tạo dòng biểu hiện

TAẽO DOỉNG BIEU HIEN


CẤU TRÚC CƠ BẢN CỦA VECTOR TẠO DÒNG
BIỂU HIỆN


PHIEÂN MAÕ & DÒCH MAÕ IN VITRO


DỊCH MÃ IN VITRO
 Các hệ thống dòch mã in vitro thông dụng :
Dòch chiết thô có chứa :
70/80S RNA, tRNA, aminoacyl-tRNA
 Tế bào hồng
synthetases, nhân tố khởi
cầu lưới thỏ
động/kéo dài/kết thúc + các
 Mầm lúa mì
aa, ATP/GTP, các cofactor (Mg2+,
 E. coli
K+, ..), các hệ thống tái tạo
năng lượng (creatine
phosphate/phosphokinase
 Phương pháp
(eukaryote), phosphoenol pyruvate
- Chuẩn : RNA tinh sạch  protein
(HC lưới, lúa mì)
(prokaryote)
- Phối hợp : DNA  RNA  protein (kết hợp hệ thống phiên mã
(RNA pol của phage + promoter T3, T7, SP6 (E. coli)

 Yêu cầu dòch mã hiệu quả
Eukaryote
Prokaryote

5’-7methylG cap

Trình tự S-D :
5’UAAGGAGGUGA3’

3’ polyA tail
Trình tự “Kozak” :


TẠO DÒNG BIỂU HIỆN TRONG E. COLI
Yêu cầu
 Phiên mã hiệu quả : promoter mạnh và điều khiển được,
có trình tự terminator (ngừng phiên mã) mạnh
Promoter thông dụng :
- lacZ, được điều hòa bởi chất cảm ứng IPTG
- Lambda PL, được điều hòa bởi protein nhạy nhiệt do tế
bào chủ tiết ra
- T7, được điều hòa bởi một promoter khác (lac promoter)
 Dòch mã hiệu quả : chứa trình tự liên kết ribosome
(ribosome binding site-rbs) + codon khởi đầu AUG (GUC) + trình
tự Shine-Dalgarno, codon ưa chuộng
 Dòch mã đúng khung đọc (in frame)
 Biến đổi sau dòch mã : sử dụng chủng E. coli biến đổi di
truyền
 Thêm một số đặc tính khác :

1. Bảo đảm tính ổn đònh : tạo fusion protein ở đầu N, biến
đổi hóa học đầu N (acetyl hóa)/thêm một số aa đặc biệt
(Met, Ser, Ala, Thr, Val, Gly, ..) ; sử dụng chủng chủ đột biến
trên một số gene mã hóa các protease
2. Tạo thuận lợi cho việc thu nhận protein (gắn thêm trình
tự tiết) : gắn trình tự tín hiệu hoặc tạo fusion protein với
protein tiết tự nhiên (MalE) hay một protein của vùng


TAÏO DOØNG
ÑOÀNG KHUNG


KET QUA CAM ệNG TONG HễẽP PROTEIN
ễ E. COLI


MỘT HỆ
THỐNG TẠO
DÒNG BIỂU
HIỆN Ở E.
COLI

Ví dụ : Chủng BL21 DE 3 đột biến mất proteases Lon,
OmpT
Chủng Rosetta có thể cung cấp tRNAs cho 7 codon


 Tinh sạch protein dựa trên ái lực giữa trình tự mục tiêu và
ligand cố đònh:

- Polyhistidine-tag (hexa histidine-tag – 6XHis-tag) : dựa trên
ái lực giữa một chuỗi His với ion Ni 2+ cố đònh thông qua
chelators (NTA-nitriloacetic acid, IDA-iminodiacetic acid)
- GST-tag : dựa trên ái lực giữa glutathione-S-transferase với
glutathione cố đònh
- FLAG-tag : DYKDDDDK, sử dụng kháng thể antiFLAG M1, 2, 5
để tinh sạch ; làm tăng tính tan của protein và có chứa trình
tự nhận biết của enterokinase
- MBP-tag (Maltose Binding Protein) / maltose : protein của
vùng periplasmic, tăng khả năng thu nhận protein trong E.
coli, sử dụng giá thể chứa maltose để tinh sạch


TINH SẠCH PROTEIN ĐÁNH DẤU
Các bước :
 Tạo dòng gene mục
tiêu vào vector có mang
trình tự dùng tinh sạch (+
trình tự cơ chất của
protease)
 Biến nạp vào E. coli và
cảm ứng tạo fusion
protein
 Thu dòch tế bào  cột,
bead, ..
 Thủy giải bằng
protease đặc hiệu
 Thu nhận protein TTH

TINH SAÏCH PROTEIN ÑAÙNH DAÁU HISTIDINE


THỦY GIẢI FUSION PROTEIN ĐỂ THU
NHẬN PROTEIN MỤC TIÊU

Các protease đặc hiệu sử dụng :
Thrombin
Leu-Val-Pro-ArgGly-Ser

His-tag/GST fusion protein

Factor Xa
Ile-Glu/Asp-Gly-Arg 
Enterokinase
Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 

MBP fusion protein


TẠO DÒNG TRONG NẤM MEN
Vì sao dùng vector nấm men ? Phù hợp cho sản xuất lớn
và sử dụng an toàn, tạo dòng trình tự kích thước lớn, cơ
chế hoạt động của eukaryote (điều hòa, spliing, glyosyl
hóa, …)
Phù hợp với các protein chứa liên kết disulfide và được
glycosyl hóa
Các loại vector :
YIp : ổn đònh, YEp : số bản sao lớn, YRp : có thể gắn
chèn vào NST, YCp : thuận tiên cho các nghiên cứu “bổ

sung” , YAC : thu nhận trình tựtạo dòng lớn (> 40 kb), Ty :
nhân bản sau khi gắn chèn vào NST
Chủng chủ thường là Pichia pastoris
Ứng dụng :
- Tổng hợp protein
- Nghiên cứu điều hòa gene


TẠO DÒNG BIỂU HIỆN & CHUYỂN GENE
VÀO TẾ BÀO ĐỘNG VẬT (TRANSFECTION)
Kỹ thuật chuyển gene vào tế bào động vật, đặc biệt
là tế bào động vật có vú Mục tiêu :
- Nghiên cứu biểu hiện gene ở tế bào động vật, đặc
biệt là những sản phẩm cần được biến đổi sau dòch
mã hoặc các gene có chứa intron
- Sản xuất protein hoặc dùng cho liệu pháp gene
- Tạo động vật chuyển gene
Một số vấn đề thực nghiệm
Vector
Gồm 3 nhóm : (1) Plasmid, (2) Plasmid + trình tự eukaryote,
(3) Vector dùng nhân bản gene và gắn chèn vào bộ
gene tế bào chủ
(1) Plasmid + hệ thống phiên mã của ĐV có vú : nhân
bản trong E. coli  chuyển vào tế bào ĐV có vú, gene
gắn chèn vào bộ gene tế bào chủ và biểu hiện bền
vững nhưng yếu
(2) Plasmid + trình tự khởi đầu sao chép eukaryote +
promoter/enhancer (SV40) : hệ thống biểu hiện tạm thời

CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO ĐỘNG
VẬT

Biện pháp chuyển
1. Biện pháp hóa học : Calcium phosphate, DEAE dextran
(polycation)
2. Biện pháp lý học : Điện biến nạp, vi tiêm, liposome, ..
3. Sử dụng vector virus : SV40, baculovirus, retrovirus,
adenovirus, ..…
Marker chọn lọc
- Thymidine kinase (tk) : tổng hợp thymidine, chọn lọc trên
môi trường HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine) với
tế bào chủ tk- Dihydrofolate reductase : kháng methotrexate, tế bào CHO
dhfr- Aminoglycoside phosphotransferase (APH) : kháng các
kháng sinh họ aminoglycoside (kanamycin, neomycin,
geneticin – G418) – Hygromycin B phosphotransferase
- XGPRT–HGPRT (Xanthine-guanine phosphoribosyltransferase) :
kháng mycophenolic acid
- .. ..
Các thành phần của một vector TTH :
1. Plasmid pBR322 chứa : replicon prokaryote (E. coli) + gene
kháng kháng sinh + một số trình tự RE


REPORTER GENE
Reporter gene : gene mã hóa cho protein chỉ thò dễ nhận
biết, được nối với gene mục tiêu để phát hiện và xác
đònh biểu hiện của gene mục tiêu
Các hệ thống thông dụng :
Protein

Hoạt tính & đo lường
 CAT (chloramphenicol acetyl
Chuyển nhóm acetyl đánh dấu
phóng xạ lên
transferase)
chloramphenicol ; phát hiện bằng
sắc ký lớp
mỏng/phóng xạ tự ghi
Nay thay bằng ELISA phát hiện
enzyme CAT
 GAL (-galactosidase)
Thủy giải galactoside không màu 
có màu
X-Gal/IPTG
 GUS (-glucuronidase)
Thủy giải glucuronide không màu
 có màu
MUG phát huỳnh quang, X glucuronide có màu
 LUC (luciferase)
Oxy hóa luciferin phát quang


VÍ DUÏ VEÀ REPORTER GENE :
GFP