Thiết lập quy trình phát hiện một số đột biến trên gen FLT3, NPM1 và CEBPA gây bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở bệnh nhân việt nam

ĐẠI H Ọ C Q U Ố C G IA HÀ NỘI

>
1—ỉ

OHO&Hl
-— /

BÁO CÁO TÒNG KẾT
K Ẻ T QUẢ T H Ụ C H IỆN ĐẺ TÀI KH&CN
CÁ P ĐẠI H Ọ C Q U Ố C GIA

Tên đề lùi:
TH1ẺT LẶP QUY TRĨ M ỉ PH ÁT HĨỆN MỘT SỐ ĐỘT BIÈN
TRÊN GEN FLT3, NPM1 VÀ CEBPA GÂY BỆNH UNG TH Ư
BẠCH CẢU CẢP DÒNG TỦ Y Ở BỆNH NHẢN VIỆT NAM

Mã

Số:

KLEPT. 12.02

Chủ trì đề tái: TS. Phạm Bảo Yêu
Phòng Ihỉ nghiệm trọng đicm Công nghộ Fnzym và Prolein
ỉ rường Dại học Khoa học Tự nhicn

H à N ội, 2014

&

PHẦN I. THÔNG TIN CHUNG
1.1. Tên đề tài/dự án:
Thiết lập quy trình phát hiện một số đột biến trên gen FLT3, NPM1 và CEBPA gây
bệnh ung thư bạch cầu cấp dòng tủy ở bệnh nhân Việt Nam.
1.2. M ã số: KLEPT.12.02
1.3. Danh sách chủ nhiệm , thành viên tham gia thực hiện đề tài/dự án

TT

Chức danh, học vị, họ và tên Đon vị công tác

Chức danh thực hiện
đề tài/dự án

1
2
3
4

TS. Phạm Bảo Yên
GS. TS. Phan Tuân Nghĩa
TS. Nguyên Thị Hông Loan
TS. Lê Xuân Hải

Chủ nhiệm
Ưy viên
Uy viên
Uy viên

ĐHKHTN
Trường ĐHKHTN
Trường ĐHKHTN
Viện Huyết học và
Truyền máu Trung ương

1.4. Đơn vị chủ trì: Đại học Khoa học T ự Nhiên
1.5. Thòi gian thực hiện:
1.5.1 Theo họp đồng:
từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 8 năm 2014
1.5.2 Gia hạn (nếu có):
đến tháng 2 năm 2015
1.5.3 Thực hiện thực tể: từ tháng 8 năm 2012 đến tháng 11 năm 2014
1.6. Những thay đổi so vói thuyết m inh ban đầu (nếu có):
(Ve mục tiêu, nội dung, phương pháp, kết quả nghiên cứu và to chức thực hiện; Nguyên
nhắn; Y kiên của Cơ quan quản lý)
Thay đổi thời gian nghiên cứu:
Thời gian theo hợp đồng: Từ tháng 8 năm 2012 đến hết tháng 8 năm 2014
Thời gian thay đổi: Từ tháng 8 năm 2012 đến hết tháng 2 năm 2015
1.7. Tổng kinh phí được phê duyệt của đề tài: 500 triệu đồng.


PHẦN II. TỌNG QUAN KÉT QUẢ NGHIÊN c ử u
1. Đ ặt vấn đề
Các tế bào máu là thành phần thiết yếu của hệ tuần hoàn, trong đó hồng cầu
(ethryocyte) chịu trách nhiệm đảm bảo cho cơ thể có đầy đủ oxy để tạo ra năng lượng, còn
bạch câu (leukocyte) đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm
nhập cua các yểu tố gây bệnh. Ưng thư máu, cụ thể là ung thư bạch cầu,xuất hiện ở cả đối
tượng người lớn và trẻ em, là một rối loạn huyết học xuất phát từ những đột biến ở tế bào
gốc máu, những tế bào đầu tiên trong quá trình sản sinh bạch cầu, gây ảnh hưởng nghiêm

trọng đến khả năng miễn dịch của người mắc bệnh thông qua việc tạo ra những bạch cầu bất
thường. Tùy theo tính chất cấp (acute) hay mạn (chronic) và phân loại tế bào dòng tủy
(myeloid) hay dòng lympho mà bệnh được chia làm 4 loại phụ, trong đó, ung thư bạch cầu
cấp tính dòng tủy (Acute Myeloid Leukemia - AML) là dạng đặc biệt nguy hiểm do tốc độ
tiến triển nhanh và và rối loạn diễn ra ở tất cả các loại bạch cầu, trừ bạch cầu lympho [Giles,
2002; Gunz, 1990].
Thống kê cho thấy, mỗi năm, số bệnh nhân ung thư máu nhập Viện Huyết học
Truyền máu Trung ương đều gia tăng, và trong tổng số bệnh nhân có tới 2/3 mẳc ung thư
bạch cầu cấp dòng tủy [Trần Thị Minh Hương, 2002].Bệnh nhân nếu không được chẩn
đoán, điều trị kịp thời và hiệu quả sẽ sớm tử vong do các biến chứng nhiễm trùng, chảy
máu, thiếu máu. Kỹ thuật karyotyping kiểm tra kiểu hình nhân tế bào là một phương pháp
xác định tổn thương NST ở bệnh nhân AML được sử dụng phổ biến ở Việt Nam cũng như
trên thế giới [Khalidi, 1998]. Tuy nhiên, bên cạnh các tổn thương ở cấp độ NST có thể phát
hiện được áp dụngxét nghiệm này, xấp xỉ một nửa số bệnh nhân AML mang các đột biến
gen và có kiểu hình nhân bình thường (normal karyotype, AML-NK) sẽ bị bỏ qua [Bene,
1999]. Đáng lưu ý là, theo các nghiên cứu trên thế giới, loại gen, sổ lượng và kiểu đột biến
là những yểu tố quan trọng ảnh hưởng đến tiên lượng bệnh, từ đó bác sỹ có thể đưa ra phác
đồ điều trị họp lý, làm tăng khả năng sống sót của người bệnh [Naoe, 1999]. Chính vì vậy,
việc phát triểncác quy trình phù hợp để phát hiện những đột biển gen thường gặpcó ý nghĩa
tiên lượng bệnh là một nhu cầu cấp thiết, đặc biệt là ở Việt Nam, nơi các bệnh viện chưa sử
dụng nhiều kỹ thuật sinh học phân tử.Trong số các gen liên quan đến AML, đột biến trên ba
gen Nucleophosmin 1 (NPM1), Fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3), và CAAT enhancer
binding protein alpha (CEBPA) có tần suất xuất hiện cao nhất, chiếm tỉ lệ lần lượt là 4045%, 20-25%, và 10-15% số ca mắc bệnh[Ammatuna, 2005; Calvo, 2009; Dốhner, 2005;
Yamamoto, 2001; Lin, 2005].
Gen NPM1 nằm ở nhiễm sắc thể số 5, bao gồm 12 exon, mã hóa cho một
phosphoprotein tham gia vào quá trình lắp ráp và vận chuyển các tiểu phần ribosome qua
màng nhân [Lim, 2006]. Có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng đột biến gen NPM1 có đáp ứng tốt
với hóa trị liệu [Dõhner, 2005]. Hai loại đột biến phổ biến trên genNPM l được công bố là
đột biến chèn thêm bốn nucleotide tại vị trí 959, và đột biến kép gồm mất trình tự GGAGG
tại vị trí 965-969 và thêm chín nucleotide [Falini, 2005]. Cả hai loại đột biển này đều làm

tăng chiều dài gen NPM1 thêm bốn nucleotide, đẫn đến việc mất một hoặc hai phân tử
trytophan cần thiết cho quá trình vận chuyển vào nhân của protein [Falini, 2005]. Đe phát
hiện đột biến tăng thêm 4 nucleotide trên gen NPM1, chúng tôi triển khai sử dụng phương
pháp khuếch đại đoạn gen (PCR) kết họp với điện di phát hiện đa hình cấu trúc mạch đơn
(PCR/SSCP). Phương pháp này dựa vào sự di chuyển theo cấu trúc không gian của mạch
ADN sau khi biến tính, và lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1989 để phát hiện những sai
khác một vài nucleotide trên gen [Orita, 1989].
Gen FLT3 nằm ở nhiễm sắc thể 13 (13q 12.2), bao gồm 24 exon, mã hóa cho protein
FLT3, thuộc thụ thể tyrosine kinase (receptor tyrosine kinase-RTK) lớp III [Agnes F, 1994].


Hai kiểu đột biến thường gặp nhất trên sen FLT3 là lặp đoạn ITD (intemal tandem
duplicaíion) và đột biến điểm TKD (tyrosine kinase domain). Đột biến FLT3-ITD có kích
thước từ 3-400 bp ở exon 14-15 mã hóa cho vùng cận màng của FLT3 [Meshinchi, 2008].
Đột biến FLT3-TKD thường xảy ra ở vị trí D835 và 1836 tương đồng với đột biến điểm
được tìm thấy ởcác RTK khác như đột biến D816 ở C-KIT và C969 ở gen FMS [Yamamoto,
2001; Kim, 2010]. Các phương pháp thường được sử dụng để phát hiện đột biến FLT3 là
PCR kết họp với điện di và PCR-RFLP. Sự xuất hiện đột biến trên gen FLT3 làm tăng khả
năng tự bảo vệ củatế bào ung thư chúng, gây ra những phản ứng kháng thuốc, làm giảm
hiệu quả của việc điều trị [Gilliland, 2002; Bagrintseva, 2005 ; Kiyoi, 1998]. Vì vậy, những
hiểu biết về các loại đột biến trên gen FLT3 sẽ giúp xây dựng phác đồ điều trị phù hợp và
tìm ra thuốc ức chế thụ thể FLT3 cho bệnh AML [Bagrintseva, 2005].
CEBPA là một protein thuộc họ Leucine Zipper, là một trong những yếu tố phiên mã
tham gia quá trình biệt hóa của bạch cầu hạt, bạch cầu đơn nhân, tế bào tạo mỡ, tế bào gan
[Darling, 1998]. Protein này được mã hóa bởi gen CEBPA không có intron, bao gồm 2783
b pv à nằm ở NST số 19 [Hendricks-Taylor, 1992]. Hai loại đột biến gen CEBPA thường gặp
nhất là đột biến mất đoạn ở đầu 5’ và đột biến làm tăng kích thước ở đầu 3’. Những trình tự
ngắn được chèn thêm hoặc lặp lại ở vùng bZIP thuộc đầu c làm mất khả năng bám vào
ADN của protein; trong khi, đột biến thay đổi khung đọc mở ở đầu N làm mã kết thúc xuất
hiện sớm hơn, thay vì tạo ra phân tử nguyên vẹn (42 kDa), những protein không hoàn thiện

được hình thành (với kích thước xấp xỉ 30 kDa) [Fuchs, 2010]. Những nghiên cứu gần đây
cho thấy có một số kĩ thuật khác nhau nhằm phát hiện đột biến CEBPA/bZIP như điện di và
giải trình tự trực tiếp [Fuster, 2012].
Các nghiên cứu về bệnh ở trong nước dựa trên các phương pháp chẩn đoán ung thư
máu truyền thống như kiểm tra lâm sàng, quan sát hình thái, hóa tể bào hay xác định dấu ấn
miễn dịch không thể chỉ ra những thay đổi ở cấp độ phân tử. Đây là một hạn chế đối với
việc tiên lượng và xây dựng phác đồ điều trị. Bệnh nhân AML mang các đột biển khác nhau
sẽ phản ứng khác nhau với các phương pháp trị liệu (phóng xạ hay hóa chất, loại thuốc sử
dụng). Tóm lại, đối với cả ba gen nêu trên, ở Việt Nam, việc pháttriển và chuẩn hóa các quy
trình phát hiệnvẫn chưa được đầu tư đúng mức để đưa ra ứng dụng rộng rãi ở các cơ sở y tế.
2. M ục tiêụ
Thiết lập được quy trình phát hiện chính xác một số đột biến trên ba gen: FLT3,
NPM1, CEBPAhay gặp trongung thư bạch cầu cấp dòng tủy cho bệnh nhân tại Việt Nam.
Bước đầu so sánh tỉ lệ cũng như tần suất xuất hiện của các đột biến gen FLT3, NPMỈ,
CEBPA ở bệnh nhân Việt Nam so với trên thế giới, từ đó giúp ích cho việc tiên lượng và áp
dụngphác đồ điều trị phù họp sau khi chuyến giao quy trình đến cơ sở y tế.
Chuyển giao được quỵ trình phát hiện một số đột biến trên ba gen: FLT3, NPM1,
CEBPA cho một cơ sở y tế để có thể bước đầu ứng dụng trong tiên lượngbệnh ung thư bạch
cầu cấp dòng tủy tại Việt Nam.
3. Phương pháp nghiên cứu
Tinh sạch A D N từ mẫu máu
156 mẫu máu của người bệnh AML được thu thập từ Viện Huyết học - Truyền máu
Trung ương.Các mẫu này được chia nhỏ vào các ống eppendorf, mỗi ống chứa 200 í-il mẫu
máu tổng số. Hồng cầu được loại bỏ bằng dung dịch ly giải RBC (Gồm 155 mM NH 4C1, 10
mM KHCO 3, 0,1 mM EDTA, pH 7,3). Sau đó, ADN được tinh sạch sử dụng bộ kít QIAamp
DNA blood mini (Qiagen). Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được xác định bằng cách điện
di Irên gel agarose 1% kết hợp với đo quang phổ hấp thụ ở bước sóng A 2603


Khuếch đại vùng gen chứa các đột biến nghiên cứu

Phản ứng khuếch đại đoạn gen NPMlcỏ kích thước 197 bp đối với mẫu thường và 201
bp
đối
với
mẫu
đột
biến
sử
dụng
cặp
mồi
đặc
hiệu
NPM1 Jbrw ard(5’ ACCACATTTCTTTTTTTTTTTTTCCAGGCT 3') và NPM1 reverse
(5,_CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA_3’) (AITbiotech). Phản ứng trong tổng
thể tích 25 Ịil gồm có 20 ng ADN tổng số; 10 pmol mỗi mồi; 0,2 mM mỗi loại dNTP; 1 unit
enzyme Dream Taq ADN polymerase (Thermo Scientiíic) và 2,5 |al đệm Dream Taq 10X.
Chu trinh nhiệt của phản ứng khuếch đại như sau: 94°c trong 4 phút; 35 chu kỳ gồm 94°c
trong 30 giây, 67 ° c trong 30 giây, 72°c trong 30 giây; và 72°c trong 4 giây.
Đe phát hiện đột biến FLT3-ITD, cặp mồi đặc hiệu được thiết kế cho phản ứng PCR
nhằm khuếch đại đoạn gen có kích thước 329 bp với trình tự như sau: 11F: 5’GCAATTTAGGTATGAAAGCCAGC-3’; 12R: 5’-CTTTCAGCATTTTGACGGCAACC3’ [Yamamoto, 2001]. Phản ứng chuỗi polymerase PCR được thực hiện với mỗi phản ứng
(25 1^1) gồm 40 - 50 ng ADN tổng số; 10 pmol mỗi mồi; 0,2 mM mồi loại dNTP; 1 unit
Dream Taq ADN polymerase, 2,5 |il đệm Dream Taq 10X. Chu trình của phản ứng PCR
như sau: 94°c trong 4 phút; 35 chu kì của 94°c trong 45 giây, 56°c trong 45 giây, 72°c
trong 1 phút; và 72°c trong 5 phút.
Trình tự mồi được sử dụng để nhân đoạn ADN 114 bp thuộc vùng TKD từ exon 17
của gen FTL3
là:
FLT3Jorw ard (17F:
S^CCGCCAGGAACGTGCTTG-S’)

vầFLT3_reverse (17R: 5’-GCAGCCTCACATTGCCCC-3’) [Yamamoto, 2001] (IDT).
Phản ứng chuỗi polymerase PCR được thực hiện với mỗi phản ứng (25 |il) gồm 40 - 50 ng
ADN tổng số; 2 pmol mỗi mồi; 0,2 mM mỗi loại dNTP; 1 unit Dream Taq ADN
polymerase, 2,5 ^1 đệm Dream Taq 10X. Chu trình của phản ứng PCR như sau: 94°c trong
4 phút: 30 chu kì của 9 4 °c trong 30 giây, 58°c trong 30 giây, 72°c trong 30 giây; và 72°c
trong 10 phút.
Nhằm phát hiện đột biến CEBPA-bZIP, một đoạn ADN 143 bp thuộc vùng này được
khuếch đại sử dụng cặp mồi CEBPA-forward:. 5'-TCGGTGGACAAGÃACAGC-S’; và
CEBPÁ-reverse: 5’-AGGCGGTCATT GTCAC TGG-3’. Các thành phần của phản ứng
PCR (25 jnl) bao gồm 2,5 nl đệm Dream Taq 10X; 0,2 mM cho mỗi loại dNTP; 10 pmol
mỗi mồi; 1 unit Dream Taq ADN polymerase (Thermo Scientific); 5% DMSO và 20 ng
ADN. Hỗn hợp phản ứng PCR được trộn đều và thực hiện theo chu trình nhiệt như sau:
94°c ứong 5 phút; 35 chu kì của 94 °c trong 1 phút, 58 ° c trong 45 giây, 72°c trong 1
phút; cuối cùng 72°c trong 15 phút.
Điện di và phân tích ph ổ băng
Điện di agarose (A G E)
Sản phẩm PCR được chạy điện di trên gel agarose 2% trong đệm TAE lx (40mM
Tris-base, 20mM acetic acid, lm M EDTA), hiệu điện thế 100V trong thời gian 40 phút đối
với hệ thống SUB-CELL GT, và hiệu điện thế 90V trong khoảng 30 phút đối với hệ thống
MINI-SƯB-CELL GT (Bio-rad), sử dụng marker 100 bp (Fermentas). Sau khi điện di xong,
bản ge! được nhuộm với dung dịch ethidium bromide 0,5 ng/ml trong 5-10 phút và soi dưới
đèn u v của hộ thống GelDoc (Bio-rađ).
Điện di polyacrylam ide (PAGE)
Nhàm phân tách nhũng đoạn ADN có chênh lệch về kích thước nhỏ hơn, sản phẩm
PCR điợc điện di trên gel polyacrylamide 12,5 % trong đệm TBE IX ( 89mM Tris base,
2mM EDTA, 89mM axit boric), hiệu điện thế 120V trong thời gian 60 phút, sử dụng marker
Lowrange (Permentas). Bản gel sau khi chạy xong được nhuộm bằng ethidium bromide 0,5
^g/ml và soi dưới đèn u v của hệ thống GelDoc (Bio-rad).
4

Đa hình cấu trú c m ạch đon (SSCP)
Một lượna 5 Ịil sản phẩm PCR được trộn với đệm íbrmamide có 9,3 % íbrmamide, 5
%0 bromophenol blue, 5 %0 xylene cyanol, 2 mM EDTA, 1 mM NaOII and 12,5 % glycerol.
Đun nóng hỗn hợp trên ở 95°c trong 10 phút để biến tính ADN, rồi để trên đá ngay trong 10
phút. Sau khi xử lý, mẫu PCR được điện di phân tích trên gel 10% polyacrylamide (29:1) có
chứa 5% glycerol với MOV trong 45 phút. Sau khi điện di, bản gel được nhuộm trong dung
dịch 0,5 ng/ml ethidium bromide và quan sát dưới ƯV trong hệ thống GelDoc (Bio-Rad).
Điện di trên gel U ltrap h o r
Một lượng 10 |ul sản phẩm PCR trộn 2 ^1 đệm mẫu 6 X rồi tra trên gel 3% Ưltraphor
agarose. Điện di trong đệm TBE ở nhiệt độ khoảng 20-30°c với 400V trong 45 phút. Bản
gel được nhuộm trong dung dịch 0,5 Ịig/ml ethidium bromide và quan sát dưới ƯV trong hệ
thống GelDoc (Bio-Rad).
Fragm ent A nalyzer
Một lượng 2 |il sản phẩm PCR được phân tích trong hệ thống điện di mao quản của
Advanced Analytical Fragment Analyzer. Ket quả được phân tích bằng phần mềm ProSize
2 .0 và xuất ra hình ảnh sổ của điện di.
Phần mềm Im ageJ
Sử dụng phần mềm ImageJ để đo độ sáng của băng điện di, từ đó suy ra nồng độ của
mẫu nghiên cứu, hoặc tỉ lệ phần trăm giữa các băng điện di.

Tạo ra đột biến FLT3-TKD D835 và CEBPA/bZIP-E sử dụng bộ kít Phusion SiteDirected Mutagenesis (Thermo Scienti/ìc)
Đoạn gen FLT3-TKD 114 bp và đoạn gen CEBPA-bZIP 143 bp bình thường được
nhân dòng vào plasmid pGEMT easy. Nhằm khuếch đại toàn bộ plasmid trên, hai cặp mồi
phosphoryl hóa được thiêt kê chứa trình tự đột biên mong muôn, gôm: cặp môi nhân đoạn
gen CEBPA là: CEBPA1407 forward (5’-CAACGTGGAGAA GACGCAGCAỌ-3’ có chèn
AAG) và CEBPA1407 reverse (5 ’-CGCTGCTTGGCCTTGTCG-3’); và cặp mồi nhân đoạn
gen
FLT3-TKD
là:

FLT3-1407forward
(5 ’TGGCTCGATATATCATGAGTGATTCCAAC-3’)
vầFLT3-1407reverse
(5 ’ATCCAAAGTCACATATCTTCACCACTTTCC-3 ).Plasmid dạng mạch thẳng được nối
lại và biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5a, sau đó,tế bào được nuôi trên môi
trườngLB-ampicillin và chọn ra những khuẩn lạc mang plasmid đột biến bằng PCR và/hoặc
cắt enzyme giới hạn.
PCR kết hợp với đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn (PCR-RFLP)
Phản ứng PCR được thực hiện nhằm nhân đoạn gen FLT3-TKD 114 bp như mô tả ở
trên. Sau đó, 6-8 ng sản phẩm PCR được trộn với 0,1 |il (20u/|il) enzyme giới hạn £coR V
(New England Biolabs), 1
đệm và nước cho đủ 10 |il, đem ủ ở 37°c trong 30 phút, bất
hoạt ở 80°c trong 20 phút. Ket quả quan sát được nhờ điện di trên gel polyacrylamide 12,5

Nhân dòng và đọc trình tự đoạn gen mang đột biến
Băng ADN mang đột biến đưực cắt ra khỏi gel agarose và được tinh sạch băng bộ
kitWizard® s v Gel and PCR Clean-Ưp System (Promega). ADN tinh sạch được gắn vector
pGEM T easy bàng enzyme T4 ligase. Vector tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào khả biến
E. cớ//DH5a theo phương pháp sốc nhiệt. Te bào khả biến này được nuôi cấy trên đĩa thạch
môi trường LB (Luria-Bertani Broth) được trải 100 |ig/ml ampicillin, 20 mg/ml X-Gal and
20 mg/mỉ isopropyl thio-beta-D-galactoside (IPTG). Qua một đêm nuôi ở 37°c, khuẩn lạc
trăng từ đĩa được chọn và kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp bàng PCR với cặp mồi
5


pGEM-T easy forward (5’-GCTCiCAAGGCGATTAAGTTG-3*) và pGEM-T easy reverse
(5’-GTTGTGTGGAATTGTCACG-3’). Những khuẩn lạc có chứa vector tái tổ hợp được
nuôi irong 1 ml môi trường LB, và tách plasmid bàng kít QIAprep Spin Miniprep (Qiagen).
Plasmid đã tinh sạch được gửi đi đọc trình tự ở Macrogen (Hàn Quốc).
4. Tổng kết kết quả nghiên cứu

4.1. Tinh sạch và định lưọug ADN tổng số
ADN tổng số tinh sạch từ các mẫu máu của người thường và bệnh nhân AML sử
dụng bộ kit Qiagen. Ket quả điện di của ADN tổng số trên gel agarose 1% cho một băng
duy nhất, không có vệt do ADN bị đứt gẫy. Ket quả đo quang phổ chothấy nồng độ ADN
tổng số vào khoảng 20-400 ng/nl, và chỉ số A 26o/A28o là 1.8 đến 2 , chứng tỏ mẫu ADN tinh
sạch không bị lẫn ARN hay protein. Ket luận, độ tinh sạch và lượng ADN tổng số là đủ để
sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR.
4.2. Gen NPM1
Thiết lập quy trìn h phát hiện đ ộ t biến NPM1
Đột biến tăng bổn nucleotide trên gen N P M Ỉ được phát hiện theo quy trìnhgồmhai
bước chính: 1-Khuếch đại đoạn gen NPM1 với cặp mồi đặc hiệu, 2-Phân tích phổ băng của
sản phẩm PCR được điện di theo phương pháp SSCP hoặctrên gel Ultraphor agarose.Chi
tiết từng bước được trình bày dưới đây.
Khuếch đại đoạn gen NPM1 với cặp mồi đặc hiệu
Theo tính toán lý thuyết, phản ứng khuếch đại từ ADN tổng sổ với cặp mồi đặc hiệu
nhân lên một đoạn gen có kích thước 197 bp đối với mẫu thường và 201 bp đối với mẫu đột
biên. Theo hình 1, kết quả điện di của sản phẩm PCR từ ADN tổng số của người thường cho
một băng duy nhất ở vị trí khoảng 200 bp so với thang chuẩn. Kích thước này phù hợp với
tính toán lý thuyết. Như vậy, thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng PCR nhân lên
thành công đoạn ADN nghiên cứu [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014; Nguyễn Văn Huynh,
2013].
M

1

2

200

100

H ình 1. Ảnh điện di sản phẩm P C R trên gel agarose 2 %
M: thang chua lĩ A D N 100 bp; 1: đoi chứng âm, 2: mâu người thường.
Phân tích sản phẩm PCR theo phương pháp SSC P trên gelpoỉỵacrylamide 10%
Thành phần đệm Formamide và quy trình xử lý sản phẩm PCR theo phương pháp
SSCP được tối ưu để thu được băng điện di sắc nét trên bản gel polyacrylamide 10%. Dựa
vào sự khác biệt của phổ băng ADN, có thể phân biệt các mẫu thành hai nhóm.Trong đó,
một nhóm có xuất hiện thêm băng ADN ở vị trí khoảng 400 bp (Hình 2, các mẫu số 5, 6 ,
8), và băng này không xuất hiện ở nhóm mẫu còn lại (Hình 2, các mẫu 2, 3, 4 và 9). Nhóm
mẫu đầu tiên có khả năng là những mẫu mang đột biến tăng bốn nucleotide củagen NPM I
[Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014; Nguyễn Văn Huynh, 2013].

6


M

1

2

3

4

5

6

7

8 9

Hình 2: Sản phẩm PC R đư ọc phân tích theo SSCP trê n polyacrylam ide 10 %
M: thang chnân A D N lowrange; 1: đôi chứng âm; 5; 6; 8: nghi ngờ có đột biên NPM1; 2;
3; 4; 7; 9: mẫu không mang đột biến.

Phân tích sản phẩm PCR trên gel Ultraphor agarose
Điện di trên gel Ultraphor agarose3 % cho thấy sản phẩm PCR từ một số mẫu cho
một băng ADN duy nhất tại vị trí 200 bp của thang chuẩn (Hình 3, mẫu số 2), trong đó, sản
phẩm PCR từ một số mẫu khác cho hai băng ADN rất gần nhau. Dựa vào tính toán theo
thang chuẩn ADN lowrange, băng ADN ở phía trên có kích thước lớn hơn vài nucleotide so
với băng ADN phía dưới, và là băng ADN có khả năng mang đột biến. Do đó, phương pháp
điện di trên Ultraphor agarose 3 % có khả năng phân tách băng ADN thường và đột biến
trong sản phẩm PCR [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].
M I

2 3

4

5

6 7

8 9 10 11 12

ỈO O l

L..-ÊÍ ếmằ im rn ^lỆ

H ình 3. Điện di sản p hẩm P C R trê n gel gel agarose U ltra p h o r 3 %
2: mâu người thường; những mâu còn lại - nghi ngờ mang đột biến.

Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR/SSCP
Hỗn hợp trộn plasmid thường và plasmid chứa đột biến N P M lch tn 4 nucleotide
TCTG từ mẫu đã sàng lọcvới các tỷ lệ khác nhau được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR.
Ket quả SSCP của sản phẩm PCR từ hỗn hợp plasmid cho thấy rằng, phương pháp này có
thể phát hiện được mẫu có 10%đột biến trở lên (Hình 4, mẫu từ 10% đến 90%). Trong khi
đó, mẫu có mang 100% đột biến cho kết quả âm tính do không có mặt đồng thời mạch ADN
thường và ADN đột biến; tuy nhiên, mức độ đột biến 100 % chưa tìm thấy ở
genNPMl [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].
M

(-)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

M

H ình 4. Kiểm tr a độ nhạy của phưotig p h áp PC R /SSC P.
M: Thang chuẩn AND; (-): Đổi chứng âm; 0-100: % đột biến NPM1 trong hon hợp.

7


Các mẫu ADN tổng số của bệnh nhân MELAS, bệnh nhân hội chứng Leigh, bệnh
nhân hội chứng rối loạn cơ và bệnh nhân đột biến FLT3-ITD được dùng làm khuôn cho
PCR và phân tích theo phưcmg pháp SSCP để xác định độ đặc hiệu của phương pháp. Ket
quà cho thấy chỉ mẫu mang đột biến NPM1 cho kết quả dương tính, còn những mẫu khác
đều cho kết quả âm tính (Hình 5). Như vậy, phương pháp PCR/SSCP là đặc hiệu để xác
định đột biến NPM1 từ các bệnh nhân AML[Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].
M

É

H ình 5: Xác định độ đặc hiệu của phương p h áp PC R -SS C P.
1: Đối chứng âm. 2, 3: Mầu có đột biến NPM1; 4, 5: Mau đột biến FLT3-ITD;
6: Hội chứng Leigh; 7: Hội chứng rối loạn cơ; 8, 9: Hội chứng M ELAS
Sàng lọc đột biến NPM1 trên bệnh nhân AM L và phân tích trìn h tự đ ộ t biến

Sàng lọc từ 156 bệnh nhân AML theo phương pháp PCR/SSCP, chúng tôixác định
được 50 mẫu có khả năng mang đột biến tăng 4 nucleotide trên gen N P M Ỉ, chiếm
32,l%[Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014].Mau người thường và 11 mẫu nghi ngờ là đột biến
NPM1 được chọn để nhân dòng và giải trình tự. Ket quả so sánh với trình tự tham chiếu
trênGenBank (số NM 002520) cho thấy mẫu ADN từ người thường cho trình tự có mức
tương đồng 100%, còn trình tự của mẫu nghi ngờ xuất hiện thêm bổn nucleotide thuộc các
kiểu hình đã được công bố trước đây. Theo đó, những đột biến chúng tôi tìm thấy thuộc loại
A (chèn 4 nucleotide TCTG), B (chèn 4 nucleotide CATG), D (chèn 4 nucleotide CCTG) và
J (chèn 4 nucleotide TATG) (Hình 6 ). Trong số 11 mẫuđã giải trình tự, 7 mẫu (63,6%) trong
số 11 mẫu thuộc đột biến loại A, 1 mẫu (9,1%) thuộc loại B, 2 mẫu (18,2%) thuộc loại D, và
1 mẫu (9,1%) thuộc loại J [Nguyễn Thị Hồng Loan, 2014]. Kết quả này thống nhất với các
nghiên cứu khác cho thấy loại A là đột biến thường gặp nhất, và loại J là ít gặp nhất
[Boonthimat, 2008]. Tất cả những đột biến này tạo ra protein dài hơn hơn protein thường
(Bảng 1).
Speáes/Abbrv

Ị

1 G ene_bank_NC_000005.9

Ị

2 Nor

I
r ig a g g

3 Type_A
4 Type_B
5. Type„D

3 Type_J

So sánh trình tự với trình tự tham chiếu của gen NPM1 (dòng đầu tiên), mẫu người thường
(dòng Nor), mau đột biến (loại A, B, D and J).
______Bảng 1. T rình tự am ỉno acid của mẫu thư ờng và m ẫu đột biến______
Mau thường
L 287WQWRKSL*
Sô lượng (tông 11
________________________________________________ mẫu)_________________
Mau đột biến loại A
L 287CLAVEEVSLRK*
7
Mau đột biến loại B
L 287CMAVEEVSLRK* 1
Mầu đột biến loại D
L 287CLAVEEVSLRK*
2_____________________
8


Mầu đột biến loại J —
----------------------------------—

L 287CMAVEEVSLRK*
—
—
-1
L->S7 là Leucine ở vị trí 287 của protein NPM 1. * là mã kêt thúc (stop codon)
4.3. Gen FLT3
4.3.1. Đột biến FLT3-ITD

Thiết lập quy trìn h phát hiện đột biến FLT3-ITD
Nhằm phát hiện đột biến FLT3-ITD, một quy trình được thiết lập gồm các bước sau:
(1) Khuếch đại đoạn gen FLT3 với cặp mồi đặc hiệu; (2) Điện di sản phẩm PCR trên gel
agarose 2% và phân tích phổ băng. Sau khi thiết kế, quy trình được thử nghiệm với 36 mẫu
bệnh đầu tiên và 3 mẫu đối chứng không mang bệnh [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014].
M

( 1)

( 2)

19

20

21

22

23

24

25

26

28

27

19

30

31

32

400 bp
300 bp

H ình 7: Điện di sản phẩm PC R m ẫu 19-32
M: marker 100 bp; (-1): sản phẩm PCR từ A D N của người không m ang bệnh AML;
(-2): đoi chứng âm của phản ứng PCR; 19-32: sản phẩm PCR từ A D N bệnh nhân AML.
Kết quả điện di 36 mẫu bệnh cho thấy tất cả các mẫu đều xuất hiện một băng điện di
sắc nét nằm giữa băng 300 bp và 400 bp của marker trên gel agarose 2% phù hợp với tính
toấn lý thuyết (329 bp) giống nhir mẫu đối chững không mang bệnh. Riêng mẫu 20 còn xuất
hiện thêm 1 băng sáng rõ có kích thước lớn hơn 329 bp có khả năng là băng mang đột biến
FLT3-ITD (Hình 7). Kết quả nhân dòng băng duy nhất của mẫu 19 và băng có kích thước
lớn hơn của mẫu 20 sau khi cắt khỏi bản gel, tinh sạch, và giải trình tự ADN tái tổ họp cho
thấy băng ở mẫu 19 có trình tự giống với gen FLT3 bình thường, còn băng có kích thước
lớn hơn ở mẫu 20 có chứa thêm một đoạn lặp 33 bp. Điều đó khẳng định mẫu 20 là mẫu có
chứa đột biến lặp đoạn FLT3-ITD và quy trình phát hiện đột biến gen FLT3-ITD thiết lập
trên đã thành công [Vũ Quang Lâm, 2013; Đỗ THỊ Thanh Trung, 2014].
M

+

l

2

3

4

5

6

7

8

9

400 bp
300 bp

H ình 8: Tối ưu độ nhạy của phản ứng PC R
(-): Đổi chứng âm của PCR; M: marker 100 bp; (+): đổi chứng dương là mau 2 0 plasm id
với nồng độ khuôn ban đầu; 1-9: mâu 2 0 plasm id với các nồng độ khuôn pha loãng từ 10
đến 10'10
Đáng chú ý là khi kích thước đoạn lặp rất nhỏ khiến băng đột biến nằm sát với băng
thường trên bản gel agarose có thể dẫn đến kết luận âm tính giả (mẫu không chứa đột biến).
9


Trong trường hợp này, nếu nồng độ khuôn quá cao, sản phấm PCR tạo ra nhiều, lúc điện di

sẽ cho băng sáng đậm. càns gây khó khăn cho việc phân tích phổ băng. Neược lại, đối với
những bệnh nhân mang đột biến FLT3-ITD có mức đột biến thấp (lượna, tế bào bạch cầu
mang gen đột biến ít hơn nhiều so với lượng tế bào bạch cầu mang gen không đột biến), nếu
sử dụng nồna, độ khuôn quá thấp có thể không quan sát thấy sàn phẩm khuếch đại của đoạn
gen mang đột biến. Đây cũne là một nguyên nhân dẫn tới kết quả xét nghiệm âm tính giả
[Meshinchi, 2008]. Nhằm tối ưu độ nhạy của quy trình, mẫu plasmid chứa đoạn gen thường
có nồng độ 400 ng/|il đã được pha loãng từ 1CT2 đến 10‘10 lần và dùng làm khuôn cho phản
ứng PCR sử dụng Dream Taq polymerase. Ket quả điện di trên gel agarose 2 % cho thấy khi
pha loãng đến 10' 7 lần (tương đương với lượng ADN tổng số là 0,33 ng), lượng sản phẩm
PCR tạo ra vẫn quan sát được băng rõ nét (Hình 8 ) [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014].
Sàng lọc và phân tích đặc điểm đột biến FLT3-ITDỞ 156 m ẫu bệnh nhân AM L Việt
Nam
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với 156 mẫu, sản phẩm PCR từ 13 mẫu (8,4%) khi
điện di thấy xuất hiện thêm băng cao hơn băng 329 bp gốc (Hình 9). Trong đó, có 5 mẫu đã
được chọn lọc để nhân dòng và đọc trình tự. Kết quả đọc trình tự cho thấy đoạn gen lặp lại
được chèn ngay cạnh đoạn gen gốc và ở các vị trí khác nhau tùy từng mẫu. Như vậy,
phương pháp PCR cùng với điện di trên gel agarose là phương pháp thực nghiệm có thể
phát hiện đột biến gen FLT3-ITD ờ bệnh nhân AML. Sử dụng quy trình trên quy mô phòng
thí nghiệm đối với 156 mẫu cho tỉ lệ xuất hiện đột biến FLT3-ITD ở bệnh nhân AML Việt
Nam là 9,0%[ĐỖ Thị Thanh Trung, 2014].
ỉ

M

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

400 bp
300 bp

H ình 9: Điện di m ột số m ẫu có khả năng chứa đột biến FLT3-ITD
M: marker 100 bp; 1: đổi chứng âm; 6: mẫu người thường; 2: đổi chứng dương; 3-5, 7-12:
các mẫu có khả năng chứa đột biến FLT3-ITD
Điện di trên gel agarose không những cho phép phát hiện được đột biến FLT3-ITD
mà còn cho thấy một số đặc điểm có vai trò quan trọng trong tiên lượng. Đầu tiên, mức đột
biến có thể được xác định dựa trên so sánh mật độ sáng tính toán với phần mềm ImageJ. 13
mẫui xuất hiện phổ băng đột biến có mức đột biến dao động trong khoảng từ 25% đến 70%.
Thứ hai, dựa trênđộ di động trên bản gel agarose của các băng marker 100 bp và của các
mẫu có thể ước tính đoạn lặp có độ dài từ 20-90 bp. Kết quả đọc trình tự khẳng định một số
đột Ibiến có kích thước từ 24-63 bp gần đúng với kích thước ước tính trên (Bảng 2) [Đỗ Thị
Thanh Trung, 2014]. số liệu này phù hợp với công bố về kích thước đột biến trong một

nghiên cứu khác trên thế giới, cho thấy đoạn lặp có độ dàitừ 15-174 bp là phổ biến nhất,
chiếm 52% các trường họp [Meshinchi, 2008].

10


Bảng 2: Kích th u ó c và m ức đột biến của các đột biến FLT3-ITD

STT

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

STT
bệnh
nhân
20
L 53
54

57
60
62
69
71
88
112
124
146
160

Kích thước đoan
chèn
(ước tính, bp)
35
76
56; 80
53
65
63
25; 59
39
61; 114
62
36; 55; 70
48; 76
40; 80; 96

Kích thước đoan
chèn

(giải trình tự, bp)
33

51
63
24
60

45

Sô lượng
đoạn chèn
(quan sát)
1
1
2
1
1
1
2
1
2
1
3
2
3

Mức độ đột biên
tôna sô
(ước tính, %)

30.3
17.4
11.4
4.6
19.0
14.3
51.1
13.2
63.7
22.1
42.7
33.8
32.4

Đặc điểm phân tử của đột biến FLT3-ITD cũng được nghiên cứu bằng máy Fragment
Analyzer (AATI) (Hình 10). Ket quả cho thấy, chúng ta có thể quan sát được số lượng và độ
dài đoạn chèn trong một mẫu dựa trên hình ảnh số, theo đó, số lượng đoạn chèn từ 1-3; kích
thước đoạn chèn nằm trong khoảng25-96 bp, và mức đột biến có thể từ 4,6% đến 63,7%.
Như vậy, phương pháp đọc bằng máy Fragment Analyzer chính xác hơn (chỉ sai lệch 1-3
nucleotide), nhưng phân tích bằng ImageJ trên gel agarose là phương pháp đơn giản, dễ
thực hiện để phát hiện và nghiên cứu đặc điểm của các đột biến làm thay đổi kích thước của
gen FLT3.
10536900C;coẹ
ÌX
iữo

8000
7000«

600C

sooc
400C-

t=t*
<-N

2397-

r

-\

w

H ình 10. Kêt quả phân tích băng máy F ragm ent A nalyzer của mâu 69

Đồ thị bên trái với những đỉnh nhọn cho thấy nồng độ của các đoạn AD N và kích thước
tương ứng của những đoạn đó. Bên phải là một hình ảnh gel số hỏa, trong đó N là băng
bình thường, * và ** chỉ các băng đột biến.

11


Trình tự nucleotiđe của đột biến FLT3-ITD được chuyển thành trình tự amino acid,
cho thấy đột biến FLT3-ITD không làm thay đổi khung đọc mở. Chỉ có một mẫu chứa đoạn
lặp ở intron, trong khi tất cả những mẫu còn lại đều chứa doạn lặp ở exon 14. Đoạn lặp ở
các vùng khác nhau từ vị trí 597 đến 608 của trình tự protein FLT3 (Bảng 3). Đoạn lặp
thường là đoạn nucleotide ở ngay trone, sen nhưne ở một số mẫu có 1-2 nucleotide neoại lai
nằm ở phía vùng xa nhất ở đầu 5’ của đoạn lặp [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014].
Bảng 3: T rìn h tự đột biên FL" r3-ITD

s T rình tự đoạn lặp
Nucle- Vi
T Axit nucleic (5’-3’)
Kích
otide
trí
T Amỉno axỉt (N-C)
thuóc la
1 CTG ATTT c AG AG A ATAT GA ATAT GATCTC A 51 bp 1
608
AATGGGAGTTTCCAAGAGAAA
17 aâ
TDFRE YE YDLK WEFPRE
603
2 TTCTCCTCAGATAATGAGTACTTCTACGTTG 63 bp 2
ATTTC AG AG AATAT G A ATATG AT CTC A A AT G 21 aa
G
FSSDNEYFYVDFREYEYDLKW
27 bp 0
3 CT ACGTT G ATTTC AG AG AATAT GA
597
DYVDFREYE
9 aa
4 GTCAGAGAATATGAATATGATCTCAAATG
60 bp 1
intro
GGAGTTTCCAAGAGAAAATTTAGAGTTTG
n
GT
601

5 T GAGTACTT CT ACGTTG ATTT c AG AG A AT A 45 bp 0
TGAATATGATCCCAA
15 aa
NE YFYVDFRE YE YDP
•

4.3.2. Đột biến FLT3-TKD
T hiết lập và tối U'U quy trìn h p h á t hiện độ t biến FLT3-TKD
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thành công đối với việc thiết lập và tối ưu hóa
quy trình phát hiên đột biến FLT3-TKD D835 thông qua 3 bước: (1) Khuếch đại đoạn gen
FLT3 với cặp mồi đặc hiệu; (2) c ắ t sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn EcoK V ; (3) Điện
di sản phẩm cắt trên gel polyacrylamide 12% và phân tích. Chi tiết các bước được trình bày
cụ thể sau đây.

Tối ưu phản ứng khuếch đại đoạn 114 bp của gen FLT3
Nhằm tối ưu phản ứng PCR, chúng tôi thay đổi các điều kiện bao gồm nồng độ
khuôn, nồng độ mồi, nồng độ Taq polymerase, và chu trình nhiệt. Ket quả cho thấy sử dụng
điều kiện mô tả trong phần Phương pháp nghiên cứucho phép nhân lên băng đặc hiệu nằm
trong khoảng giữa hai băng 100 bp và 150 bp của thang chuấn ADN trên bản gel điện di
(Hình 1 la). Sau đó, băng này được tinh sạch, nhân dòng và giải trình tự rồi so sánh với trình
tự gen FLT3 đã được công bố, cho thấy, băng có kích thước 114 bp như dự kiến vàtrình tự
hoàn toàn khớp với gen gốc. Như vậy, có thể kết luận ràng chu trình nhiệt và thành phần
phản ứng PCR là phù hợp để nhân lên đoạn gen mong muốn và mẫu đã đọc trình tự được
coi là mẫu đối chứng thường cho các thí nghiệm sau.

12


>1

{.)

Sj

0.5' 1’

8U

—70
z

GO

,7 5 ,8

5,8

■ p

114
68
46

Ị« >
i 20
ĩ 10
Ò'

1,5

0

1S

20

25

Thòi gianùmáu

Hình 11: Tối ưu thòi gian ủ mẫu
a: Anh điện di sản phâm căt sản phâm PCR của gen FLT3 với các thời gian ủ khác
nhau từ 30 giây đến 30 phút; (-) mau gốc; b: % băng 114 bp còn lại sau khi cắt.

Tối ưu phản úng cắt eniynte giới hạn
Nhằm so sánh và phát hiện mẫu đột biến bởi sự thay đổi phổ băng điện di sản phẩm
PCR sau khi cắtenzyme giới hạn, đầu tiên phải xác định đầu vào của phản ứng cắt sao cho
hiệu suất đạt 100% đối với mẫu không đột biến. Vì vậy, cần phải tính toán một cách chính
xác đế tối ưu lượng sản phẩm PCR, lượng enzyme sử dụng, cũng như thời gian phản ứng.
Trong nghiên cứu này, nếu đoạn gen FLT3-TKD 114 bp không chứa đột biến thì sẽ bị cắt
thành hai đoạn 68 bp và 46 bp; ngược lại, nếu đoạn gen FLT3-TKD chứa đột biến sẽ không
bị cắt. Nồng độ của sản phẩm PCR 114 bp và sản phẩm Cắt68 bp, 46 bp được tính toán bằng
phần mềm ImageJ.
Thời gian tối ưu được xác định bằng cách chia hỗn hợpphản ứng cắt thành những thể
tích bằng nhau và dừng phản ứngở các thời điểm khác nhau từ 5 phút đến 30 phút. Ket quả
cho thấy sau 10 phút 90% sản phẩm PCR đã bị cắt, và sau 30 phút lượng này lên tới 98,5%
(Hình 1la; 1lb). Trong một thí nghiệm khác, khi kéo dài thời giản phản ứng tới 3 giờ, bản
gel điện di cho thấy vẫn còn một lượng nhỏ (1-2%) băng 114 bp không cắt hết. Vì vậy, thời
gian 30 phút được chọn là thời gian tối ưu để phản ứng hoàn toàn cho quy trình phát hiện

đột biến FLT3-TKD.
Sau khi tối ưu, phản ứng cắt đoạn 114 bp được thực hiện với 6-8 ng sản phẩm PCR,
0,1 |il enzyme £coRV (20 u/|il) và ủ ở 37°c ở 30 phút.

Xác địnhtỉnh chính xác và độ nhạy của quy trình
Nhằm khẳng định tính chính xác của quy trình FLT3-TKD, một đột biến nhân tạo ở
đoạn ADN 114 bp được tạo ra sử dụng bộ kit Phusion Mutagenesis, thay Nucleotide đầu
tiên trong trình tự nhận biết của enzyme EcoRV từ G thành T. Đây là đột biến thay thế phổ
biến nhất thuộc vùng TKD [Yamamoto, 2001]. Đột biến này được sử dụng làm mẫu đối
chứng dương cho quy trình nghiên cứu.
Độ nhạy của phương pháp được xác định bằng cách sử dụng hỗn hợp plasmid mang
đoạn gen chứa đột biến nhân tạo mô tả ở trên và plasmid mang đoạn gen thường làm khuôn
cho phản ứng PCR. Hai loại plasmid này được trộn theo các tỉ lệ khác nhau từ 0%-100%
của plasmid đột biến. Ket quả cho thấy quy trình này có thể phát hiện được mẫu chứa 5%
ADN đột biến. Bẻn cạnh đó, kết quả cũng chỉ ra rằng nếu sản phẩm cắt còn lại ít nhất 25%
của băng 114bp thì mẫu đó có thể chứa đột biến FLT3-TKD (Hình 12).
13


Hình 12: Xác định độ nhạy của quy trìn h vói phưoìig pháp cắt enzyme giói hạn
a: Anh điện di sản phẩm cắt sản phẩm PCR của gen FLT3 với tỉ lệ đột biến khác
nhau (giếng 2-9); M: Thang chuẩn ADN Lowrange (giếng 1); b: % băng 114 bp còn
lại sau khi căt.
Sàng lọc và phân tích trình tự đột biến FLT3-TKD ỏ’ mẫu bệnh nhân AM L Việt Nam
Bước đầu sàng lọc trên 156 mẫu bệnh nhân AML Việt Nam sử dụng quy trình đã thiết
lập xác định được 5 mẫu (3,2%) nghi ngờmangđột biến (các mẫu số 9, 40, 76, 83, và 105,
Hình 13). Phần trăm của sản phấm PCR không cất trong phản ứng cắt enzyme giới hạn của
các mẫu này được tính toán bằng phần mềm ImageJ và trình bày chi tiết trong bảng 4. Việc
phân tích trình tự các mẫu trên cho thấy tất cả đều chứa đột biến thay thế nucleotide trong
bộ ba mã hóa D835. Nucleotide đầu tiên của codon này, từ G đều bị thay thế thành T, dẫn

đến thay đổi acid Aspartic thành Tyrosine (D835Y) [Đỗ Thị Thanh Trung, 2014].
M 74 7i l i

77 71 19 177 mt írt

M «1 tnt »0 83 8Í

87 «8 91 19i

Hình 13: Điện di sản phẩm cắt cùa 156 m ẫu sử dụng quy trìn h đã được thiết lập
M: thang chuẩn ADN; mt: mẫu đột biến; wt: mẫu không đột biến:
74-177, 80-192: sản phẩm cắt của băng 114 bp.
Bảng 4: % cua sản phẩm PC R 114 bp cỏn ại
% của sản phẩm PC R 114 bp
M ầu
còn lại
45,61%
9
48,32%
40
79,60%
76
79,16%
83
71,23%
105


4.4. Gen CEBPA
Thiết lập quy trình p h át hiện đột biến CEBPA

Quy trình phát hiện đột biến CEBPA/bZIP được thực hiện theo các bước như sau: (1)
Khuếch đại đoạn gcn CEBPA/bZIP với cặp mồi đặc hiệu; (2) phân tích sản phẩm PCR theo
phương pháp SSCP. Chi tiết các bước được trình bày cụ thế sau đây.
K/tuếch đại đoạn gen CEBPA/bZIP
Sản phẩm của phản ứng PCR được điện đi trên gel polyacrylamide 15% và cho 1
băng ADN sắc nét tại vị trí khoảng 100-150 bp của thana, chuẩn ADN. Kích thước băng
ADN này phù họp với kích thước dự kiến là 143 bp của đoạn gen khuếch đại dựa trên tính
toán lý thuyết (Hình 14). Như vậy, phản ứng khuếch đại đã nhân lên thành công vùng
CEBPA/bZIP cần nghiên cứu[Bùi Hường Quỳnh, 2014].
(-)

M

1

2

150 J

100 J

H ình 14: Điện di sản phẩm P C R trê n gel polyacrylam ide 15%.
Khuôn cho phản ứng khuếch đại là A D N tổng so của bệnh nhân AM L (giếng so 1 và 2),
hoặc nước (đổi chứng âm) M: thang chuẩn A D N

Tạo đột biến CEBPA/bZIP nhân tạo và thiết lập quy trình ph á t hiện đột biến bằng
phương pháp SSCP
Băng cách thiết kế chèn trình tự AAG vào mồi xuôi CEBPAỈ407ịương ứng với vị trí
1530-1531 trên gen CEBPA, chúng tôi tạo ra đột biến lặp đoạn ba nucleotide nhân tạothuộc
vùng CEBPA/bZIP, dẫn tới sự xuất hiện thêm một nhóm Lysine tại vị trí 313-314 của

protein CEBPA. Quá trình tạo đột biến dựa vào plasmid pGEM-T đã mang đoạn gen 143 bp
CEBPA/bZIP bìnhthường. Phản ứng khuếch đại với cặp mồi tạo đột biến nhân lên một đoạn
ADN thẳng có kích thước 3161 bp, gồm toàn bộ khung vector 3015 bp. đoạn CEBPA/bZỈP
143 bp, và 3 nucleotide chèn thêm vào trong trình tự mồi xuôi. Ở hình 15a, giếng số 1 có
một băng ADN có kích thước khoảng 3 kb, phù hợp với tính toán lý thuyết. Đoạn ADN
thẳng này được nối tròn lại bằng T4 ligase và plasmid tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E.
coli. Điện di sản phẩm PCR từcác khuẩn lạc theo phương pháp PCR/SSCP cho thấy hai phổ
băng ADN khác biệt.

15


Hình 15: Tạo đột biến CEBPA/bZIP-E
a: Khuếch đại toàn bộ plasm idpG EM -T easy có mang đoạn CEBPA/bZIP dài 143 bp giếng số 1. b: Sàng lọc các khuẩn lạc mang plasmid có đột biến cần tạo theo phương pháp
P C R /SSC P giếng số 1 và 2. M: thang chuân low range. (-): đối chứng âm.
Giải trình tự cho thấy, phổ băng có một băng ADN duy nhất là từ khuẩn lạc mang
plasmid thường (Hình 15a, giếng số 2), còn phổ băng xuất hiện băng lạ ở khoảng kích thước
200 bp là từ khuẩn lạc mang plasmid có đột biến nhân tạo (Hình 15b, giếng số 1). Như vậy,
băng lạ xuất hiện trên gel polyacrylamide 10% là do sự có mặt của cả 2 đoạn CEBPA/bZIP
thường và đột biến trong SSCP. Kết luận, chúng tôi đã tạo thành công đột biến nhân tạo
chứa đoạn lặp 3 nucleotide AAG và sử dụng plasmid mang đột biến này để xây dựng
phương pháp phát hiện đột biến lặp đoạn ngắn thuộc vùngCEBPA/bZĨP[Bùỉ Hương Quỳnh,
2014].
Độ nhạy của phương pháp PCR/SSCP trong việc phát hiện đột biến CEBPA/bZIP
Plasmid có mang đoạn CEBPA/bZIP thường (gọi tắt là plasmid thường), và plasmid
có mang đoạn CEBPA/bZIP đột biến nhân tạo (gọi tắt là plasmid đột biến) được trộn theo
các tỷ lệ khác nhau theo bảng 5. Ket quả của các hỗn hợp trộn là băng lạ xuất hiện ở những
mẫu có 5% đột biến trở lên (Hình 16). Điều đó kết luận rằng, phương pháp PCR/SSCP có
thể phát hiện đột biến với tỷ lệ đột biển ít nhất là 5%.
Bảng 5: Hỗn hợp trộn giữa plasmid thường và pỉasmid đỏt biến với các tỉ lê khác nhau

Mức đột biến (%)
0
5
10
20
Sô
bản
copy
của
plasmid thườne
7.2 X 109
5.76 X 109
6.84 X 109
6.48 X 109
Sô
bản
copy
của
plasmid đột biến
0
3.58 X 108
7.16 X 108
1.432X 109
Mức đột biến (%)
Sô
bản
copy
plasmid thường
Sô
bản

copy
plasmid đột biến

30

50

70

100

5.04 X 109

3.6 X 109

5.012X 109

0

2.148 X 109

3.58 X 109

2.16 X 109

7.1ÓX 109

của
của

16


Hình 16: Thí nghiệm xác định độ nhạy của phương pháp PCR/SSCP.
Hon hợp trộn giữa plasmid thường và plasmid đột biến với các tỉ lệ khác khác nhau từ 0%
đến 100% được làm khuôn cho phản ứng PCR và SSCP.
Kết quả sàng lọc và phân tích trìn h tự đột biếnCEBPẠ/bZỈP ở 156 bệnh nhân AML
Trong số ADN tổng số từ 156 bệnh nhân được tiến hành kiểm tra theo phương pháp
PCR/SSCP, 12 mẫu (7,7%) có xuất hiện băng lạ và nghi ngờ mang đột biến
CEBPA/bZỈP(Hình 17a) [Bùi Hương Quỳnh, 2014]. Kết quả giải trình tự 1 mẫu nghi ngờ
cho thấy 3 nucleotide CTG chèn được chèn vào vị trí 1536-1537, tương ứng với một amino
acid Leucine mới xuất hiện tại vị trí 315 ở protein CEBPA (Hình 17b). Hơn nữa, từ độ sáng
của băng lạ ở bản gel SSCP và so sánh với tỷ lệ đột biến từ thí nghiệm độ nhạy cho thấy,
mẫu đột biến đã được giải trình tự có mức đột biến từ 5-10%.
(-)

1. Wild type CEBPA
2. AAG insertion
3. CTG insertion

M

(+)

1

2

V |_TQQ KVLVpTQQKVL V rTQ Q K V L L

Hình 17: Sàng lọc đột biến CEBPA/bZIP trong 156 m ẫu bệnh nhân AML.
a: AD N tống so được làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR (mau so 1 và 2), mẫu đổi
chứng dương (+) dùng plasmid mang đột biến nhân tạo làm khuôn, đối chứng âm (-) không
có AD N khuôn, b: Trình tự amino acid của mau thường (dỏng 1), đột biến nhân tạo có
mang 3 nucleotide AAG (dòng 2), đột biến của mâu 2 có 3 nucleotide CTG (dòng 3).
ĐAI HỌC QUỐC GIA HA NỘl
ÍRUNG TAM t h ô n g tin thư VIẺN

o o n Ê ô o o o /,5 ?

17


4.5. Sự có m ặt của đột biến N P M l và F LT3-ITD và sự liên quan đến đặc điểin lâm
sàng
Bệnh nhân AML được nghiên cứu trong đề tài nàynằm trong khoảng từ 17-85 tuổi
với độ tuổi trung bình là 43, và tỉ lệ nam/nữ là 75/81. Trong tổng số 156 mẫu đã sàng lọc, có
56/156 (35.9%) mang mộttrong hai đột biến, hoặc NPM1, hoặc FLT3 (Hình 18). Đột biến ở
2 gen này thường được tìm thấy ở nhóm bệnh nhân AML có tỉ lệ rủi ro cao. Nhiều nghiên
cứu gần đây đã chỉ ra rằng bệnh nhân mang đột biến NPM1 đơn có phản ứng tốt hơn với
hóa trị liệu sovới bệnh nhân có đột biến FLT3-ITD đơn hoặc mang cả 2 đột biến. Trong
cácsố liệu công bố trước đây, tỉ lệ trường hợp mang cả 2 đột biến là 10-12%. Khi sàng lọc
đột biến FLT3-ITD và NPM1 trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được 8 mẫu (5,1%)
có khả năng chứa cả 2 đột biến, trong đó 2 mẫu đã được khẳng định bàng việc đọc trình tự.

Hình 18. Sự x uất hiện của đột biến FLT3 IT D và NPM1 ở 156 bệnh nhân AML
FLT3-IDT/NPM1-Wt: bệnh nhân mang đột biến FLT3-IDT, nhưng không mang đột biến
NPM1; NPM l-mut/FLT3-wí: bệnh nhân mang đột biến NPM1 nhưng không chứa đột biến
FLT3-ITD;FLT3-ITD/NPM1-mut: bệnh nhân mang cả 2 đột biến; FLT-wt/NPMl-wt: bệnh
nhãn không mang đột biến nào trong hai đột biến FLT3-ITD và NPM1.

Ket quả nhuộm nhiễm sắc thể tế bào kèm theo biên bản thu mẫu được thực hiện ở
126/156 mẫu bệnh nhân cho thấy 94 bệnh nhân (79,4%) có kiểu hình nhiễm sắc thể bình
thường, trong đó 35 bệnh nhân (37,2%) xuất hiện đột biến được nghiên cứu. Trong 32 mẫu
còn lại có bất thường ở cấp độ nhiễm sắc thể (25,6%), 11 mẫu (34,4%) mang đột biến gen
NPM1 hoặc/và FLT3. Bên cạnh đó, tỉ lệ xuất hiện các đột biến ở hai gen giữa nam và nữ có
sự chênh lệch đáng kể. Cụ thể đột biển có tiên lượng tốt NPM1 xuất hiện ở nữ nhiều hơn
nam, chiếm 66,0% và tỉ lệ mang đột biến FLT3-ITD thì ngược lại, ở nam nhiều hơn nữ,
chiếm 64,3%. Trong nghiên cứu này, đột biến NPM1 được tìm thấy ở các nhóm từ MI đến
M 6 theo phân loại FAB, trong khi đột biến FLT3-ITD không tìm thấy ở MO và M3.
Bảng 6: Thống kê các đặc điểm lâm sàng ở bệnh nhân AM L
Đặc điềm
lâm sàng

FLT3-mut
N=13

NPMl-mut
N=50

FLT3-wt/
NPM1-Wt
N=100

NPMỈniut và
FLT3wt
N=42
46

FLT3mut vù
NPM1mut

N=8
45

Tỏng sô
N=155

42

FLT3mut và
NPMỈwt
N=5
37

Tuôi trung
bình
Khoảng

41,5

46

19-72

18-82

17-85

19-68

18-82

24-70

17-85

43

18


39/42
FLT3-wt/
NPM1-WÍ
N=100

4/1
FLT3mut và
NPM1wt
N=5

13/29
NPMÌmut và
FLT3wt
N=42

4/4
FLT3mut vù
NPMỈmut
N=8

74/81
MI I

17/33
NPMl-muí
N=50

í
£

8/5
FLT3-mut
N=13

■

Nam/nữ (n)
Đặc điêm
lâm sàng

Phân loại
FAB
MO
1
0
0
0
1
0
1

MI
1
1
3
3
0
2
6
M2
12
1
2
33
1
11
46
M3
0
5
20
0
5
0
25
M4
9
6
14
14
30

3
3
M5
1
7
11
1
18
0
6
M6
2
5
1
1
4
1
7
M7
0
0
0
0
0
0
0
FLT3-mut/NPMl-wt: bệnh nhân mang đột biên FLT3, nhưng không mang đột biên NPMI;
NPMl-mut/FLT3-wt: bệnh nhân mang đột biến NPM1 nhưng không chứa đột biến FLT3ITD;FLT3-mut/NPMI-mut: bệnh nhân mang cả 2 đột biến; FLT-wt/NPMl-wt: bệnh nhản
không mang đột biến nào trong hai đột biến FLT3 và NPM1.
5. Đánh giá về các kết quả đã đạt được và kết luận

5.1. Quy trình p h á t hiện đột biến
Hai quy trình phát hiện đột biến tăng 4 nucleotide trên gen NPM1 và đột biến lặp
đoạn 1TD trên gen FLT3 đã được chuyển giao thành công tới khoa Sinh học phân tử, Viện
Huyết học - Truyền máu Trung ương. Cả hai quy trình đảm bảo tính lặp lại, độ tin cậy và độ
nhạy để sử dụng trong việc thực hiện xét nghiệm cho bệnh nhân AML, cho phép phát hiện
đột biền nhanh chóng và đơn giản, phù hợp với nhu cầu của cơ sở y tê.
Mỗi quy trình đều bao gồm đối chứng thường và đối chứng đột biến đã được xác
định trình tự. Đối chứng đột biến của quy trình phát hiện đột biến lặp trình tự ngắn thuộc
vùng bZIP trên gen CEBPA và đột biến điểm thuộc vùng tyrosine kinase TKD trên gen
FLT3 là các đột biến nhân tạo. Việc nhóm nghiên cứu chủ động tạo ra các đối chứng dương
là điểm mới thay cho kỹ thuật nhân dòng đột biến sẵn có khó áp dụng với đột biến
CEBPA/bZIP và FLT3-TKD vì tần suất xuất hiện thấp của hai loại này. Quy trình phát hiện
đột biến CEBPA/bZIP sử dụng phương pháp điện di trên gel Ultraphor là một loại agarose
có khả năng phân tách cao các đoạn ADN chênh lệch một vài nucleotide về kích thước có
thế dễ dàng thực hiện tại phòng xét nghiệm ở bệnh viện. Tất cả các quy trình cho kết quả
sau 3-5 tiếng bắt đầu từ nguyên liệu ban đầu là ADN tổng số lách từ mẫu máu người bệnh.
5.2. Sàng lọc các đột biến nghiên cứu trong 156 bệnh nhân ẢM L Việt Nam
Các quy trình được nghiên cứu phát triển được sử dụng để phát hiện đột biến tăng 4
nucleotide trên gen NPM1, FLT3-ITD, FLT3-TKD, và đột biến lặp đoạn CEBPA/bZIP ở 156
bệnh nhân AML Việt Nam. Ket quả cho thấy tần suất xuất hiện của các đột biến trên lần
lượt là 32,1 %, 8,4 %, 3,2 %, và 7,7 %, trong đó, đối với mỗi đột biến, ít nhất là 1 và nhiều
nhất là 10 đột biến đã được khẳng định bằng phương pháp giải trình tự. Như vậy, trừ FLT3ITD, tần suất xuất hiện của các đột biến còn lại trong mẫu bệnh nhân AML Việt Nam đều
cao hơn hoặc xấp xỉ các bài báo được công bố trước đây về những nghiên cứu trên bệnh
nhân nước ngoài.
Đây là một trong những báo cáo đầu tiên thống kê về tỉ lệ nhừng đột biến gen cơ bản,
thường gặp nhất ở bệnh nhân AML tại Việt Nam. Tuy nhiên, do lượng mẫu còn ít, chưa đến
19


200 so với 500-600 cho tới hàng nghìn mẫu thu thập ở các nghiên cứu thực hiện trên thế

giới, sc liệu này có thể chưa mang tính chất đại diện cho Việt Nam. Đe tăng độ tin cậy của
tần suấ: đột biến tính toán trong đê tài sẽ cần số mẫu lớn hơn.
5.3. Phân tích đặc điếm phân tủ' của các đột biến được phát líiện và giải trình tự
Sử dụng phương pháp điện di phát hiện chênh lệch về độ dài có thể xác định được
một cách tương đối kích thước đột biến lặp đoạn FLT3-ITD và CEBPA/bZIP bằng cách so
sánh vơi đối chứng dương và thang chuẩn. Riêng với FLT3-ITD, do khả năng xuất hiện
nhiều doạn lặp trong cùng một mẫu, số đoạn lặp cũng là một đặc điểm phân tích được khá
rõ trên bản gel agarose sau khi nhuộm hoặc hình ảnh số hóa thu được từ máy Fragment
Analyzer. Ngoài ra, do các mẫu có thể chứa đồng thời bạch cầu thường và bạch cầu đột
biến, một đặc điểm nữa là mức đột biến, nói cách khác là tỉ lệ tế bào bất thường trong tổng
số tế bào, cũng có thể tính toán được khá chính xác qua hình ảnh. Và, như đã nêu trong
phần 5.2, tùy loại đột biến, có 1-10 mẫu đã được giải trình tự sau khi sàng lọc sử dụng các
quy trình phát triển trong đề tài này.
Bốn đặc điểm phân tử trên hầu như chưa được nghiên cứu một cách bài bản ỞViệt
Nam. Tuy nhiên, những công bố quốc tế trước đây đã chỉ ra tầm quan trọng của chúng trong
tiên lượng bệnh để từ đó có phương thức điều trị hợp lý. Ví dụ như số đoạn lặp nhiều, kích
thước đoạn lặp lớn và mức đột biến cao thường là yếu tố tiên lượng xấu đối với bệnh nhân
AML [Meshinchi, 2008; Stirevvalt, 2006]. Bên cạnh đó, việc phân tích trình tự chính xác các
đột biến còn có ý nghĩa thống kê, cho thấy rõ sự khác biệt về mức độ phổ biến và phân bố
của đột biến.
Kẹt luận
Đe tài đã phát triển thành công bốn quy trình phát hiện các đột biến thường gặp ở
bệnh nhân AML, trong đó hai quy trình được chuyển giao cho Viện Huyết học-Truyền máu
Trung ương. Sàng lọc ban đầu trên 156 người mắc AML góp phần đưa ra cái nhìn sơ lược
về tỉ lệ những đột biến nghiên cứu tại Việt Nam. Ngoài những con số thống kê, nhóm
nghiên cứu cũng phân tích di sâu vê các dặc điêm phân tử của đột biên. Các kêt quá của đê
tài là tiền đề quan trọng cho việc chẩn đoán, tiên lượng và điều trị bệnh và cần được tiếp tục
trên quy mô lớn hơn.
6. Tóm tắt kết quả (tiếng Việt và tiếng Anh)
Tiếng Việt'. Đề tài tập trung vào một số đột biến phổ biến nhất liên quan tới bệnh ung

thư bạch cầu cấp dòng tủy trên ba gen: NPM1, FLT3, và CEBPA. Việc phát hiện những đột
biến này cung cấp thông tin cần thiết cho việc tiên lượng bệnh, từ đó hỗ trợ bác sỹ điều trị
lựa chọn phương án điều trị hợp lý nhất cho bệnh nhân. Bốn quy trình chẩn đoán đã được
phát triển thành công, bao gồm một quy trình phát hiện đột biến tăng 4 nucleotide trên gen
NPM1, hai quy trình phát hiện đột biến lặp đoạn ITD và thay thế nucleotide vùng tyrosine
kinase TKD trên gen FLT3, và một quy trình phát hiện đoạn lặp thuộc vùng bZIP của gen
CEBPA. Mỗi quy trình bao gồm hai bước chính: khuếch đại đoạn gen chứa đột biến nghiên
cứu sử dụng cặp mồi thiết kế đặc hiệu, và phân tách sản phẩm PCR trên gel agarose hoặc
polyacrylamide, có thể tiền xử lý với enzyme giới hạn hay chất biến tính. Các plasmid chứa
đoạn gen thường và đột biến đã được khẳng định bằng cách giải trình tự được sử dụng làm
đối chứng thường (chứng tỏ kết quả âm tính) và đối chứng bệnh (dương tính). Đặc biệt, đối
với đột biến FLT3-TKD và CEBPA/bZIP, hai đối chứng bệnh đã được tạo ra bàng phương
pháp gây đột biến nhân tạo.
Các quy trình sau khi kiểm tra chứng nhận hiệu quả được sử dụng trên quy mô phòng
thí nghiệm với ỉ 56 mẫu máu thu thập từ bệâh nhân AML, cho thấy số mẫu nghi ngờ mang
đột biến lần lượt là 50 (32,1 %), 13 (8,4%), 5 (3,2%), và 12 (7,7%) tương ứng với 4 loại đột
20


biến tăng 4 nucleotide trên gen NPMỈ, FLT3-ITD, FLT3-TKD, và lặp đoạn CEBPA/bZIP.
Đáng chú ý là có 8 mẫu (5,1%) mang cả hai loại đột biến NPM1 và FLT3-ITD. Tần suất
xuất hiện của FLT3-ITD thấp hơn so với các nehiên cứu công bố trước đây có thế là do sự
không đồng nhất của các đợt thu mẫu khác nhau, sắp tới, chúng tôi sẽ thu thập lượng mẫu
lớn hơn và có đầy đủ các thône tin lâm sàng để có thể đưa ra số liệu mang tính đại diện cao
hơn và phân tích sâu hơn về mối liên hệ với các yếu tố lâm sàng.
Tiếng A n h : The proịect íocused on most frequent AML-linked mutations on three
genes: NPM1, FLT3, and CEBPA. Detection o f these mutations provides necessary
information for AML prognosis and treatment, vvhich is important to improve survival rate.
Four diagnostic procedures were sucessfully established including one íor tetranucleotide
additionon NPM1, two for FLT3 intemal tandem duplication (FLT3-ITD) and substitutionin

tyrosine kinase domain (FLT3-TKD), and one for duplication in bZIP domain on CEBPA.
Each procedure included two main steps: amplitìcation of the íragment carrying mutations
using speciíĩcally designed primers, and separation o f PCR Products on either agarose or
polyacrylamide gels, with or without pre-treatment with either restriction enzyme or
denaturant. Plasmids carrying either verifíed normal or mutated sequences were used as
normal (negative) and mutant (positive) Controls, respectively. Especially, for FLT3-TKD
and CEBPA/bZIP mutation detection, tvvo positive Controls were synthesized using
mutagenesis.
The screening o f 156 AML samples using the validated procedures gave the result of
50 NPM1 mutants (32.1%), 13 FLT3-ITD mutants (8.4%), 5 FLT3-TKD mutants (3.2%),
and 12 CEBPA/bZIP mutants (7.7%). Interestingly, there were 8 samples constituting 5.1 %
carrying both NPM1 and FLT3-ITD mutations. The fact that the FLT3-ITD í'requency
(8.4%) reported in this study vvas lower than other studies would be explained by the bias in
sample collection. Besides, the blood samples o f 156 AML patients were collected in 3
different batches and the mutation frequency o f each batch was different, e.g., 8/45 (17.8%)
o f the íìrst batch, 2/30 (6.7%) o f the second and 4/80 (5%) o f the third.In the near tìiture, we
might apply the procedure in larger sample size or in cooperation with other clinical
facilities to have more representative statistical data on AML gene mutations.

21


Danh m ục chữ viết tắt

AML
AML-NK
NPM1
FLT3
CEBPA
PCR

PCR/SSCP
RTK
ITD
TKD
C-KIT
PCR-RPLP
NST
bZIP
AGE
PAGE
mut
wt

Acute Myeloid Leukemia
Normal Karyotype
Nucleophosmin 1
Fms-like tyrosine kinase 3
CAAT enhancer binding protein
alpha
Polymerase Chain Reaction
Single-Strand Conformation
Polymorphism
Receptor Tyrosine Kinase
Intemal Tandem Duplication
Tyrosine Kinase Domain
C-KIT gene
Restriction Fragment Length
Polymorphism
Basic Leucine Zipper domain
Agarose Gel Electrophoresis

Polyacrylamide Gel
Electrophoresis
Mutation
Wild type

ư ng thư bạch câu câp dòng tủy
Kiêu hình nhân bình thường
Nucleophosmin 1
Fms-like tyrosine kinase 3
CAAT enhancer binding protein
alpha
Phương pháp khuêch đại đoạn
gen
Đa hình câu trúc mạch đơn
Thụ thê tyrosine kinase
Đột biên lặp đoạn
Đột biên điêm
Gen C-KIT
Đa hình chiêu dài đoạn căt giới
han
Nhiêm săc thê
Điện di Agarose
Điện di polyacrylamide
Loai đôt biên
Loại bình thường

22


Tài liêu tham khảo

1. Giles F.J., Armand K., et al, 2002. "‘Acute myeloid \eukimia'\Hematology, 73-110.
2. Gunz F .w ., 1990. “Leukemia in the past". ỉn: Henderson ES, Lister TA (eds).
Leukemia. WB Saunders Company: Philadelphia, 3-11.
3. Trần Thị Minh Hương, Đỗ Trune Phấn, 2002.“Tình hình bệnh máu tại viện Huyết
Học - Truyền Máu. Bệnh viện Bạch M ar.K ỷ yếu côns trình nghiên cứu khoa học
Huyết Học - Truyền Máu, Nhà xuất bản Y học, 1:15-24.
4. Khalidi H.S., Medeiros L.J., Chang K.L., Brynes R.K., Slovak M.L., Arber
D.A.,1998. “The immunophenotype of adult acute myeloid leukemia: high írequency
o f lymphoid antigen expression and comparison of immunophenotype, FrenchAmerican-British classiíication, and karyotypic abnormalities”. American Journaỉ o f
Clinical Pathology, 109(2): 211-220.
5. Bene M.C., Bemier M., Castoldi G., 1999. “Impact of immunophenotyping on
management o f acute leukemia”. Haematological, 84-123.
6 . Kiyoi H., Naoe T., Nakano Y., Yokota s., Minami s., Miyawaki s., Asou N.,
Kuriyama K., Jinnai I., Shimazaki c ., Akiyama H., Saito K., Oh H., Motoji T., Omoto
E.,
Saito H., Ohno R., Ưeda R., 1999.“Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gen
mutations in acute myeloid leukemia”.,ổ/ooí/) 93: 3074-3080.
7. Ammatuna E., Nogueral N.I., Zangrilli D., Curzi p., Panetta p., Bencivenga p.,
Amađori s., Federici G., Lo-Coco F., 2005.“Rapid detection o f nucleophosmin
(NPM1) mutations in acute myeloid leukemia by denaturing HPLC”.Clinicaỉ
Chemistry 51(11): 2165-2167.
8 . Calvo K.L., Ojeda M.J., Ammatuna E., Lavorgna s., Ottone T., Targovnik H.M., LoCoco F., Noguera N.I., 2009.“Detection o f the nucleophosmin gen mutations in acute
myeỉogenous
leukemia
through
RT-PCR
and
polyacrylamide
gel
electrophoresis”.European Journal o f Hematology, 82(1): 69-72.

9. Dôhner K., Schlenk R.F., Habdank M., SchollC., Rũcker F.G., Corbacioglu A.,
Bullinger L., Frốhling s., Dốhner H., 2005.“Mutant nucleophosmin (NPM1) predicts
favorable prognosis in younger adults with acute myeloid leukemia and normal
cytogenetics: interaction with other gene mutations”. Blood, 106:3740-3746.
10.Lin L.I., Chen C .Y , Lin D.T., Tsay w „ Tang J.L„ Yeh Y.C., Shen H.L., Su F.H.,
Yao M., Huang S.Y., Tien H.F., 2005.“Characterization o f CEBPA mutations in acute
myeloid leukemia: most patients vvith CEBPA mutations have biallelic mutations and
show a distinct immunophenotype o f the leukemic cells”.Clinical Cancer Research,
11(4): 1372-1379.
11.
Lim M.J., Xin w .w ., PhD., 2006. „Nucleophosmin and human cancer“. Cancer
Detect Prev, 30(6): 481-490
12. Falini B., Mccucci c ., Tiacci E., Alcalay M., Rosati R., Pasqualucci L., La Starza R.,
Diverio D., Colombo E., Santucci A., Bigerna B., Pacini R., Pucciarini A., Liso A.,
Vignetti M., Fazi p., Meani N., Pettirossi V., Saglio G., Mandelli F., Lo-Coco F.,
Pelicci P.G., Martelli M.F., GIMEMA Acute Leukemia Working Party, 2005.
“Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal
karyotype”. The New England Journaỉ ofM edỉcine, 352:254-266.
B .O rita M., Iwahana H., Kanazawa H., Hayashi K., Sekiya T., 1989.“Detection o f
polymorphisms o f human DNA by gel electrophoresis as single-strand coníbrmation
polymorphism”. Proceedings o f the National Academy o f Sciences USA, 86:27662770.
23


14. Boonthimat c ., Thongnoppakhun w ., Auewarakul c.u.,2008. “Nucleophosmin
mutation in Southeast Asian acute myeloid leukemia: eight novel variants, FLT3
coexistence and prognoslic impact o f NPM1/FLT3 mutations”. Haematological,
93(10): 1565-1569'
15.Darline G.J., Ross S.E., MacDougald O.A., 1998.“The role o f C/EBP genes in
adipocyte differentiation”. The Journal o f Biological Chemistry, 23: 30057-30060

16.
Hendricks-Taylor L.R., Bachinski L.L., Sicilliano M.J., Fertitta A., Trask B., de Jong
P J., Ledbetter D.H., Darlington G.J., 1992.“The CCAAT/enhancer binding protein
(C/EBPa) sene (CEBPA) maps to human chromosome 19q 13.1 and the related
nuclear factor NF-IL 6 (C/EBP B) gene (CEBPB) maps to human chromosome
20ql3.1”. Genomics 14: 12-17.
17.Fuchs o ., Kostecka A., Provazníková D., Krásná B., Kotlín R., Stanková M.,
Kobylka p., Dostálová G., Zeman M., Chochola M., 2010.“CCAAT/EnhancerBinding Protein a (CEBPA) Polymorphisms and Mutations in Healthy Individuals
and in Patients with Peripheral Artery Disease, Ischaemic Heart Disease and
Hyperlipidaemia”.Folia Biologica (Proha), 56: 51-57.
18.

Fuster o . , Barragán E., B oluỉer p., Such E. & Valencia A., ỉbánez M., Dolz s., Juan

I.d., Jiménez A., Gómez M.T., Buno I., Martínez J, Cervera J., Montesinos p.,
Moscardó F., Sanz M.Á., 2012.“Fragment length analysis screening for detection of
CEBPA mutations in intermediate-risk karyotype acute myeloid leukemia”. Annals of
Hematology, 91(1): 1-7.
19. Agnès F., Shamoon B., Dina c ., Rosnet o ., Bimbaum D., Galibert F., 1994.“Genomic
structure o f the downstream part o f the human FLT3 gene: exon/intron structure
conservation among genes encoding receptor tyrosine kinases (RTK) of subclass III”,
Gene, 145: 283-288.
20. Meshinchi s., Stirewalt D.L., Alonzo T.A., Boggon T.J., Gerbing R.B., Rocnik J.L.,
Lange B.J., Gilliland D.G., Radich J.p., 2008. “Structural and numerical variation of
FLT3/ITD in pediatric AML”, Blood, 111 (10): 4930-4933.
21. Yamamoto Y., Kiyoi H., Nakano Y., Suzuki R., Kodera Y., Miyawaki s., Asou N.,
Kuriyama K., Yagasaki F., Shimazaki c ., Akiyama H., Saito K., Nishimura M.,
Motọịi T., Shinagawa K., Takeshita A., Saito H., Ueda R., Ohno R., Naoe T., 2001.
“Activating mutation of D835 within the activation loop o f FLT3 in human
hematologic malignancies”, Blood, 97 ( 8 ): 2434-2439.

22. Kim Y.K., Kim H.N., Lee S.R.,Ahn J.s., Yang D.H., Lee J.J., Lee I.K., Shin
M.G.,Kim H.J., 2010.“Prognostic signiíĩcance o f nucleophosmin mutations and FLT3
intemal tandem duplication in adult patients with cytogenetically normal acute
myeloid leukemia”, Korean Journal ofHematology, 45 (1): 36-45.
23. Gilliland D.G. and Griffín J.D., 2002. “The roles o f FLT3 in hematopoiesis and
leukemia”, Blood, 100 (5): 1532-1542.
24. Bagrintseva K., Geisenhof s., Kem R., Eichenlaub s., Reindl c ., Ellwart J.w .,
Hiddemann w ., Spiekermann K., 2005. “FLT3-ITD-TKD dual mutants associated
with AML confer resistance to FLT3 PTK inhibitors and cytotoxic agents by
overexpression of Bc\-x(LỴ\Blood, 105 (9): 3679-3685.
25.Kiyoi H., Towatari M., Yokota s., Hamaguchi M., Ohno R., Saito H., Naoe T., 1998.
“Intemal tandem duplication o f the FLT3 gene is a novel modality of elongation
mutation which causes constitutive activation o f the product”. Leukemia, 12 (9):
1333-1337.
24