩn lạc tỏa ra mùi chua của acid.


Theo bảng phân loại được sửa đổi hiện nay, vi khuẩn lactic gồm khoảng 20 giống
thuộc họ Lactobacillaceae, chúng thường có dạng hình cầu (hoặc ovan) và hình que,
trong đó các giống chủ yếu nhất là: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus,
Tetragenococcus, Vagococcus và Weisslella. Trong khóa phân loại của Bergey 1957,
giống Bifidobacterum cũng được xếp vào nhóm vi khuẩn lactic, trong đó chúng được
xem như là Lb.bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung
của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae - một
nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men khác với vi khuẩn lactic. Việc
phân loại vi khuẩn lactic vào các chi khác nhau phần lớn là dựa trên hình thái sinh học,
chế độ và con đường lên men khác nhau, tăng trưởng ở nhiệt độ khác nhau, qui trình
sản xuất acid lactic, khả năng phát triển ở nồng độ muối cao, và chịu được acid hoặc
kiềm. Phân loại theo con đường hóa học như thành phần acid béo và các thành phần
của thành tế bào, ngoài ra phương pháp sinh học di truyền hiện đại cũng được sử dụng
trong phân loại.

Hình 1.1: Cây phát sinh loài của vi khuẩn lactic. (Owen R. Fennema et al. 2004)

Trong đó: - Khoảng cách tiến hóa gần bằng nhau.
- Trong đó nhóm được đống khung là nhóm vi khuẩn được xem là an
toàn với con người.
1.2.1.3. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, catatalase âm
tính và là vi khuẩn kỵ khí chịu oxy (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu bằng
con đường lên men và không hô hấp do không có cytochromes, chỉ trừ giống
Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc. Vi khuẩn lactic có thể lên men các loại đường
monosaccharide và disaccharide nhưng không phải tất cả các vi khuẩn lactic đều lên
men được bất kỳ loại disaccharide nào, một số không lên men được saccharose, một số


không sử dụng được lactose, các vi khuẩn lactic không lên men được tinh bột (trừ
chủng Lactobacillus delbruceckii) và các polysaccaride khác.
Theo khóa phân loại của Bergey 1986 giới thiệu về các giống của vi khuẩn lactic,
thì có 5 giống phù hợp với mô tả chung về vi khuẩn lactic: Streptococcus, Pediococcus,
Lactobacillus, Leuconostoc, Aerococcus. Trước đây giống Bifidobacterium cũng được
xếp vào nhóm vi khuẩn lactic trong khóa phân loại của Bergey 1957, trong đó chúng
được xem là Lb. bifidum mặc dù Bifidobacterium không phù hợp với các mô tả chung
của vi khuẩn lactic mà chúng liên quan nhiều hơn đến nhóm Actinomycetaceae một
nhóm vi khuẩn gram dương và có con đường lên men đường khác với vi khuẩn lactic.
Trong 5 giống thuộc vi khuẩn lactic thì có 4 giống được mô tả và nghiên cứu
nhiều nhất đó là: Streptococcus, Pediococcus, Lactobacillus, Leuconostoc. Đây là
những trực khuẩn hoặc cầu khuẩn không sinh bào tử. Tất cả vi khuẩn lactic đều không
chuyển động, gram dương, hô hấp yếm khí tùy nghi.
Đường kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0.5 – 1.5μm. Các tế bào hình cầu

xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thước tế bào trực khuẩn
lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẻ hoặc kết thành chuỗi.
Vi khuẩn lactic có hoạt tính protease phân hủy protein thành peptide, acid amin,
hoạt tính này ở các loài khác nhau thì khác nhau, thường ở trực khuẩn là cao hơn.
Chúng chịu được trạng thái khô hạn, bền vững với CO2 và etylic, nhiều loài vẫn sống
được trong môi trường 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl,
có thể sống trong môi trường từ 7 – 10% NaCl.
Các loài vi khuẩn lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành acid lactic trong
môi trường, và sức chịu acid (hay độ bền acid) cũng rất khác nhau. Đa số các trực
khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid lactic cao hơn (khoảng 2 – 3%) liên cầu khuẩn
(khoảng 1%). Các trực khuẩn này có thể phát triển ở pH 3.8 – 4 (cầu khuẩn không thể
phát triển được ở môi trường này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH
5.5 – 6.