Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân hủy protein trong nƣớc thải chế biến thủy sản

Đồ án tốt nghiệp

LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công nghệ sinh học – Thực phẩm – Môi
trường, Trường Đại học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Những kết quả có được trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt
nghiệp của người khác dưới bất kỳ hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án
tốt nghiệp này là hoàn toàn trung thực. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về đồ án
của mình.
TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Huỳnh Mai Nhi

i


Đồ án tốt nghiệp

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời tri ân chân thành đến Cô
Nguyễn Hoài Hương đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt thời gian xây
dựng đề cương và hoàn thành đồ án. Em xin cám ơn Thầy Huỳnh Văn Thành đã
động viên, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực
hiện.
Đồng thời, em cũng gửi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô khoa Công nghệ sinh
học – Thực phẩm – Môi trường đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt
thời gian dài học tập. Với những kiến thức mà em đã tiếp thu được không chỉ giúp
em thực hiện tốt đồ án tốt nghiệp mà còn là nền tảng kiến thức cho công việc sau
này.

Em xin gửi lời cám ơn sâu sắc đến gia đình đã luôn chăm sóc, tạo điều kiện
cho em đến trường theo đuổi ước mơ và là chỗ dựa vững chắc không chỉ về tinh
thần mà cả vật chất cho em trong suốt những năm qua.
Em cũng xin gửi lời cám ơn chân thành đến các bạn cùng thực hiện đề tài
trong phòng thí nghiệm – những người luôn động viên, luôn sát cánh và giúp đỡ hết
mình để em hoàn thành tốt đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin cám ơn các Thầy Cô trong Hội đồng phản biện đã dành
thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy Cô lời chúc sức
khỏe.
TP. HCM, ngày 15 tháng 08 năm 2015
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Huỳnh Mai Nhi

ii


Đồ án tốt nghiệp

MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................ ix
DANH

MỤC

BẢNG

..................................................................................................x DANH MỤC HÌNH
.................................................................................................

xi

MỞ

ĐẦU

...................................................................................................................2
1. Tính cấp thiết của đề tài ................................................................................2
2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease .......................................................3
2.1.

Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong nước...........................3

2.2.

Tình hình sản xuất enzyme protease trên thế giới .............................3

3. Mục đích nghiên cứu ......................................................................................3
4. Nhiệm vụ nghiên cứu .....................................................................................3
5. Phương pháp nghiên cứu...............................................................................4
6. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu .................................................................5
7. Ý nghĩa đề tài ..................................................................................................5
8. Các kết quả đạt được của đề tài ....................................................................5
9. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp .........................................................................5
CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................7

1.1. Tổng quan về ngành sản xuất thủy sản ........................................................7

1.2. Tổng quan về nước thải chế biến thủy sản ................................................10
1.2.1. Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản .........................................10
1.2.2. Đặc tính của nước thải chế biến thủy sản ..............................................14
1.2.3. Ảnh hưởng của nước thải thủy sản đến môi trường nước .....................15
1.2.4. Hệ thống xử lý nước thải cho các nhà máy sản xuất thủy sản ..............17
1.3. Tổng quan về vi sinh vật trong nước thải công nghiệp.............................18
1.3.1. Nguồn gốc vi sinh vật trong nước thải công nghiệp .............................18
1.3.2. Thành phần vi sinh vật trong nước thải công nghiệp ............................19
1.3.3. Chuyển hóa vật chất của vi sinh vật trong nước thải công nghiệp........19
1.4. Tổng quan về quá trình phân giải các chất giàu protein nhờ vi sinh vật21
3


1.4.1. Quá trình amon hóa protein ...................................................................22
1.4.2. Vi sinh vật tham gia quá trình phân hủy protein ...................................23
1.4.2.1. Bacillus subtillis ..............................................................................24
1.4.2.2. Bacillus cereus ................................................................................25
1.4.2.3. Bacillus mensentericus....................................................................25
1.4.3. Enzyme protease của vi sinh vật ...........................................................26
1.4.3.1. Protease ngoại bào của vi sinh vật: .................................................26
1.4.3.2. Protease nội bào của vi sinh vật:.....................................................27
1.4.3.3. Phân loại theo trung tâm hoạt động của enzyme ............................28
1.5. Tổng quan về các phương pháp xử lý nước thải .......................................28
1.5.1. Các phương pháp xử lý nước thải cơ bản..............................................29
1.5.1.1. Phương pháp cơ học........................................................................29
1.5.1.2. Phương pháp hóa lý ........................................................................29
1.5.1.3. Phương pháp hóa học......................................................................30
1.5.2. Phương pháp sinh học xử lý nước thải ..................................................31
1.5.2.1. Nguyên tắc ......................................................................................31
1.5.2.2. Các quá trình sinh học chủ yếu xảy ra trong nước thải ..................31

1.5.2.3. Các hình thức xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học ...........33
1.5.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý nước thải bằng phương
pháp sinh học.................................................................................................35
1.6. Tổng quan về chế phẩm sinh học ................................................................37
1.6.1. Định nghĩa chế phẩm sinh học ..............................................................37
1.6.2. Mục đích của việc sử dụng chế phẩm sinh học trong thủy sản .............37
1.6.3. Các chế phẩm sinh học xử lý nước thải chứa nito trên thị trường ........38
1.6.3.1. Men vi sinh JUMBO .......................................................................38
1.6.3.2. Chế phẩm sinh học EMIC...............................................................39
1.6.3.3. Chế phẩm AQUAPOND.................................................................39
1.6.3.4. Chế phẩm sinh học EM ...................................................................40
1.6.3.5. Chế phẩm vườn sinh thái cho thủy sản ...........................................40


CHƯƠNG 2.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................42

2.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài .......................................................42
2.1.1. Địa điểm nghiên cứu .............................................................................42
2.1.2. Thời gian nghiên cứu.............................................................................42
2.2. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................42
2.2.1. Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn...............................................................42
2.2.2. Hóa chất và môi trường .........................................................................42
2.2.2.1. Hóa chất ..........................................................................................42
2.2.2.2. Môi trường ......................................................................................42
2.2.3. Thiết bị và dụng cụ ................................................................................53
2.2.3.1. Thiết bị ............................................................................................53
2.2.3.2. Dụng cụ ...........................................................................................53
2.3. Bố trí thí nghiệm...........................................................................................54

2.4. Bố trí thí nghiệm chi tiết ..............................................................................54
2.4.1. Phân lập và định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn amon hóa .................54
2.4.1.1. Phân lập vi khuẩn amon hóa ...........................................................54
2.4.1.2. Định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được ......................57
2.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease của
các chủng phân lập được ...................................................................................58
2.4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường thu enzyme đến khả năng
sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn..............................................60
2.4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme trên môi
trường lỗ thạch casein ...................................................................................61
2.4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối môi trường thu enzyme đến
khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn ..............................63
2.4.2.4. Khảo sát ảnh hưởng chế độ cung cấp oxi đến khả năng sinh enzyme
protease của các chủng vi khuẩn ...................................................................64
2.4.2.5. Khảo sát động học tổng hợp enzyme protease của các chủng vi
khuẩn

.........................................................................................................66


2.4.3. Thí nghiệm ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải CBTS........67
2.5. Phương pháp nghiên cứu.............................................................................68
2.5.1. Phương pháp thu mẫu, xử lý mẫu..........................................................68
2.5.2. Phương pháp tăng sinh ..........................................................................69
2.5.3. Phương pháp pha loãng mẫu .................................................................69
2.5.4. Phương pháp phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein............69
2.5.4.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật thuần khiết ................................69
2.5.4.2. Phương pháp bảo quản và giữ giống vi sinh vật.............................71
2.5.5. Phương pháp tăng sinh chủng vi khuẩn phân lập được.........................71
2.5.6. Các phương pháp quan sát đặc điểm hình thái ......................................72

2.5.6.1. Quan sát hình thái khuẩn lạc ...........................................................72
2.5.6.2. Soi khuẩn lạc ...................................................................................72
2.5.6.3. Phương pháp nhuộm gram ..............................................................72
2.5.6.4. Phương pháp nhuộm bào tử ............................................................72
2.5.7. Các thử nghiệm sinh hóa đối với chủng vi khuẩn phân lập ..................73
2.5.7.1. Thử nghiệm catalase .......................................................................73
2.5.7.2. Thử nghiệm khả năng di động ........................................................73
2.5.7.3. Thử nghiệm Indol ...........................................................................73
2.5.7.4. Thử nghiệm VP ...............................................................................73
2.5.7.5. Thử nghiệm urease..........................................................................73
2.5.7.6. Thử nghiệm nitratase (khử nitrate) .................................................73
2.5.7.7. Thử nghiệm MR (Methyl Red) .......................................................74
2.5.7.8. Thử nghiệm khả năng lên men các nguồn carbohydrate ................74
2.5.7.9. Thử nghiệm khả năng lên men (F) và oxy hóa (O) glucose ...........75
2.5.7.10.Thử nghiệm TSI ..............................................................................75
2.5.7.11.Thử nghiệm citrate ..........................................................................75
2.5.7.12.Thử nghiệm khả năng chịu mặn......................................................75
2.5.7.13.Thử nghiệm Tyrosine......................................................................75
2.5.7.14.API KIT 20E ...................................................................................76


2.5.8. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đo mật độ quan (OD600nm) 76
2.5.9. Phương pháp đục lỗ thạch .....................................................................76
2.5.10. Phương pháp nghiên cứu khả năng phân hủy tinh bột, protein, lipase,
cellulose.............................................................................................................77
2.5.11. Các phương pháp định lượng các chỉ số trong nước thải ......................79
2.5.11.1.Phương pháp xác định Clorua.........................................................79
2.5.11.2.Phương pháp xác định nhu cầu oxi hóa học (COD) .......................79
+

2.5.11.3.Phương pháp định lượng N-NH4 ...................................................79
2.6. Phương pháp xử lý số liệu thống kê............................................................79
CHƯƠNG 3.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................80

3.1. Kết quả phân lập và lựa chọn các chủng có khả năng phân hủy protein ...
........................................................................................................................80
3.2. Kết quả định danh sơ bộ..............................................................................80
3.2.1. Kết quả thử nghiệm sinh hóa .................................................................80
3.2.2. Quan sát hình thái, sinh lý .....................................................................82
3.3. Khảo sát khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân
lập được................................................................................................................88
3.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme protease của
các chủng vi khuẩn phân lập được ....................................................................90
3.4.1. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme
protease của các chủng vi khuẩn phân lập được ...............................................90
3.4.2. Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme trên môi trường lỗ thạch
casein ...............................................................................................................92
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tăng trưởng và
sinh enzyme protease của các chủng phân lập được .........................................98
3.4.3.1. Khả năng tăng sinh khối của các chủng ở các nồng độ muối khác
nhau

.........................................................................................................99

3.4.3.2. Kết quả ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh enzyme
của các chủng phân lập được ......................................................................102

vii

3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của oxi đến khả năng sinh enzyme protease
của các chủng phân lập được ..........................................................................106
3.4.5. Khảo sát động học tổng hợp protease trong môi trường nhân tạo ......108
3.4.6. Ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải ...................................110
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................54
1. Kết luận .........................................................................................................54
2. Đề nghị...........................................................................................................55
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................120
A. Tài liệu Tiếng Việt ......................................................................................120
B. Tài liệu Tiếng Anh ......................................................................................121
C. Tài liệu Internet ..........................................................................................123
PHỤ LỤC ...................................................................................................................1

8


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
CBTS:

Chế biến thủy sản CFU:

Colony forming unit ĐKVPG:
Đường kính vòng phân giải
DO:

Oxy hòa tan (Dissolved Oxygen)

ĐKVPG:

Đường kính vòng phân giải

FAO:

Food and Agriculture Organization (tổ chức Lương thực và
Nông nghiệp Liên Hợp Quốc

MT:

Môi trường
MT1 Môi trường phân lập vi khuẩn phân hủy protein, chứa
1% gelatine

MT2:

Môi trường thu enzyme

N2 :

Khi Nitơ

NA:

Nutrient agar

NB:

Nutrient broth
+

Amonium

-

Nitrite

NO3 :

-

Nitrate

OD:

Optical Density

TN:

Thí nghiệm

TSB:

Tripticase Soya Broth

TSI:

Triple Sugar Iron Agar

TSS:

Total suspended solids (tổng vật chất lơ lửng)

VK:

Vi khuẩn

VP – MR:

Voges – Proskauer – Methyl Red

VSV:

Vi sinh vật

NH4 :
NO2 :

9


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 theo giá so sánh 2010. .......................8
Bảng 1.2. Khối lượng sản phẩm thủy sản xuất khẩu từ năm 2002 – 2005. ................9
Bảng 1.3. Năng lực sản xuất của các cơ sở chế biến thủy sản đông lạnh. ...............10
Bảng 1.4. Lượng phế thải trung bình cho một tấn sản phẩm thủy sản. ....................12
Bảng 1.5. Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản. ................................13
Bảng 1.6. Giá trị các thông số ô nhiễm làm cơ sở tính toán giá trị tối đa cho phép.13
Bảng 1.7. Một số vi sinh vật tham gia quá trình amon hóa protein..........................24
Bảng 2.1. Kết quả thử nghiệm khử nitrate thành nitrite. ..........................................74

Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái các chủng vi khuẩn phân lập. ...................................80
Bảng 3.2. Kết quả định danh sơ bộ các chủng vi khuẩn phân lập được từ nước thải
thủy sản. ....................................................................................................................80
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập được.
...................................................................................................................................88
Bảng 3.4. pH môi trường nuôi cấy tối ưu để tổng hợp enzyme protease của các
chủng phân lập được. ................................................................................................92
Bảng 3.5. pH hoạt động tối ưu của enzyme protease của các chủng phân lập .......97
Bảng 3.6. pH môi trường nuôi cấy tối ưu và pH hoạt động tối ưu của enzyme
protease tổng hợp từ các chủng vi khuẩn. .................................................................98
Bảng 3.7. Nồng độ muối tối ưu cho khả năng tăng trưởng của các chủng phân lập
.................................................................................................................................102
Bảng 3.8. Nồng độ muối tối ưu cho khả năng sinh enzyme protease của chủng phân
lập ............................................................................................................................106
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của điều kiện oxi đến khả năng sinh enzyme của các chủng
.................................................................................................................................108
Bảng 3.10. Thời gian nuôi cấy tối ưu của các chủng phân lập được......................110

10


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm (nghìn tấn). ............................9
Hình 1.2. Sơ đồ quy trình công nghệ chế biến thủy sản đông lạnh dạng tươi. ........11
Hình 1.3. Dây chuyền công nghệ xử lý nước thải thủy sản điển hình. ....................17
Hình 1.4. Đường cong sinh trưởng kép của vi sinh vật trong nước thải. .................20
Hình 1.5. Chuyển hóa các hợp chất nitơ trong xử lý sinh học. ................................22
Hình 1.6. Quá trình amon hóa protein. .....................................................................23
Hình 1.7. Quá trình phân giải protein ngoại bào. .....................................................27
Hình 1.8. Quá trình hoạt động protease nội bào.......................................................27

Hình 1.9. Men vi sinh JUMBO. ............................................................... ................38
Hình 1.10. Chế phẩm sinh học EMIC ............................................................... .......39
Hình 1.11. Chế phẩm AQUAPOND. ............................................................... ........39
Hình 1.12. Chế phẩm EM gốc. ............................................................... ..................40
Hình 1.13. Chế phẩm sinh học vườn sinh thái. ....................................................... .41
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí các bước thí nghiệm..............................................................54
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân giải protein từ nước
thải chế biến thủy sản. ...............................................................................................55
Hình 2.3. Quy trình phân lập vi khuẩn có khả năng phân hủy protein. ...................56
Hình 2.4. Quy trình định danh sơ bộ các chủng phân lập được. ..............................58
Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt bố trí thí nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quy
trình tổng hợp enzyme...............................................................................................59
Hình 2.6. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường thu enzyme đến khả
năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn. ................................................60
Hình 2.7. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt động của enzyme trên môi
trường lỗ thạch casein. ..............................................................................................61
Hình 2.8. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối môi trường thu enzyme
đến khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn. ..................................63
Hình 2.9. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của oxi đến quá trình sinh enzyme protease
của các chủng vi khuẩn. ........................................................................................... .64

11


Hình 2.10. Quy trình khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy thu enzyme đến
khả năng sinh enzyme protease của các chủng vi khuẩn. .........................................66
Hình 2.11. Quy trình ứng dụng chủng chọn lọc vào xử lý nước thải CBTS. ...........67
Hình 3.1. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT1.3..................................83
Hình 3.2. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT1.4..................................84
Hình 3.3. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT2.3..................................85

Hình 3.4. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT3.3..................................86
Hình 3.5. Hình thái tế bào, hình thái khuẩn lạc chủng NT4.3..................................87
Hình 3.6. Kết quả sinh enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn phân lập được. 89
Hình 3.7. pH môi trường thử hoạt tính enzyme lipase. ............................................90
Hình 3.8. Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme
protease của các chủng. .............................................................................................91
Hình 3.9. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT1.3 trên
môi trường casein. .....................................................................................................93
Hình 3.10. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT1.4
trên môi trường casein...............................................................................................94
Hình 3.11. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT2.3
trên môi trường casein...............................................................................................95
Hình 3.12. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT3.3
trên môi trường casein...............................................................................................95
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease của chủng NT1.3
trên môi trường casein...............................................................................................96
Hình 3.14. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tăng trưởng của các chủng
phân lập.. .................................................................................................................100
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease
của chủng NT1.3. ....................................................................................................103
Hình 3.16. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease
của chủng NT1.4 .....................................................................................................103

xii


Hình 3.17. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease
của chủng NT2.3 .....................................................................................................104
Hình 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease
của chủng NT3.3. ....................................................................................................105

Hình 3.19. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng tổng hợp enzyme protease
của chủng NT4.3. ....................................................................................................105
Hình 3.20. Ảnh hưởng của điều kiện oxi đến khả năng sinh enzyme protease. ....107
Hình 3.21. Động học tổng hợp enzyme protease của các chủng phân lập. ...........109
Hình 3.22. Khả năng xử lý nước thải của chủng chọn lọc so với mẫu đối chứng
không cấy VSV. ......................................................................................................111
Hình 3.23. Hoạt tính enzyme tăng thêm khi bổ sung chủng chọn lọc vào nước thải.
.................................................................................................................................112

xiii


MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Công nghiệp chế biến thủy sản (CBTS) là một trong những ngành phát triển
khá mạnh mang lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Bên cạnh những lợi ích to lớn đạt
được về kinh tế - xã hội, ngành công nghiệp CBTS cũng phát sinh nhiều vấn đề về
môi trường cần phải giải quyết. Trong đó, ô nhiễm môi trường do nước thải là một
trong những mối quan tâm hàng đầu. Nhìn chung, nước thải CBTS thường có các
thành phần ô nhiễm vượt quá tiêu chuẩn cho phép nhiều lần. Trong khi đó, lưu
3

lượng nước thải tính trên một đơn vị sản phẩm cũng khá lớn, thường từ 30 – 80 m

nước thải cho một tấn thành phẩm (Lâm Minh Tấn và ctv., 2004). Mặc khác, xây
dựng hệ thống xử lý nước thải hoàn chỉnh cho bất cứ cơ sở sản xuất hay nhà máy
nào cũng không phải đơn giản, đòi hỏi kinh phí thực hiện cũng như diện tích đất
xây dựng khá lớn. Thực tế vẫn còn nhiều cơ sở sản xuất và khu công nghiệp chưa
đầu tư và vận hành hệ thống xử lý nước thải.
Nước thải CBTS có thành phần đặc trưng gây ô nhiễm là các hợp chất hữu cơ

giàu Nitơ. Nguồn gốc gây ô nhiễm chủ yếu phát sinh trong các công đoạn sơ chế và
làm sạch nguyên liệu (tôm, cá, mực,...). Bên cạnh đó, nó còn làm ô nhiễm các
nguồn nước mặt, nước ngầm, huỷ hoại hệ thuỷ sinh vật và gây ảnh hưởng đến sức
khoẻ con người. Do đó, cần phải có phương pháp phù hợp để xử lý và khắc phục
tình trạng ô nhiễm trong các nhà máy chế biến thủy sản. Công nghệ xử lý nước thải
CBTS ngày càng đi sâu vào áp dụng công nghệ sinh học và các biện pháp sinh học
có hiệu quả xử lý triệt để, hơn hẳn những biện pháp xử lý hóa lý khác.
Một số vi sinh vật trong nước có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa
thành phần chủ yếu của nước thải thủy sản, đặc biệt là vi khuẩn thuộc chi Bacillus.
Các chủng vi sinh vật này đã có nhiều ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như: công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp thực phẩm,...đặc biệt là trong
lĩnh vực xử lý nước thải chứa nhiều protein như nước thải chế biến thủy sản. Trong
điều kiện tự nhiên của nước thải, các vi sinh vật này tự phát triển về số lượng và
khối lượng nhưng đòi hỏi thời gian dài. Nếu các vi sinh vật này được tách riêng và

2


tăng sinh trước trong môi trường giàu protein sau đó bổ sung vào nước thải ở giai
đoạn vi sinh vật sinh trưởng mạnh nhất thì vừa có thể nâng cao hiệu quả xử lý nước
thải, vừa rút ngắn được thời gian thích nghi của vi sinh vật trong bể xử lý. Dựa trên
cơ sở đó, đề tài “Phân lập một số chủng vi sinh vật chịu mặn có khả năng phân
hủy protein trong nước thải chế biến thủy sản” được thực hiện nhằm tìm ra
chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein trong điều kiện có nồng độ NaCl ở
mức 3% để sản xuất các chế phẩm sinh học bổ sung vào hệ thống xử lý nước thải
chế biến thủy sản, nâng cao hiệu quả xử lý trước khi thải ra ngoài môi trường tự
nhiên.
2. Tình hình nghiên cứu enzyme protease
2.1. Tình hình nghiên cứu enzyme protease trong
nước

Trương Thị Mỹ Khanh và Vũ Thị Hương Lan (2010) đã phân lập từ mẫu nước
thải nhà máy thủy sản được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein và ứng
dụng vào xử lý nước thải chế biến thủy sản.
2.2. Tình hình sản xuất enzyme protease trên thế giới
Theo nghiên cứu của Graslund et al. (2003) cho thấy 86% người nuôi tôm ở
Thái Lan sử dụng vi sinh vật hữu ích để cải thiện chất lượng nước và bùn đáy ao
nuôi. Verschuere (2000) đã nghiên cứu và công bố vi khuẩn Bacillus spp. đóng vai
trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng nước do vi khuẩn này đạt hiệu quả
cao trong việc chuyển đổi vật chất hữu cơ thành CO2. Do vậy, Bacillus spp. làm
giảm tích lũy chất hữu cơ và các chất hòa tan.
3. Mục đích nghiên cứu
Phân lập tuyển chọn vi khuẩn chi Bacillus có khả năng chịu mặn và tổng hợp
protease khi nồng độ NaCl lên đến 3 %.
4. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Phân lập và chọn lọc vi khuẩn Bacillus spp. amon hóa chịu mặn.
 Định danh sơ bộ.
 Khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh enzyme
của các chủng nghiên cứu.


 Khảo sát pH hoạt động tối ưu của enzyme sinh ra từ các chủng nghiên cứu.
 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối đến khả năng sinh enzyme của các
chủng nghiên cứu.
 Khảo sát điều kiện cung cấp oxy thích hợp cho việc thu enzyme
protease của các chủng nghiên cứu.
 Khảo sát động học tổng hợp enzyme của các chủng phân lập.
5. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp tổng hợp tài liệu:
 Nghiên cứu, thu thập tài liệu tham khảo, tài liệu internet liên quan
đến đề tài.



Tổng hợp, lựa chọn các tài liệu liên quan đến mục tiêu đề ra trong đề
tài..

 Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
 Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng amon hóa, không gây bệnh
và có hoạt tính mạnh nhất từ nước thải nhà máy CBTS.
 Thực hiện một số khảo sát hình thái, thử nghiệm sinh lý sinh hóa từ
đó tuyển chọn chủng VK mong muốn, loại VSV có nguy cơ gây
bệnh.
 Thực hiện bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng sinh enzyme protease
phân hủy protein của chủng VK đã được tuyển chọn phụ thuộc nồng
độ muối và oxy.


Khảo sát khả năng sinh enzyme của chủng chọn lọc trong môi
trường nước thải chế biến thủy sản.

 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu:
 Ghi nhận số liệu từ kết quả thí nghiệm khảo sát theo từng thời điểm.


Xử lý số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel và phần mềm
Statgraphics.


6. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
 Đối tượng:
 Nghiên cứu thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn có khả năng phân

giải protein từ nguồn nước thải nhà máy CBTS.
 Phạm vi giới hạn đề tài:
 Vi khuẩn phân giải protein có nguồn gốc từ nước thải CBTS.
7. Ý nghĩa đề tài
 Ý nghĩa khoa học: Phân lập được chủng VSV có khả năng phân hủy
protein đạt hiệu quả cao. Góp phần xác định một số đặc điểm về hình thái tế
bào và khuẩn lạc của một số vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus, các điều kiện,
yếu tố môi trường và ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến việc thu sinh
khối và
thu enzyme protease của vi khuẩn.
 Ý nghĩa thực tiễn: dựa trên những gì thu được trong quá trình nghiên
cứu góp phần tìm ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh enzyme protease
có hoạt tính cao ứng dụng tạo ra chế phẩm sinh học ứng dụng trong xử lý
nước
thải thủy sản, bảo vệ môi trường.
8. Các kết quả đạt được của đề tài
 Phân lập được 5 chủng có khả năng sinh enzyme protease phân hủy
protein từ nước thải chế biến thủy sản. Từ kết quả phân lập và định danh sơ
bộ cho thấy 5 chủng vi khuẩn đều mang đặc điểm của vi khuẩn Bacillus spp.
 Kết quả khảo sát khả năng tổng hợp enzyme protease được của các
chủng vi khuẩn trên môi trường nhân tạo giàu protein làm cơ sở để sản
xuất chế
phẩm sinh học amon hóa cho nước thải giàu protein.
 Bước đầu ứng dụng vi khuẩn chọn lọc vào nước thải chế biến thủy sản cho
thấy hiệu quả xử lý cao.
9. Kết cấu của đồ án tốt nghiệp
 Phần Mở đầu.
 Chương 1: Tổng quan tài liệu - nội dung chương đề cập đến các nội dung
liên quan đến tài liệu nghiên cứu.

 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu - nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và các phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
 Chương 3: Kết quả và thảo luận - nội dung chương đưa ra những kết
quả mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng cho kết
quả
thu được.
 Phần Kết luận và đề nghị: nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đạt
được và đề nghị cho những hướng cần cải thiện thêm trong đề tài.


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về ngành sản xuất thủy sản
Ngành chế biến thủy sản hiện nay phát triển thành một ngành kinh tế mũi
nhọn, ngành sản xuất hàng hóa lớn, đi đầu trong hội nhập kinh tế quốc tế. Với sự
tăng trưởng nhanh và hiệu quả thủy sản đã đóng góp tích cực trong chuyển đổi cơ
cấu kinh tế nông nghiệp, nông thôn, đóng góp hiệu quả cho công cuộc xóa đói,
giảm nghèo, giải quyết việc làm cho trên 4 triệu lao động, nâng cao đời sống cho
cộng đồng dân cư khắp các vùng nông thôn, ven biển, đồng bằng, trung du, miền
núi…, đồng thời góp phần quan trọng trong bảo vệ an ninh quốc phòng trên vùng
biển đảo của Tổ quốc.
Chiều 12/6, tại hội chợ VIETFISH 2008 Hiệp hội Chế biến và xuất khẩu Thuỷ
sản Việt Nam (VASEP) đã ký bản thoả thuận hợp tác với Hiệp hội các nhà kinh
doanh và Chế biến Thuỷ sản Liên Bang Nga dựa trên nhu cầu phát triển các mối
quan hệ kinh tế, quan hệ đối tác kinh doanh giữa các tổ chức Nhà nước và các Công
ty tư nhân thuỷ sản của 2 quốc gia (Vasep,13/6/2008).[34]
Việt Nam là một trong 10 nước xuất khẩu thủy sản hàng đầu trên thế giới,
ngành thủy sản hiện tại chiếm 4% GDP, 8% xuất khẩu và 9% lực lượng lao động
(khoảng 3,4 triệu người) của cả nước. Nhóm hàng chủ đạo trong xuất khẩu thủy sản
của Việt Nam là cá tra, cá basa, tôm và các động vật thân mềm như mực, bạch tuộc,

nghêu, sò,… Trong vòng 20 năm qua ngành thủy sản luôn duy trì tốc độ tăng trưởng
ấn tượng từ 10-20%. Năm 2014 sản lượng chế biến xuất khẩu đạt trên 1,4 triệu tấn
với giá trị kim ngạch đạt 7,83 tỷ USD. Ngoài ra còn có hàng nghìn cơ sở chế biến
nhỏ lẻ, hộ gia đình, với các loại hình chế biến phong phú như: nước mắm, mắm
tôm, thủy sản khô, ăn liền, sứa ướp muối phèn,....[24]
Trình độ công nghệ chế biến và đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm thuỷ sản
Việt Nam được nâng cao. Hệ thống nhà máy chế biến thủy sản phần lớn đã được
đầu tư và nâng cấp nên có dây chuyền thiết bị hiện đại, áp dụng hệ thống quản lý
chất lượng tiên tiến của thế giới như ISO, HACCP,.... Trên 620 số cơ sở chế biến
thủy sản đạt điều kiện đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm.


Tỷ trọng sản phẩm có giá trị gia tăng ngày một cải thiện, chủng loại sản phẩm
ngày một phong phú. Sản phẩm sơ chế chiếm 51%, sản phẩm làm sẵn chiếm 36%,
sản phẩm ăn liền chiếm 13%. Như vậy, tỷ trọng các sản phẩm chế biến sâu đạt gần
50% .[1]
Theo Tổng cục Thống kê, qua bảng 1.1 ước tính giá trị sản xuất thủy sản năm
2014 (tính theo giá so sánh 2010) ước đạt gần 188 nghìn tỷ đồng, tăng 6,5% so với
cùng kỳ năm ngoái. Trong đó, giá trị nuôi trồng thủy sản ước đạt hơn 115 nghìn tỷ
đồng và giá trị khai thác thủy sản ước đạt hơn 73 nghìn tỷ đồng.
Bảng 1.1. Giá trị sản xuất thủy sản năm 2014 theo giá so sánh 2010.
Đơn vị: tỷ đồng
Chỉ tiêu

So sánh

Năm 2013

Năm 2014

Giá trị sản xuất thủy sản

176.548,0

188.083,9

106,5

- Nuôi trồng thủy sản

106.570,1

115.060,6

108,0

- Khai thác thủy sản

69.977,9

73.023,3

104,4

2014/2013

(Nguồn: Tổng cục Thống kê)
Tổng sản lượng thủy sản năm 2014 ước đạt 6,3 triệu tấn, tăng 4,4% so với
năm 2013 và tăng 1,7% so với kế hoạch đề ra. Trong đó, sản lượng khai thác thủy
sản đạt 2,68 triệu tấn, tăng 3,9% và nuôi trồng thủy sản đạt 3,62 triệu tấn, tăng 4,8%

so với cùng kỳ.
Với chủ trương thúc đẩy phát triển của chính phủ, hoạt động nuôi trồng thủy
sản đã có những bước phát triển mạnh, sản lượng liên tục tăng cao trong các năm
qua, bình quân đạt 12,77 %/năm, đóng góp đáng kể vào tăng trưởng tổng sản lượng
thủy sản của cả nước. Trong khi đó, trước sự cạn kiệt dần của nguồn thủy sản tự
nhiên và trình độ của hoạt động khai thác đánh bắt chưa được cải thiện, sản lượng
thủy sản từ hoạt động khai thác tăng khá thấp trong các năm qua, với mức tăng bình
quân 6,42 %/năm.[40]


(Nguồn: Vasep.com.vn)
Hình 1.1. Sản lượng thủy sản Việt Nam qua các năm (nghìn tấn).
Cùng với ngành nuôi trồng và khai thác thủy sản thì ngành chế biến thủy sản
cũng góp phần gia tăng sản lượng chung của ngành thủy sản Việt Nam với hàng
trăm cơ sở chế biến thủy sản trong cả nước. Trong những năm gần đây, khoảng
35% đầu ra của sản phẩm thủy sản được sản xuất để xuất khẩu và phần còn lại được
bán ra trên thị trường nội địa hoặc ở dạng tươi sống (34,5%), hoặc đã qua chế biến
(45,7%) dưới dạng bột cá, nước mắm, cá khô... Bắt đầu từ năm 1995, nghề đánh cá
xa bờ được đầu tư mạnh nên sản lượng đã tăng lên 1.230.000 tấn. Một số sản phẩm
thủy sản truyền thống của Việt Nam và khối lượng xuất khẩu các sản phẩm đó theo
thời gian được trình bày trong bảng 1.2.
Bảng 1.2. Khối lượng sản phẩm thủy sản xuất khẩu từ năm 2002 – 2005.
Hạng mục

Đơn vị

2002

2003

2004

2005

Tôm đông lạnh

Tấn

114579.98

124779.69

141122.03

149871.8

Philê cá đông lạnh

Tấn

112034.52

132270.71

165596.33

208071.1

Sản phẩm cá khô

Tấn

17181.76

7222.04

14755.54

21675.6

Tấn

115160.11

141798.66

108802.32

148611.5

Tấn

270693.66

285461.13

293125.24

310254.4

Giáp xác và động
vật thân mềm đông
lạnh
Tổng sản phẩm


Kim ngạch xuất

Triệu

khẩu

USD

932

954

989

1,312

(Nguồn: Bộ Thủy Sản ở Việt Nam FICen,2005)
Trong giai đoạn 2001 – 2013, xuất khẩu thủy sản Việt Nam tăng nhanh về cả
giá trị và sản lượng. Đến năm 2013, giá trị xuất khẩu đạt trên 6,7 tỷ USD, sản phẩm
thủy sản được xuất khẩu sang 165 nước và vùng lãnh thổ. 3 thị trường chính là EU,
Mỹ và Nhật Bản chiếm trên 60% tỷ trọng .[34]
Số cơ sở chế biến thủy sản đông lạnh qua các năm đều tăng dần, cũng như
năng lực sản xuất của các cơ sở chế biến cũng tăng thể hiện qua bảng 1.3.
Bảng 1.3. Năng lực sản xuất của các cơ sở chế biến thủy sản đông lạnh.

Chỉ tiêu

2002

2007

2012

211

320

429

3.150

4.262

7.870

Số thiết bị cấp đông (chiếc)

836

1.318

1.378

Tủ đông tiếp xúc (chiếc)

517

681

694

Tủ đông gió (chiếc)

193

355

376

Tủ đông IQF (chiếc)

126

282

317

Số cơ sở chế biến
Tổng CS thiết bị cấp đông (tấn/ ngày)

(Nguồn: Cục chế biến NLTS và NM)
1.2. Tổng quan về nước thải chế biến thủy sản
1.2.1. Các công đoạn phát sinh nước thải thủy sản
Hầu hết các loại hình công nghệ CBTS đều có nhu cầu sử dụng nước khá lớn
cho nhiều công đoạn: chế biến, bảo quản nguyên liệu và sản phẩm. Do vậy đã tạo ra

một lượng lớn nước thải trong quá trình sản xuất.
Nước thải ở các khâu chế biến chiếm 85% - 90% tổng lượng nước thải, 10 % 15% còn lại là nước thải sinh hoạt của công nhân trong nhà máy. Nguồn gây ô
nhiễm ở khâu chế biến cơ bản :
- Sơ chế nguyên liệu: rửa, phân loại, mổ, rã đông...
- Các quá trình chế biến: ngâm, tách xương, cắt khúc, phile, làm sạch, luộc.
- Quá trình vệ sinh thiết bị, nhà xưởng và vệ sinh của công nhân.


Các bước sản xuất trong một nhà máy chế biến thủy sản điển hình và các công
đoạn phát sinh nước thải được thể hiện trên hình 1.2.
Nguyên liệu
Nước sạch
(Tôm, cá, mực…)

Hoá chất khử trùng
(Clorin, Javen)

Sản xuất nước đá
Tiếp nhận nguyên liệu
Bảo quản nguyên liệu
o

(kiểm tra chất lượng, rửa sơ bộ, bảo quản nguyên liệu)

Nước thải

o

(t = 0 5 C)
Nước

Xử lý, rửa sạch nguyên liệu
(chặt, cắt, mổ, bóc, tách, đánh vẩy…)

Nước

Phân loại, rửa sạch
(phân hạng, phân cỡ, cân đo)

Nước đá

Xếp khuôn, cấp đông
(Dạng Block, IQF)

Nước thải

Nước thải

Nước ngưng

Tách khuôn, bao gói
(Vào túi PE, đóng hộp cacton)
Bảo quản sản phẩm
o

(t

o

-20 C, Block, IQF)

Hình 1.2. Sơ đồ quy trình công nghệ chế biến thủy sản đông lạnh dạng tươi.
(Lê Minh Nguyệt, 2003)
Lượng phế thải thủy sản phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính nguyên liệu như:
chủng loại, kích cỡ, độ tươi, hình dáng cấu tạo,… cũng như trình độ về thiết bị công


nghệ sản xuất. Khối lượng phế thải trung bình trên 1 đơn vị sản phẩm chủ yếu của
các loại hình công nghệ sản xuất điển hình được nêu trong bảng 1.4.
Bảng 1.4. Lượng phế thải trung bình cho một tấn sản phẩm thủy sản.
Lượng phế
STT

Công nghệ chế biến

Loại sản phẩm

thải (tấn/tấn
sản phẩm)

1

Tôm

0,75

Cá

0,6

Chế biến sản phẩm

Cá Philê

1,85

đông lạnh

Mực

0,45

Nhuyễn thể 2 mảnh vỏ

4

Mực philê

1,5

Cá

1,7

Tôm

1,2

Chế biến sản phẩm

Tôm, cá

1,6

khô

Mực

0,7

4

Sản xuất nước mắm

Nước mắm

0,28

5

Chế biến thực vật biển

Agar

2
3

Sản xuất đồ hộp

6

(Nguồn: Báo cáo cơ sở khoa học của Viện xây dựng quy chế bảo vệ môi trường
trong nghiệp chế biến thủy sản, Bô Thủy sản, 2000)
Lượng chất thải lỏng trong chế biến thuỷ sản được coi là quan trọng nhất, các
nhà máy chế biến đông lạnh thường có lượng chất thải lớn hơn so với các cơ sở chế
3

biến hàng khô, nước mắm, đồ hộp, bình quân khoảng 50.000 m /ngày... Mức ô
nhiễm của nước thải từ các nhà máy chế biến tuỳ thuộc vào loại mặt hàng chủ yếu
mà nhà máy đó sản xuất. Một số rất ít chất thải từ chế biến surimi có các chỉ số
BOD5 lên tới 3.120mg/l, COD tới 4.890mg/l nước thải từ chế biến Agar có chứa các
hoá chất như NaOH, H2SO4, Javen, Borax nhưng liều lượng không cao và tải lượng
cũng không nhiều, tuy nhiên nếu loại nước thải này không được pha đủ loãng mà


trực tiếp thải ra môi trường có thể gây hại cho môi trường. Các dạng nước thải công
nghiệp chế biến thủy sản thể hiện qua bảng 1.5.
Bảng 1.5. Các dạng nước thải công nghiệp chế biến thủy sản.
STT

Loại nước

Tỷ lệ

1

Nước bảo quản, sơ chế

15 – 25

2

Nước trong công đoạn xử lý nguyên liệu

35 – 45

3

Nước trong công đoạn vệ sinh thiết bị nhà xưởng

20 – 30

4

Nước kỹ thuật, làm mát thiết bị

1–5

5

Nước sinh hoạt

10 – 15

(Nguồn: Báo cáo hiện trạng Môi trường, Cục Thủy Sản, 2007)
Thành phần và tính chất đặc trưng nước thải sản xuất thủy sản được thống kê
theo bảng 1.6. Đầu ra nước thải sản xuất thủy sản được so sánh với QCVN
11:2008/BTMNT quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về nước thải công nghiệp chế biến
thủy sản.
Bảng 1.6. Giá trị các thông số ô nhiễm làm cơ sở tính toán giá trị tối đa cho phép.

STT Thông số
1

pH

2

C

Đơn vị

A

B

-

6–9

5,5 – 9

BOD5 ở 20 C

mg/l

30

50

3

COD

mg/l

50

80

4

Tổng chất rắn lơ lửng (TSS)

mg/l

50

100

5

Amoni (tính theo N)

mg/l

10

20

6

Tổng Nitơ

mg/l

30

60

7

Tổng dầu, mỡ động thực vật

mg/l

10

20

8

Clo dư

mg/l

1

2

9

Tổng Coliforms

MPN/100ml

3.000

5.000

0

(Nguồn: QCVN 11:2008/BTNMT)
Trong đó: