Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ, ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh dùng xử lý chất thải chăn nuôi

ư

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI
KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ, ỨNG DỤNG SẢN
XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG XỬ LÝ CHẤT
THẢI CHĂN NUÔI

Ngành:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : TS. PHẠM HUỲNH NINH
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1151110352

:

LÊ ANH THY
Lớp: 11DSH04

TP. Hồ Chí Minh, năm 2015


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Tôi tên: Lê Anh Thy
Sinh ngày 16 tháng 09 năm 1993
Sinh viên lớp: 11DSH04 - Công Nghệ Sinh Học - Trường ĐH Kỹ Công Nghệ TP
Hồ Chí Minh.
Tôi xin cam đoan: Đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ, ỨNG DỤNG SẢN XUẤT CHẾ
PHẨM VI SINH XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI” do Tiến sĩ Phạm Huỳnh
Ninh hướng dẫn là đề tài của riêng tôi. Các số liệu, kết quả trong luận văn tốt
nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình luận văn
nào trước đây. Những thông tin tham khảo trong khóa luận đều được trích dẫn cụ
thể nguồn sử dụng.
Tất cả những nội dung trong đồ án đúng như nội dung đề tài và yêu cầu của
giáo viên hướng dẫn. Nếu có sai sót tôi xin chịu trách nhiệm trước hội đồng.
Người viết ký tên

Lê Anh Thy.


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cám ơn chân thành và sự tri ân sâu sắc đối với các Thầy, Cô
của trường Đại học Công Nghệ Thành Phố Hồ Chí Minh, đặc biệt là Thầy, Cô khoa
Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường đã tạo điều kiện thuận lợi cho em
có cơ hội làm đồ án tốt nghiệp.
Để hoàn thành bài báo cáo tốt nghiệp này trong thời gian qua, ở Phân viện,
nơi tôi có điều kiện được tiếp xúc với thực tế, trao dồi kinh nghiệm sống, kinh
nghiệm làm việc cho bản thân, tất cả những điều ấy đều nhờ sự hướng dẫn tận tình

cùng với sự quan tâm chỉ bảo giúp đỡ nhiệt tình của Ban lãnh đạo, các cô chú, anh
chị tại ở Phòng thí nghiệm và phân tích chăn nuôi, Phân viện chăn nuôi Nam Bộ. Ở
trường tôi đã nhận được sự giúp đỡ dìu dắt của quý Thầy Cô Bộ môn. Thầy Cô đã
mang đến cho tôi hành trang để bước vào cuộc sống.
Qua đây, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành, cùng lòng biết ơn sâu sắc đến
TS. Phạm Huỳnh Ninh- Phó Bộ môn dinh dưỡng thức ăn chăn nuôi và chị Lê
Hoàng Bảo Vi, người trực tiếp hướng dẫn tôi hoàn thành bài báo cáo này.
Kính mong nhận được ý kiến đóng góp của quý Thầy Cô.
Chân thành cảm ơn.


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................... iv
DANH MỤC BẢNG .................................................................................................. vi
GIỚI

THIỆU

........................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...........................................................................3
1.1.

Chu trình nitơ ..................................................................................................3

1.2.

Quá trình nitrate hóa .......................................................................................7

1.3.

Vi khuẩn Nitrosomonas ................................................................................10

1.3.1.

Lịch sử phát hiện....................................................................................10

1.3.2.

Phân loại.................................................................................................10

1.3.3.

Đặc điểm hình thái .................................................................................11

1.3.4.

Cấu trúc tế bào .......................................................................................12

1.4.

Vi khuẩn Nitrobacter....................................................................................12

1.4.1.

Phân loại.................................................................................................12

1.4.2.

Đặc điểm hình thái .................................................................................12

1.5.

Ứng dụng của vi khuẩn nitrate hóa ..............................................................13

1.5.1.

Trong thủy sản .......................................................................................13

1.5.2.

Trong chăn nuôi .....................................................................................14

CHƯƠNG

2.VẬT
.................................17

LIỆU

THÍ

NGHIỆM

VÀ

PHƯƠNG

PHÁP

2.1.

Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm ................................................17

2.2.

Nguồn vi sinh vật ..........................................................................................17

2.3.

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................17
i


Đồ2.4.
án tốtVật
nghiệp
liệu thí nghiệm .......................................................................................17

i


Đồ án tốt nghiệp

2.4.1.

Đối tượng thí nghiệm.............................................................................17

2.4.2.

Trang thiết bị thí nghệm ........................................................................17

2.4.3.

Hóa chất và môi trường thí nghiệm.......................................................18

2.5.

Phương pháp .................................................................................................21

2.5.1.

Cách lấy mẫu..........................................................................................21

2.5.2.

Phương pháp phân lập ...........................................................................22

2.5.3.

Phương pháp định danh .........................................................................22

2.5.4.

Phương pháp đo độ đục (OD)................................................................23

2.5.5.

Phương pháp xác định hàm lượng nitrite (phương pháp Griess llosvay

hay Diazonium) [3]..............................................................................................24
2.5.6.

Phương pháp xác định hàm lượng nitrate (phương pháp

Salycilate)[3]........... ............................................................................................26
2.5.7.

Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc trên môi

trường đặc ............................................................................................................28
2.5.8.

Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi

khuẩn chuyển hóa nitơ.........................................................................................29
2.5.9.

Lên men sản xuất chế phẩm vi sinh dùng xử lý chất thải chăn nuôi ở

quy mô phòng thí nghiệm....................................................................................31
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................32
3.1.

Kết quả lấy mẫu ............................................................................................32

3.2.

Kết quả phân lập, định danh .........................................................................32

3.2.1.

Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas ...........................................................32

3.2.2.

Phân lập vi khuẩn Nitrobacter...............................................................33

3.2.3.

Định danh ...............................................................................................35

ii


Đồ án tốt nghiệp

3.3.

Kết quả định lượng nitrite, nitrate ................................................................38

3.3.1.

Hàm lượng NO2– sinh ra của các chủng vi khuẩn Nitrosomonas .........38

3.3.2.

Hàm lượng NO3– sinh ra của các chủng vi khuẩn Nitrobacter.............40

3.4.

Kết quả khảo sát các đặc tính .......................................................................41

3.4.1.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH......................................................41

3.4.2.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ....................................44

3.4.3.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ..............................................47

3.4.4.

Kết quả khảo sát động học của quá trình lên men.................................49

3.2.4.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cơ chất.................................51

3.5.

Kết quả quá trình lên men sản xuất chế phẩm vi sinh dùng xử lý chất thải

chăn nuôi ở quy mô phòng thí nghiệm ...................................................................54

CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................56
4.1.

Kết luận .........................................................................................................56

4.2.

Đề nghị..........................................................................................................56

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................57
PHỤ LỤC............ ................................................................................................................1

3


Đồ án tốt nghiệp

DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1. Vi khuẩn Nitrosomonas europea khi quan sát dưới kính hiển vi quan
học (a) và (b) kính hiển vi điện tử..........................................................11
Hình 1. 2. Vi khẩn Nitrosomonas............................................................................11
Hình 1. 3. Tế bào vi khuẩn Nitrobacter winogradski quan sát dưới kính hiển vi
quang học (a) và (b) kính hiển vi điện tử
...............................................13
Hình 2.1.

Nơi lấy mẫu ............................................................................................21

Hình 3.1.

Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Nitrosomonas phân lập từ
nước thải chuồng heo nái (nuôi con)(a-chủng S14), nước thải từ
chuồng gà giống (b-chủng S18), từ phân gà giống (gà mái đẻ) (c-chủng
S16) và từ chế phẩm Balasa No1 (d-chủng Sba). .................................33

Hình 3.2.

Hình ảnh khuẩn lạc của chủng vi khuẩn Nitrobacter phân lập từ nước
thải heo con sau cai sữa (a-chủng B8) và từ bùn đất ở đường ống từ
chuồng heo thịt (b-chủng B15), nước ở đường ống từ các chuồng thải
ra (c-chủng B6) và từ nước thải chuồng heo sinh sản (d-chủng B10). .34

Hình 3.3.

Kết quả kiểm tra sinh hóa khả năng khử amonium của vi khuẩn nitrite
hóa...........................................................................................................35

Hình 3.4.
Hình 3.5.

Tế bào Nitrosomonas sau khi nhuộm Gram (vật kính 100X) ...............36
Kết quả kiểm tra sinh hóa khả năng khử NO2– thành NO3 – của vi khuẩn
nitrate hóa. ..............................................................................................37

Hình 3.6.

Tế bào Nitrobacter sau khi nhuộm Gram (vật kính 100X) ..................38

Hình 3.7.

Biểu đồ cột thể hiện hàm lượng NO2– (mg/l) sinh ra của các chủng vi
khuẩn Nitrosomonas...............................................................................39

Hình 3.8.

Biểu đồ cột thể hiện hàm lượng NO3– (mg/l) sinh ra của các chủng vi
khuẩn Nitrobacter. ..................................................................................40

4


Hình 3.9.

Biểu đồ cột kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrosomonas
S18.. ........................................................................................................42

Hình 3.10. Biểu đồ cột kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrobacter B6.43
Hình 3.11. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng
Nitrosomonas S18 ..................................................................................44
Hình 3.12. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng
Nitrobacter B6 ........................................................................................46
Hình 3.13. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng
Nitrosomonas S18. .................................................................................47
Hình 3.14. Biểu đồ cột kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng Nitrobacter
B6. ...........................................................................................................48
Hình 3.15. Biểu đổ khảo sát động học quá trình lên men của chủng Nitrosomonas
S18. .........................................................................................................49
Hình 3.16. Biểu đổ khảo sát động học quá trình lên men của chủng Nitrobacter
B6.. ..........................................................................................................50
Hình 3.17. Biểu đồ khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho chủng Nitrosomonas

S18. .........................................................................................................51
Hình 3.18. Biểu đồ khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho chủng Nitrobacter
B6.... ........................................................................................................53
Hình 3.19. Chế phẩm sau khi sấy khô của chủng Nitrosomonas S18. ....................54
Hình 3.20. Chế phẩm sau khi sấy khô của chủng Nitrobacter B6. .........................55


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.

Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm nitrite hóa ...........8

Bảng 1.2.

Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm vi khuẩn nitrate
hóa (Bergey, 1994) ...................................................................................9

Bảng 2.1.

Các bước thiết lập mẫu chuẩn để phân tích nitrite bằng phương pháp
Griess llovay, Diazonium .......................................................................25

Bảng 2.2.

Các bước thiết lập mẫu chuẩn để phân tích nitrate bằng phương pháp
Salycilate............... .................................................................................27

Bảng 3.1.

Các mẫu được lấy tại Phân viện Chăn nuôi Nam Bộ ............................32

Bảng 3.2.

Kết quả hàm lượng NO2– của các chủng vi khuẩn Nitrosomonas .........38

Bảng 3.3.

Kết quả hàm lượng NO3– (mg/l) của các chủng vi khuẩn Nitrobacter .40

Bảng 3.4.

Kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrosomonas S18 ..............41

Bảng 3.5.

Kết quả khảo sát pH thích hợp cho chủng Nitrobacter B6 ...................42

Bảng 3.6.

Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng Nitrosomonas
S18....................... ...................................................................................44

Bảng 3.7.

Kết quả khảo sát nồng độ muối thích hợp cho chủng Nitrobacter B6 ..45

Bảng 3.8.

Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng Nitrosomonas S18 ......47

Bảng 3.9.

Kết quả khảo sát nhiệt độ thích hợp cho chủng Nitrobacter B6 ...........48

Bảng 3.10. Kết quả khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho chủng Nitrosomonas
S18......................... .................................................................................51
Bảng 3.11. Kết quả khảo sát nồng độ cơ chất thích hợp cho chủng Nitrobacter
B6........................... ................................................................................52
Bảng 3.12. Các yếu tố tối ưu cho chủng vi khuẩn nitrate hóa .................................54
Bảng 3.13. Kết quả kiểm tra mật độ tế bào trước và sau khi cấy.............................55


GIỚI THIỆU
❖ Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi phát triển thì việc phòng chống ô nhiễm môi trường càng
trở nên cần thiết. Không chỉ có nguồn nước bị ô nhiễm mà môi trường không khí
cũng bị ô nhiễm do các loại khí như CO2, H2S, NH3,... trong đó khí NH3 là một
trong những khí chủ yếu gây khó chịu, có mùi khai. Nếu tiếp xúc với nồng độ
amoniac 134-140 ppm trong 2 giờ trong không khí sẽ gây kích ứng nặng ở mũi,
ngứa họng, rát ngực, cần phải rời khỏi khu vực tiếp xúc; nếu nồng độ amoniac trên
10.000 ppm sẽ có triệu chứng bồn chồn, tím tái, khó thở và dẫn đến tử vong[21].
NH3 rất có hại cho sức khỏe của vật nuôi và con người. Một trong những phương
pháp kiểm soát ô nhiễm khí trong chăn nuôi là dùng đệm lót sinh học. Đệm lót sinh
học trong chăn nuôi giúp nông dân bảo vệ tốt môi trường, chăn nuôi không có mùi
hôi thối, rút ngắn thời gian, hạn chế bệnh tật và năng suất cao.
Hiện nay các chế phẩm vi sinh dùng trong đệm lót thường nhằm mục đích
chính là loại bỏ, phân hủy nhanh các hợp chất hữu cơ chứa carbon, nitơ, và lưu
huỳnh. Các vi khuẩn như Bacillus, Lactobacillus, Nitrosomonas, Nitrobacter,
Thiobacillus thường được sử dụng để thúc đẩy quá trình nitrate hóa, phân giải tinh
bột, xellulose và sulfur. Các vi khuẩn thực hiện quá trình oxy hóa các thành phần

này thành sản phẩm cuối cùng là nước và CO2, chuyển hóa nitơ dạng hữu cơ và vô
cơ thành dạng khí. Quá trình loại bỏ nitơ trong chất thải diễn ra chủ yếu bởi các quá
trình như ammonia hóa, nitrate hóa và phản nitrate hóa. Quá trình khoáng hóa nitơ
trong chất hữu cơ dẫn đến tích lũy NH4+, hình thành khí độc nếu không có quá trình
nitrate hóa tiếp theo bởi Nitrosomonas, để chuyển hóa NH4+ thành NO2–. Tiếp đó,
NO2– được chuyển hóa thành NO3 – nhờ Nitrobacter. Nitrate (NO3–) có thể được các
vi sinh vật khác (nấm men, Lactobacillus) sử dụng như nguồn dinh dưỡng hay được
chuyển thành nitơ phân tử phát tán vào trong không khí nhờ tác dụng của các vi
khuẩn phản nitrate hóa, yếm khí như Pseudomonas. Hiện tại các sản phẩm vi sinh

Trang 1


dùng trong đệm lót sinh học chủ yếu được nhập khẩu, chỉ duy nhất một sản phẩm
được sản xuất trong nước là chế phẩm Balasa No1. Nhằm đa dạng hóa sản phẩm
dùng trong đệm lót vi sinh, góp phần hạn chế phụ thuộc vào sản phẩm nhập ngoại,
cần thiết phải tiến hành phân lập, khảo sát, tìm ra các chủng vi sinh có hoạt lực cao
trong phân giải, chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, đặc biệt là vi khuẩn chuyển hóa
nitơ.
Từ những nhận định trên, tôi thực hiện đề tài “PHÂN LẬP VÀ TUYỂN
CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CHUYỂN HÓA NITƠ, ỨNG DỤNG SẢN
XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH DÙNG XỬ LÝ CHẤT THẢI CHĂN NUÔI”.
Đề tài luận văn này là 1 phần trong đề tài nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi
sinh dùng trong đệm lót sinh học cho chăn nuôi của TS. Phạm Huỳnh Ninh, Phân
viện chăn nuôi Nam Bộ.
❖ Mục tiêu và phạm vi của đề tài
Phân lập, định danh các chủng vi khuẩn chuyển hóa nitơ (tập trung vào nhóm
vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter) từ phân, bùn đất, nước thải chăn nuôi heo,
chế phẩm Balasa No1.
Khảo sát các điều kiện sinh trưởng của các chủng vi khuẩn vừa phân lập

(môi trường, nhiệt độ, pH, thời gian nuôi cấy).
Lên men, sản xuất chế phẩm vi sinh dùng xử lý chất thải chăn nuôi ở quy mô
phòng thí nghiệm.
❖ Mục đích và ý nghĩa
Phân lập và định danh được các chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ
cao, ứng dụng sản xuất chế phẩm vi sinh dùng trong đệm lót sinh học cho chăn
nuôi, giúp giảm thiểu ô nhiễm môi trường, giảm công lao động, tiết kiệm thời gian
và nước rửa chuồng và góp phần nâng cao năng suất vật nuôi.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

Chu trình nitơ
Cơ bản của vòng tuần hoàn nitơ là quá trình nitrate hóa (nitrification), phản

nitrate hóa (denitrification) và cố định nitơ (nitrogen fixation).
Nitơ chủ yếu tồn tại ở khí quyển, chiếm tới 78% trong khí quyển, trong sinh
quyển chỉ chiếm 0,3% tổng khối lượng sinh vật. Muối vô cơ của nitơ (muối ammon,
nitrate, nitrite) có độ hòa tan trong nước cao, dễ tham gia vào vòng tuần hoàn. Chất
mùn (humus) trong đất ôn đới thông qua việc khoáng hóa từ từ mà chuyển biến
thành N vô cơ. Vùng nhiệt đới do nóng và ẩm, tốc độ khoáng hóa nhanh, ít tích lũy
chất mùn. Khí nitrogen là khí trơ, muốn mở nối N≡N cần dùng nhiều năng lượng,
chỉ có một số ít sinh vật cố định được Nitơ. Thông qua tia chớp phóng điện, phun
trào của núi lửa, cũng có thể cố định được một lượng ít nitơ. Ngoài ra, cố định nitơ
tại các nhà máy phân đạm hóa học (tốn rất nhiều năng lượng) cũng có thể biến
N2 thành muối ammon hoặc nitrate cung cấp cho cây trồng. Khoảng 85% tác dụng
cố định nitơ trên trái đất là do vi sinh vật cố định nitơ thực hiện, trong đó 60% xảy
ra trên đất liền và 40% xảy ra ở đại dương. Thực vật hấp thụ nitơ vô cơ trong đất,
chủ yếu là nitrate để tổng hợp ra protein thực vật. Động vật hấp thu protein thực vật

để tổng hợp thành protein động vật. Xác động thực vật và chất bài tiết chứa nitơ
được vi sinh vật phân hủy trở lại thành nitơ vô cơ, một phần được thực vật hấp thu,
phần còn lại qua tác dụng của vi khuẩn phản nitrate hóa biến thành khí nitơ trở về
khí quyển.
Vi sinh vật dị dưỡng (heterotrophs) cũng có thể tiến hành nitrate hóa, một số
vi sinh vật dị dưỡng còn có thể kết hợp quá trình nitrate hóa với quá trình phản
nitrate hóa kỵ khí, đó là quá trình oxy hóa NH4+ trong điều kiện mức oxy thấp và
tạo ra N2O và N2. Trong điều kiện thiếu oxy việc tồn tại quá trình oxy hóa ion
ammon cho thấy quá trình nitrate hóa không chỉ là quá trình hiếu khí.
Nitrate hóa là một quá trình hiếu khí, oxy hóa ion ammon (NH4+) thành
nitrite (NO2–), rồi sau đó oxy hóa thành nitrate (NO3–). Chẳng hạn, vi khuẩn thuộc


các chi Nitrosomonas và Nitrosococcus đóng vai trò quan trong trong giai đoạn
trước, còn vi khuẩn thuộc chi Nitrobacter và các vi khuẩn dị dưỡng hóa năng tương
ứng sẽ thực hiện giai đoạn sau. Gần đây người ta phát hiện thấy vi khuẩn
Nitrosomonas eutropha trong phản ứng phản nitrate hóa tương quan, sẽ dùng
NO2 làm chất oxy hóa, trong điều kiện kỵ khí oxy hóa ion ammon thành nitrite và
NO. Ngoài ra, quá trình nitrate hóa dị dưỡng (heterotrophic nitrification) thực hiện
bởi vi khuẩn và nấm đóng vai trò quan trọng trong những môi trường acid.
Quá trình phản nitrate hóa (denitrification) đòi hỏi một loạt các điều kiện môi
trường khác nhau. Đó là một quá trình dị hóa, thông thường do các vi khuẩn dị
dưỡng như Pseudomonas denitrificans thực hiện. Trong quá trình này nitrate sẽ là
chất oxy hóa trong điều kiện hô hấp kỵ khí, tuy vẫn có thể tích lũy nitrite, nhưng
sản phẩm chủ yếu của quá trình phản nitrate hóa là N2 và N2O. Nitrite rất hệ trọng
đối với môi trường vì chúng có thể tạo ra các nhân tố gây ung thư (carcinogenic)
thuộc loại nitrosamin. Sau nữa là nitrite có thể bị chuyển hóa thành ammon do tác
dụng khử dị hóa của nhiều loài vi khuẩn khác nhau, bao gồm các vi khuẩn
Geobacter metallireducens, Desulfovibrio spp., và Clostridium.
Quá trình đồng hóa nitơ là việc sử dụng nitơ vô cơ làm chất dinh dưỡng và

dùng chúng để tạo ra sinh khối mới của vi sinh vật. Vì ion ammon đã bị khử cho
nên chúng trực tiếp thâm nhập mà không cần tiêu hao nhiều năng lượng. Tuy nhiên
lúc đồng hóa nitrate lại cần dùng nhiều năng lượng để khử. Trong quá trình này
nitrite có thể được tích lũy như một loại sản phẩm trung gian.
Sinh vật nhân nguyên thủy hiếu khí hay kỵ khí đều có một số loài có khả
năng cố định nitơ, nhưng khả năng này không có ở các sinh vật nhân thực
(eucaryotes). Trong điều kiện hiếu khí có khá nhiều loài vi sinh vật sống tự do tham
gia vào quá trình này (Azitobacter, Azospirillum). Trong điều kiện kỵ khí vi khuẩn
cố định nitơ quan trọng nhất là thuộc chi Clostridium. Vi khuẩn lam, chẳng hạn
như Anabaena, Oscillatoria, do cố định nitơ đã làm tăng nguyên tố nitơ trong môi
trường nước. Ngoài ra còn có quá trình cố định nitơ do quan hệ cộng sinh giữa thực


vật và vi sinh vật. Ví dụ sự cộng sinh của vi khuẩn nốt sần (Rhizobium,
Bradyrhizobium) với cây bộ Đậu, của xạ khuẩn Frankia với nhiều cây thân gỗ, của
vi khuẩn lam Anabaena azollae với bèo hoa dâu (Azolla).
Quá trình cố định nitơ đòi hỏi phải có một chuỗi nối tiếp các bước khử.
Ammon – sản phẩm của quá trình nitơ - gia nhập ngay vào chất hữu cơ dưới dạng
một amin. Các quá trình khử là rất mẫn cảm với O 2 và phải phát sinh trong điều
kiện kỵ khí, ngay cả với các vi sinh vật hiếu khí. Sự bảo vệ các enzyme cố định nitơ
được thực hiện bởi nhiều cơ chế khác nhau, bao gồm cả các rào cản vật lý, chẳng
hạn như các dị bào tử (heterocysts) ở vi khuẩn lam. Vi sinh vật có thể oxy hóa
NH4+ kỵ khí cùng với việc khử NO2– để làm sản sinh ra N2, đó là quá trình oxy hóa
ammon thiếu oxy (anamox process). Quá trình này có thể giúp loại bỏ nitơ trong
nước thải ở các phân xưởng xử lý nước thải, làm giảm sự mẫn cảm với nitơ ở các hệ
sinh thái nước ngọt và nước biển. Tập đoàn vi sinh vật phù du (planctomycetes)
đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
Lượng nitơ trong quá trình tuần hoàn tính theo tỷ tấn (10 15g) được thống kê
như sau:
Trong khí quyển - 3 800 000;

Trên lục địa: phản nitrate hóa - 0,12/năm; xác hữu cơ - 300; ammon do phân
giải chất hữu cơ chuyển vào khí quyển - 0,075/năm; cố định sinh học - 0,14/năm;
cố định công nghiệp - 0,036/năm; cố định do tia chớp - 0,004/năm; nitơ theo sông
ra biển: NO3– - 0,008/năm, NH4+ - 0,005/năm.
Trong đại dương: cố định sinh học - 0,10/năm; cố định do tia chớp 0,004/năm; xác hữu cơ – 550; chất vô cơ tạo thành do ammon hóa và nitrate hóa 577; phản nitrate hóa - 0,09/năm; trầm tích: 0,00025NH4+/năm; 0,002
N/năm.
Quá trình chuyển hóa nitơ hữu cơ thành muối ammon được gọi là quá trình
ammon hóa (ammonification). Dưới tác dụng của vi sinh vật protein, các base nitơ
sẽ bị thủy phân tạo thành amino acid. Sau đó tiếp tục phân hủy tới NH3.


NH3 giải phóng ra lại có thể bị vi sinh vật sử dụng. Việc tiến hành tái đồng
hóa ammon (cố định sinh học) và ammon hóa (khoáng hóa) có liên quan đến tỷ lệ
C/N trong môi trường. Thông thường lúc NH3 bị hạn chế thì quá trình cố định sinh
học là chính, trong điều kiện ngược lại thì quá trình khoáng hóa lại là chủ yếu. Nếu
tỷ lệ C/N bằng khoảng 20 thì quá trình cố định sinh học và quá trình khoáng hóa đạt
tới tỷ lệ lý luận bình quân.Trong sản xuất nông nghiệp khi bón phân tạo ra tỷ lên
C/N nhỏ hơn 20 thì quá trình khoáng hóa vượt quá quá trình cố định sinh học.
Ngược lại, nếu tỷ lệ C/N cao hơn 20 thì quá trình cố định sinh học vượt quá quá
trình khoáng hóa.
Quá trình khử nitrate bao gồm khử nitrate đồng hóa và khử nitrate dị hóa.
Khử nitrate đồng hóa:
Khử nitrate đồng hóa là quá trình sinh học, sau khi nitrate được tế bào hấp
thụ, sẽ khử hình thành amon kết hợp vào vật chất tế bào. Nhiều vi khuẩn, nấm và
tảo có khả năng khử nitrate đồng hóa. Mục đích của quá trình này là sử dụng
ammon trong nitrate, mà không phải là chất nhận electron, cho nên hệ enzyme khử
nitrate đồng hóa (gồm enzyme khử nitrate đồng hóa và enzyme khử nitrite đồng
hóa) không bị ức chế bởi oxy khí quyển.
Khử nitrate dị hóa:
Khử nitrate dị hóa là quá trình sinh học sau khi nitrate được tế bào hấp thụ,

được dùng làm chất nhận electron, qua đó khử thành ammon. Trong môi trường bùn
bẩn, nước thải công nghiệp, hoặc trong dạ cỏ, dễ dàng sinh tác dụng khử nitrate dị
hóa. Trong quá trình này nitrate đóng vai trò chất nhận electron, cho nên tác dụng
khử nitrate dị hóa bị oxy ức chế.
Khử nitrate dị hóa lại chia thành khử nitrate dị hóa dạng lên men và khử
nitrate dị hóa dạng hô hấp. Đặc điểm khử nitrate dị hóa dạng lên men là không có
sự tham gia của enzyme kết hợp màng, cytocrom và phosphoryl dẫn truyền
electron, còn khử nitrate dị hóa dạng hô hấp thì ngược lại. Nếu sản phẩm khử nitrate
dị hóa dạng hô hấp ở thể khí như N2, N2O thì gọi là quá trình phản nitrate hóa


(denitrification). Trong quá trình phản nitrate hóa, nitrate qua tác dụng của các
enzyme khử nitrate, enzyme khử NO…, lấy cytocrom làm chất nhận electron, cuối
cùng bị khử thành N2. Một khối lượng lớn N2, N2O được phóng thích vào khí
quyển.
Vi khuẩn phản nitrate hóa phổ biến nhất trong thiên nhiên là
chi Pseudomonas, rồi đến chi Alcaligenes, ngòai ra còn có các chi Moraxella,
Spirillum, Corynebacterium, Prcoccus, Thiobacillus, Bacillus, Micrococcus và
Vibrio. Vi khuẩn phản nitrate hóa phần lớn là các vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc,
khi trao đổi năng lượng có thể dùng oxy hoặc nitrate làm chất nhận electron cuối
cùng. Việc khử nitrate có ý nghĩa nhất định trong việc sử dụng chất hữu cơ trong
đất, nhưng tác dụng phản nitrate hóa làm giải phóng khí N2O, có thể tham gia vào
việc phá hủy tầng ozon của khí quyển[20].
1.2.

Quá trình nitrate hóa
Quá trình nitrate hóa là quá trình loại bỏ nitơ trong chất thải, các vi khuẩn sẽ

chuyển hóa NH3 thành dạng NO3–. NO3- có thể được các thực vật thủy sinh sử dụng
như là một nguồn dinh dưỡng hoặc có thể bị chuyển hóa tiếp thành khí nitơ (N2)

qua hoạt động của các vi khuẩn yếm khí như Pseudomonas. Quá trình này gồm 2
giai đoạn được thực hiện bởi 2 nhóm vi khuẩn nối tiếp nhau:
Giai đoạn nitrite hóa: chuyển hóa NH4+ thành nitrite (NO2–) bởi nhóm vi
khuẩn nitrite hóa.
Giai đoạn nitrate hóa: chuyển hóa NO2– thành nitrate (NO3–) bởi nhóm vi
khuẩn nitrate hóa.
Các quá trình chuyển hóa NH3 đều cần có sự tham gia của oxy và độ kiềm
của nước
NH4+ +
O2 +

1
2

3
2

O2  NO2– + 2H+ + H2O

NO2–  NO3–


Hai nhóm vi khuẩn này có mối quan hệ mật thiết với nhau. Chúng phân bố
rộng rãi trong tự nhiên: môi trường đất, nước. Môi trường thích hợp cho cả 2 loài là
có pH>6.
Vi khuẩn tham gia mạnh nhất trong quá trình nitrite hóa là vi khuẩn tự dưỡng
hóa năng vô cơ và là loài hiếu khí bắt buộc. Khi chúng chuyển hóa ammonium
thành nitrite sử dụng cho hoạt động sống của mình.
Bảng 1. 1. Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm nitrite hóa
Loài vi

khuẩn

Đặc điểm tế
bào

Hình
thức sinh
sản

Hình thức
chuyển
động

tº và pH cho
sinh trưởng

Nơi sống

Nitrosomonas
europaea

Hình que

Phân đôi

Bằng đơn
mao

5- 40ºC

Đất, nước
ngọt, biển

Nitrosococcus
oceanus
Nitrosococcus
nitrosus
Nitrosococcus
mobillis
Nitrosospria
briensis

0,8 – 2,2 
Hình cầu

Phân đôi

1,8 – 2,2 
Hình cầu

Phân đôi

1,8 – 2,2 
Hình cầu

Phân đôi

1,5 – 2,7 
Hình xoắn
0,3 – 0,4 

Phân đôi

Bằng đơn
mao
Không di
động
Bằng đơn
mao hoặc
chùm mao
Chuyển
động chùm
mao

pH = 5,8-9,5
25 - 30ºC

Biển

pH = 7,5 - 8
20 - 30ºC

Đất

pH = 6,5 - 8
15 - 30ºC

Nước lợ

pH = 6,5 – 8,2

20 - 30ºC

Đất

pH = 7 - 8

Trong tự nhiên vi khuẩn nitrite hóa rất nhiều: Nitrosococcuseanus,
Nitrosococcus halophila (thuộc phân lớp � – proteobacteria), Nitrosomonas sp. và
Nitrosopira sp. (thuộc lớp � - proteobacteria), Nitrosocystis, Nitrosolobus. Tất cả
các vi sinh này đều giống nhau về mặt sinh lý, sinh hóa nhưng khác nhau về đặc


điểm hình thái và cấu trúc tế bào. Tất cả đều thuộc loại tự dưỡng bắt buộc. Nhưng
chỉ có Nitrosomonas được ứng dụng nhiều nhất trong giai đoạn nitrite hóa.
Sau quá trình nitrite hoá thì amonium được chuyển hóa thành nitrite, các vi
khuẩn thuộc nhóm nitrate hóa sẽ thực hiện giai đoạn tiếp theo, chuyển hóa nitrite
thành nitrate. Các vi khuẩn này là vi khuẩn tự dưỡng hóa năng vô cơ, vi khuẩn
nitrate hóa thường gặp (gồm có 3 chi khác nhau): Nitrobacter vinogradskii,
Nitrobacter agilis (thuộc phân lớp � - Proteobacteria) là những trực khuẩn thẳng,
mảnh, đôi khi có dạng hình cầu, không di động và tạo thành những tập đoàn khuẩn
keo. Nitrospina gracili, Nitrococcus mobilis (thuộc phân lớp � - proteobacteria) tế
bào dạng cầu, có tiên mao. Chi Nitrobacter được ứng dụng nhiều nhất.
Bảng 1. 2. Đặc điểm của một số vi khuẩn điển hình thuộc nhóm vi
khuẩn nitrate hóa (Bergey, 1994)
Loài vi khuẩn

Đặc điểm tế bào

Hình thức
sinh sản

tº và pH cho
sinh trưởng

Nơi sống

Nitrobacter
vinogradskii

Hình que

Mọc chồi

20 - 30ºC

Đất, nước
ngọt, biển

0,6 – 0,8 x 1 – 2 

pH = 7 - 8

Đơn mao
Nitrococcus
mobilis

Hình cầu

Phân đôi

1,5 – 1,7 

20 - 30ºC

Biển

pH = 7 - 8

Đơn mao
Nitrospira sp.

Hình xoắn

Phân đôi

0,6 – 0,8 x 1,2 – 2 

20 - 30ºC

Biển

pH = 6,5 - 8

Ngoài Nitrosomonas và Nitrobacter được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất
thì còn có một số loài cũng có khả năng nitrate hóa: Alcaligenes, Anthrobacter,
Corynebacterium, Achromobacter, Pseudomonas...[4].


1.3.

Vi khuẩn Nitrosomonas
1.3.1.

Lịch sử phát hiện

Vi khuẩn Nitrosomonas là loại vi khuẩn oxy hóa ammonium (Ammonium
oxidizing bacteria – AOB). Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển
hóa ammonium thành nitrite trong điều kiện hiếu khí.
Vi khuẩn này đã được các nhà khoa học phát hiện và phân vào lớp � Proteobacteria (Woese và ctv, 1984, 1985; Head và ctv, 1993; Teske và ctv, 1994;
Utaker và ctv, 1995; Purkhold và ctv, 2000).
1.3.2.

Phân loại

Về mặt phân loại học, các nhà khoa học đã xếp Nitrosomonas như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Proteobacteria
Lớp: � – Proteobacteria
Bộ: Nitrosomonadales
Họ: Nitrosomonadaceae
Giống: Nitrosomonas
Trong quá trình nghiên cứu, đến nay các nhà khoa học đã xác định 10 loài
của Nitrosomonas bao gồm: N.europaea, N.eutropha, N.halophila, N.communis,
N.marina, N.aestuarii, N.nitrosa, N.oligotropha, N.cryotolerans, N.ureae.


Hình 1. 1. Vi khuẩn Nitrosomonas europea khi quan sát dưới kính
hiển vi quan học (a) và (b) kính hiển vi điện tử
1.3.3.

Đặc điểm hình thái

Nitrosomonas là vi khuẩn Gram âm, không sinh nội bào tử, tế bào nhỏ bé
hình cầu hay ovan, di động hoặc không di động, một số loài di động bằng tiên mao
ở đầu cực, đứng riêng lẻ, thành đội hay thành chuỗi. Chúng phân bố rộng rãi trong
nước, đất. Nitrosomonas là vi khuẩn kị ánh sáng, thường kết thành khối gọi là tập
đoàn khuẩn keo.

Hình 1. 2. Vi khuẩn Nitrosomonas
Biên độ nhiệt từ 5 - 30ºC, thích hợp trong khoảng 5 - 30ºC. Có thể chịu đựng
pH từ 5,8 – 8,5.


1.3.4.

Cấu trúc tế bào

Những loài ở biển được bao bọc thêm một lớp protein ở ngoài, màng tế bào
chất bên trong. Lượng G+C chứa trong DNA vào khoảng 47,5 – 51%. Chỉ có một
số loài có thể sử dụng được ure như nguồn ammonium. Là loài dinh dưỡng hóa
năng vô cơ bắt buộc, oxy hóa NH4+ thành NO2 –, dùng quá trình cố định CO2 để đáp
ứng nhu cầu về năng lượng và nguồn cacbon vô cơ. Hợp chất cacbon có thể đồng
hóa ở một giới hạn và có thể gây kích thích cho tế bào tự dưỡng phát triển.
1.4.

Vi khuẩn Nitrobacter
Vi khuẩn Nitrobacter là loại vi khuẩn oxy hóa nitrite. Chúng đóng vai trò

quan trọng trong quá trình chuyển hóa nitrite thành nitrate trong điều kiện hiếu khí.
1.4.1.

Phân loại

Về mặt phân loại học, các nhà khoa học đã xếp Nitrobacter như sau:
Giới : Bacteria
Ngành : Proteobacteria
Lớp : � -

Proteobacteria
Bộ : Rhizobiales
Họ : Bradyrhizobiaceae
Giống : Nitrobacter
Các loài trong chi Nitrobacter bao gồm: Nitrobacter winogradskyi,
Nitrobacter hamburgensis, Nitrobacter vulgaris và Nitrobacter alkalicus[9].
1.4.2.

Đặc điểm hình thái

Nitrobacter có dạng hình que, hình bầu dục hay hình cầu. Là những vi khuẩn
Gram âm, rất nhỏ bé, kích thước khoảng 0,5 – 0,8 x 1 - 2��m. Chúng có thể di động
hoặc không di động (Nitrobacter winogradski), di động các tiên mao hoặc tiêm mao


(Nitrobacter agilis). Trong điều kiện không thuận lợi, Nitrobacter có thể tạo thành


tập đoàn khuẩn keo. Các vi khuẩn này không sinh bào tử, trên bản silicagel hoặc
trên thạch (chứa nitrite) tạo thành những khuẩn lạc màu vàng, trong suốt và nhỏ bé
(đường kính khoảng 0,2 mm) chung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải[4].

Hình 1. 3. Tế bào vi khuẩn Nitrobacter winogradski quan sát dưới
kính hiển vi quang học (a) và (b) kính hiển vi điện tử
1.5.

Ứng dụng của vi khuẩn nitrate hóa
1.5.1.

Trong thủy sản

Hiện nay vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rộng rãi trong xử lý nước (nước
thải công nghiệp, nước thải sinh hoạt và nước thải từ nuôi trồng thủy sản). Trong
nuôi trồng thủy sản, nhóm vi khuẩn nitrate hóa được sử dụng rất phổ biến trong
lãnh vực sản xuất giống thủy sản và nuôi thủy sản thâm canh. Quy trình sản xuất
được thực hiện thông qua hệ thống lọc sinh học tuần hoàn, nước thải từ các bể ương
nuôi tôm cá chứa hàm lượng NH3 (do tôm cá bài tiết ra) được đưa vào bể lọc sinh
học để xử lý. Trong bể lọc sinh học, vi khuẩn Nitrosomonas sẽ chuyển hóa
NH4+ thành NO2– (giai đoạn nitrite hóa), kế đến vi khuẩn Nitrobacter chuyển hóa
NO2– thành NO3–(giai đoạn nitrate hóa). Nước sau khi xử lý qua bể lọc sinh học
hoàn toàn không độc cho tôm cá và được được tái sử dụng để ương nuôi tôm cá


(đưa trở lại bể ương nuôi). Trong suốt quá trình nuôi, nước sẽ tuần hoàn trong một
hệ thống kín và hoàn toàn không thay nước, chỉ có một lượng nhỏ nước mới được
cấp thêm vào hệ thống để bù đắp cho lượng nước hao hụt do bốc hơi. Hiện nay, các

nước phát triển đã ứng dụng rất thành công quy trình lọc sinh học tuần hoàn
trong sản xuất thâm canh cá trê phi, cá chình, cá hồi và cá bơn và cả cá rô phi. Ở
Việt Nam, quy trình lọc sinh học tuần hoàn được áp dụng phổ biến trong các trại
sản xuất giống tôm càng xanh và tôm sú, đặc biệt là các trại giống ở vùng Đồng
Bằng Sông Cửu Long. Quy trình sản xuất dựa hoàn toàn vào nhóm vi sinh vật tự

nhiên nên không sử dụng hóa chất, kháng sinh nên sản phẩm đạt tiêu chuẩn vệ sinh
an toàn thực phẩm thủy sản. Do quá trình sản xuất trong hệ thống kín nên hạn chế
được dịch bệnh. Không thay nước nên không gây ô nhiễm môi trường. Lượng nước
sử dụng trên một đơn vị sản phẩm thấp. Chi phí công lao động thấp.
Mặc dù mới chỉ mới được ứng dụng trong lãnh vực sản xuất giống, nhưng
nhóm vi khuẩn nitrate hóa (Nitrosomonas, Nitrobacter…) đã mang lại lợi ích thiết
thực cho nghề nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam. Nhóm vi khuẩn này còn có nhiều
triển vọng cho sự phát triển nuôi thủy sản thâm canh trong tương lai[24].
1.5.2.

Trong chăn nuôi

Nhiều nước trên thế giới hiện nay đã áp dụng chăn nuôi trên nền đệm lót sinh
thái nhằm tăng năng suất, góp phần bảo vệ môi trường. Ở Việt Nam để xử lý các
chất thải ngành chăn nuôi hiện đang áp dụng nhiều công nghệ như ủ phân compost,
khí sinh học và vi sinh vật chọn lọc để tăng cường quá trình phân giải chất thải.
Trong đó, việc áp dụng đệm lót có bổ sung chế phẩm vi sinh đang được quan tâm.
Đệm lót sinh học là đệm lót trên nền chuồng chăn nuôi. Đệm lót này hiện
đang được khuyến cáo là trấu và mùn cưa. Trấu và mùn cưa được đưa vào nền
chuồng nuôi, sau đó được rải lên trên mặt một lớp hệ men vi sinh vật có ích. Hệ vi
sinh vật này có tác dụng chủ yếu:
- Phân giải phân, nước tiểu do vật nuôi thải ra, hạn chế sinh khí hôi, thối.