Nghiên cứu đặc điểm của gen defensin phân lập từ cây đậu xanh (vigna radiata l wilczek)

i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

DEFENSIN PHÂN LẬP
TỪ CÂY ĐẬU XANH (Vigna radiata L. Wilczek)

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2014


ii

LỜI CAM ĐOAN

.TS Chu Hoàng Mậu. Các số liệu và kết quả
trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào. Mọi trích dẫn trong luận văn đều ghi rõ nguồn gốc.

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2014
Tác giả luận văn

Phan Hải Cường


3

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã tận tình
hướng dẫn

để tôi c

hoàn thành b

Luận văn thạc sĩ Công

nghệ sinh học này.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô

C

,

Bộ môn Di truyền học & Sinh học hiện đại, K
nông n

, Trường Đại học Sư phạm -

–
đ

,

.

tôi trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô Khoa Khoa học sự sống, Trường Đại học
Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới toàn thể gia đình, cảm ơn bạn bè và đồng

nghiệp đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt thời gian qua.

Thái Nguyên, ngày 29 tháng 9 năm 2014
Tác giả luận văn

Phan Hải Cường


4

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
ƠN .................................................................................................. iii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iv
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ............................................
vi

MỞ

ĐẦU

.......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu của đề tài ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
..................................................................................... 3
............................................................................. 9
1.2.1.

................................................. 9
..................... 11

1.3. DEFE

......................................................... 16

Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 22
U .. 22
2.1.1. Vật liệu……...…………………………………………………….…..22
................................................................................... 22
2.1.3. Địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 23
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………………24


5

2.2.1. Phương pháp sinh học phân tử………………………………………..24


6

2.2.2. Phương pháp xác định trình tự nucleotide và xử lý số liệu ................. 31
Chương 3.

........................ 32
DEFENSIN 1 T

............. 32
cDNA

DEF 1 .............................................................................................................. 33
DEF 1 t

6................................ 33

cDNA DEF1 ........................................................ 35
3.3. PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG VỀ TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE VÀ
TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN CỦA GEN DEF 1………………...39
........................................................................... 44
....................................................................................................... 44
2.

........................................................................................................ 44
............................................................................ 45


7

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
ABA

Abscisic acid

bp

Cặp base

cs

Cộng sự
Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung được tổng hợp

cDNA

từ RNA thông tin nhờ enzym phiên mã ngược)

DEF1

Defensin 1

DEPC

diethyl pyrocarbonate

DNA

deoxyribosenucleic acid

dNTP

deoxynucleoside triphosphate

EDTA

Ethylen Diamin Tetraacetic Acid

E. coli

Escherichia coli

et al.
IPTG

Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb

Kilo base

kGy

Kilogray

mRNA

messenger ribonucleic acid

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RNA

Ribonucleic Acid

TAE

Tris acetat EDTA

VSV

Vi sinh vật

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galacto-pyranoside


vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

2.1.

............................... 22

Bảng 2.2. Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA .......................................... 25
Bảng 2.3.

1 .......................... 26

Bảng 2.4. Thành phần phản ứng nhân gen ..................................................... 26
Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector ..................................... 29
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng colony - PCR .............................................. 31
Bảng 3.1. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen DEF1 của giống đậu
xanh
VN6 và các trình tự có mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế
.................37
Bảng 3.2. Sự sai khác về trình tự amino acid suy diễn của protein DEF1 ở

giống đậu xanh VN6 và trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng gen
Quốc tế ... 38
3.3.
.................................... 39
3.4.
1 (%) ......40
Bảng 3.5.
1 (%) ........................... 41


viii

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis Linnes trưởng thành và tác hại
của chúng…………………………………………………………………………..10

2.1.

....................................................27

Hình 2.2.

................................................28

3.1.

cDNA DEF1

VN6, VN7, VN16 nghiên cứu
.................................................................33

Hình 3.2. Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm colony PCR...................................35
3.3.

cDNA DEF1
437639) .................................................36

3.4
xanh VN6 với trình tự mang mã số AY437639 trên ngân hàng gen Quốc tế
.......... 38
3.5.
1 ......................................................................................41
3.6
1.........................................................................42


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Cây đậu xanh [Vigna radiata (L.) Wilczek] là một loại cây công nghiệp
quan trọng của nền nông nghiệp châu Á, có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao.
Về mặt dinh dưỡng, hạt đậu xanh là nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 24%
– 28 %), chứa 1,3% lipid, glucid 60 % và các chất khoáng như Ca, Fe, Na...
Cùng nhiều loại vitamin tan trong nước như A, B1, B2, C... Hệ thống rễ cây
đậu xanh có những nốt sần ở rễ, trên nốt sần có chứa các vi khuẩn cố định
đạm giúp tăng giá trị dinh dưỡng cho đất.
Ở nước ta, cây đậu xanh là một trong những cây trồng truyền thống, có
khả năng cung cấp dinh dưỡng cao, dễ tiêu hoá, là cây phân xanh, cải tạo đất
trống xói mòn, chính vì vậy cây đậu xanh là một trong ba cây công nghiệp
ngắn ngày chính, sau lạc, đậu tương. Nước ta có nhiều thuận lợi để phát triển

sản xuất nông nghiệp song cũng có nhiều cơ hội tốt để sâu hại phát sinh phát
triển và phá hại nghiêm trọng các loại cây trồng ngoài đồng ruộng cũng như
trong kho bảo quản sau thu hoạch. Sau khi thu hoạch nếu không có sự bảo
quản hoặc bảo quản không tốt sẽ làm nông sản hao hụt rất lớn cả về số lượng
và chất lượng. Nguyên nhân dẫn đến sự hao hụt đó là sâu mọt hạt, chúng
không những làm thiệt hại về số lượng nông sản, làm giảm chất lượng, giảm
giá trị thương phẩm, gây mùi khó chịu, mầu sắc không bình thường mà còn là
nguyên nhân ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng.
Hiện nay trong các kho dự trữ đậu đỗ đang bị các loài sâu mọt gây hại
như: Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.), mọt đậu đỏ Bruchus
quadrimaculatus, mọt đậu nành Ancanthoscelides obtectus, mọt đậu tằm
Bruchus rufimanus. Đặc biệt là Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis (L.)
thuộc họ Bruchid, bộ Coleoptera, đây là loài dịch hại chủ yếu và nguy hiểm.
Chúng không những gây hại trong kho dự trữ mà chúng còn lan truyền và gây


2

hại cả ở ngoài đồng ruộng. Mọt đậu xanh gây hại trên các loại đậu: Đậu xanh,
đậu tằm, đậu đũa, đậu Hà Lan, đậu đen trong đó hại nặng nhất là đậu xanh. Sự
thiệt hại do chúng gây ra là rất lớn, làm ảnh hưởng đến nền kinh tế quốc dân,
do đó công tác phòng trừ sâu mọt đậu nói chung và mọt đậu xanh nói riêng
đang là một vấn đề cấp thiết cần được quan tâm nghiên cứu. Chính vì vậy,
việc chọn tạo các giống đậu xanh có năng suất cao, chất lượng tốt, có khả
năng chống chịu sâu bệnh, côn trùng đáp ứng nhu cầu thực tiễn là nhiệm vụ
cần thiết đối với ngành chọn giống đậu xanh.
Trong những năm gần đây, có một số công trình nghiên cứu về khả năng
kháng côn trùng, kháng nấm, kháng virus đã được tiến hành trên một số loại
cây trồng khác nhau. Các nghiên cứu đều thống nhất rằng đặc tính kháng mọt
hại hạt của cây trồng rất phức tạp và có liên quan đến gen defensin 1 (DEF1).

DEF1 ở thực vật ức chế sự phát triển của một loạt các loại nấm, một số loại
virus, một số loại côn trùng gây hại lương thực. Tuy nhiên, các nghiên cứu về
mối liên quan giữa đặc điểm sinh lí, hoá sinh và sinh học phân tử của gen
DEF1 với khả năng kháng mọt gây hại ở hạt đậu xanh còn ít được công bố.
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi lựa chọn và tiến hành nghiên
cứu đề tài “Nghiên cứu đặc điểm của gen defensin phân lập từ cây đậu
xanh (Vigna radiata L. Wilczek)”.
2. Mục tiêu của đề tài
Xác định được trình tự cDNA DEF1 phân lập từ cây đậu xanh
tạo nguyên liệu phục vụ thiết kế vector chuyển gen kháng mọt ở đậu xanh.
3. Nội dung nghiên cứu
3.1.

DEF1

;

3.2.
DEF1
VN6;
DEF1
;


3

Chương 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu xanh
Nguồn gốc: Đậu xanh (Vigna radiata L. Wilczek), có bộ NST 2n = 22,
là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo. Theo Vavilov, đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn
Độ, được phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới trong đó chủ yếu là ở các
nước Đông và Nam Á. Dạng dại của V. radiata cũng được tìm thấy ở
Madagasca, bên bờ Ấn Độ Dương, Đông Phi [14].
Phân loại khoa học của cây đậu xanh:
Giới (regnum): Plantae
Ngành (division): Magnolyophita
Lớp (class): Magnolyopsida
Bộ (order): Fabales
Họ (Familia): Fabaceae
Chi (genus): Vigna
Loài (species): V. radiata
Chi Vigna là một trong những chi lớn trong họ Đậu, bao gồm 7 chi phụ:
Vigna, Haydonia, Plactropic, Macrhyncha, Ceratotropic, Lasiospron,
Sigmaidotrotopis. Đậu xanh theo quan điểm lấy hạt của nhân dân ta bao gồm
các loài thuộc hai chi phụ là Ceratotropic, còn được gọi là nhóm đậu châu Á,
bao gồm 16 loài hoang dại và 5 loài trồng trọt là V. radiata, V. mungo, V.
aconitifolia, V. angularis, V. umbellata [2].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây đậu xanh
Cây đậu xanh thuộc loại cây thân thảo, là loại cây trồng cạn thu quả và
hạt bao gồm các bộ phận rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt.


4

Đặc điểm của rễ
Hệ rễ đậu xanh thuộc loại rễ cọc bao gồm rễ chính và các rễ phụ. Rễ
chính thường ăn sâu khoảng 20 - 30 cm, trong điều kiện thuận lợi có thể ăn

sâu tới 70 - 100 cm. Rễ phụ thường gồm 30 - 40 cái, dài khoảng 20 - 25 cm.
Trên rễ phụ có nhiều lông hút do biểu bì rễ biến đổi thành, có vai trò
tăng cường sức hút nước và các chất dinh dưỡng cho cây. Tuy nhiên, bộ rễ
của cây đậu xanh yếu hơn nhiều so với các cây đậu đỗ khác nên khả năng
chịu hạn và chịu úng của cây đậu xanh tương đối kém. Nếu bộ rễ phát triển
tốt thì bộ lá xanh nâu, cây ra nhiều hoa, quả, hạt mẩy. Ngược lại, bộ rễ phát
triển kém thì cây sẽ chóng tàn, các đợt ra hoa sau sẽ khó đậu quả hoặc quả sẽ
bị lép [10], [14]. Trên rễ cây họ Đậu có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn cố định
đạm Rhizobium. Các nốt sần trên rễ bắt đầu hình thành khi cây có 2 - 3 lá thật
và đạt tối đa khi cây ra hoa rộ. Trên mỗi cây có khoảng 10 - 20 nốt sần, tập
trung chủ yếu ở cổ rễ. Kích thước của các nốt sần không giống nhau, đường
kính dao động từ 4 - 5 mm, so với đậu tương và lạc thì nốt sần của cây đậu
xanh ít và nhỏ hơn. Trên các loại rễ thì lớp rễ đầu tiên có nhiều nốt sần, còn
các lớp rễ mọc ra từ cổ rễ về sau ít nốt sần hơn. Người ta nhận thấy rằng
những nốt sần hình thành sau khi cây ra hoa (nốt sần thứ cấp) hoạt động mạnh
hơn loại nốt sần sinh ra ở nửa đầu thời kỳ sinh trưởng. Trung bình mỗi vụ, 1
ha đậu xanh có thể bù lại cho đất tương ứng 85 - 108 kg nitơ làm cho đất tơi
xốp hơn [11], [12].
Đặc điểm của thân và cành
Thân cây đậu xanh thuộc loại thân thảo hình trụ, phân đốt, cao khoảng 40
- 70 cm mọc thẳng đứng, có khi hơi nghiêng. Thân đậu xanh nhỏ, tròn, có
màu xanh hoặc màu tím tùy thuộc vào kiểu gen, có một lớp lông màu nâu
sáng bao bọc. Trên thân chia 7 - 8 đốt, ở giữa hai đốt gọi là lóng. Độ dài của
các lóng thay đổi tùy theo vị trí trên cây và điều kiện khác. Các lóng dài
khoảng 8 - 10 cm, các lóng ngắn chỉ 3 - 4 cm. Từ các đốt mọc ra các cành,


5

trung bình có 1 - 5 cành. Các cành mọc ra từ các nách lá thứ 2, 3 phát triển

mạnh gọi là cành cấp I, trên mỗi cành này lại có trung bình 2 - 3 mắt, từ các
mắt này mọc ra các chùm hoa. Các đốt thứ 4, 5, 6 thường là mọc ra các chùm
hoa. Thời kỳ trước khi cây có 3 lá chét thì tốc độ tăng trưởng của thân chậm,
sau đó mới tăng nhanh dần đến khi ra hoa và hoa rộ, đạt chiều cao tối đa lúc
đã có quả chắc. Đường kính trung bình của thân từ 8 - 12 mm và tăng trưởng
tỷ lệ thuận với tốc độ tăng trưởng của chiều cao cây [14].
Đặc điểm của lá
Lá cây đậu xanh thuộc loại lá kép, có ba lá chét, mọc cách. Trên mỗi
thân chính có 7 - 8 lá thật, chúng xuất hiện sau khi xuất hiện lá mầm và lá
đơn. Lá thật hoàn chỉnh gồm có: lá kèm, cuống lá và phiến lá. Cả hai mặt trên
và dưới của lá đều có lông bao phủ. Diện tích của các lá tăng dần từ dưới lên,
các lá mọc ở giữa thân rồi lại giảm dần lên phía ngọn. Chỉ số diện tích lá (m

2

2

lá/m đất) có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất quang hợp và năng suất thu hoạch.
Số lượng lá, kích thước, hình dạng và chỉ số diện tích lá thay đổi tuỳ thuộc
vào giống, đất trồng và thời vụ [2], [14].
Đặc điểm của hoa
Hoa đậu xanh là loại hoa lưỡng tính, tự thụ phấn, mọc thành chùm to,
xếp xen kẽ nhau ở trên cuống. Các chùm hoa chỉ phát sinh ra từ các mắt thứ
ba ở trên thân, nhiều nhất là ở mắt thứ tư, còn ở các cành thì tất cả các mắt
đều có khả năng ra hoa. Thường sau khi cây mọc 18 - 20 ngày thì mầm hoa
hình thành, sau 35 - 40 ngày thì nở hoa. Trong một chùm hoa, từ khi hoa đầu
tiên nở đến hoa cuối cùng kéo dài 10 - 15 ngày. Mỗi chùm hoa dài từ 2 - 10
cm và có từ 10 - 125 hoa. Khi mới hình thành hoa có hình cánh bướm, màu
xanh tím, khi nở cánh hoa có màu vàng nhạt. Hoa đậu xanh thường nở rải rác,
các hoa ở thân nở trước, các hoa ở cành nở sau, chậm hơn, có khi còn chậm

hơn các chùm hoa cuối cùng ở ngọn cây [14]. Trên cùng một cành, các chùm
hoa cũng nở chênh lệch nhau có khi đến 10 - 15 ngày. Trong một chùm hoa
cũng vậy, từ khi hoa đầu tiên nở đến hoa cuối cùng có thể chênh lệch 10 - 15


6

ngày. Hoa nở được 24 giờ là tàn, sau khi nở hoa và thụ tinh khoảng 20 ngày là
quả chín. Số lượng hoa dao động rất lớn, từ 30 đến 280 hoa trên một cây.
Công thức hoa là: K5C5A10G1. Thời gian nở hoa chia thành 3 nhóm:
Nhóm ra hoa tập trung: Hoa nở kéo dài

16 ngày.

Nhóm ra hoa không tập trung: Hoa nở liên tiếp

30 ngày.

Nhóm ra hoa trung gian: Hoa nở từ 16 đến 30 ngày.
Đặc điểm của quả
Quả đậu xanh thuộc loại quả giáp, có dạng hình trụ, dạng tròn hoặc
dạng dẹt với đường kính 4 - 6 mm, dài khoảng 8 - 10 cm, có 2 gân nổi rõ dọc
hai bên quả, đa số là quả thẳng, có một số hơi cong, khi còn non quả có màu
xanh, khi chín vỏ quả có màu nâu vàng hoặc xám đen, đen... gặp nắng dễ bị
tách vỏ. Một cây trung bình có khoảng 20 - 30 quả, mỗi quả có từ 5 - 10 hạt.
Trên vỏ quả được bao phủ một lớp lông mịn. Mật độ lông phụ thuộc vào đặc
điểm của giống và khả năng chống chịu của cây. Những giống đậu xanh
chống chịu bệnh khảm vàng virus và sâu đục quả có mật độ lông dày, vào thời
kì chín hoàn toàn lông trên quả thường rụng đi hoặc tự tiêu biến [1], [2]. Các
quả của những lứa hoa đầu lại thường chín chậm hơn các quả ra lứa sau đó,

nhưng quả to và hạt mẩy hơn. Các quả của những đợt hoa ra sau thường ngắn,
ít hạt, hạt không mẩy, màu hạt cũng nhạt và bé hơn. Các quả sinh ra từ các
chùm hoa trên thân nhiều quả và quả to, dài hơn quả của các chùm hoa ở
cành. Quả đậu xanh chín rải rác, có khi kéo dài đến 20 ngày [11].
Đặc điểm của hạt
Hạt không nội nhũ, phôi cong, hai lá mầm dày, lớn và chứa nhiều chất
dinh dưỡng. Hạt gồm vỏ hạt, rốn hạt 2 lá mầm và mầm non. Mầm non là nơi
thu nhỏ của mầm rễ, 2 lá đơn, thân chính và lá kép đầu tiên.
Hạt có hình tròn, hình trụ, hình ô van, hình thoi... và có nhiều màu sắc
khác nhau như: màu xanh mốc, xanh bóng, xanh nâu, vàng mốc, vàng bóng
nằm ngăn cách nhau bằng những vách xốp của quả. Ruột hạt màu vàng, xanh,
xanh nhạt. Hình dạng hạt kết hợp với màu sắc và độ lớn của hạt là chỉ tiêu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

7

quan trọng để đánh giá chất lượng của hạt. Mỗi quả có từ 8 - 15 hạt. Hạt của
những quả trên thân thường to, mẩy hơn hạt của các quả ở cành. Hạt của các
quả lứa đầu cũng to và mẩy hơn các quả lứa sau. Số lượng hạt trung bình trong
một quả là một trong những yếu tố chủ yếu tạo thành năng suất của đậu xanh.
Trọng lượng hạt của mỗi cây biến động lớn từ 20 - 90 gam tùy giống, thời vụ
và chế độ canh tác. Trọng lượng 1000 hạt đậu xanh từ 50 đến 70 gam [1].
1.1.3. Đặc điểm hoá sinh của hạt đậu xanh
Hạt đậu xanh chứa 23 - 28% protein, 1,3% lipid, 56 - 60% glucid, 12%
nước, các vitamin B1, B2, C… các muối khoáng như Ca, Na, Fe, K… [14].
Đối với cây trồng thu hạt nói chung và cây đậu xanh nói riêng, đánh giá
chất lượng hạt được thực hiện bằng những phân tích thành phần hoá sinh
trong hạt như: hàm lượng protein, lipid, đường, thành phần amino acid, hàm

lượng và hoạt độ của các enzyme trong hạt ở giai đoạn nảy mầm... Trong đó,
hai thành phần quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sự nảy mầm của hạt và sự
phát triển của cây là protein và lipid.
Protein
Protein thực vật nói chung và protein đậu xanh nói riêng là nguồn cung
cấp đạm dễ tiêu hoá cho con người và một số vật nuôi. Trong hạt đậu xanh,
các phân tử protein chiếm khoảng 23 - 28% và được chia thành hai nhóm:
nhóm protein đơn giản và nhóm protein phức tạp. Trong nhóm protein đơn
giản chủ yếu là globulin, chiếm từ 60 - 80%, còn lại là albumin và một số loại
khác. Chức năng chính của protein dự trữ là cung cấp amino acid và nitơ cho
quá trình nảy mầm của hạt. Protein đậu xanh có chứa đầy đủ các tính chất
chung nhất của protein [14]. Ngoài ra, protein đậu xanh còn có một số tính
chất riêng biệt như khả năng hút nước và dầu tạo nhũ tương, khả năng hoà tan
trong nước. Đó là một trong những yếu tố quan trọng trong nghiên cứu và
công nghệ sản xuất các sản phẩm từ đậu xanh.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

8

Protein đậu xanh được đánh giá là có chất lượng tốt do có chứa đầy đủ
các amino acid không thay thế và hàm lượng của chúng tương đối trùng với
tiêu chuẩn dinh dưỡng dành cho trẻ em do tổ chức nông lương thế giới (FAO)
và tổ chức y tế thế giới (WHO) đưa ra [21].
Lipid
Lipid là những hợp chất hữu cơ có trong tế bào sống, không hoà tan
trong nước nhưng tan trong các dung môi hữu cơ không phân cực như ether,
petroleum ether, benzen... Lipid cũng là thành phần cấu tạo quan trọng của

màng sinh học, là nguồn dự trữ nhiên liệu cung cấp năng lượng cho cơ thể.
Lipid cùng với protein và polysaccarid cung cấp năng lượng cho sự nẩy mầm
của hạt. Tuy hàm lượng lipid trong hạt đậu xanh chiếm tỷ lệ thấp (trung bình
khoảng 1,3%) [14], nhưng đó lại là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá phẩm
chất và khả năng bảo quản hạt.
1.1.4. Tầm quan trọng của cây đậu xanh
Cây đậu xanh là loại cây trồng có giá trị kinh tế cao. Hạt đậu xanh là
nguồn thực phẩm giàu đạm (khoảng 23 - 28%), ngoài ra còn có lipid khoảng
1,3%, glucid 56 - 60,2% , nước 12% và các chất khoáng như Ca, Fe, Na, K,
P... cùng nhiều loại vitamin hoà tan trong nước như vitamin B1, B2, C...
Protein hạt đậu xanh chứa đầy đủ các amino acid không thay thế như leucine,
isoleucine, lysine, methionine, phenylalanine, valine... Hạt đậu xanh không
chỉ phù hợp với nhu cầu tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu
có giá trị. Hạt đậu xanh được dùng để chế biến ra nhiều loại thực phẩm ngon,
bổ, hấp dẫn như các loại bột dinh dưỡng, các loại bánh, chè, xôi đỗ và một số
đồ uống... Lá non và ngọn của cây đậu xanh có thể được dùng để làm rau,
muối dưa. Thân, lá xanh có thể dùng làm thức ăn cho vật nuôi [1], [2].
Ngoài ra đậu xanh còn có giá trị trong y học, vỏ hạt đậu xanh có vị
ngọt, mát, không độc nên có tác dụng giải nhiệt, giải bách độc [16].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

9

Trồng cây đậu xanh còn có tác dụng cải tạo và bồi dưỡng đất. Nhờ hệ
rễ đậu xanh có các nốt sần chứa các vi khuẩn cộng sinh thuộc chi Rhizobium
có khả năng cố định nitơ từ khí trời, cung cấp một phần đạm cho cây và để lại
lượng đạm đáng kể trong đất sau khi thu hoạch. Vì vậy, đất sau khi trồng đậu

xanh sẽ trở nên tơi xốp và giàu dinh dưỡng hơn [14].
1.2.
mọt gây hại hạt đậu xanh
Đậu xanh có thể bị nhiễm nấm, vi khuẩn, virus ở các giai đoạn sinh
trưởng khác nhau. Một số bệnh điển hình có thể gặp là: Bệnh đốm lá đậu xanh
(do nấm Sercostora); Bệnh đốm nâu hại lá đậu xanh (Phyllosticta phaseolina
Sacc); Bệnh lở cổ rễ đậu xanh (do nấm Rhizoctonia solani); Bệnh gỉ sắt hại
đậu tương, đậu xanh (Uromyces appendiculatuss); Bệnh khảm vàng hại đậu
xanh, đậu tương (Bean yellow mosaic virus); Bệnh khảm lá đậu xanh, đậu
tương (Soybean mosaic virus); Bệnh mọt hại đậu xanh (Callosobruchus
chinensis Linnes). Trong số các bệnh thường gặp ở đậu xanh thì bệnh mọt hại
đậu xanh do Callosobruchus chinensis Linnes gây ra thiệt hại tương đối lớn
[4].
Mọt đậu xanh có tên khoa học là Callosobruchus chinensis
Linnes thuộc họ Bruchidae, bộ Coleoptera. Mọt trưởng thành là con đực dài
khoảng 2,5 mm, rộng 1,64 mm còn mọt cái dài 3 mm, rộng 1,8 mm [51], [54].
Thân hình bầu dục ngắn, toàn thân màu đen nâu, màu nâu đỏ hay trà nâu, có
nhiều lông nhỏ màu đen nâu, màu vàng nâu hay màu trắng xám. Ðầu nhỏ,
quặp về phía trước. Râu đầu mọc ở ngay miệng mép lõm của mắt, râu đầu có
11 đốt, râu con cái hình răng cưa, râu con đực hình quạt lược. Gốc râu, thân
râu màu hồng nâu, và càng về phía đầu râu màu càng đậm. Ðầu màu nâu tối
đến màu đen, phủ đầy chấm lõm và lông nhung màu vàng kim thưa thớt,
mảnh khảnh. Mép sau ngực trước ở giữa có 2 khóm lông hình bầu dục dài
màu xám trắng. Sống giữa xuyên dọc ở gốc chân môi đến giữa mép sau mắt.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

10

Mắt cao và lồi, đoạn trước lõm vào rất sâu, hình chữ U, ngực trước có hình
chóp cụt bằng đầu, mặt lưng lồi tròn, mép sau lồi ra phía sau, ở phần chính
giữa của phần gốc có một đôi vật lồi dạng u hình trứng dài, phủ đầy lông
cứng màu trắng sữa dạng phiến. Chiều dài của cánh cứng hơi lớn hơn chiều
ngang, trên mỗi cánh cứng có 10 đường vân chạy thẳng, có nhiều lông màu
vàng nâu, màu đen nâu hay màu xám trắng. Gốc cánh cứng và đầu cánh cứng
đều màu đen nâu, giữa lưng có một con đường vân màu đen chạy ngang, phía
trước và phía sau đường vân đều có mọc nhiều lông nhỏ màu xám trắng. Chân
màu nâu vàng, đốt đùi chân sau có 2 đường sống ở phía bụng, có một răng ở
phía trước ngọn sống, răng ngoài tù, răng trong dài và thẳng, ngọn tròn [4].

Hình 1.1. Mọt đậu xanh Callosobruchus chinensis Linnes trưởng thành và tác hại
của chúng (Nguồn: FDACS-DPI, Mỹ [54])

Trứng do mọt đẻ ra dài 0,4 - 0,6 mm, hình bầu dục, một đầu bé, một
đầu to, màu vàng nhạt, không trong và không có ánh. Sâu non khi đã lớn dài
khoảng 3,5 mm, màu trắng sữa, hình cong như hình cánh cứng. Không có
những đường tuyến lưng, trên các đốt lưng ở giữa có 2 đường nhỏ chạy ngang
nổi lên, ở giữa 2 đường này tạo thành đường máng nhỏ. Sâu non tuổi một có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

11

chân rất nhỏ, tạm thời không phân đốt, cánh ngực trước có răng tù tròn.
Nhộng dài 3 - 3,5 mm, hình bầu dục to và mập, có nhiều lông nhỏ màu vàng
nhạt, đầu cong xuống, có vết cánh và chân rõ rệt [4].
Mỗi năm mọt thường sinh 4 - 5 lứa, nếu sống trong điều kiện thích hợp
mọt có thể sinh được 8 - 11 lứa. Sâu trưởng thành nở ra hơn 1 ngày chui ra từ

1 lỗ tròn. Con đực nở ra độ được hơn nửa giờ bắt đầu giao phối, nhưng nói
chung là sau 5 giờ rưỡi sau khi giao phối, con cái bắt đầu đẻ trứng. Mọt có thể
đẻ trứng trên quả ở ngoài đồng hay trên hạt ở trong kho, có thể đẻ liên tục 2 3 quả trên cùng 1 hạt. Thời kỳ trứng kéo dài 4 - 15 ngày, bình quân 6 ngày.
Thời kỳ sâu non kéo dài 13 - 34 ngày. Giai đoạn nhộng kéo dài 3 - 18 ngày.
Mọt có tính giả chết. Mùa đông trung bình con cái sống được 39 ngày, con
0

0

đực sống 36,4 ngày. Mùa hè mọt hay bay bổng ra ngoài kho. Ở 22 C - 29,5 C
0

0

và độ ẩm 88 - 100 % phát dục thích hợp nhất, dưới 10 C, và trên 37 C, mọt
không có khả năng đẻ trứng [4].
Thời gian thực hiện 1 vòng đời của mọt đậu xanh sai khác nhau rất
nhiều, phụ thuộc vào các yếu tố như độ nhiệt, độ ẩm và thức ăn, thời gian đó
từ 18 - 60 ngày. Trong điều kiện hoàn toàn thích hợp, một đời con cái có thể
đẻ được 80 - 100 trứng. Có những trường hợp điều kiện không thích hợp, mọt
có thực hiện một vòng đời có thể kéo dài đến 196 ngày. Thời gian sống của
mọt đậu xanh phụ thuộc rất chặt chẽ vào thức ăn. Mọt đậu xanh thuộc loại sâu
hại phá hại thời kỳ đầu, nó có thể làm hỏng toàn bộ hạt đậu [4].

Mọt gây hại đậu xanh có mặt khắp thế giới, các vùng trồng đậu xanh ở
nước ta đều có loại mọt này. Nó ăn hại các loại đậu xanh, đậu tằm, đậu đũa,
đậu Hà Lan, đậu tương, đậu biển, hạt sen,... Trong đó đậu xanh là bị thiệt hại
nặng nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

12

Phòng và trị mọt hại đậu xanh trên thế giới
Callosobruchus có thể phòng trừ bằng xử lý xông hơi methyl bromide
hoặc phosphine, mặc dù sự đăng ký sử dụng sản phẩm này ở nhiều khu vực
có thể bị hạn chế hoặc bị cấm. Việc bảo quản kín cũng có hiệu quả trong việc
hạn chế tác hại của loài mọt này.
Theo Philips (1994) cho rằng biện pháp hóa học có hiệu quả rất cao đối
với mọt đậu. Hiệu quả có thể đạt 90 – 99% với các loại thuốc hóa học thuộc
nhóm Lân hữu cơ và Pyrethroid [39].
Trộn hạt với dầu thực vật, tro hoặc lá có mùi thơm,... cũng có hiệu quả
trong việc hạn chế tác hại của C. chinensis. Sản phẩm chiết xuất từ cây có tác
dụng hạn chế tác hại của C. chinensis và các loài dịch hại thuộc họ Bruchidea
khác [33].
Theo Subramanyan và cộng sự (1985) [44], báo cáo về vai trò của
Bacillus thuringensis đối với phòng trừ các loại ngài thuộc bộ cánh vảy
(Lepidoptera) gây hại trong kho. Các nghiên cứu được tiến hành tại Mỹ với
các loài như: Plodia interpunctella,

Ephestia cautella, E. kuehniella và

Sitotroga cerealla. Kết quả cho thấy chỉ cần sử dụng chế phẩm này với liều
lượng > 10 mg/kg đã hạn chế được sự gây hại của chúng trong kho ngũ cốc
[6].
Theo Adler (2001) [24]; Sabah (2001) [42], thì thực vật làm thay đổi tập
tính của côn trùng thông qua việc tạo ra mùi vị hấp dẫn hay xua đuổi. Phòng
trừ côn trùng gây hại kho có thể sử dụng các chiết xuất của thực vật và các
hợp chất làm sạch hoặc tổng hợp theo 3 cách:

Dùng mùi vị xua đuổi để ngăn côn trùng ở khu vực xung quanh của
hàng hoá đóng gói hoặc xung quanh cửa kho lây nhiễm vào trong kho.
Dùng mùi vị hấp dẫn để phát hiện sớm côn trùng gây hại, giám sát kỹ
thuật phòng trừ hoặc bẫy bả.
Các hợp chất độc đối với côn trùng: Hiệu quả của các chiết xuất từ dầu
thực vật đối với côn trùng gây hại trong kho là rất tổng hợp. Các loài dịch hại
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

13

khác nhau và các pha phát dục khác nhau của cùng một loài dịch hại có phản
ứng không giống nhau đối với chiết xuất nhất định. Lượng chất tinh khiết
trong một chất chiết xuất từ thực vật có thể khác nhau phụ thuộc vào điều
kiện khí hậu, địa lý và giống cây.
Phòng và trị mọt hại đậu xanh ở Việt Nam
Theo Bùi Công Hiển và cộng sự (1989)
[7] , [8].
[3].
Để giảm thiệt hại do mọt gây ra cho đậu xanh, hiện nay có một số
phương pháp phòng trừ mọt như sau:
(i) Phòng trừ tự nhiên
Phòng trừ tự nhiên là việc làm giảm quần thể côn trùng bởi các yếu tố
tự nhiên (không do con người), đặc biệt là nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp đến
sự sinh trưởng, phát triển và gây hại của côn trùng (như số lứa trong năm, số
trứng đẻ hoặc mức độ gây hại). Ẩm độ và nhiệt độ tác động đến cường độ trao
đổi chất của hàng hoá, bảo quản nên có sự ảnh hưởng trực tiếp đến côn trùng
gây hại.
Ngoài ra yếu tố địa hình ảnh hưởng trực tiếp đến phân bố cây ký chủ và

côn trùng gây hại, địa hình có sự tác động đến yếu tố khí hậu (ảnh hưởng đến
lượng mưa, nhiệt độ, độ ẩm tương đối của không khí bên trong và ngoài
kho...Một yếu tố nữa đó là kẻ thù tự nhiên: có rất nhiều loài sinh vật là kẻ thù
tự nhiên của côn trùng gây hại trong kho như côn trùng ký sinh và bắt mồi, vi
sinh vật gây bệnh, tuyến trùng ký sinh... Lợi dụng những yếu tố trên, con
người đã sử dụng nhiều cách khác nhau để lựa chọn khu vực xây dựng kho
tàng bảo quản (hướng nhà, loại hình kho, cấu trúc kho, biện pháp phòng trừ
và thời gian phòng trừ,....để bảo vệ và khuyến khích sự phát triển một cách

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

/>

hợp lý kẻ thù tự nhiên của côn trùng gây hại nhằm giữ cho quần thể loài côn
trùng gây hại luôn ở dưới ngưỡng gây hại kinh tế .
(ii) Phòng trừ bằng biện pháp sinh học
Biện pháp sinh học là biện pháp làm giảm các quần thể côn trùng gây
hại bằng việc sử dụng các sinh vật sống hay các chế phẩm sinh học do con
người tạo ra. Tổ chức đấu tranh sinh học quốc tế (IOBC, 1971), định nghĩa:
Biện pháp sinh học là sử dụng những sinh vật sống hay các sản phẩm hoạt
động sống của chúng nhằm ngăn ngừa hoặc làm giảm bớt tác hại do các sinh
vật gây ra [13].
Biện pháp sinh học bao gồm các khía cạnh sinh học khác nhau của hệ
thống sống ảnh hưởng tới quá trình sinh sản, tập tính và chất lượng thức ăn
của côn trùng gây hại. Biện pháp sinh học cũng bao gồm việc sử dụng các
chất độc có nguồn gốc tự nhiên, các chất xua đuổi hay dẫn dụ, những chất có
thể sử dụng trong hệ thống phòng trừ tổng hợp côn trùng gây hại trong kho.
Biện pháp sinh học tạo ra cơ hội để đấu tranh có hiệu quả chống lại một loài
dịch hại riêng biệt mà không gây ảnh hưởng đến các loài dịch hại khác hoặc
các loài côn trùng có ích.

(iii) Phương pháp phòng trừ bằng cơ học và vật lý
Hiện nay có nhiều quan niệm khác nhau về phòng trừ cơ học và vật lý.
Có tác giả cho rằng phòng trừ vật lý là bao gồm cả phòng trừ cơ học, có tác
giả không nhất trí quan điểm này mà tách phòng trừ cơ học thành biện pháp
riêng.
Phòng trừ vật lý là việc làm thay đổi môi trường trong kho bằng các
yếu tố vật lý làm cho bất lợi đối với sự phát triển của côn trùng gây hại hoặc
không cho chúng tiếp cận với hàng hoá bảo quản.
Theo Marcos Kogan (1998) [35], đưa ra trên 300 công trình nghiên cứu
của các tác giả trên thế giới về phương pháp phòng trừ vật lý và chia ra thành


các nhóm yếu tố như: Quản lý vệ sinh; Sinh thái học; Chiếu xạ; Cơ học, rào
chắn vật lý và sử dụng khí trơ.
Sử dụng năng lượng điện tử ở mức nhẹ để phòng trừ mọt, thí nghiệm
này được tiến hành trong phòng thí nghiệm đối với mọt ở các các giai đoạn
khác nhau (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 và 18 ngày tuổi) xử lý ở mức 170 kv
trong vòng 20 phút kết quả cho thấy sự nhạy cảm đối với bức xạ điện tử giảm
khi tuổi của mọt tăng, giai đoạn trứng dễ nhiễm bức xạ điện tử cao nhưng
ngược lại giai đoạn 18 ngày tuổi thì mọt trưởng thành vẫn hoàn toàn phát triển
được do vậy để đạt được tỷ lệ chết ở giai đoạn trưởng thành 80 % phải xử lý ở
mức năng lượng cao hơn (200 kv tức = 10 kGy). Còn đối với trưởng thành
sống sót còn lại thì ảnh hưởng tới sức đẻ trứng, thời gian sống và những con
này không có khả năng hoàn thành chu kỳ sống. Đây là một biện pháp rất
hiệu quả và an toàn vì nó không ảnh hưởng tới khả năng nẩy mầm của hạt
đậu [49], [50].
(iv) Phương pháp bức xạ ion
Nhiều công trình nghiên cứu xác định liều gây chết và gây bất thụ ở
côn trùng gây hại trong kho cho biết liều chiếu 0,5 kGy đã đủ gây bất thụ cho
các loài ngài thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) và ở mức 0,25 kGy đã gây bất

thụ cho loài côn trùng cánh cứng (Coleoptera) [6].
(v) Phòng chống bằng thuốc thảo mộc và hoá học.
Thuốc thảo mộc dùng để trừ các loài côn trùng gây hại ở ngoài đồng
cũng như trong kho tàng đã được con người biết đến ứng dụng từ rất lâu.
Goblob và Webley (1980), đã tổng kết nghiên cứu các kết quả nghiên
cứu, thử nghiệm và áp dụng thuốc thảo mộc ở nhiều nơi trên thế giới với các
loài thực vật khác nhau, trong đó việc tạo ra các chế phẩm thuốc thảo mộc từ
cây Neem Ấn Độ (Azadirachta indica), cỏ mạt (Acorus calamus), cây ruốc cá
(Derris spp.), cây thuốc lá, thuốc lào [50].


Hiệu quả của các chiết xuất từ dầu thực vật đối với côn trùng gây hại
trong kho là rất tổng hợp. Các loài dịch hại khác nhau và các pha phát dục
khác nhau của cùng một loài dịch hại có phản ứng không giống nhau đối với
chiết xuất nhất định. Lượng chất tinh khiết trong một chất chiết xuất từ thực
vật có thể khác nhau phụ thuộc vào điều kiện khí hậu, địa lý và giống cây
[42].
Hoá chất mang tích chất thực vật (phytochemicals) được biết đến phổ
biến nhất là azadirachtin, chất này được dùng riêng ở dạng thuốc thảo mộc
hoặc ở dạng hỗn hợp như một thành phần của lá hoặc dạng chiết xuất (dạng
dung dịch hoặc dạng bột) của cây xoan Ấn độ (neem)(Azadirachta indica).
Azadirachtin có tác dụng hạn chế sự đẻ trứng và tiêu diệt côn trùng (sâu non
và trưởng thành). Dầu của cây xoan Ấn độ (Neem) và chất chiết xuất khác
hoặc dẫn xuất từ cây neem có thể sử dụng trực tiếp trên hạt [49].
Đánh giá dầu thực vật trừ sâu hại bắt đầu được sử dụng từ những năm
đầu của thế kỷ 19. Năm 1927, một công trình nghiên cứu tiến hành tại Mỹ đã
ghi nhận hạt dầu bông, hạt lanh, hạt thầu dầu có hiệu quả trừ sâu [50].
Hiện nay bệnh do vi sinh vật, côn trùng gây hại chưa có thuốc đặc trị.
Tuy nhiên, các biện pháp nêu trên không mang lại hiệu quả cao trong việc
phòng trừ đối với bệnh mà lại tốn nhiều thời gian, công sức. Vì thế, hướng

giải quyết hiệu quả để chống lại bệnh do mọt gây ra hiện nay là tạo ra những
giống cây trồng nói chung và cây đậu xanh chuyển gen nói riêng có khả năng
kháng loại mọt gây hại này.
1.3. DEFENSIN

GEN DEFENSIN

Carvalho và cs (2011) đã nghiên cứu hoạt tính sinh học của defensins
và ứng dụng trong công nghệ sinh học. Defensins thực vật là peptide cation
phổ biến ở thực vật và thuộc về một siêu họ lớn của các peptide kháng khuẩn
được tìm thấy trong các sinh vật gọi chung là defensins. Cấu trúc chính của
peptide gồm 45-54 amino acid. Trong cấu trúc ba chiều, defensins nhỏ và
hình cầu, bao gồm một chuỗi xoắn α và phiến gấp nếp β. Cấu trúc ba chiều