TẠO DÒNG CASSETTE GEN ĐỘT BIẾN WZZ (Oantigen chain length determinant gene) CỦA VI KHUẨN Vibrio harveyi TRONG E.coli DH5α

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG CASSETTE GEN ĐỘT BIẾN WZZ
(O-antigen chain length determinant gene) CỦA VI KHUẨN
Vibrio harveyi TRONG E.coli DH5α

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

:TRẦN PHẠM VŨ LINH

Niên khóa

:2009 - 2013

Tháng 06/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG CASSETTE GEN ĐỘT BIẾN WZZ
(O-antigen chain length determinant gene) CỦA VI KHUẨN
Vibrio harveyi TRONG E.coli DH5α

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. NGUYỄN QUỐC BÌNH

TRẦN PHẠM VŨLINH

CN. MAI THU THẢO

Tháng 06/2013


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên,cho tôi gởi lời cảm ơn chân thành đến Ban giám hiệu Trường Đại học
Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, quý thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học
đã tận tâm giảng dạy và truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt 4 năm học đại học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết hơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Quốc Bình và đặc biệt là cô
Mai Thu Thảo, đã cho tôi cơ hội tiến hành đề tài này, chỉ dạy tận tình và cho tôi nhiều
bài học quý giá trong quá trình học tập và làm khóa luận.
Tôi cũng gởi lời cảm ơn chân thành đến 4 người đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong
suốt thời gian làm đề tài, cám ơn cô Ngô Huỳnh Phương Thảo,cô Biện Thị Lan Thanh,
thầy Võ Khánh Hưng và thầy Lâm Vỹ Nguyên. Cám ơn mọi người đã động viên, cỗ vũ
và giúp đỡ tôi rất nhiều lúc gặp khó khăn.
Cám ơn anh chị tại phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, Trung tâm Công Nghệ
Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh, đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong thời gian làm đề tài.

Tôi cũng xin gởi lời cám ơn đến tất cả thành viên lớp DH09SH, dù mỗi người đều
bận việc đề tài, nhưng vẫn luôn động viên và giúp đỡ lẫn nhau. Cám ơn những người
bạn mới mà tôi quen được ở Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Thành phố Hồ Chí Minh
trong thời gian làm đề tài. Mọi người đã cho tôi cảm giác ấm áp và thân quen như một
gia đình nhỏ.
Và cuối cùng, con xin ghi nhớ công lao sinh thành và dưỡng dục của ba mẹ, cám
ơn ba mẹ đã cho con một bộ óc biết suy nghĩ, một trái tim biết yêu thương và một bàn
tay biết lao động không mệt mỏi. Cám ơn gia đình nhỏ của con, luôn dõi theo từng
bước con đi và cho con một bến đỗ bình yên lúc con gặp áp lực trong thời gian làm đề
tài cũng như trong cuộc sống.
Trần Phạm Vũ Linh

i


TÓM TẮT
Thủy sản là một trong số những ngành quan trọng có đóng góp lớn vào kim ngạch
xuất khẩu của Việt Nam. Tuy nhiên song hành với sự gia tăng kim ngạch xuất khẩu là
sự bùng phát dịch bệnh, trong đó bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn thuộc nhóm
Vibrio spp. gây ra là một dịch bệnh phổ biến và gây chết hàng loạt. Trong các nhóm
Vibrio spp. gây bệnh thì Vibrio harveyi thì nguy hiểm và gây bệnh nhiều hơn cả. Để
hướng tới làm vaccine phòng bệnh, nhiều nghiên cứu cho thấy tính ưu việc của kỹ thuật
knockout gen (gen độc) dựa trên cơ sở tái tổ hợp tương đồng giữa đoạn cassette nhân
tạo và DNA bộ gen là rất hiệu quả. Trong số những gen gây độc được nghiên cứu nhiều
ở Vibrio harveyi, gen wzz điều hòa chiều dài của O-antigen trên bề mặc tế bào vi khuẩn
chính là đối tượng knockout chính. Do đó, mục đích của nghiên cứu này là nhằm tạo ra
đoạn cassette nhân tạo, thông qua kỹ thuật PCR Overlap và tạo dòng đoạn cassette trên,
phục vụ cho những công tác nghiên cứu tiếp theo.
Trong nghiên cứu này, đầu tiên các chủng Vibrio spp. có được từ phân lâp từ tôm
bệnh, được sàng lọc trên môi trường chọn lọc VHA (vibrio harveyi agar) và kỹ thuật

PCR với cặp mồi 16S_F/16S_R và gyrB_F3/gyrB_R3, nhằm tìm ra đúng chủng Vibrio
harveyi hoang dại. Sau đó, tiến hành PCR Overlap để tạo ra đoạn cassette nhân tạo.
PCR lần một với ba cặp mồi: mồi đầu, mồi cuối của gen wzz và mồi đoạn kanmycin từ
plasmid pKD4. PCR lần hai, nói các đoạn lại với nhau bằng forward primers đoạn đầu
và reverse primers đoạn cuối. Cuối cùng, tiến hành tạo dòng cassette trên vào vectơ đầu
bằng pJET1.2/blunt trong E.coli DH5α.
Kết quả, đã thu nhận hai chủng Vibrio harveyi hoang dại từ sáu chủng ban đầu.
Đoạn cassette nhân tạo H-K-T đã được tạo dòng thành công có kích thước 2153 bp và
chèn đúng vào vectơ đầu bằng pJET1.2/blunt trong E.coli DH5α. Qua các bước sàng
lọc sau tạo dòng và giải trình tự, đã khẳng định kết quả trên là đúng và đáng tin cậy.

ii


SUMMARY
Thesis “Molecular cloning of casstte wzz gene mutation (O-antigen chain
lengthdeterminant gene) of Vibrio harveyi bacteria in Ecoli DH5α”
Aquaculture is an important component of exports and an earner foreign exchange
for our country. There are many unfavourable elements influencing on commercial
value of shrimps. Luminous bacteria disease cause by Vibrio spp is one of the most
dangerous and make serial shrimps death. Vibriohaveryi is the most dangerous
members of the Vibrionaceae. Driving directions to vaccines made, some reports
demonstrated the preeminence of knockout gene technique based on homologous
recombinant between satellite cassette fragments brings us a lot of favourableness to
make prophylactic vaccine. On all of virulence genes is wzz which control the lenght of
O antigen is gene knockout. Using overlap PCR and clone this cassette to make satellite
cassette provide for other researchs is this study’s pupose.
In thesis, the first isolating vibrio spp. fromdeseased shrimps, was selected on
VHA culture and used PCR technique with 16S_F/16S_R, gyrB_F3/gyrB_R3 primers for
subdividing. The second, Overlap PCR was used for creating cassette, first time PCR

with three pair of primers: beginning fragment primers (H fragment), fragment primers
(T fragment) of wzz gene primers and kanamycin primer from plasmid pKD4. Second
time PCR with forward primer of the wzz gene beginning fragment and reverse primer
of the wzz gene ending fragment piece to connect together. Finaly, inserting these
satellite cassette into blunt plasmid pJET1.2/blunt and transfer this plasmid into E.coli
DH5α.
Results, there are 2 of 6 strains Vibrio spp isolated from deseased shrimps are wild
types. The size of H –K –T satellite cassette has been cloned successfully is 2153 bp
and inserted correctly in blunt plasmid pJET1.2/blunt in E.coli DH5α. Selecting
methods after cloning and sequencing show that we had target satellite cassette in E.coli
DH5α with pJET1.2/blunt.
Keywords: Vibrio harveyi, E.coli DH5α, cloning, isolate, cassette.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ..................................................................................................................... i
Tóm tắt .......................................................................................................................... ii
Summary ...................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................ iv
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... vii
Danh sách các bảng .................................................................................................... viii
Danh sách các hình ....................................................................................................... ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................ 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3

2.1. Sơ lược về vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng ở tôm ................................ 3
2.1.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi ................................................................................ 3
2.1.2. Môi trường phân lập VHA (Vibrio harveyi agar) ................................................. 5
2.1.3.Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh cho tôm kháng Vibrio harveyi ............. 6
2.2. Sơ lược về bệnh phát sáng do V.harveyi gây ra trên tôm ......................................... 6
2.2.1. Dấu hiệu bệnh trên tôm ........................................................................................ 6
2.2.1.1 Dấu hiệu bên ngoài của tôm bệnh....................................................................... 6
2.2.1.2 Dấu hiệu mô học của tôm bệnh .......................................................................... 7
2.2.2. Điều kiện phát sinh bệnh ..................................................................................... 7
2.2.3. Khu vực phân bố bệnh ......................................................................................... 7
2.2.4. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra trên thế giới và Việt Nam.......... 8
2.3. Lipopolysacharide (LPS) và vai trò gen wzz trong qua trình tổng hợp LPS ............. 9
2.3.1. Cấu trúc và chức năng của LPS ............................................................................ 9
2.3.2. Quá trình tổng hợp LPS và vai trò gen wzz ......................................................... 10
2.4 Khái niệm về cassette H-K-T gen đột biến wzz ...................................................... 12
2.5. Kỹ thuật tạo dòng gen ngoại lai............................................................................. 12
iv


2.5.1. Khái quát tạo dòng ............................................................................................. 12
2.5.2. Vật liệu dùng trong tạo dòng .............................................................................. 14
2.5.3. Kỹ thuật dùng trong tạo dòng ............................................................................. 16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 19
3.1. Thời gian và địa điểm ........................................................................................... 19
3.2. Vật liệu ................................................................................................................. 19
3.2.1. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................................ 19
3.2.2. Hóa chất............................................................................................................. 19
3.2.3. Môi trường......................................................................................................... 20
3.2.4. Vật liệu sinh học ................................................................................................ 21
3.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 23

3.3.1. Sàng lọc và kiểm tra các chủng Vibrio spp. ........................................................ 23
3.3.1.1 Sàng lọc và kiểm tra bằng phương pháp cấy truyền trên môi trường ................ 23
3.3.1.2 PCR các chủng Vibrio spp. với cặp mồi 16S_F/16S_R và gyrB_F3/ ................ 24
3.3.2. Tạo cassette H-K-T bằng phương pháp PCR Overlap ....................................... 25
3.3.2.1 Sơ đồ tạo cassette H-K-T bằng phương pháp PCR Overlap ............................. 25
3.3.2.2 Thiết kế mồi ..................................................................................................... 26
3.3.2.3 Phản ứng PCR lần một ..................................................................................... 26
3.3.2.4 Tinh sạch sản phẩm PCR ................................................................................. 28
3.3.2.5 Phản ứng PCR lần hai ...................................................................................... 28
3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel........................................................................ 29
3.3.3. Tạo dòng cassette H-K-T vào vecto pJET1.2/blunt ............................................ 29
3.3.3.1 Tạo tế bào khả nạp E.coli DH5α ...................................................................... 29
3.3.3.2 Đo OD kiểm tra nồng độ DNA biến nạp .......................................................... 30
3.3.3.3 Phản ứng nối plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt và cassette H-K-T ................... 30
3.3.3.4 Biến nạp plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt::H-K-T vào E.coli DH5α ............... 31
3.3.4. Kiểm tra sản phẩm biến nạp cassette H-K-T vào vecto pJET1.2/blunt................ 31
3.3.4.1 Kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc .......................................................................... 32
3.3.4.2 Tách plasmid và kiểm tra bằng PCR plasmid tái tổ hợp ................................... 33
3.3.4.3 Kiễm tra plasmid pJET1.2/blunt:::H-K-T WZZ với enzyme cắt ...................... 34
3.3.4.4 Giải trình tự cassette H-K-T wzz ...................................................................... 35
v


Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 36
4.1. Kết quả ................................................................................................................. 36
4.1.1. Sàng lọc và kiểm tra các chủng vi khuẩn Vibrio spp........................................... 36
4.1.1.1 Cấy chuyền trên môi trường chọn lọc VHA (Vibrio harveyi agar) .................... 36
4.1.1.2 PCR các chủng Vibrio spp. với cặp mồi 16S_R/16S_F và gyrB_F/ ................... 39
4.1.2. Tạo cassette H-K-T bằng phương pháp PCR Overlap ........................................ 41
4.1.2.1 Phản ứng PCR lần 1 ......................................................................................... 41

4.1.2.2. Phản ứng PCR lần hai ..................................................................................... 42
4.1.2.3 Tinh sạch sản phẩm PCR từ gel........................................................................ 43
4.1.3 Tạo dòng cassette H-K-T vào vecto pJET1.2/blunt ............................................. 43
4.1.3.1 Đo OD kiểm tra nồng độ DNA chuẩn bị cho phản ứng nối............................... 43
4.1.4. Kiểm tra sản phẩm biến nạp cassette H-K-T vào vecto pJET1.2/blunt............... 43
4.1.4.1 Kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc .......................................................................... 44
4.1.4.2 Kiểm tra bằng phương pháp PCR plasmid tái tổ hợp ........................................ 45
4.1.4.3 Kiểm tra plasmid pJET1.2/blunt:::H-K-T WZZ với enzyme cắt ....................... 46
4.1.4.4 Kết quả giải trình tự ......................................................................................... 46
4.2. Thảo luận .............................................................................................................. 59
Chương 5 KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................ 51
5.1. Kết luận ................................................................................................................ 51
5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ApR
BHIA
BL1
BL2
BL3
BL4
BL5
BLAST
Bp
BSA

dATP
dCTP
dGTP
DNA
Dnase
dNTP
dTTP
E. coli
FRT
H
K
Kb
LB
LPS
mRNA
NCBI `
PCR
T
Taq
TBE
Rpm
VH
VHA
UV
Xg
YHV
WSSV

Gen kháng ampicillin
Brain Heart Infusion Agar

Chủng vi khuẩn thứ nhất phân lập từ Bạc Liêu
Chủng vi khuẩn thứ hai phân lập từ Bạc Liêu
Chủng vi khuẩn thứ ba phân lập từ Bạc Liêu
Chủng vi khuẩn thứ tư phân lập từ Bạc Liêu
Chủng vi khuẩn thứ năm phân lập từ Bạc Liêu
Basic Local Alignment Search Tool
Base pair
Bovine Serum Albumin
Deoxyadenosine triphosphate
Deoxycytidine triphosphate
Deoxyguanosine triphosphate
Deoxyribonucleic acid
Deoxyribonuclease
Deoxynucleotide triphosphate
Deoxythymidine triphosphate
Escherichia coli
Flippase recognition target
Đoạn gen đầu, được khuếch đại từ gen gây độc wzz
Đoạn gen kháng kanamycin khuếch đại từ pKD4
kilobase pair
Luria-Bertani
Lipopolysacharide
Messenger ribonucleic acid
National Center for Biotechnology Information
Polymerase Chain Reaction
Đoạn gen cuối được khuếch đại từ gen gây độcwzz
Thermus aquaticus
Tris/Borate/EDTA
Revolutions per minute
Chủng vi khuẩn xin từ Viện thủy sản II

Vibrio harveyi agar
Ultraviolet
Li tâm trọng lực
Yellow Head Virus
Whitespot Syndrome Baculovirus
vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của V.harveyi .................................................................... 4
Bảng 2.2 Hình thái khuẩn lạc trên môi trường VHA ...................................................... 5
Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi cặp mồi 16S_F/16S_R và gyrB_F3/gyrB_R3 ...................... 24
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi 16S_F/16S_R và gyrB.. .................. 24
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho cặp mồi 16S_F/16S_R và gyrB_F3/gyrB_R3 ............................. 25
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại đoạn H, K và T ................................ 27
Bảng 3.5 Chu trình nhiệt cho cặp mồi WF1/WR1và cặp mồi WF2/WR2 ..................................... 27
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt cho cặp mồi KF/RF .............................................................. 27
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR nối 3 đoạn H, K và T ......................................... 28
Bảng 3.8 Chu trình nhiệt cho cặp mồi WF1/WR2 ......................................................................................... 29
Bảng 3.9 Thành phần phản ứng nối tạo plasmid tái tổ hợp .......................................... 30
Bảng 3.10 Trình tự khuếch đại cặp mồi pJET1.2 F/pJET1.2 R .................................... 32
Bảng 3.11Thành phần phản ứng PCR kiểm tra khuẩn lạc ............................................ 32
Bảng 3.12 Chu trình nhiệt cho cặp mồi pJET1.2 F / pJET1.2 R ................................... 33
Bảng 3.13 Thành phần phản ứng PCR plasmid tái tổ hợp ........................................... 34
Bảng 3.14 Thành phần phản ứng cắt plasmid pJET1.2/blunt:::H-K-T wzz ................... 35
Bảng 4.1 Hình dạng khuẩn lạc các chủng Vibrio spp. mọc trên môi trường VHA ....... 36
Bảng 4.2 Kết quả đo OD nồng độ các đoạn H, K, T .................................................... 42
Bảng 4.3 Kết quả đo OD cassette H-K-T dùng cho phản ứng nối ................................ 43

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng trong tối ...................................................... 3
Hình 2.2 Cấu trúc của LPS ........................................................................................ 10
Hình 2.3 Các bước tạo dòng gen ............................................................................... 13
Hình 3.1 Thang DNA 1kb ......................................................................................... 20
Hình 3.2 Plasmid pKD4 ............................................................................................ 21
Hình 3.3 Vector tạo dòng pJET1.2/blunt và những đặc điểm chính ........................... 22
Hình 3.4 Quy trình sàng lọc và kiểm tra các chủng vi khuẩn Vibrio spp.. .................. 23
Hình 3.5 Quy trình tạo cassette H-K-T bằng phương pháp 2 STEP .......................... 25
Hình 3.6 Danh sách các enzyme cắt và vị trí cắt cho plasmid pJET1.2/blunt ............. 35
Hình 4.1 Kết quả nhuộm Gram 6 chủng Vibrio spp. hoang dại .................................. 37
Hình 4.2 Kết quả cấy phân lập trên môi trên môi trường VHA .................................. 38
Hình 4.3 Kết quả kiểm tra bằng cặp mồi 16S_R/16S_F ............................................. 40
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra bằng cặp mồi gyrB F3/ gyrB R3 ............................................................... 40
Hình 4.5 Kết quả khuếch đoạn gene H, K, T ............................................................. 41
Hình 4.6 Kết quả phản ứng PCR lần hai .................................................................... 42
Hình 4.7 Hình thái khuẩn lạc plasmid tái tổ hợp pJET1.2/blunt:::H-K-T wzz ............ 43
Hình 4.8 Trình tự vùng gen MSC của pJET1.2/blunt................................................. 44
Hình 4.9 Kết quả kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc ........................................................ 44
Hình 4.10 Kết quả kiểm tra bằng phương pháp PCR plasmid tái tổ hợp .................... 45
Hình 4.11 Kết quả kiểm tra bằng phản ứng cắt với BglII........................................... 46
Hình 4.12 Kết quả BLAST trình tự đoạn đầu (đoạn H) cassette H-K-T wzz .............. 46
Hình 4.13 Kết quả BLAST trình tự đoạn gen kan (đoạn K) cassette H-K-T wzz ........ 48
Hình 4.14 Kết quả BLAST trình tự đoạn cuối (đoạn T) cassette H-K-T wzz .............. 48

ix

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thủy sản là một trong số những ngành quan trọng có đóng góp lớn vào kim ngạch
xuất khẩu của Việt Nam. Theo Vasep, năm 2012 xuất khẩu thủy sản Việt Nam đạt
6.134,328 triệu USD tăng 0,3% so với 2011. Trong đó xuất khẩu tôm đã góp một phần
không nhỏ trong tổng kim ngạch xuất khẩu. Trong 11 tháng đầu năm 2012 xuất khẩu
tôm đạt 1952,085 triệu USD. Tuy nhiên, theo đánh giá của Tổng cục Thủy sản, vụ tôm
năm 2012 diễn ra hết sức khó khăn ở nhiều địa phương, đặc biệt là thời tiết, môi trường
diễn biến phức tạp, dịch bệnh xảy ra trên diện rộng, ảnh hưởng lớn đến hiệu quả xuất
khẩu. Trong đó, nổi bật là bệnh đốm trắng do virus (WSSV–White Spot Syndrome
Virus) và bệnh phát sáng do các chủng vi khuẩn thuộc giống Vibrio gây ra, một khi đã
xảy ra có khả năng gây chết hàng loạt. Khó khăn hơn nữa là chủng vi khuẩn này có thể
lây nhiễm ở tất cả các giai đoạn từ giai đoạn ấu trùng đến khi trưởng thành.
Trong các nhóm Vibrio spp. gây bệnh thì Vibrio harveyi là loài nguy hiểm và
thường gây bệnh nhất, tính độc của Vibrio harveyi chủ yếu được quyết định bởi 3 gen
: aroA, purA là hai biến dưỡng và gen wzz (hay còn gọi là Cld [chain length
determinant]) là gen ngoại độc tố. Hiện nay, khi dịch bệnh xảy ra, bà con nông dân chủ
yếu sử dụng kháng sinh để trị bệnh, tuy nhiên do hướng đến việc xuất khẩu nên việc sử
dụng kháng sinh là không phù hợp do phải kéo dài từ 5 - 7 ngày. Do đó việc tìm ra một
phương pháp để sớm phòng bệnh cho tôm ở giai đoạn đầu bằng việc sử dụng vaccine là
hết sức quan trọng.
Đáp ứng những yêu cầu trên, nghiên cứu “Tạo dòng gen đột biến WZZ (O-antigen
chain length determinant gene)của vi khuẩn Vibrio harveyi trong E.coli DH5α” được
thực hiện. Bước đầu tạo dòngcassette nhân tạo H-K-T với H và T là trình tự đoạn đầu
và cuối của gen wzz, K là trinh tự của đoạnkanamycin từ plasmid pKD4, nhằm tạo cơ sở
cho việc knockout gen wzz tạo ra chủng Vibrio harveyi nhược độc, phục vụ cho việc thử
nghiệm vaccine nhược độc phòng bệnh phát sáng sớm ở tôm và định hướng tạo được
chủng Vibrio harveyi nhược độc chứa DNA vectơ mang gen mã hóa vỏ protein VP28

của virus gây bệnh đốm trắng trên tôm sú.
1


1.2 . Yêu cầu của đề tài
Tạo dòng cassette nhân tạo H-K-T gen đột biến wzz vào tế bào E.coli DH5α là yêu
cầu chính của nghiên cứu này, tạo tiền đề cho những nghiên cứu tiếp theo.
1.3. Nội dung thực hiện
- Sàng lọc và kiểm tra các chủng Vibrio spp. có sẵn trên môi trường chọ lọc và
PCR với cặp mồi đặc hiệu nhận biết chủng.
- PCR Overlap các đoạn đầu (đoạn H) đoạn cuối (đoạn T) và đoạn giữa (đoạn K)
tạo cassette nhân tạo H-K-T của gen wzz.
- Tạo dòng cassette H-K-T wzz vào E.coli DH5α, phục vụ nghiên cứu tiếp theo.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Vibrio harveyi gây bệnh phát sáng ở tôm
2.1.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi
Vi khuẩn nhóm Vibrio phát sáng là một phần của hệ vi sinh vật tự nhiên khu trú ở
vùng biển ven bờ, được tìm thấy trên bề mặt và cả bên trong ruột của các động vật sống
ở biển. V. harveyi và V. splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tôm ấu
trùng và hậu ấu trùng bị bệnh phát sáng. Tuy nhiên V. harveyi mới được xem là loài vi
khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng trên tôm (Lý Thị Thanh Loan, 1999).

Hình 2.1 Khuẩn lạc V. harveyi phát sáng
trong tối (Zhang, 2001).
V. harveyi thuộc giống Vibrio, họVibrionaceae. Đặc điểm chung của V.harveyi là:
vi khuẩn gram âm, hình que thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6

μm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển. V.harveyi
không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh vật biển nào, nó di chuyển bằng roi
(Sung và ctv, 2001).
Quan sát trong bóng tối các đĩa cấy V. harveyi trên môi trường BHIA, khuẩn lạc
phát ra các ánh sáng màu xanh nhạt, V. harveyi có khả năng kháng chịu rất nhiều loại
kháng sinh thông thường như erythromycin, penicillin, streptomycin và sulfadiazine.
3


V.harveyi có khả năng tổng hợp enzyme catalase nên không bị tiêu diệt bởi H2O2
(Vattanaviboon và Mongkolsuk, 2001).
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hóa của Vibrio harveyi
Đặc điểm

V.harveyi

Nhuộm gram

-

Di động

+

Thử Oxydase

+

Phát sáng

+

Phát sáng 40C

-

Phát sáng 300C

+

Phát triển môi trường 0% NaCl

-

Phát triển môi trường 3% NaCl

+

Phát triển môi trường 7% NaCl

+

Phát triển trên TCBS

Xanh

Thử O/F Glucose

+/+

Thủy phân Arginine

-

Thủy phân Orinithine

-

Thủy phân Lysine

+

Sử dụng Citrate

-

Urease

-

Khử Nitrate

+

Indol

+

Sinh H2S

-

Methyl red

+

Vosges – Proskauer

-

Dịch hóa Gelatin

+

Acid hóa Glucose

+

Acid hóa Inositol

-

Acid hóa Mannitol

+

Acid hóa Sucrose

-

4


Hiện nay, cơ chế gây bệnh của V. harveyi vẫn được chưa biết rõ. Năm 1997 Liu
cho rằng protease, phospholipase hoặc hemolysin có thể giữ vai trò quan trọng trong
việc gây bệnh, trong đó protease cystein giữ vai trò là ngoại độ tố chính đối với tôm.
Vào năm 1999 Montero và Austin cho rằng lipopolysaccharide có thể hình thành nên
độc tố gây chết của V. harveyi dòng E2 đối với tôm. Nhìn chung, hemolysin của vi
khuẩn được coi là yếu tố quan trọng của các Vibrio gây bệnh bằng cách gây nhiễm
trùng máu và tiêu chảy ở vật chủ (Zhang, 2001).
2.1.2. Môi trường phân lập VHA (Virio harveyi agar)
Môi trường chọn lọc V.harveyi có nồng độ pH rất cao (pH=9). Do pH cao nên chỉ
có những loài Vibrio đặc biệt mới có thể phát triển được, còn những loài vi khuẩn sống
khác không thể phát triển được. Nồng độ muối NaCl cao cùng với với việc ủ ở nhiệt độ
280C, cho phép những loài Vibrio có thể tồn tại được. Một yếu tố nữa giúp cho việc
chọn lọc đặc hiệu Vibrio là khả năng sử dụng cellobise và ornithine trong môi trường.
Hình thái khuẩn lạc Virio harveyi trên môi trường nuôi cấy cũng là một yếu tố quan
trọng để phân biệt Virio harveyi với các loài Vibrio khác.
Bảng 2.2 Hình thái khuẩn lạc trên môi trường VHA
Loài
Vibrio harveyi

Vibrio natriegens
Vibrio vulnificus, Vibrio anguillarum và
Vibrio pelagius
Vibrio aestuarianus và Vibrio campbellii
Vibrio alginolyticus, Vibrio
parahaemolyticus và Vibrio carchariae
Pseudomonas spp. và Flavobacterium
spp.

Hình thái khuẩn lạc
Khuẩn lạc nhỏ, đường kính 2 - 5mm, có
màu xanh đậm, tối, viền quanh khuẩn lạc có
một vòng sáng vàng
Khuẩn lạc nhỏ (2 - 5mm), màu xanh sáng
Không phát sáng được trên môi trường này
Rất nhỏ, đường kính khoảng 2mm, khuẩn
lạc có màu xanh sáng
Khuẩn lạc kích thước lớn, đường kính 45mm
Không phát triển được trên môi trường này
(Mai Thu Thảo, 2011)

Decarboxylation orthinin sẽ làm pH của môi trường thay đổi, làm cho các khuẩn
lạc xuất hiện màu xanh dương. Quá trình lên men cellobiose cũng làm pH thay đổi, làm
khuẩn lạc xuất hiện màu xanh lá, đôi khi xuất hiện những vằn sáng màu vàng bao quanh
5


khuẩn lạc. Vibrio harveyi có thể sử dụng đồng thời cellobiose và orthinine. Nhờ khả
năng sống trong môi trường có nồng độ muối cao mà Virio harveyi phát triển nhanh
hơn các loài vibrio còn lại (Lachilan Harris và ctv,1996).
Thành phần môi trường VHA bao gồm: D-cellobiose 2 g, L-ornithine 2 g, NaCl
30 g, Tris aminomethane 1,21 g, Agar 20 g, K2HPO4 0,075 g, Thymol blue 0,04 g,
Bromothymol blue 0,04 g, Bacto Peptone 0,1 g, Yeast extract 0,1 g. Chuẩn pH = 9 và
định mức 1.000 ml với nước cất vô trùng.
2.1.3. Tình hình nghiên cứu vaccine phòng bệnh cho tôm kháng Vibrio harveyi
Bệnh phát sáng trên tôm do vi khuẩn V.harveyi gây ra cho tôm đang là một dịch
bệnh gây thiệt hại trực tiếp đến năng suất, chất lượng của tôm nuôi ở Việt Nam và thế
giới. Hiện nay, bệnh chủ yếu được điều trị bằng các loại kháng sinh. Ở Việt Nam vẫn

chưa có một nghiên cứu nào để tạo ra vaccine phòng bệnh này trên tôm.
Năm 2010, nhóm nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh và ctv báo cáo đề
tài: “Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính
kháng Vibrio spp.”. Kết quả cho thấy có sự suy giảm mật độ vi khuẩn Vibrio trong nước
khi bổ sung vào đồng thời tỉ lệ sống cũng giảm ở giai đoạn PL13 (giai đoạn xuất bán)
tăng hơn 15% so với đối chứng.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu tại Anh về vaccine từ các chủng Vibrio bất
hoạt trong đó có V.harveyi. Loại vaccine này được thử nghiệm trên tôm ở giai đoạn
trưởng thành. Kết quả thử nghiệm cho thấy tỉ lệ sống sót của tôm sau khi tiêm vaccine
bất hoạt từ 92,3% - 100% và có sự gia tăng đáp ứng miễn dịch trên tôm.
Hiện nay chưa có loại vaccine phòng bệnh nào cho tôm ngoại trừ một số chế phẩm
vi sinh có tính đối kháng và một số chế phẩm giúp tăng cường đáp ứng miễn dịch trên
tôm (Mai Thu Thảo, 2011).
2.2. Sơ lược về bệnh phát sáng do V.harveyi gây ra trên tôm
2.2.1. Dấu hiệu bệnh trên tôm
2.2.1.1 Dấu hiệu bên ngoài của tôm bệnh
Dấu hiệu nhận biết tôm bị bệnh phát sáng là: tôm yếu lờ đờ, kém bắt mồi hoặc bỏ
ăn, có màu sậm hoặc trắng đục. Màu sắc cơ thể đôi khi chuyển sang màu hồng. Tôm
bơi nổi, tấp mé, phát sáng phần đầu ngực hay toàn thân (quan sát được trong bóng tối),
6


có thể nhiễm 100% đàn tôm. Tôm bệnh có thể bị đóng rong ở mang và vỏ, gan tôm bị
teo lại, sẫm màu, tôm chậm lớn. Tôm có thể bị chết rải rác (10 – 20%) và có thể tăng
lên trong giai đoạn 45 ngày nuôi đầu tiên (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).
Khi tôm nhiễm khuẩn toàn thân, thì tỷ lệ chết có thể lên đến 100% (Lý Thị Thanh
Loan, 1999). Ấu trùng có thể chết từ rải rác tới hàng loạt đặc biệt ở giai đoạn tiền ấu
trùng (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2001).
2.2.1.2 Dấu hiệu mô học của tôm bệnh
Tôm bị bệnh nặng, soi dưới kính hiển vi mẫu xoang bạch huyết và mẫu ruột thấy

dày đặc những vi khuẩn di động, cơ quan chủ yếu nhiễm khuẩn là gan tụy. Tôm giống
dưới 45 ngày nuôi, bị nhiễm bệnh phát sáng biểu hiện tế bào ống bên trong gan tụy bị
phá hủy. Chổ lõm giữa các tế bào hình ống bị bịt kín bởi các bạch cầu và các tế bào sợi.
Tế bào biểu mô bị hoại tử và vi khuẩn tập trung từng đám trong Lumen. Quan sát
những tôm nhỏ hơn thấy sự phá hủy ở các mô nhiều hơn (Lý Thị Thanh Loan, 1999).
2.2.2. Điều kiện phát sinh bệnh
Bệnh phát sáng trên tôm thường xảy ra trong tất cả các giai đoạn (Đỗ Thị Hòa và
ctv, 2001). Vibrio phát sáng xâm nhập vào bể ươm qua trứng tôm, tôm mẹ, thức ăn và
dụng cụ sản xuất. Bệnh có thể lây nhiễm từ các trại giống, ao ươm sang ao nuôi thịt.
Phát triển mạnh trong những ao có hàm lượng chất hữu cơ cao, chất thải đáy ao tích tụ
nhiều. Gặp ở những vùng có độ mặn cao, phát triển mạnh nhất ở độ mặn 30 – 35‰. Ở
dưới 5‰ hầu như không thấy bệnh này xuất hiện. Bệnh có thể xuất hiện ở pH từ 7,5 – 9
bệnh có thể xuất hiện khi mất tảo đột ngột hay do môi trường biến động mạnh. Các vi
khuẩn gây bệnh có thể có trong nguồn nước cấp vào ao nuôi (Harris và ctv, 1996).
2.2.3. Khu vực phân bố bệnh
Bệnh phổ biến ở nhiều nơi trên thế giới, đặc biệt tại các trại sản xuất tôm giống.
Kết quả từ việc điều tra vi khuẩn phát sáng vùng duyên hải ở Thái Lan cho thấy vi
khuẩn phát sáng là một trong những thành phần loài trong khu hệ vi khuẩn ở vùng cửa
sông và vùng nước lợ. Điều này được chứng minh từ kết quả phân lập vi khuẩn của các
mẫu nước cấp vào và thải ra cũng như các mẫu bùn trong hệ thống ao nuôi tôm có
nguồn nước cấp từ vùng duyên hải (Fraser, 2005).

7


Theo một số nguồn tài liệu của Phillipine, Thái Lan và Indonesia, Vibrio gây bệnh
phát sáng được tìm thấy trong nước biển vùng ven bờ, nhất là nơi có hàm lượng chất
hữu cơ cao và có nhiều xác động thực vật chết sau chu kỳ “nở hoa”. Số lượng vi khuẩn
Vibrio thường tăng vọt trong và sau mùa mưa, nhất là các tháng 10 – 12. Vì vậy vùng
gần bờ biển cũng được xem là nguồn nhiễm chính (Lavilla và ctv, 1998).

2.2.4. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra trên thế giới và Việt Nam
Ngày nay nghề nuôi tôm đã trở thành một ngành kinh tế quan trọng đem lại thu
nhập khá cao cho nông dân. Diện tích nuôi tôm ngày một tăng, khi diện tích nuôi càng
mở rộng thì rủi ro trong ngành nuôi tôm càng gia tăng, điển hình là sự gia tăng của các
mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất.
Các số liệu thống kê cho thấy sản lượng tôm nuôi trên thế giới giảm dần từ
733.000 tấn năm 1994 còn 712.000 tấn năm 1995, rồi 693.000 tấn năm 1996 và đến
năm 1997 chỉ còn 660.000 tấn. Tại Việt Nam,trong hai năm 1994 – 1995 hiện tượng
tôm nuôi chết hàng loạt và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt
hại trên dưới 250 tỉ đồng (Nguyễn Văn Hảo, 2000). Theo báo cáo kết quả nuôi trồng
thuỷ sản năm 2003 của ngành cho thấy: cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ
thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các tỉnh,
thành phố ven biển từ Ðà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị chết nhiều,
chiếm 97,06% diện tích có tôm bị chết trong cả nước.
Bệnh truyền nhiễm được xem là một trong những nguyên nhân làm giảm sản
lượng tôm nuôi. Việc khống chế các mầm bệnh bằng cách dùng hóa chất theo phương
pháp truyền thống cho thấy ngày càng ngày càng kém hiệu quả đối với các mầm bệnh
mới xuất hiện. Ngược lại, công nghệ sinh học ngày càng gia tăng vai trò hữu hiệu của
mình trong chẩn đoán các mầm bệnh, giải thích rõ quá trình phát sinh bệnh, phát triển
các phương thức chẩn đoán và phòng ngừa hữu hiệu đối với dịch bệnh. Hiện nay bệnh
truyền nhiễm do nhóm vi khuẩn phát sáng và nhóm virus MBV, YHV và WSSV được
xem là tác nhân gây bệnh đáng được quan tâm nhất làm ảnh hưởng đến sản lượng tôm
nuôi hàng năm (Nguyễn Văn Hảo, 2000).
Trước đây, nhóm Vibrio được xem là nhóm vi khuẩn cơ hội. Tuy nhiên, gần đây
qua nhiều ổ dịch xảy ra trên tôm sú nuôi do vi khuẩn Vibrio gây ra cho thấy loài này
8


dường như được xem là vi khuẩn gây bệnh tiên phát thật sự chứ không phải là vi khuẩn
cơ hội. Vibrio gây chết ấu trùng tôm, tôm giống, tôm thương phẩm và kể cả tôm trưởng

thành. Dịch bệnh có thể gây chết 100%.
Trong năm 2003, thiệt hại do V. harveyi gây ra cho nghề nuôi tôm của toàn thế
giới là 800 triệu USD, trong đó chỉ tính riêng ở Thái Lan, thiệt hại đã là 160 triệu USD
(Fraser, 2005).
Trong 30 chủng nghi ngờ thu được từ ấu trùng bị bệnh phát sáng tại Khánh Hòa,
người ta nhận thấy V. harveyi chiếm ưu thế với tần số bắt gặp là 14/30 (46,67%), sau đó
đến V. parahaemolyticus 6/30, chiếm 20%. Ngoài ra còn gặp V. vulnificus 3/30 (10%),
đây cũng chính là những loài vi khuẩn được cho là tác nhân gây bệnh phát sáng ở tôm
sú ấu trùng (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2002).
2.3. Lipopolysacharide (LPS), vai trò của gen wzz trong quá trình tổng hợp LPS
2.3.1. Cấu trúc và chức năng của LPS
LPS là thành phần chính của lớp màng ngoài của vi khuẩn Gram âm, góp phần
quan trọng tạo nên sự toàn vẹn cấu trúc của vi khuẩn và giúp bảo vệ màng khỏi sự tấn
công của một vài loại hóa chất. LPS cũng tăng điện tích âm của màng tế bào và giúp ổn
định cấu trúc màng nói chung.
Cấu trúc LPS gồm 3 vùng khác nhau: lipid A, oligosaccharide lõi và O-antigen.
- Lipid A thường là đường đôi glucosamine gắn với nhiều acid béo. Những chuỗi
acid béo kị nước này gắn chặt LPS vào màng tế bào vi khuẩn. Lipid A là thành phần
gây độc chính của vi khuẩn Gram âm. Khi tế bào vi khuẩn bị ly giải bởi hệ thống miễn
dịch, những mảnh vỡ của màng chứa lipid A được giải phóng vào vòng tuần hoàn, gây
sốt, tiêu chảy, và có thể gây sốc nội độc tố (còn gọi là sốc nhiễm trùng).
- Lõi của LPS luôn luôn chứa một thành phần oligosaccharide gắn trực tiếp với
lipid A và thường chứa đường như heptose và 3-deoxy-D-mannooctulosonic Acid
(KDO, keto-deoxyoctulosonate).
- Antigen (O polysaccharide hoặc O side chain) là domain ngoài cùng của LPS. Oantigengồm nhiều phiên bản lặp lại (thường là 10 - 30 lần) của một đơn vị
oligosaccharide (O unit). Mỗi đơn vị Oligosaccharide gồm khoảng từ 2 đến 6 phân tử
đường. O-antigen được phơi bày ra bên ngoài bề mặt tế bào vi khuẩn và do đó nó là
9

mục tiêu nhận biết của kháng thể vật chủ. O-antigen có tính chuyên biệt kháng nguyên
cao. Sự thay đổi trong cách sắp xếp và liên kết giữa các phân tử đường trong O unit tạo
nên các cấu trúc khác nhau của O-antigen, đặc trưng cho việc nhận biết kháng nguyên.

A

B

Hình 2.2 Cấu trúc của LPS. (A) Cấu trúc LPS trên vi khuẩn G-, (B) Cấu trúc 3 vùng LPS
(Trần Thị Thanh Thanh, 2010)

Từ lâu, LPS được coi là nội độc tố và là nhân tố gây đáp ứng miễn dịch mạnh ở
động vật. LPS cũng tham gia vào quá trình sản xuất nhiều loại chất trung gian liên quan
tới sốc nhiễm khuẩn. LPS hoạt động như một nội độc tố đầu tiên bởi vì nó bám vào
phức hợp receptor CD14/TLR4/MD2 và xúc tiến sự tiết các cytokine tiền viêm trong
nhiều loại tế bào, đặc biệt là ở đại thực bào. Ngoài ra, những nghiên cứu trong vài năm
gần đây cho thấy LPS có vai trò trong việc hoạt hóa nhiều nhân tố phiên mã
(Bengoechea và ctv, 2002; Franco và ctv, 1998; Guo và ctv, 2005; Tang và ctv, 2007).
2.3.2. Quá trình tổng hợp LPS và vai trò gen wzz
Trong quá trình tổng hợp LPS, lipid A và oligosaccharide lõi được tổng hợp cùng
với nhau, trong khi O-antigen được tổng hợp độc lập (Franco và ctv, 1998). Hầu hết các
O-antigen được tổng hợp theo con đường phụ thuộc Wzy (Wzy dependent pathway), tuy
nhiên cũng có một vài loại O-antigen được tổng hợp bằng các hình thức polymer hóa
khác (Wzy independent pathway) (Franco và ctv, 1998).
10


Trong con đường tổng hợp phụ thuộc Wzy, đầu tiên O-unit được tổng hợp bằng
cách chuyển liên tục những phân tử đường (từ đường tương ứng của nucleotide) đến
lipid vận chuyển undecaprenol-phosphate (UndP) nhờ những enzyme glycosyl

transferase chuyên biệt. Quá trình này xảy ra trong tế bào chất. Ban đầu, O-unit hoàn
chỉnh vẫn tập hợp trên undecaprenylphosphate. Sau đó, enzyme O-unit flippase (Wzx)
chuyển O-unit từ màng trong ra màng ngoài. Ở đó, Ounit được polymer hóa tạo thành
O-antigen nhờ O-antigen polymerase (Wzy) và sau đó được nối với lipid lõi A nhờ
enzyme WaaL ligase (Bengoechea và ctv, 2002; Guo và ctv, 2005; Burrows và ctv,
1997; Tang và ctv, 2007). Sự di chuyển cuối cùng của phân tử LPS hoàn chỉnh ra bề
mặt tế bào được giả thiết là điều hòa bởi một phức hợp protein ngoài màng Imp/RlpB.
Chiều dài chuỗi O-antigen được điều hòa bởi gen wzz, còn được gọi là Cld (chain
length determinant) hay Rol (regulator of O-antigen length). Khi chủng vi khuẩn bị đột
biến gen wzz thì chiều dài chuỗi O-antigen sẽ phân bố một cách ngẫu nhiên (Tang và
ctv, 2007). Đến nay, cơ chế protein Wzz ảnh hưởng tới quá trình polymer hóa vẫn chưa
được hiểu rõ. Bastin và cộng sự cho rằng Wzz hoạt động như thiết bị bấm giờ phân tử,
cho phép sự polymer hóa bởi Wzy tiếp tục trong một khoảng thời gian định trước nào đó
hoặc cho tới khi chiều dài đặc trưng của chuỗi O-antigen được hình thành. Một giả
thuyết khác được đưa ra bởi Monora và cộng sự cho rằng protein Wzz hoạt động như
một chaperone phân tử để tập trung phức hợp protein gồm Wzy, WaaL và chuỗi
polysaccharide đang được hình thành. Chiều dài O-antigen chuyên biệt là kết quả động
học do tỉ lệ khác nhau của Wzy so với WaaL. Hiện vẫn chưa có bằng chứng sinh hóa cụ
thể nào cho cả hai mô hình này (Tang và ctv, 2007).
Gen wzz có tính chất bảo tồn loài cao. Protein Wzz nằm trong họ “polysaccharide
co – polymerase” (PCP). Thành viên của nhóm này liên quan đến sự điều hòa chiều dài
chuỗi của nhiều polysaccharide trong đó có O-antigen, capsular polysaccharide, và
exopolysaccharide. Protein Wzz có cấu hình màng: hai xoắn helix xuyên màng lần lượt
nằm gần đầu amino và đầu carboxyl. Đến nay, thông tin cấu trúc của những protein
trong họ này vẫn chưa được xác định rõ (Tang và ctv, 2007).

11


2.4 Khái niệm về cassette H-K-T gen đột biến wzz

Cassette một trình tự gen nhân tạo được thiết kế để knockout gen gây độc của vi
khuẩn gây bệnh hướng đến làm vaccine nhược độc. Trình tự cassette được tạo bởi
phương pháp lai gen thông qua kỹ thuật PCR Overlap các đoạn với nhau. Trong nghiên
cứu này, cassette H-K-T gen wzz được thiết kế bao gồm 3 đoạn: đoạn thứ nhất là trình
tự đầu của gen wzz được đặt tên là H, đoạn thứ hai là trình tự gen kanamycin từ plasmid
pKD4 được đặt tên là K và đoạn cuối là trình tự cuối gen wzz được đặt tên là đoạn T.
Cassette mang hai vùng trình tự đầu và cuối giống với trình tự đầu và cuối của gen gây
độc, khi được chuyển vào vi khuẩn gây bệnh, với sự có mặt của các tác nhân hỗ trợ tiếp
hợp, việc trao đổi đoạn gen sẽ xảy ra. Khi trao đổi thành công, gen đích sẽ được chèn
trình tự gen kanamycin, việc chèn trình tự này gây bất hoạt gen gây độc và cũng là một
dấu hiệu dùng để chọn lọc sinh học.
2.5. Kỹ thuật tạo dòng gen ngoại lai
2.5.1. Khái quát tạo dòng
Tạo dòng là quá tŕnh tái tổ hợp một gen hoặc một đoạn DNA vào vector có khả
năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào chủ. Mục đích của việc tạo dòng nhằm thu
một lượng lớn bản sao của một trình tự DNA xác định.
Các bước cơ bản trong tạo dòng bao gồm
Tách và phân lập các DNA cần tạo dòng: tiến hành chọn DNA phù hợp với
plasmid tạo dòng, tiếp theo sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA, tùy thuộc vào tính
chất enzyme cắt đầu bằng hay đầu so le mà có các bước xử lý cắt cho phù hợp với mục
đích tạo dòng.
Chọn và xử lý vectơ: khi chọn vectơ cần chú ý đến độ lớn của gen lạ, loại tế bào
chủ tiếp nhận vectơ và phương pháp ứng dụng. Tiến hành xử lý vectơ: cắt vectơ bằng
cùng enzyme cắt hạn chế với cùng enzyme cắt DNA, khử nhóm phosphat bằng enzyme
alkaline phosphatase để tránh hai đầu vectơ đóng trở lại.
Tạo DNA tái tổ hợp bằng cách ghép DNA lạ vào vectơ đã được cắt bằng cùng một
enzyme cắt giới hạn, khi đó chúng sẽ ghép đôi lại với nhau nhờ bắt cặp bổ sung thông
qua liến kết phosphat, mỗi phản ứng nốicần có mặt của enzyme DNA ligase để hoàn
chỉnh phân tử lai.
12

Chuyển DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhờ phương pháp biến nạp hoặc tải nạp,
mục địch chính của việc chuyển này là để sử dụng bộ máy tế bào nhận nhân nhiều số
lượng bản sao DNA tái tổ hợp, có 4 hình thức chuyển gen: tiếp hợp (conjugation) phổ
biến ở vi khuẩn, sự truyền thông tin di truyền thông qua sự tiếp xúc trực tiếp 2 tế bào.
Chuyển nạp (transduction) là quá trình DNA được chuyển sang vi khuẩn khác bởi virus
hoặc thực khuẩn thể, quá trình này bao gồm việc chuyển DNA ngoại lai vào tế bào bằng
vectơ của virus. Chuyển nhiễm (transfection) là quá trình chuyển nucleic acid (hay
protein) tự do vào tế bào, thường dùng để nói đến chuyển gen ở sinh vật nhân chuẩn.
Biến nạp (transformation) thường được dùng để mô tả quá trình chuyển, tiếp nhận và
biểu hiện vật liệu di truyền từ môi trường xung quanh tế bào một cách trực tiếp.

Hình 2.4 Các bước tạo dòng gen
( )
Phát hiện dòng cần tìm: nếu mục đích đoạn gen chưa biết, người ta thường dùng
đầu dò. Nếu đoạn DNA biết, công việc đơn giản và nhanh chóng.

13


Kiểm tra và thu nhận sản phẩm của gen tái tổ hợp: nếu mục đích thiết lập ngân
hàng cDNA, đầu tiên phải tách plasmid tái tổ hợp ra khỏi dịch nuôi cấy, cắt plasmid tái
tổ hợp bằng enzyme RE và thu được hai băng DNA, một có độ dài bằng khung vectơ
một có độ dài bằng cDNA. Điện di kiểm tra lại sản phẩm cắt và kiểm tra độ dài
cDNA.Nếu sản phẩm gen tái tổ hợp là protein, hormone, kháng sinh người ta có thể thu
nhận sản phẩm bằng phương pháp phân tách, chiết, lắng, lọc, ly tâm kết tủa phân đoạn
hoặc trao đổi ion.
2.5.2. Vật liệu dùng trong tạo dòng
Tế bào chủ: nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng tùy thuộc vào mục

đích. Tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, lưu giữ và nhân giống, chấp
nhận được nhiều loại vector. Vi khuẩn E. coli đáp ứng được những yêu cầu này và
thường được sử dụng trong kỹ thuật tạo dòng. E. coli là vi khuẩn gram âm, hình que,
thường gặp trong ruột người. E. coli có một nhiễm sắc thể dạng vòng nằm trong vùng
nhân. Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã xảy ra đồng thời. Sau khi
mRNA được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã mà không qua các bước sửa
đổi sau phiên mã. Rất nhiều thí nghiệm tạo dòng gen sử dụng E. coli làm tế bào chủ.
Ngoài ra, một số tế bào chủ khác cũng được sử dụng như nấm men, tế bào thực vật, tế
bào động vật (Trịnh Đình Đạt, 2010).
Vectơ là phân tử DNA thường có dạng vòng, mang nhiều đặc tính trong đó có khả
năng xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và mượn bộ máy tế bào của vi khuẩn để tạo ra
nhiều bản sao khác giống hệt vector ban đầu. Các vector phải thỏa mãn một số yêu cầu
như: có các trình tự khởi đầu sao chép (ori - origin of replication) để tự sao chép mà tồn
tại độc lập; có các trình tự nhận biết của enzyme giới hạn để gắn đoạn gen lạ vào; các
trình tự điều hòa tạo thuận lợi cho sự phiên mã đoạn gen lạ; đảm bảo sự di truyền bền
vững của DNA tái tổ hợp; có các gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra chúng hoặc các
gen lạ. Có nhiều loại vector: plasmid, phage, cosmid, nhiễm sắc thể nhân tạo nấm
men…Dựa vào chức năng, người ta còn phân ra vector tạo dòng (chỉ có mục đích nhân
dòng) và vector biểu hiện (có mang các tín hiệu cần thiết cho việc biểu hiện gen). Việc
lựa chọn sử dụng một loại vector dựa vào kích thước của đoạn DNA cần tạo dòng và
mục đích tạo dòng.
14