Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn ở cây lạc (arachis hypogaea l )

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ THU NGÀ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN
NAC2LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY
LẠC (Arachis hypogaea L.)

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
––––––––––––––––––

NGUYỄN THỊ THU NGÀ

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ CHUYỂN GEN

NAC2
LIÊN QUAN ĐẾN CHỊU HẠN Ở CÂY
LẠC (Arachis hypogaea L.)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 62 42 01 21

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:GS.TS. LÊ TRẦN BÌNH

THÁI NGUYÊN - 2014

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

/>

3


4

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Một trong những hiện tượng thay đổi của môi trường ảnh hưởng tới sự sinh
trưởng và phát triển của thực vật là tình trạng hạn.Hạn hán có ảnh hưởng xấu ở các
mức độ khác nhau trong suốt quá trình hay từng giai đoạn sống của cơ thể thực vật
dẫn đến làm giảm năng suất cây trồng, chậm phát triển và gây chết. Hiện nay trên
thế giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán. Tại Việt Nam, trong 7,3 –
7,4 triệu ha đất trồng thì có tới 1,5 – 1,8 triệu ha bị thiếu nước.
Nghiên cứu bản chất tính chống chịu của cây trồng cho thấy đây là một tính
trạng đa gen. Vai trò cụ thể của từng gen riêng rẽ liên quan đến tính chống chịu ở
thực vật(ví dụ P5CS, RD22…) đã được nhiều nghiên cứu tìm hiểu và phân tích. Tuy
nhiên, dưới tác động của các yếu tố bất lợi từ ngoại cảnh, không chỉ các gen riêng rẽ
được biểu hiện mà là một hệ thống các gen liên quan được kích hoạt biểu hiện nhằm

đáp ứng với tình trạng bất lợi mà thực vật gặp phải. Một trong số những yếu tố kích
hoạt hoạt động của các gen liên quan đến khả năng chống chịu là các nhân tố phiên
mã (transcription factor – TF).
Họnhân tố phiên mã NAC (NAC transcription factor) là một trong những họ
TF đặc trưnglớn nhất trong hệ genthực vật [106].Nhân tố phiên mãNAC có liên
quan đếnnhiều quá trình sinh lý quan trọng trong cơ thể thực vật [99]. Nhiều gen
NAC tham gia vào phản ứng với những áp lực khác nhau từ môi trường,trong đó có
hạn [87], [113], [133]… Nhiều tác giả đã nghiên cứu chuyển gen mã hóa nhân
tố phiên mãNAC thành công vào một số loài cây trồng như: cây lúa, lúa mỳ,
thuốc lá,...[54], [55],[60], [77], [87], [103], [127], [133].Trên đối tượng cây
lạc,các gen AhNAC1, AhNAC2, AhNAC3 liên quan đến tính chịu hạn đã được tách
dòng thành công [71], AhNAC2 đã được sử dụng để thiết kế vector mang cấu trúc
gen chịu hạn và chuyển thành công vào cây Arabidopsis [72].
Lạc là cây nông nghiệp ngắn ngày được trồng phổ biến trên thế giới. Ở nước
ta, cây lạc được trồng trên khắp các miền và phù hợp với nhiều vùng sinh thái khác
nhau. Tuy nhiên, hạn, mặn, lạnh vẫn là yếu tố hạn chế đối với sự sinh trưởng và


năng suất của cây trồng trong đó có cây lạc. Cây lạc là cây họ đậu, thuộc nhóm chịu
hạn kém [13].Một số kỹ thuật chọn tạo giống có khả năng chịu hạn như lai giống
hoặc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật đã được áp dụng [11], [13], [14], [15].Tuy
nhiên, việc sử dụng kỹ thuật chuyển gen nhằm tạo ra những giống lạc có khả năng
chịu khô hạn còn chưa được nghiên cứu nhiều.Từ những lí do trên, chúng tôi đã tiến
hành đề tài: “Nghiên cứu phân lập và chuyển gen NAC2 liên quan đến tính chịu hạn
ở cây lạc (Arachis hypogaea L.)”nhằm thử nghiệm khả năng chuyển gen chỉ thị và
tiến tới chuyển gen chịu hạn với mục đích tạo ra dòng cây chuyển gen phục vụ chọn
giống chịu hạn ở cây lạc. Ứng dụng thực tiễn của nghiên cứu nhằm cải tạo cây lạc
và cải thiện về khả năng chống chịu trên đối tượng cây trồng này.
2. Mục tiêu nghiên cứu
(1) Phân lập được gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc chịu hạn tốt.

(2) Thiết kế được vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã
NAC2. Tạo cây chuyển gen và biểu hiện được protein NAC2 ở cây thuốc lá.
(3) Tạo được dòng cây lạc chuyển gen. Phân tích các dòng cây lạc chuyển gen.
3. Nội dung nghiên cứu
(1) Phân nhóm các giống lạc nghiên cứu theo mức độ chịu hạn thông qua đánh
giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn mô sẹo và cây non.
(2) Phân lập, tách dòng và giải trình tự gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 liên
quan đến tính chịu hạn của cây lạc.
(3) Thiết kế vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mãNAC2, tạo
vi khuẩn A.tumefaciensmang vectortái tổ hợp và chuyển vào cây thuốc lá mô hình.
(4) Xác định sự có mặt của gen chuyển NAC2 trên cây thuốc lá, đánh giá khả
năng chịu hạn của các dòng thuốc lá chuyển gen thông qua sự thay đổi hàm lượng
proline. Phân tích biểu hiện protein tái tổ hợp NAC2 ở cây thuốc lá chuyển gen.
(5) Phát triển hệ thống tái sinh cây ở cây lạc và chuyển gen chỉ thị (GUS) qua mô
sẹo và phôi soma.
(6) Chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2vào cây lạc, phân
tích các dòng lạc chuyển gen.


4. Những đóng góp mới của luận án
i) Tách dòng thành công gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2 từ giống lạc
chịu hạn tốt L12.
ii) Thiết kế thành công vector chứa cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên
mã NAC2 và chuyển vào cây thuốc lá, kết quả biểu hiện protein ở cây chuyển gen
chứng minh cấu trúc đã thiết kế hoạt động tốt ở thuốc lá.
iii) Thông qua hệ thống tái sinh đã xây dựng, luận án tối ưu và hoàn thiện
được quy trình chuyển gen hoàn chỉnh thông qua mô sẹo và phôi soma ở cây lạc
nhằm phục vụ tạo cây lạc chuyển gen theo mục đích cải thiện khả năng chống chịu
với tình trạng thiếu nước từ môi trường. Giống lạc LVT được thử nghiệm chuyển
gen GUS và chuyển cấu trúc mang gen mã hóa nhân tố phiên mã NAC2.

5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
5.1. Ý nghĩa khoa học
i) Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp dẫn liệu khoa học về ứng dụng kỹ
thuật chuyển gen nhằm phục vụ việc cải thiện tính chịu hạn của cây lạc.
ii) Cung cấp thông tin về nhân tố phiên mã NAC và gen NAC2 ở cây lạc. Khả
năng chịu hạn ở các giống lạc nghiên cứu và vai trò của gen NAC2 trong đáp ứng
với sự thiếu nước từ môi trường.
5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả đánh giá khả năng chịu hạn của cây lạc ở mức độ mô sẹo và cây non
được sử dụng làm cơ sở để đánh giá và ứng dụng biện pháp cải thiện khả năng chịu
hạn của cây lạc. Kết quả thu được ban đầu về cây lạc chuyển gen sẽ làm căn cứ để
đánh giá ở các mức độ tiếp theo nhằm phục vụ các nghiên cứu về cải thiện tính chịu
hạn của cây lạc.


Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. HẠN VÀ TÁC ĐỘNG CỦA HẠN ĐẾN THỰC VẬT
1.1.1. Tác động của hạn đến thực vật và cây lạc
1.1.1.1. Cây lạc
Cây lạc có nguồn gốc ở vùng Nam Bolivia, Tây bắc Achentina, Nam Mỹ.
Người Bồ Đào Nha đưa cây lạc từ Brazin sang Tây Phi và sau đó đến Tây Nam Ấn
Độ từ thế kỉ XVI. Sau đó được đem trồng ở rất nhiều nước trên thế giới. Ở Việt
Nam, cây lạc được du nhập từ Trung Quốc sang và được trồng vào khoảng thế kỉ
XVII- XVIII [8], [13].
Về mặt phân loại, cây lạc có tên khoa học là Arachis hypogaea (L.) với 2n=40
NST. Theo Krapo Vikas và một số tác giả khác, cây lạc thuộc họ cánh bướm
Fabaceae, thuộc chi Arachis. Loài lạc trồng Archis hypogaea (L.) gồm hai loài phụ:
Loài phụ Hypogaea gồm hai chủng: Hypogaea loại hình Virginia và Bersuta kohter.
Loài phụ Fastigiata gồm hai chủng: Fastigiata loại hình Valencia và Vulgaris harz

loại hình Spanish.
Về hình thái, cây lạc gồm các bộ phận chính là rễ, thân, lá, hoa và quả lạc.
Rễ lạc có rễ cọc và rễ con. Trên rễ lạc có nhiều nốt sần được tạo thành do vi
khuẩn Rhizobium sống cộng sinh, do vậy cây lạc có khả năng cố định nitơ phân tử
trong không khí thành đạm cung cấp cho cây và đất trồng. Những nốt sần này tăng
nhanh về số lượng và kích thước từ khi cây lạc có 6 - 7 lá đến lúc nở hoa.Thân
chính của cây lạc thường chỉ cao khoảng 25cm - 50cm. Lá lạc là loại lá kép hình
lông chim có 4 lá chét mọc đối nhau, hình trái xoan ngược, có 2 lá kèm hình dải
nhọn bao quanh thân. Trên thân chính thường có khoảng 20 lá. Khi cây lạc có 5 - 6
lá trên thân chính thì lạc bắt đầu phân hoá các mầm hoa. Hoa lạc mọc ra từ các mắt
của cành. Mỗi vị trí có thể có từ 3 - 5 hoa, khi cây lạc đã có 8 - 9 lá thì hoa nở. Lạc
là loại cây tự thụ phấn nghiêm ngặt, khi thấy hoa nở là cây đã thụ phấn xong. Hoa
lạc sau khi thụ phấn thì đâm tia xuống đất hình thành quả (thường gọi là củ). Quả


lạc có hình trụ thuôn thắt lại ở giữa các hạt, vỏ quả cứng có gân mạng. Mỗi quả có 1
- 3 hạt. Hạt hình trứng, có vỏ lụa màu đỏ, vàng, cánh sen hoặc trắng [13].
Theo thời gian sinh trưởng của cây lạc, người ta chia làm giống chín sớm (thời
gian sinh trưởng 90 ngày - 125 ngày) và giống chín muộn (140 ngày - 160 ngày).
Cây lạc đòi hỏi khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cho sinh trưởng phát triển của cây lạc từ
0

0

0

0

24 C - 33 C. Nhiệt độ để hạt nảy mầm thấp nhất phải trên 12 C, từ 15 C hạt lạc đã
0

bắt đầu nảy mầm tốt, dưới 17 C hoa không thụ phấn, yêu cầu độ ẩm từ 60% - 70%,
độ ẩm thấp dưới 60% đã kéo dài thời gian nảy mầm và hạt không nảy mầm được ở
độ ẩm đất 40% - 50%. Đất trồng lạc lí tưởng phải là đất thoát nước nhanh, chân đất
nhẹ, thoáng, có màu sáng, tơi xốp, phù sa pha cát có đầy đủ canxi và lượng chất hữu
cơ vừa phải sẽ tạo điều kiện cho lạc nảy mầm, dễ dàng ngoi lên mặt đất và sinh
trưởng, hình thành quả tốt, độ pH của đất từ 6-7 là thích hợp nhất [13].
Cây lạc được coi là cây trồng có hiệu quả kinh tế cao và có giá trị đa dạng về
các mặt dinh dưỡng, chăn nuôi, trồng trọt và trong công nghiệp.
Diện tích trồng lạctập trung nhiều nhất ở vùng Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh
rồi tới đồng bằng và trung du Bắc Bộ (Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Nam, Nam Định,
Ninh Bình). Trên thực tế, diện tích trồng lạc ở nước ta còn nhỏ và phân tán, trừ một
vài vùng lạc tập trung như Diễn Châu (Nghệ An), Hậu Lộc (Thanh Hoá). Gần đây
cây lạc được khuyến khích phát triển mạnh, đặc biệt ở những nơi đất bạc màu, thoái
hoá như vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ, những dải đất ven biển từ Thanh Hoá
chạy dài tới giáp Đông Nam Bộ,… đều có thể trồng được lạc. Nhiều vùng đất, nhất
là ở miền Nam có thể trồng được 2 vụ lạc trong năm [13].
1.1.1.2. Tác động của hạn đến thực vật
Hạn là một trong những yếu tố cực đoan phi sinh học được quan tâm đến
nhiều nhất hiện nay. Hiện tượng khô hạn xảy ra khi trong môi trường đất và không
khí thiếu nước đến mức áp suất thẩm thấu của cây không cạnh tranh được để lấy
nước vào tế bào. Trong trường hợp này, tác động của môi trường bên ngoài rất lớn,
gây ảnh hưởng đáng kể lên sự phát triển của thực vật, có thể dẫn đến hủy hoại cây
cối và mất mùa[7], [23], [27], [36]. Các yếu tố bất lợi của môi trường có thể là:
nhiệt độ cao, gió nóng, thời tiết và khí hậu.Khái niệm hạn dùng để chỉ tình trạng


mất nước của cây. Khả năng thực vật có thể giảm thiểu mức tổn thương do thiếu hụt
nước gây ra gọi là tính chịu hạn [7].
Xu thế thayđổi của khí hậu làm cho hạn hán bất thường xảy ra ở nhiềunơi,

đây là nguyên nhân chính làm giảm năng suất cây trồng [94]. Theo FAO, ước tính
có 70% tiềm năng về năng suất bị mất đi do điều kiện bất lợi của môi trường và sâu
bệnh hại, ngay cả ở những quốc gia có nềnnông nghiệp phát triển. Hiện nay trên thế
giới có khoảng 45% diện tích đất trồng bị hạn hán [45]. Tại Việt Nam, trong 7,3-7,5
triệu ha đất trồng thì có tới 1,5-1,8 triệu ha thiếu nước.
Khi gặp hạn, trạng thái của chất nguyên sinh trong tế bào thay đổi mạnh, ảnh
hưởng đến tính chất hoá lý của chất nguyên sinh như tính thấm, mức độ thuỷ hoá
của keo, thay đổi pH, độ nhớt, cuối cùng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất bình
thường của cơ thể. Hạn ảnh hưởng xấu đến quá trình hình thành diệp lục, phá hoại
lục lạp nên hiệu suất quang hợp giảm xuống nhanh chóng. Hạn ảnh hưởng đến hoạt
động hút khoáng của bộ rễ, dẫn đến tình trạng thiếu những nguyên tố dinh dưỡng
quan trọng trong quá trình trao đổi và tổng hợp các chất hữu cơ khác nhau trong cơ
thể thực vật [28], [36], [45].
Để chống khô hạn, cây có thể giữ không bị mất nước, giảm diện tích lá, rút
ngắn chu kì sống.Bất kỳ sự mất nước nào cũng dẫn đến hiện tượng thiếu hụt nước
trong tế bào. Nước vừa là nguyên liệu, vừa là môi trường để các phản ứng trao đổi
chất xảy ra. Vì vậy, sự vi phạm chế độ nước ảnh hưởng rất lớn đến mọi quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây.
Về tác động của hạn đến thực vật, các nhà khoa học tập trung nghiên cứu
theo 2 hướng: khảo sát tính chịu hạn của các đối tượng thực vật trong điều kiện tự
nhiên ngoài đồng ruộng hoặc trong điều kiện nhân tạo tại phòng thí nghiệm.
Nhiều cây trồng như ngô, lúa, đậu tương, lạc…đã được các nhà nghiên cứu
đánh giá, khảo sát về đặc tính chịu hạn thông qua các điều kiện tự nhiên ngoài đồng
ruộng. Một trong những phương pháp được sử dụng là chủ động gây ra sự thiếu
nước và tiến hành nghiên cứu phản ứng của các cơ thể thực vật trong điều kiện này.
[5].Khi gặp hạn, cây lạc cũng chịu ảnh hưởng nặng nề đến quá trình sinh trưởng và
phát triển. Khi tiến hành nghiên cứu ngoài tự nhiên bằng phương pháp gây hạn nhân


tạo, nhận thấy sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm

giảm sút cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả
chắc, giảm hàm lượng lipid trong hạt lạc [8].Những quan sát cho thấy, trong điều
kiện thí nghiệm gây thiếu nước ở thời kì ra hoa đã làm giảm nghiêm trọng số hoa,
đợt ra hoa hoặc hoa nở rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa
có ích giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở [13].
Trong điều kiện nhân tạo, nhiều nghiên cứu tiến hành đánh giá tác động của
hạn ở một số giai đoạn phát triển của các đối tượng thực vật khác nhau như mô sẹo,
hạt nảy mầm, cây non 3 lá…Trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu
nhằm đánh giá tác động của hạn và nâng cao tính chịu hạn ở cây trồng ở mức độ in
vitro như ngô [42], lạc [11], [14], lúa [2], khoai tây [67],…
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng PEG, sorbitol, manitol… như những tác nhân
gây khô hạn trong môi trường nuôi cấy nhằm nghiên cứu tác động của hạn lên thực
vật. PEG là một hợp chất có ái lực rất lớn với nước, khi đưa vào môi trường nuôi
cấy, nó không chỉ ngăn cản rễ hút nước mà còn chiếm nước từ rễ cây, khiến cây
nhanh chóng rơi vào tình trạng sốc hạn [67].
Như vậy có thể thấy, mức độ ảnh hướng của các yếu tố cực đoan, trong đó có
hạn đến khả năng phản ứng của cây trồng là rất rõ rệt. Hiện tượng mất nước cục bộ
chỉ gây thiệt hại cho một nhóm nhỏ, nhưng hạn hán kéo dài sẽ gây thiệt hại cho
nhiều loại cây trồng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng. Các loài thực vật khác
nhau sẽ có khả năng chống chịu khác nhau với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào
bản chất di truyền từ bao thế hệ của chúng. Vì vậy, có cây có thể chống chịu được
và tồn tại, có cây sẽ bị chết. Ngay trong cùng một loài, các cá thể khác nhau cũng
phản ứng ở các mức độ không hoàn toàn như nhau [7].
1.1.1.3. Tác động của hạn đến cây lạc
Cây lạc đượctrồng trên35,5triệu ha ở82 quốc giatrên thế giới. Hơn một
nửa sốkhu vực sản xuất, chiếm70% diện tích trồnglạcthuộcvùng khô hạnvà bán khô
hạn;ở những nơinày, cây lạc thường xuyên chịuáp lựchạn hánvới thời gianvà cường
độkhácnhau[50], [79], [92], [104]. Dự kiến giá trị tổn thấthàng nămtrong sảnxuấtlạc
tương đương vớihơn 520triệu USD gây rabởi hạn[39], [40]. Tại Hoa Kỳ,cây lạc

đóng góphơn 4tỷUSD cho nền kinh tếcủa đất nướcmỗi năm. Tại đây, phần lớncây
lạc được trồng dướiđiều kiệnnước trờivàchỉcómột diện tíchhạn chếđược tưới
tiêu[39]. Ở châu Ávà châu Phi, cây lạcđược trồngtrong điều kiệnnước trờitrongmùa
mưa và bịhạn hánliên tụcdolượng mưa ít có thể xảy ratạibất kỳ thời điểm nàotrong
chu kỳsống của cây trồng [40].Ở Việt Nam, sản xuất lạc được phân bố ở tất cả các
vùng sinh thái nông nghiệp, với khoảng 40% tổng diện tích các cây công nghiệp
ngắn ngày [13].
Ảnh hưởng của hạn vớicây lạc được thể hiện theo nhiều cách, ảnh hưởng đến
cảsố lượng và chất lượng của cây trồng. Thâm hụt nước, tùy thuộc vào thời gian xảy
ra, có thể là nguyên nhân gây ra hiện tượng giảm đáng kể năng suất lạc bằng cách
tác động lên các quá trình sinhlýnhư cố định đạm, quang hợp, và sự hấp thu canxi
cho phát triển vỏ quả[50], [79].Khi cây lạc gặp hạn sẽ làm mất độ ẩm từ quả dẫn
đến làm giảm hoạt độngsinh lý của hạt, bên cạnh đóảnh hưởng của hạn hán còn làm
thay đổi chất lượng dinh dưỡng của protein trong hạt lạc[39].Hạn làm ảnh hưởng
đến lipid màng tế bào, các phản ứng quang hợp [92],quá trình trao đổi chất, tăng
trưởng và năng suất của cây lạc[39].Thiếu hụt về độ ẩmlàm cản trở quá trình hình
thành nốt sần ở các cây họ đậu. Có nhiều bằng chứng cho thấy,quá trình hấp thụ N,
P và K của cây lạc bị giảm do hạn hán[39].
Hạnđãảnh hưởngxấu đến cácmối quanhệ vềnước, quang hợp, dinh dưỡng
khoáng, sự trao đổi chấtvà tăng trưởng ở lạc.Hạn hán căng thẳng nghiêm trọng làm
giảm hàm lượng chất diệp lục a, b và diệp lục tổng số. Sự sụt giảm chất diệp lục là
do sự ức chế tổng hợp chất diệp lục.Tích lũy hàm lượng chất khô bị giảm khi tình
trạng thiếu nước kéo dài [39], [40], [92]. Căng thẳng về nướcthườngxuyêndẫn
đếnthay đổivề giải phẫu họcnhưgiảmkích thướccủa các tế bàovà các khoảng
gianbào, vách tế bào dày hơn vàphát triển hơncủamôbiểu bì, giảm kích thước lá và
thay đổi trong hệ rễ[40], [92].
Sự thoát ra củacác chất hòa tanlàkết quả củahiện tượng tổn thươngmàng tế
bào. Đây là một phản ứngthông thườngcủamôcây lạcdưới ảnh hưởng của một số
điều kiện bất lợi từ môi trường như nhiệt độthấphoặc cao, độ ẩm của đấtthấp hoặcđộ

mặn của đấtcao. Nhiều nghiên cứu đãchỉ ra rằng,canxilà yếu tố cần thiếtđể duy


trìtính toàn vẹncủa màng. Quá trình bổ sungcanxicó ảnh hưởngthuận lợiđến
mốiquan hệvề nướccủa cây trồng vàkhả năng chịukhô hạntrongcây lạc[39],
[92].Thiếu nướctrong đất ởgiai đoạn hình thànhvỏ quả có thểlàm giảmsự hấp
thucanxi cho phát triển vỏ vàgây rahiện tượng vỏkhông dày, hàm lượng
canxithấptrong vỏvàhạt.Dấu hiệu điển hìnhcủa sự thiếu hụtcanxitronghạt bao
gồmtimrỗng,hư hỏng phôihoặcphát triểnchồi mầm.
Hầu nhưtất cả cácquá trìnhtrao đổi chất đềubị ảnh hưởng bởisự
thiếunước.Hoạt độngcủa các enzymebị suy giảm do hiện tượng thiếu hụtnước
nghiêm trọnggây ra.Phức hệ carbohydrate vàproteinbị phá hủybởi các enzymethành
các loại đườngđơn giảnvà các amino acid tương ứng.Proline, một aminoacid, được
tích lũy mỗi khi thực vật gặp điều kiện bất lợi về độẩm. Hàm lượng proline được
tích lũynhiều hơn sau khi cây trồng gặp hạn, do đóhàm lượng nàyđược coi là mộtchỉ
số tốt khi nghiên cứu về cây trồng chịu hạn[39], [40].
Tốc độ tăng trưởng của rễ lạc bị ảnh hưởng bởi độ ẩm của đất. Thiếu hụt về
nước kích thích sự tăng trưởng của rễ vào trong đất sâu hơn.Nghiên cứu đã chỉ ra
rằng, rễ lạc chiết xuất nước trong đất có hiệu quả ở độ sâu ít nhất là 180 cm trong
đất cát mịn. Tất cả những đặc điểm này góp phần làm tăng khả năng tránh bị khô
hạn của cây lạc[92].
Tác động của hạn đến các giai đoạn phát triển của cây lạc
Thời kì trước ra hoa
Trong mỗi thời kì sinh trưởng cây lạc chỉ có khả năng chịu hạn ở một mức
độ nhất định [31]. Biểu hiện bề ngoài khi cây lạc bị hạn ở tất cả các thời kì sinh
trưởng rõ rệt nhất là ở bộ lá. Khi độ ẩm đất giảm, lá lạc nhỏ và dày hơn, màu lá từ
xanh đậm chuyển dần sang xanh nhạt do diệp lục bị phá huỷ. Ở thời kì trước ra hoa,
nhu cầu về nước không cao lắm. Cây lạc chịu được hạn nhất vào thời kì trước ra
hoa, bị hạn trong thời gian ngắn ở thời kì này chỉ làm chậm sự phát triển và tốc độ
sinh trưởng dễ được khôi phục trở lại nếu được tưới đủ ẩm [13], [62], [79].

Trong quá trình ra hoa
Những quan sát cho thấy, thời gian bắt đầu ra hoa của cây lạc không bị trì
hoãn bởi khô hạn[39].Tuy nhiên thiếu nước trong thời kì ra hoa làm giảm nghiêm


trọng số hoa, đợt rộ không hình thành được, thời gian ra hoa kéo dài, tỉ lệ hoa có ích
giảm đi do quá trình thụ phấn bị cản trở. Vì vậy, hạn ở thời kì ra hoa có thể kéo dài
thời gian ra hoa – chín của lạc , gây ảnh hưởng đáng kể tới năng suất của lạc [13],
[39]. Sự thiếu hụt nước ở thời kì ra nụ hoa đã làm giảm diện tích lá, làm giảm sút
cường độ quang hợp của lá, giảm khả năng đậu quả và khối lượng quả chắc, giảm
hàm lượng lipid trong hạt lạc [8].
Quá trình hình thành quả
Cây lạc có thể gặp điều kiện bất lợi về nước trong suốt quá trình đâm tia và
phát triển quả[79]. Điều này sẽ dẫn đến làm giảm rõ rệt về năng suất, mức độ giảm
phụ thuộc vào từng giống lạc.Không chỉ năng suất lạcmà chất lượng của hạtcũng bị
giảm dưới điều kiện hạn hán. Tia không có khả năng thâm nhập hiệu quả vào trong
đất khô. Quá trình đâm tia và vùng rễ trong khu vực đất thiếu nước làm giảm tốc độ
tăng trưởng của quả và hạt giống xấp xỉ 30% và giảm trọng lượng cho mỗi hạt từ
563 đến 428 mg[39]. Hạntronggiai đoạnhình thành quảvà hạtlàm giảm năng suất5685% [84], [104].Trong giai đoạn hình thành quả, do diện tích lá đạt cao nhất, tốc độ
chất khô tích luỹ cũng cao nên cần lượng nước lớn nhất so với các giai đoạn khác
trong thời kì sinh trưởng. Độ ẩm đất có thể giảm đi trong thời kì quả chín (65% 70%). Độ ẩm quá cao trong thời kì này (trên 90%) thường dẫn đến lốp đổ và dễ làm
quả bị thối, nảy mầm [7], [79].
1.1.2. Cơ chế chịu hạn của thực vật
Sự chống chịu hoặc mẫn cảm đối với các yếu tố cực đoan phụ thuộc vào đặc
tính của loài, kiểu gen, các giai đoạn phát triển của thực vật. Tính chống chịu là khả
năng của thực vật có thể ngăn ngừa được thương tổn khi bị tác động bất lợi từ ngoại
cảnh. Hạn tác động lên cây theo hai hướng chính, làm tăng nhiệt độ cơ thể của cây
và gây mất nước trong cây. Tính chịu hạn là khả năng của cây chịu đựng sự đốt
nóng và khô [7].
Cơ chế chịu hạn của thực vật rất phức tạp, không chỉ liên quan đến đặc

điểm hình thái giải phẫu mà còn liên quan đến những thay đổi thành phần hoá sinh
trong tế bào, sự điều chỉnh hoạt động của gen liên quan đến tính chịu hạn của thực
vật. Những thực vật tồn tại trên môi trường thiếu nước làm cho chúng bị mất cân


bằng về thẩm thấu và các cơ chế bảo vệ của thực vật được khởi động để phản ứng
với tình trạng thiếu nước cực đoan [45].
1.1.2.1. Cơ chế biến đổi hình thái của đặc tính chịu hạn
Khả năng chịu hạn của thực vật liên quan đến việc thay đổi toàn bộ cơ thể,
mức độ mô, mức độ sinh lý và phân tử. Biểu hiện của một hoặc sự kết hợp của
những thay đổi này xác địnhkhả năng cơ thể thực vật duy trì được sự sống dưới điều
kiện độ ẩm giới hạn. Những cơ chế bảo vệ của thực vật đã được nhiều nhà nghiên
cứu tìm hiểuvà phân tích, trong đó cơ chế biến đổi về mặt hình thái trong điều kiện
hạn đã được đề cập đến và giải thích [45].
Thực vật có thể phát triển nhanh về mặt hình thái và thúc đẩy quá trình hình
thành hạt (cơ chế thoát hạn). Cơ chế này được thể hiện ở việc trưởng thành và ra
hoa sớm, thay đổi thời gian sinh trưởng cho phù hợp với giai đoạn thiếu nước. Phát
triển những giống có thời gian sinh trưởng ngắn là một chiến lược có hiệu quả cho
việc giảm thiểu tổn thất về năng suất cây trồngdưới tác động của hạn, giúp cây
trồng tránh được những điều kiện bất lợicủa môi trường [45], [75].
Các cơ chế làm giảm sự mất nước từ thực vật như kiểm soát sự thoát hơi
nước của khí khổng, hoặc duy trì sự hấp thu nước thông qua một hệ thống rễ tốt (cơ
chế tránh hạn)[75], [104]. Sinh khối, mật độ, chiều dài và chiều sâu của rễ là các
đặc điểm chính giúp cho việc tránh hạn và ảnh hưởng đến năng suấtcây trồng dưới
tác động thiếu nước của môi trường [45], [75],[121, [104].
Có hai cơ chế của cây trồng để làm giảm lượng nước mất đi đó là sự thay đổi
độ mở của khí khổng và làm giảm lượng bức xạ hấp thụ. Khi cây gặp hạn, khí
khổng đóng lại, ngăn chặn sự thoát hơi nước ra ngoài. Khi mất nước nhiều, khí
khổng không còn khả năng đóng, nước ồ ạt thoát ra ngoài dẫn đến cây héo và chết.
Để duy trì cân bằng nước nội bộ có hiệu quả, khí khổng phải đóng chặt và sự mất

nước qua tầng biểu bì phải nhỏ [45], [75]. Cơ chế làm giảm lượng nước mất đi bằng
cách giảm lượng bức xạ hấp thụ đạt được nhờ hoạt động của lá hoặc sự thay đổi đặc
điểm phản xạ của lá. Sự cuộn lá là chuyển động thụ động cũng có tác động làm
giảm sự bức xạ. Giảm diện tích bề mặt thoát hơi nước để làm giảm lượng nước mất
đi. Các cây trồng chịu hạn thường có số nhánh và số lá ít, diện tích lá giảm. Sự giảm


sinh trưởng của lá khi thiếu nước làm giảm nhu cầu nước. Giảm diện tích lá được
coi là một yếu tố quan trọng trong khả năng chịu hạn của cây trồng [45].
Trên phương diện hình thái thì chồi và rễ bị tác độngnhiều nhất bởi tình trạng
thiếu nước. Đây đều là những bộ phận quan trọng của thực vật trong sự thích nghi
với hạn hán. T

ái lá có lông là một đặc điểm chịu khô hạn giúp bảo vệ lá khi

nhiệt độ quá cao. Lông lá làm giảm nhiệt độ và thoát hơi nước.Hình thành lớp cutin
và sáp trên bề mặt cũng là một trong những phương pháp hiệu quả về mặt kiểu hình
nhằm chống mất nước [45].
Như vậy, thực vật có thể thoát khỏi hạn hán bằng cách rút ngắn thời gian
sinh trưởng, và tránh hạn với việc duy trì tiềm năng nước trong mô bằng cách giảm
sự mất nước,tăng cường sự hấp thu nước, hoặc cả hai. Một số thực vật có thể làm
giảm diện tích bề mặt của chúng bằng cách rụng lá hoặc tạo lá nhỏ.
1.1.2.2. Cơ chế sinh lý, hóa sinhcủa đặc tính chịu hạn
Điều chỉnh áp suất thẩm thấu (ASTT), bảo vệ thẩm thấu, các chất chống oxy
hóa cóvai trò vô cùng quan trọng hình thành nên một hệ thống bảo vệ có ảnh hưởng
đếnkhả năng chịu hạn của thực vật[45], [73].
Cơ chế hóa sinh có tác dụng bảo vệ tế bào trong điều kiện mất nước là: khử
độc các sản phẩm trung gian trong quá trình phân giải các hợp chất cao phân tử, xúc
tiến sự phục hồi các cấu trúc sinh học bị hư hại. Sau khi hạn ngừng tác động, quá
trình phục hồi diễn ra nhanh nếu bộ gen được bảo tồn khỏi hư hại trong thời gian

khô hạn. Điều đó có được là do các protein trong nhân với sự tham gia của các
protein đáp ứng với stress đặc hiệu, nhờ vậy mà DNA chỉ bị biến đổi khi hạn nặng
kéo dài. Khi gặp hạn, trong tế bào xuất hiện nhiều H2O2 gây độc cho tế bào và cho
cây, vì vậy trong cây có hiện tượng tăng hoạt tính các enzyme oxydoreductase để
giải độc. Đây cũng là một cơ chế để bảo vệ ti thể khỏi bị tổn thương.
Có rất nhiều hợp chất liên quan đến tính chịu hạn của thực vật, một số chất
được quan tâm nghiên cứu trong việc đáp ứng với hạn của cây trồng như các
phytohormon, amino acid, đường, polyamine, sắc tố và carotenoid… [45].
a) Bảo vệ nước trong tế bào vàmô
Cải thiệntình trạngnướctrong mô có thể đạt được thông quasự điềuchỉnh


thẩm thấu hoặc thay đổi tính linh hoạt củatế bào. Điềunàylà cần thiếtđể duy trì hoạt
độngsinh lý trong thời gian hạn hán kéo dài.Thay đổi tính linh hoạt của tế bào có thể
thông qua biến đổi thành tế bào. Như vậy, có thể ngăn cản nước đi từ trong tế bào ra
ngoài nhờ biến đổi cấu trúc thành tế bào, thu hẹp kênh trao đổi nước [45].
Cáccơ chế khác nhau như điều chỉnhASTT, hình thành abscisicacid…có thể
chống chịuđối vớitác độngcủahạnbằng cách duy trì tiềm năngnướctrong mô cao.Với
sự tích tụ các chất hòa tan, khả năng thẩmthấucủa tế bàođược tăng lên, thu hút
nướcvào trong tế bàovàgiúpbảo vệ sức trương. Điều chỉnh ASTTgiúp duy trì sự
cânbằngvề nước trong tếbàocùng với sự tích lũycác chất hòa tantrong tế bào chất,
do đó giảm thiểunhững tác hại của hạn hán [45], [75], [109].
b) Các chất chống oxy hóa
Hệ

thống

bảovệchốngoxyhóatrongtế

bào

thực

vậtbao

gồmcả

cácthànhphầnthuộc enzyme vàphienzyme. Các thành phần có bản chất enzymebao
gồm

superoxide

dismutase,

catalase,peroxidase,

ascorbateperoxidasevàglutathionereductase. Các yếu tố phienzymecó cystein,
glutathione khửvà ascorbicacid [45].Trong điều kiệnmôi trường bất lợi,như hạn,
hoạtđộngcủa các enzyme chống oxy hóadiễn ra mạnhvà hàm lượngcủacácyếu tốphi
enzyme rất quan trọng.
Enzyme chống oxy hóa là một trong nhữngcơ chế hiệu quảchống lại
stressoxyhóa.Sự phiên mã của một số gen mã hóa cho enzyme chống oxy hóa như
glutathione reductase hoặc ascorbate peroxidase diễn ra mạnh trong suốt quá trình
phục hồi từ thời điểm thiếu nước, điều này đóng một vai trò quan trọng trong việc
bảo vệ các bộ phận của tế bào khỏi bị hư hại bởi các phản ứng oxy hóa. Thiệt hại do
oxy hóa trong các mô thực vật được giảm bớt bởi sự phối hợp hoạt động của một hệ
thống các chất chống oxy hóa có bản chất phi enzyme. Chúng bao gồm β-carotene,
acid ascorbic,α-tocopherol, glutathione khử[45]. Sự hình thành carotenenhư một
phần quan trọng của hệ thống bảo vệ chống oxy hóa ở thực vật [119]. β-carotene
trong lục lạp của tất cả các cây xanh liên quan chặt chẽvới hệ thống trung tâm

quang hệ I và quang hệ II. Ở đây, β-carotene, ngoài chức năng như một sắc tố còn


hoạt động như một chất chống oxy hóa hiệu quảvà đóng một vai trò duy nhất trong
việc bảo vệ chu trình quang hóa [45].
c) Ổn định màng tế bào
Màng sinh học là mục tiêu tác động đầu tiên của nhiều nhân tố phi sinh học
bất lợi. Việc duy trì tính toàn vẹn và sự ổn định của màng dưới điều kiện thiếu nước
là một cơ chế chính trong khả năng chịu hạn ở thực vật. Khả năng chịu hạnđược
xem như tăng sự ổn định màng tế bào trong điều kiện thiếu nước[45].
Các nguyên nhân của sự phá vỡ màng chưa được biết, tuy nhiên, giảm bớt về
thể tích tế bào gây ra hiện tượng tăng độ nhớt của các thành phần tế bào chất. Điều
này làm tăng khả năng tương tác phân tử dẫn đến có thể gây ra biến tính protein.
Một loạt các hợp chấtđược xác định có thể ngăn chặn các phân tử tương tác bất lợi
trong điều kiện hạn. Có thể kể đến là proline, glutamate, glycinebetaine, sorbitol,
fructans,sucrose và oligosaccharides. Khả năng thoát ion ra khỏi tế bào có thể là do
hiện tượng ức chế bởi nhiệt của các enzyme chịu trách nhiệm giới hạn màng để duy
trì gradient hóa học trong tế bào [75].
d) Điều hòa sự phát triển của thực vật
Điều hòa sự phát triển của thực vật liên quan đến các phytohormon được sản
xuất trong tế bào. Những chất có ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý trong cơ thể
thực vật như auxin, gibberellins, cytokinin, ethylene và abscisic acid. Dưới điều
kiện khô hạn, các auxin nội sinh, gibberellins và cytokinin thường giảm, trong khi
đó abscisic acid và ethylene lại tăng [109].
ABA là một chất ức chế sự tăng trưởng và được sản xuất dưới tác động của
nhiều nhân tố bất lợi từ môi trường, trong đó có hạn. Hàm lượng ABA tăng kéo
theo sự đóng lỗ khí làm giảm cường độ thoát hơi nước, ABA xúc tiến quá trình
tổng hợp protein và amino acid có tác dụng tăng khả năng giữ nước của tế bào trong
điều kiện khô hạn. Tất cả thực vật đáp ứng với hạn và nhiều nhân tố bất lợi khác
bằng cách tích lũy ABA. ABA thường gặp trong tất cả thực vật có hoa và được

công nhận là một loại hoocmon điều chỉnh biểu hiện gen và hoạt động như một tín
hiệu cho sự khởi đầu của các quá trình liên quan đến thích ứng với hạn và và các
yếu tố bất lợi khác từ môi trường[45]. Tăng nồng độ ABA dẫn đến nhiều thay đổi


trong quá trình phát triển, sinh lý và tăng trưởng. ABA làm thay đổitốc độ tăng
trưởng tương đối của các bộ phận khác nhau trong thực vật như ức chế phát triển
diện tích lá,phát sinh rễ nhiều và sâu. ABA gây ra sự xuất hiện của một loạt các sự
kiện phức tạp dẫn đến việc đóng cửa khí khổng, vốn là một yếu tố phản ứng bảo tồn
nước.Do hiệu quả trong việc khí khổng đóng, ABA có thể kiểm soát tốc độ thoát
hơi nước, đến mức độ nào đó, có thể tham gia vào cơ chế chịu hạn ở thực vật [130].
Ethylene từ lâu đã được coi là một hormone ức chế sự tăng trưởng [109].
Ethylenecó thể đáp ứng điều hòa hiệu suất lá trong suốt vòng đời của nó cũng như
xác định sự khởi đầu của quá trình lão hóa tự nhiên và sự lão hóa gây ra qua trung
gian hạn hán. Nhiều nghiên cứu gần đây cho rằng,cơ thể thực vật có thể tối ưu hóa
quá trình tăng trưởng và chống chịu stress phi sinh học như hạn hán. Phản ứng này
có liên quan đến quá trình tổng hợp ethylene [86].
Polyaminelà cation có thể kết hợp với các thành phần anion của màng tế bào,
chẳng hạn như phospholipid, do đó bảo vệ màng kép lipid khỏi bị hư hỏngdưới tác
động của các yếu tố bất lợi.Sự quan tâm trong các nghiên cứu ngày càng tăng về sự
tham gia của polyamine trong phản ứng bảo vệ cơ thể thực vật chống lại các yếu tố
bất lợitừ môi trường [45]. Nhiều gen mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình
trao đổi chất polyamine được tách dòng từ một số loài, và biểu hiện của chúng dưới
một số điều kiện bất lợi đã được phân tích[129].
e) Các chất hoà tan và điều chỉnh thẩm thấu
Một trong những khả năng chống chịu các yếu tố bất lợi phổ biến nhất trong
thực vật là sản xuất lượng lớn các loại chất hữu cơ hoà tan khác nhau. Chúng bảo vệ
cơ thể thực vật khi gặp các yếu tố bất lợi thông qua các biện pháp như điều chỉnh
thẩm thấu, khử độc bởi các phản ứng oxy hóa, ổn định màng tế bào và cấu trúc tự
nhiêncủa enzyme, protein. Điều chỉnh thẩm thấu là một cơ chế để duy trì mối quan

hệ về nước dưới sự bất lợi về thẩm thấu. Nó liên quan đến sự tích tụ của một loạt
các phân tử/ion, bao gồm đường tan, proline, glycinebetaine, axit hữu cơ, canxi,
kali, ion clo…[7]
Quá trình điều chỉnh thẩm thấu được thực hiện với sự tích lũy các chất hòa
tan. Trong số này, prolinelà một trong những chất quan trọng nhất và sự tích lũy


proline tự do là một đáp ứng phổ biến của thực vật bậc cao, tảo, động vật và vi
khuẩn khi tiềm năng nước thấp [119]. Vai trò sinh lý của proline tự do bao gồm bảo
vệ các cấu trúc nội bào và các đại phân tử khi tế bào gặp các điều kiện bất lợi về
ASTT, bảo vệ các cấu trúc protein và nâng cao hoạt tính của nhiều loại enzyme
khác nhau, chống oxy hóa với chức năng phân cắt các gốc oxy phản ứng và bất hoạt
các gốc oxy tự do [108].
Glycinebetaine (N, N, N-trimethyl glycine) là một trong những hợp chất hoà
tan được nghiên cứu nhiều trong thực vật, động vật và vi khuẩn [119]. Nhiều
nghiêncứu chứng minh rằng, glycinebetaine đóng một vai trò quan trọng trong việc
tăng cường khả năng chống chịu của thực vật dưới tác động của các yếu tố bất lợi
phi sinh học trong đó có hạn hán [90].
Trehalose được biết đến là một disaccharide không có tính khử của glucose,
đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ và nâng cao sức đề kháng của cơ thể chống lại
những yếu tố bất lợi của môi trường. Trongtự nhiên, trehalose được sinh tổng hợp
như một cơ chế đáp ứng với các yếu tố bất lợi của nhiều cơ thể sinh vật, bao gồm vi
khuẩn, nấm, tảo, côn trùng, động vật không xương sống và thực vật bậc thấp [121].
Khả năng sản xuất trehalose, trước đây được cho là không có ở thực vật bậc cao,
hiện nay đã có nghiên cứu cho thấy chúng được tích lũy với số lượng lớn ở một số
cây dương xỉ chịu hạn và thực vật hạt kín chịu khô hạnMyrothamnus flabellifolia
[45]. Sự có mặt với hàm lượng thấp của trehalose đã được chứng minh cả trong
thuốc lá và nhiều thực vật bậc cao [66]. Vai trò sinh lý của trehalose bao gồm ổn
định hiệu suất của các enzymekhử nước, protein và màng lipid,cũng như bảo vệ các
cấu trúc sinh học dưới tác động của khô hạn [121].

f) Protein liên quan đến khả năng chịu hạn
Một số hormon hoặc chất kích thích (ví dụ như ABA) sẽ giúp cho cây hoạt hóa
một loạt các quá trình sinh tổng hợp các protein và các chất khác ngăn ngừa tác
động bất lợi và cây có thể thích ứng với điều kiện này. Dựa vào khả năng chống
chịu, tính chất và mức độ phản ứng khác nhau của từng loài, người ta có thể chia
các protein được sinh ra trong quá trình đó làm 2 loại, các protein có chức năng


chống chịu và các protein có chức năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có
chức năng trong việc phản ứng đối với tình trạng stress [7].
Tùy trong từng điều kiện môi trường bất lợi khác nhau, thực vật sản sinh ra
những loại protein có chức năng chống chịu khác nhau. Ví dụ đối với khô hạn, có
thể biểu hiện những loại protein như: môi giới phân tử (MGPT)- molecular
chaperone, LEA protein, protein kênh chuyển nước qua màng - aquaporin, proline,
transporters, các enzyme loại độc tố (detoxification enzymes), protein chống đông
lạnh (antifreeze proteins), protein gắn với mRNA (mRNA binding protein), enzyme
chủ chốt trong sinh tổng hợp các chất điều hoà áp suất thẩm thấu và các loại
protease khác nhau (hình 1.1) [101].

Hình 1.1. Chức năng của các gen cảm ứng với điều kiện khô hạn [101]
Để biểu hiện bất kỳ gen nào cũng đều cần có sự hoạt hóa promoter của chúng.
Hệ thống tín hiệu nhận biết từng loại stress khác nhau, bao gồm nhiều chất cảm ứng
có nguồn gốc protein hoặc là các chất khác. Đó là các yếu tố điều hòa phiên mã như
MYB, MYC, NAC, DREB, protein kinase như MAP kinase...Các protein có chức
năng điều khiển sự biểu hiện gen và có thể có chức năng trong việc phản ứng đối


với tình trạng hạn như protein kinase, TF và các enzyme trong chuyển hoá
phospholipid.
Protein chức năng như aquaporins có khả năng tạo điều kiện thuận lợi và

điều chỉnh trao đổi nướcthụ động qua màng. Chúng là thành viênthuộc một họ
protein bảo thủ cao trong màng tế bào. Ở thực vật, aquaporins có mặt nhiều trong
màng sinh chất và trong màng không bào. Phân tích cấu trúc của aquaporins đã cho
thấy cơ chế chung của protein vận chuyển nước qua màng. Aquaporins có thể điều
chỉnh tính thấm của màng tế bào theo cả hai hướng phụ thuộc vào ASTT[7].
Aquaporins giữmột vai tròđặc biệt trong việc kiểm soát vận chuyển nướcqua màng.
Protein sốc nhiệt (HSP – heat shock protein)có chức năng môi giới phân tử
được gọi là chaperone. Chúng có một vai trò quan trọng việc tái tạo lại cấu trúc
không gian đúng của protein mới tổng hợp, duy trì cấu trúc đặc hiệu của protein,
ngăn chặn sự hủy hoại của protein chưa tạo cấu trúc đúng, khởi đầu cho sự phân
giải protein bị biến tính. Protein sốc nhiệt có trọng lượng phân tử thấp thường được
sản xuất để đáp ứng với các yếu tố bất lợi của môi trường [7], [119].HSP chiếm trên
1% protein tổng số trong lá, rất đa dạng và có ở hầu hết các loài thực vật. Chúng
không những xuất hiện khi gặp nóng đột ngột mà còn luôn có mặt trong quá trình
sinh trưởng bình thường, các giai đoạn biệt hóa của mô, thời kỳ sinh sản, cũng như
được tổng hợp ở điều kiện cực đoan khác của môi trường trong đó có hạn [7].
Protein ổn định màng tế bào và protein biểu hiện trong giai đoạn cuối của
quá trình hình thành phôi (LEA) là những nhóm protein khác chịu trách nhiệm quan
trọng trong việc đáp ứngvới khả năng chịu hạn. Thuộc về nhóm protein này có thể
kể đến dehydrins. Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc cô lập ion được tập
trung trong quá trình mất nước của tế bào. Những protein này giúp bảo vệ protein
khỏi sự suy giảm và proteinases, có chức năng loại bỏ protein hư hỏng và biến tính.
Dehydrins thuộc nhóm protein LEA, được tích lũy để đáp ứng với sự mất nước và
nhiệt độ thấp.Trong cấu trúc của các protein này có vùng bảo thủ cao giàu Lysine
được dự đoán tham gia vào tương tác kỵ nước, dẫn đến làm ổn định cấu trúc của các
đại phân tử [107].


Nhiều protein biểuhiện nhằm đáp ứng với khô hạn trong đó có protein
thuộc nhóm LEAđã được Ramesh và đtg (2007) nghiên cứu. Các tác giả đã chứng

minh được sự liên quan về chức năng của các protein này với việc phát triển các
giống lạc có khả năng chịu hạn. Trong nghiên cứu, một số protein liên quan đến sự
bất lợi về nước trong kiểu gen cây lạc đã được xác định, đánh giá vai trò của các
protein này trong cây lạc để thích nghi với khí hậu và thích ứng với hạn hán [91].
1.1.2.3. Cơ chế phân tử của đặc tính chịu hạn
Thực vật phản ứng và thích ứng,sống sót dưới tác động của sự khô hạn
bằngcách đáp ứng khác nhau về mặt hình thái, sinh lý, hóa sinh và phân tử. Khả
năngchịu hạn được xem như thực vật có khả năng phát triển, ra hoa và cho năng
suất kinh tế dưới điều kiện không được cung cấp nước tối ưu [45]. Hạn hán làm ảnh
hưởng đến các mối quan hệ về nước của thực vật ở mức độ tế bào, mô và cơ quan,
gây ra những phản ứng đặc hiệu cũng như không đặc hiệu, phản ứng thích ứng hoặc
gây thiệt hại [23], [28].
Biểu hiện gen có thể đượckích hoạt trực tiếp dưới tác động của các yếu tố bất
lợi hoặc là kết quả của các đáp ứng thứ cấp khi bị thương tổn. Tuy nhiên khả năng
chống chịu hạnlà một hiện tượng phức tạpliên quan đến hoạt động của nhiều gen
[7]. Khi gặp hạn, một loạt các cơ chế bảo vệ được khởi động thông qua việc tiếp
nhận các tín hiệu được cơ thể thực vật nhận biết. Khi đó, những thay đổi trong biểu
hiện gen (điều chỉnh lên và xuống) sẽ diễn ra. Những gen khác nhau được cảm ứng
để đốiphó với hạn hán ở mức độ phiên mã, các sản phẩm của gen được cho là có
chức năng trong chống chịu hạn [101].
Có hai xu hướng tìm kiếm các gen liên quan đến tính chống chịu của cây trồng
đối với điều kiện sinh thái phi sinh học bất lợi. Xu hướng thứ nhất là tìm những gen
liên quan trực tiếp đến khả năng chống chịu hạn, lạnh, ngập úng hay phèn
mặn…(Ví dụ RD29A), xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo
hướng các yếu tố điều khiển như các nhân tố phiên mã [1].
Các yếu tố cực đoan của môi trường trong đó có hạn tác động lên các nhân tố
phiên mã (ví dụ CBF1 – hình 1.2), tiếp theo, nhân tố phiên mã hoạt hóa khả năng
phát hiện và gắn với DNA nhờ các yếu tố cis phản ứng với sự mất nước (DRE –

drought responsive element) trên promoter của gen đích (ví dụ RD29A – hình
1.2)tạo thành đường dẫn truyền tín hiệu phức tạp: từ sự nhận biết, cảm ứng với điều
kiện môi trường đến việc hoạt hóa các nhân tố phiên mã và tham gia vào quá trình
điều hòa biểu hiện gen đích ở giai đoạn phiên mã. Trong quá trình này, có thể đồng
thời tham gia nhiều gen, tổng hợp cùng một lúc nhiều loại protein điều hòa phiên
mã cũng như protein liên quan đến tính chống chịu.

Hình 1.2. Mô hình hoạt động của gen liên quan đến khả năng chống chịu hạn [76]
Việc tìm kiếm gen liên quan đến khả năng chịu hạn theo xu hướng thứ nhất
được nhiều phòng thí nghiệm chú ý trên nhiều đối tượng khác nhau. Ví dụ như ở Cỏ
Ba lá, lúa mỳ, lúa mạch, ngô, Arabidopsis, lúa nước, đậu tương, lạc…Hai nhóm gen
được mô tả nhiều và chi tiết là nhóm LEA của cây lúa mạch và nhóm RAB của cây
lúa nước. Nhóm thứ nhất mã hóa những protein xuất hiện vào thời kỳ muộn của quá
trình hình thành phôi sau khi thụ phấn và đó là những protein góp phần bảo vệ phôi
trong quá trình ngủ và chịu hạn của phôi trong hạt khô. Nhóm thứ hai liên quan đến
tác động ức chế sinh trưởng tế bào của ABA khi thực vật gặp điều kiện bất lợi. Các
gen RAB phản ứng với ABA ngoại sinh và nội sinh tạo ra những protein có chức
năng ức chế và bảo vệ. Đây là hai nhóm gen được chú ý nhiều để sử dụng trong
công nghệ gen [1].


Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh vai trò làm tăng tính chống chịu khô
hạn của các gen mã hóa cho protein LEA như gen mã hóa cho protein Em của lúa
mỳ, đậu xanh, đậu tương, lúa gạo [7]. Chức năng của chúng được dự đoán dựa trên
khả năng giữ nước tốt của tế bào. Gen mã hóa cho protein D7 từ cây bông, protein
HVA1 từ đại mạch có chức năng cô lập ion trong quá trình mất nước. Gen mã hóa
cho LE25 từ cà chua và D113 từ cây bông, protein của các gen này có thể thay thế
vị trí nước trong màng tế bào để giữ ổn định cấu trúc này [7]. Gen OsLEA3-1 ở lúa
đã thể hiện tính chống chịu khô hạn trong điều kiện đồng ruộng nhờ sự điều khiển
của promoter CaMV35S [124]. Đặc điểm chung của các protein LEA là chúng có

các chuỗi peptide ưa nước cao nên một số LEA protein thích hợp với vai trò mang
nước, những protein này có thể giúp duy trì nhu cầu nước trong tế bào. Chúng có
thể xem như các chất tan thích hợp đóng vai trò duy trì cấu trúc của không bào khi
thiếu nước [7].
Phần lớn dehydrin đều được tổng hợp khi cảm ứng với điều kiện mất nước.
Gen mã hóa cho protein RAB 18 ngăn ngừa sự mất nước trong tế bào khí khổng ở
lá, còn gen mã hóa cho protein LTI29 và ERD14 tăng cường giữ nước trong rễ. Khi
gặp hạn hoặc bị mất nước, chúng đều được tổng hợp với lượng đáng kể ở
Arabidopsis. Gen mã hóa cho protein DHN13 của đại mạch có trong hầu hết các mô
tế bào ở điều kiện bình thường cũng như khi gặp hạn, lạnh và xử lý ABA, còn
protein DHN4 chỉ có trong hạt, khi xử lý ABA và mất nước. Các gen dehydrin khác
của đại mạch như Dhn1, Dhn 3, Dhn 4, Dhn 6, Dhn 9 đều có sản phẩm phiên mã rõ
rệt khi mất nước và xử lý ABA [7], [94].
Nhiều gen mã hóa cho enzyme tham gia vào các phản ứng với hạn đã được
nghiên cứu về mặt chức năng. Các độc tố xuất hiện dưới ảnh hưởng của các yếu tố
bất lợithường do nguyên nhân có sự tích lũy các phân tử phản ứng lại với các yếu tố
bất lợi như aldehyde. Các phân tử này có thể là nguyên nhân phân giải lipid, làm
biến đổi các protein và acid nucleic. Dưới tác động của aldehyde dehydrogenase
(ALDH), aldehyde có thể bị biến đổi thành carboxylic acid không độc. Gen mã hóa
cho ALDH xuất hiện trong tất cả các cơ thể sinh vật cho thấy sự quan trọng của nó
trong các chức năng sinh học nói chung. Sự cân bằng aldehyde là rất cần thiết trong


quá trình bảo vệ thẩm thấu khỏi các yếu tố bất lợi. Gen BADH (betaine aldehyde
dehydrogenase) cũng đóng vai trò quan trọng trong sự chống chịu của thực vật với
hạn và muối. Gen JcBD1 thuộc nhóm này đã được biểu hiện, sau khi đánh giá cho
thấy khả năng chịu hạn cao hơn so với đối chứng [131]. Trong các chất tan, proline
được xem là chất đóng vai trò chính trong điều chỉnh thẩm thấu ở các cây chịu khô
hạn hoặc đất nhiễm mặn. Vai trò của các gen mã hóa cho các enzyme xúc tác cho
quá trình tổng hợp proline liên quan tới khả năng chịu hạn của thực vật nói chung

và cây trồng nói riêng đã được nhiều nghiên cứu đề cập đến [42]. Hầu hết các
amino acid tăng lên khi cảm ứng với điều kiện bất lợi của môi trường nhưng proline
tăng lên rõ rệt hơn cả. Khi tế bào bị mất nước nghiêm trọng hàm lượng proline tăng
lên 48 lần so với đối chứng. Khi xử lý với muối, cây tích lũy proline một cách từ từ
và tăng gấp 7 lần so với đối chứng sau 72 giờ xử lý [112].
Rất nhiều gen được phân lập và biểu hiện có mối quan hệ với tính kháng hạn
đã được chứng minh như trehalose6-phosphate-synthase (gen TPS) phân lập từ cây
bông [66], gen CaAMP1 từ cây tiêu [69], gen TaAIDFFa từ lúa mỳ [126], gen codA
từ cây khoai tây [20], gen mã hóa chaperonin từ cây đậu tương [10] … Đã có nhiều
công bố nghiên cứu về gen mã hóa cho cystatin và thảo luận về mối liên quan của
cystatin với khả năng chống chịu của thực vật như khả năng chịu hạn, lạnh, mặn.
Gen mã hóa cystatin đã được phân lập từ cây lạc [16], đậu đũa [41],
Arabidopsis[132],…
Theo xu hướng thứ hai tập trung tìm hiểu về gen chống chịu theo hướng các
yếu tố điều khiển, ví dụ như các nhân tố phiên mã (bZIP, MYB, MYC,
EREBP/AP2, NAC, DREB và zinc fingers). Hiện nay nhóm gen mã hóa cho các
yếu tố điều khiển quá trình phiên mã của những gen liên quan đến khả năng kháng
hạn ở thực vật đang rất được quan tâm nghiên cứu. Gen NAC (mã hóa cho nhân tố
phiên mã NAC) khi được chuyển vào cây không chỉ biểu hiện tính chống chịu lại
cùng lúc với nhiều điều kiện bất lợi như hạn, mặn, lạnh mà còn ảnh hưởng tích cực
đến sự phát triển và năng suất cây trồng [57]. Gen TERF1 điều khiển tổng hợp
ethylene responsive factor (ERF) protein đã được chuyển vào lúa cho thấy biểu hiện
khả năng chịu hạn của cây và sống sót trong môi trường có nồng độ muối cao [48],