PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG
DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : HỒ BẢO QUỐC
Niên khoá

: 2006 – 2010

Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG Bacillus thuringiensis CÓ KHẢ NĂNG
DIỆT SÂU BỘ CÁNH VẢY (Lepidoptera)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

HỒ BẢO QUỐC

KS. NGUYỄN VĂN LẪM

Tháng 07/2010


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:
-

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công nghệ Sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi
trong suốt quá trình học tại trường.

-

TS. Lê Đình Đôn, người thầy đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên tôi
trong suốt thời gian thực tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

-

Thầy Nguyễn Ngọc Hùng, người thầy đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập và hoàn thiện khoá luận.

-

KS. Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá
trình thực tập vừa qua.

-

Phòng Vi sinh Bộ môn Công nghệ Sinh học đã cho phép và tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại phòng.

-

Viện Nghiên cứu Công nghệ sinh học và Môi trường trường đại học Nông Lâm
đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi nghiên cứu tại viện.

-

Các bạn lớp DH06SH đã luôn bên tôi, giúp đỡ, động viên, chia sẻ cùng tôi
trong thời gian thực tập cũng như trong suốt những năm học vừa qua.

-

Cha mẹ, bậc sinh thành đã sinh ra và nuôi dưỡng tôi, các anh chị em trong gia
đình luôn quan tâm, ủng hộ tôi học tập và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Sinh viên thực hiện

HỒ BẢO QUỐC

i

TÓM TẮT
Bacillus thuringiensis là trực khuẩn G+, hiếu khí không bắt buộc, sinh protein tinh
thể độc tố chống lại nhiều loại côn trùng khác nhau. Dựa vào đặc tính này người ta sử
dụng B. thuringiensis làm tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp một cách
rộng rãi.
Mục đích của nghiên cứu là để phân lập các chủng B. thuringiensis sinh độc tố diệt
sâu thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera) từ những mẫu đất khác nhau ở một số tỉnh Nam
Trung Bộ, Tây Nguyên, Đông Nam Bộ, xác định đặc tính và đánh giá độc lực của các
chủng phân lập. Tổng cộng có 188 mẫu đất được thu thập ở Quảng Ngãi, Bình Định,
Phú Yên, KonTum, Gia Lai, DakLak, Lâm Đồng, Tây Ninh. 3100 vi khuẩn được phân
lập từ những mẫu đất thu thập ở trên bằng phương pháp phân lập sử dụng môi trường
T3 lỏng có chứa 0,25 M sodium acetate và xử lý nhiệt ở 80oC. Dựa vào đặc điểm hình
thái khuẩn lạc xác định được 203 vi khuẩn có khuẩn lạc giống khuẩn lạc B.
thuringiensis. Sau khi cho chúng mọc trên môi trường T3 thạch sau 48 giờ, tiến hành
quan sát 203 mẫu phân lập dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần nhằm khảo sát
protein tinh thể độc tố. Kết quả xác định được 9 chủng sản sinh protein tinh thể độc tố.
Thử hoạt tính sinh học diệt sâu của 9 chủng B. thuringiensis trên đối tượng sâu khoang
(Spodoptera litura), kết quả tất cả 9 chủng đều âm tính với Spodoptera litura. Sử dụng
PCR với cặp primer đặc hiệu cho gene cry1Ab đối với 9 chủng phân lập, không có
chủng nào cho ra sản phẩm PCR.

ii


SUMMARY
Bacillus thuringiensis is a Gram positive, facultative anaerobic bacteria that
produces proteins toxic against different insect species. This feature makes it the most
widely used biological control agent in agriculture.
The aim of this study was to isolate B. thuringiensis strains that produce protein
toxic against Lepidoptera from different soil samples in several provinces in South

Central, South and Highland Regions of Vietnam, and to investigate their phenotypic
and genotypic characterizations. Total 188 soil samples in Quảng Ngãi, Bình Định,
Phú Yên, Kon Tum, Gia Lai, Daklak, Lâm Đồng, Tây Ninh. Three thousand one
hundred bacteria were isolated from these samples by sodium acetate selection and
heat treatment. For phenotypic characterization, 203 of these isolates were grown for
48 h and crystal protein production was observed by phase contrast microscope during
spore formation. Nine of 203 the bacterial colonies were identified as B. thuringiensis.
Spherical type crystal morphology was mostly observed type among the others.
Examine biological activity of nine B. thuringiensis strains on the subject Spodoptera
litura, the results, all nine B. thuringiensis strains were negative for Spodoptera litura.
For genotypic characterization, the cry1Ab gene content of the isolates were screened
by Polymerase chain reaction (PCR) analysis. In addition, DNA analysis of 9 isolates
by Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) for all isolates were also carried out. All
nine B. thuringiensis strains didn’t give PCR product.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................... i
Tóm tắt ................................................................................................................. ii
Summary .............................................................................................................. iii
Danh sách chữ viết tắt .......................................................................................... vii
Danh sách các bảng .............................................................................................. viii
Danh sách các hình .............................................................................................. ix
Chương I MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1.1.

Đặt vấn đề ....................................................................................................... 1

1.2.

Yêu cầu của đề tài............................................................................................ 1

1.3.

Nội dung thực hiện ......................................................................................... 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus thuringiensis ......................................................... 4
2.1.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................. 4
2.1.2. Đặc điểm phân loại và sự phân bố ................................................................... 4
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại ........................................................................................ 4
2.1.2.2. Sự phân bố .................................................................................................... 4
2.1.3. Đặc điểm hình thái........................................................................................... 4
2.1.4. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis.............................. 5
2.1.4.1. Đặc trưng dinh dưỡng .................................................................................... 5
2.1.4.2 Quá trình phát triển của vi khuẩn B.t ........................................................... 6
2.1.4.3. Đặc tính sinh lý của vi khuẩn B.t .................................................................. 6
2.1.4.4. Đặc điểm sinh hoá ......................................................................................... 6
2.1.5. Tính năng di truyền của Bacillus thuringiensis ............................................... 7
2.1.5. Bộ gene của Bacillus thuringiensis .................................................................. 7
2.1.5.1. Những Cry gene ........................................................................................... 8
2.1.5.2. Phân loại gen độc tố ...................................................................................... 8
2.1.6. Phân loại Bacillus thuringiensis ...................................................................... 10
2.1.7. Sự khác nhau về độ độc của các biến loài B.t ................................................. 10
2.1.8. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn B.t ................................................................... 10

2.1.9. Chất độc của vi khuẩn B.t............................................................................... 10
2.1.9.1. exotoxin ......................................................................................................... 10
2.1.9.2. δ-endotoxin .................................................................................................... 11
2.2. Khía cạnh an toàn của độc tố tinh thể ................................................................. 16
2.2.1. Ảnh hưởng đến sức khỏe con người ................................................................ 16
2.2.2. Ảnh hưởng đến môi trường ............................................................................. 17
2.2.2.1. Nước ngầm và hệ sinh thái đất ...................................................................... 17
2.2.2.2. Động vật và côn trùng .................................................................................. 17
2.3. Những phương pháp phân lập Bacillus thuringiensis ......................................... 18
2.4. Những phương pháp mô tả đặc tính của Bacillus thuringiensis ......................... 18
2.5. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam................................................. 19
2.5.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................................... 19
2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam .................................................................... 20
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................... 21
3.1. Thời gian, địa điểm .............................................................................................. 21
3.1.1 Thời gian............................................................................................................ 21
3.1.2 Địa điểm nghiên cứu.......................................................................................... 21
3.2. Vật liệu ............................................................................................................... 21
3.2.1. Nguồn gốc mẫu................................................................................................. 21
3.2.2. Thiết bị .............................................................................................................. 23
3.2.3. Dụng cụ............................................................................................................. 23
3.2.4. Hoá chất ............................................................................................................ 23
3.3. Phương pháp thực hiện đề tài .............................................................................. 24
3.3.1. Cách lấy mẫu đất để phân lập vi khuẩn ............................................................ 24
3.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis ................................... 24
3.3.3. Thử hoạt tính sinh học diệt sâu......................................................................... 25
3.3.4. Phát hiện gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR ........................................................ 27
3.3.4.1 Phương pháp ly trích DNA ............................................................................. 27
3.3.4.2 Phương pháp PCR .......................................................................................... 28

3.3.4.3 Phương pháp điện di và đọc kết quả ....................................................... 29
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 30
4.1. Phân lập Bacillus thuringiensis ........................................................................... 30
4.2. Hình dạng tinh thể của các chủng Bacillus thuringiensis phân lập được............ 34
4.3. Thử hoạt tính sinh học diệt sâu ......................................................................... 37
4.4. Phát hiện gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR ........................................................... 38
4.4.1. Kết quả ly trích DNA ....................................................................................... 38
4.4.2. Kết quả phản ứng PCR sử dụng cặp primer TY6 và TY14 ............................. 39
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 41
5.1 Kết luận................................................................................................................. 41
5.2 Đề nghị ................................................................................................................. 41
Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 42
Phụ lục


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
B. thuringiensis : Bacillus thuringiensis
B.t

: Bacillus thuringiensis

Cry

: Crystal

CTAB

: Cethyltrimethylammonium bromide

Cyt

: cytolytic

Da

: Dalton (1Da = 1,66005380782(83) × 10−24 g)

DNA

: Deoxyribonucleic Acid

dNTP

: Deoxynucleotide triphosphate

EDTA

: Ethyleneediamine tetraacetic acid

EDTA

: Ethylenediamine tetra acetic acid

G+

: Gram dương

ICP

: Insecticidal crystal protein

kb

: Kilo base

KDa

: Kilodalton

mM

: Milimolar

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PFGE

: Pulsed Field Gel Electrophoresis

sp.

: Species

TAE

: Tris Acetate EDTA

TE

: Tris EDTA

U

: Unit

UV

: Ultra Violet

μl

: Microliter

μM

: Micromolar

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn Bacillus thuringiensis ............................ 7
Bảng 3.1 Danh sách mẫu đất thu thập tại một số tỉnh ............................................... 21
Bảng 3.1 (tt) Danh sách mẫu đất thu thập tại một số tỉnh ......................................... 22
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu ............................................. 27
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR và lượng cần đủ cho một phản ứng ................ 28

Bảng 3.4 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp primer TY6 và TY14 ................... 29
Bảng 4.1 Đặc điểm hình thái của các dạng khuẩn lạc thu được ................................ 31
Bảng 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis ..................................... 32
Bảng 4.3 Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính diệt sâu .......................................... 34

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis ................................................................. 4
Hình 2.2 Sơ đồ biểu diễn một cây chủng loại phát sinh ............................................ 9
Hình 2.3 Cấu trúc của Cry protein ............................................................................. 13
Hình 2.4 Cấu của Cyt protein .................................................................................... 13
Hình 2.5 Sơ đồ biểu diễn sự chuyển hoá các tiền độc tố ........................................... 15
Hình 3.1 Sơ đồ các bước phân lập vi khuẩn Bacillus thuringiensis từ đất ................ 25
Hình 3.2 Hình ảnh một nghiệm thức trong thí nghiệm.............................................. 26
Hình 3.3 Các nghiệm thức trong thí nghiệm xác định hoạt tính sinh học ................. 26
Hình 4.1 Đặc điểm khuẩn lạc B. Thuringiensis của mẫu TN2 .................................. 30
Hình 4.2 Sơ đồ thể hiện kết quả phân lập .................................................................. 33
Hình 4.3 Vi khuẩn Bacilus thuringiensis .................................................................. 34
Hình 4.4 Nghiệm thức TN2 sau 1 ngày ..................................................................... 37
Hình 4.5 Mẫu sâu chết của nghiệm thức đối chứng dương ....................................... 37
Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA tổng số các chủng Bacillus thuringiensis ............... 39
Hình 4.7 Kết quả PCR khi khuếch đại bằng cặp primer TY6 và TY14 .................... 40

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngày nay các chế phẩm sinh học an toàn cho phòng trừ sâu hại cây trồng và nông
sản bảo quản đã được khuyến khích, ứng dụng để thay thế dần các thuốc trừ sâu hoá
học, trong đó thuốc trừ sâu vi sinh Bacillus thuringiensis (gọi tắt là B.t) được dùng
rộng rãi nhất. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã có rất nhiều cố gắng để
phân lập vi khuẩn này từ môi trường của nhiều nước trên thế giới với hy vọng tìm ra
những chủng B. thuringiensis có phổ gây bệnh mới và khoảng vật chủ rộng hoặc nâng
cao hoạt tính các chủng B. thuringiensis đối với các nhóm côn trùng mới, hay tìm kiếm
nguồn gen từ những chủng phân lập cho các kỹ thuật di truyền tiếp theo. Với sự phát
triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học hiện đại, đặc biệt là công nghệ gen đã mở ra
những tiềm năng hết sức to lớn cho việc phát triển thuốc trừ sâu sinh học B.
thuringiensis. Việc làm giàu thêm bộ sưu tập các chủng B. thuringiensis phân lập ở
Việt Nam và nguồn gen quý từ những chủng này nhằm tạo ra các chủng tái tổ hợp mới
có phổ diệt sâu rộng hơn đối với một số loài côn trùng quan trọng là rất cần thiết. Với
vị thế là một trường đại học có thế mạnh về lĩnh vực nông nghiệp trường đại học Nông
Lâm có nhiều công trình nghiên cứu thiết thực phục vụ cho ngành nông nghiệp. Tuy
nhiên chưa có công trình chính thức nào nghiên cứu về Bacillus thuringiensis. Với
mong muốn đóng góp một phần công sức nhỏ bé của mình cho ngành công nghệ sinh
học của trường chúng tôi tiến hành phân lập, phân loại các chủng B. thuringiensis từ
một số địa phương, sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định tính chất của các
chủng Bacillus thuringiensis phân lập được nhằm tìm kiếm các chủng Bacillus
thuringiensis.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Phân lập, xác định đặc tính và đánh giá khả năng diệt sâu thuộc bộ cánh vảy của
các chủng Bacillus thuringensis trong các mẫu đất từ các nguồn khác nhau của một số
tỉnh có sinh thái khác nhau ở Nam trung bộ, Tây nguyên và Nam bộ.
1.3. Nội dung thực hiện
-

Phân lập Bacillus thuringiensis từ đất.

-

Quan sát kính hiển vi điện tử phát hiện vi khuẩn Bacillus thuringiensis.

1


-

Thử hoạt tính sinh học trên sâu khoang (Spodoptera litura) để phát hiện chủng
mang gene Cry1.

-

Phát hiện gen cry1Ab bằng kỹ thuật PCR.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Côn trùng là nhóm sinh vật đa dạng nhất trên Trái Đất, với hơn 1 triệu loài đã được
mô tả chiếm hơn một nửa tổng số tất cả các loài sinh vật sống mà con người biết đến.
Có khoảng 5.000 loài chuồn chuồn; 2.000 loài bọ ngựa; 20.000 loài châu chấu; 17.000
loài bướm; 120.000 loài hai cánh; 82.000 loài cánh nửa; 350.000 loài cánh cứng và
khoảng 110.000 loài cánh màng. Nhiều loài ảnh hưởng tiêu cực đến con người: Gây
thiệt hại cây trồng và hoạt động như các vector truyền bệnh cho cả con người và động
vật, chẳng hạn như bệnh sốt rét và sốt vàng da (Glazer và Nikaido, 1994). Vì vậy, con
người mong muốn kiểm soát côn trùng. Khi được phát triển song song với sự phát
triển của ngành hóa học, chất hóa học đã được bắt đầu được sử dụng để kiểm soát dịch

hại vào giữa năm 1800. Việc sử dụng các hóa chất vô cơ và các hợp chất asen hữu cơ
đã được theo sau bởi các hợp chất organochlorine, organophosphates, carbomates,
pyrethroid và formamidines (Glazer và Nikaido, 1994). Những hóa chất này rất hiệu
quả trong việc diệt và kiểm soát nhiều loài sâu hại. Tuy nhiên, chúng ảnh hưởng trực
tiếp hoặc gián tiếp đến hệ sinh thái bao gồm tích lũy dư lượng chất độc trong tự nhiên,
vấn đề sức khỏe của động vật có vú và sự phát triển của sâu kháng thuốc (Glazer và
Nikaido, 1994). Những vấn đề liên quan với thuốc trừ sâu hóa học đã định hướng con
người tìm ra những biện pháp kiểm soát dịch hai an toàn hơn và thân thiện hơn với
thiên nhiên thay thế cho biện pháp kiểm soát côn trùng bào thuốc hoá học.
Trong tự nhiên, một số vi sinh vật có tiềm năng để sản xuất một số tác nhân sinh
học có khả năng lây nhiễm các sinh vật sống khác bao gồm cả côn trùng. Nhiều loài
trong số các tác nhân lây nhiễm có một phổ ký chủ hẹp, không độc hại đối với côn
trùng có lợi hoặc động vật có xương sống (Glazer và Nikaido, 1994). Vì vậy, việc sử
dụng các vi sinh vật gây bệnh không được phát triển như là biện pháp sinh học kiểm
soát dịch hại. Virus côn trùng (baculoviruses), một số nấm, động vật nguyên sinh và vi
khuẩn đã được sử dụng làm tác nhân sinh học kiểm soát sâu bệnh. Trong số tất cả
những tác nhân sinh học kiểm soát sâu bệnh, Bacillus thuringiensis là các vi sinh vật
quan trọng nhất với các hoạt động gây bệnh qua đường tiêu hoá chống lại nhiều loài
côn trùng.

3


2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus thuringiensis
2.1.1. Lịch sử của Bacillus thuringiensis
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis (B.t) được phân lập lần đầu tiên bỡi một nhà khoa
học người Nhật S. Ishiwata vào năm 1901, từ ấu trùng tằm (Bombyx mori). Năm 1911,
nhà côn trùng học người Đức phát hiện tại vùng Thuringi vùng Địa Trung Hải sau khi
phân lập trên loài sâu xám. Năm 1915 được gọi là Bacillus thuringiensis.
Trong thập kỷ 60 của thế kỷ 20 người ta còn phát hiện nhiều biến loài trên sâu xám,

sâu róm thông, sâu xanh…và đã chế tạo ra chế phẩm B.t.
Ở Việt Nam chế phẩm B.t được nghiên cứu từ năm 1971.
2.1.2.

Đặc điểm phân loại và sự phân bố

2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
•

Giới: Eubacteria

•

Ngành: Firmicutes

•

Lớp: Bacilli

•

Bộ: Bacillales

•

Họ: Bacillaceae

•

Giống: Bacillus

•

Loài: thuringiensis

Hình 2.1 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis.


2.1.2.2. Sự phân bố
Bacillus thuringiensis là vi khuẩn Gram dương, sống trong đất, B. thuringiensis
chiếm khoảng 0,005 - 0,5% Bacillus sp. phân lập trong đất (Travers và ctv, 1987).
Ngoài ra, B. thuringiensis cũng xuất hiện tự nhiên trong ruột của sâu non của các loại
bướm đêm và bướm, cũng như trên bề mặt tối của thực vật.
2.1.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus thuringiensis là trực khuẩn sinh bào tử, hiếu khí không bắt buộc, G+, có
phủ tiên mao không dày, tế bào đứng riêng rẽ và xếp thành từng chuỗi.
B. thuringiensis có họ hàng gần với B. cereus, một loại vi khuẩn đất, và B.
anthracis, tác nhân gây bệnh than. Ba sinh vật này khác nhau trong đặc điểm plasmid

4


của chúng. Giống như các thành viên khác của chi, chúng có khả năng sản xuất nội
bào tử.
Hình thái cá thể B.t rất đơn giản, quá trình sống có thể chia thành 3 giai đoạn
+ Thể dinh dưỡng
Thể dinh dưỡng dạng que hai đầu tù, tựu như lạp xường, kích thước 1,2 - 1,8 µm x
3 – 5 µm. Lông roi mọc xung quanh, hơi động hoặc không động. Chúng thường tồn tại
một cá thể hay hai cá thể liền nhau. Phản ứng Gram dương. Thể dinh dưỡng là giai
đoạn sinh sản phân chia ngang. Trong thời kỳ sinh sản thường có từ 2 đến 8 thể dinh

dưỡng liền nhau thành chuỗi. Lúc này sinh trưởng nhanh, trao đổi chất nhiều dễ nuôi
cấy trên môi trường.
+ Nang bào tử
Khi cơ thể già, một đầu nào đó trong cơ thể hình thành bào mầm hình bầu dục, còn
đầu kia hình thành tinh thể hình thoi. Đó là giai đoạn nang bào tử. Nang bào tử hình
trứng dài to hơn thể dinh dưỡng. Nếu dùng thuốc nhuộm fusin nhuộm màu, thì thể
dinh dưỡng màu đở, tinh thể màu đỏ sẫm, bào mầm không màu, chỉ nhìn thấy một
vầng chiết quang.
+ Bào mầm và tinh thể
Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó, chúng nứt ra, phóng bào mầm
và tinh thể. Kích thước bào mầm từ 0,8 x 2 µm đến 0,9 x 2 µm. Bào mầm ở dạng ngủ
nghỉ có thể đề kháng với các điều kiện môi trường bất lợi. Tinh thể thường có kích
thước thay đổi theo biến loài, thường vào khoảng 0,6 x 2 µm; hình thoi, cũng có loại
hình tròn, hình bầu dục, hình vuông theo biến loài và loại môi trường. Tinh thể là một
loại protein là chất diệt sâu có hiệu quả chủ yếu.
2.1.4. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Bacillus thuringiensis
2.1.4.1. Đặc trưng dinh dưỡng
Vi khuẩn B.t có thể mọc trên các loại môi trường nuôi cấy, trên môi trường khác
nhau hình thái khuẩn lạc sẽ khác nhau.

5


Trên môi trường pepton agar bề mặt khuẩn lạc rộng, hình tròn, nuôi trong 72 giờ
đường kính có thể đạt 1cm; khuẩn lạc màu trắng sữa, bề mặt phẳng, mép hơi có dạng
phóng xạ giống dạng thảm, có tuyến phóng xạ dạng sợi.
Trên môi trường glucose 2,2%, agar nuôi ở nhiệt độ 30oC trong 24 giờ khuẩn lạc
màu vàng, sau 48 giờ có hình vòng tròn dày, đường kính 3 mm, giữa có vòng màu sẫm
hơn, bề mặt màu trắng bóng, khô, thô mép uốn, sau 3 ngày đường kính đạt 2cm.
2.1.4.2. Quá trình phát triển của vi khuẩn B.t

Theo Bechtel và ctv (1976), trong quá trình phát triển của vi khuẩn chúng trải qua
rất nhiều biến đổi về sinh lý sinh hoá. Nếu thông qua kính hiển vi quang học hoặc kính
hiển vi điện tử ta thấy sự hình thành bào mầm trải qua 7 giai đoạn:
-

Giao đoạn I (7 giờ): Sợi trục hình thành nhiễm sắc thể.

-

Giai đoạn II (7 giờ): Phát sinh màng tế bào hoàn thành vách tiền bào tử.

-

Giai đoạn III (8 – 9 giờ): Tiền bào tử tách ra từ từ trong tế bào mẹ.

-

Giai đoạn IV – VI (8 – 12 giờ): Xung quanh bào tử hình thành vỏ bào tử, màng

ngoài và bào tử được hình thành. Tinh thể xuất hiện vào đầu của kỳ VI dần dần lớn lên
-

Giai đoạn VII (Sau 12 giờ): Bào tử trưởng thành.

2.1.4.3. Đặc tính sinh lý của vi khuẩn B.t
-

Nhiệt độ: Có thể sinh trưởng trong điều kiện nhiệt độ 12 - 40oC, nhiệt độ thích

hợp là 27 – 32oC, 35 - 40oC sinh trưởng nhanh nhưng chóng lão hoá, nhiệt độ thấp

chúng sinh trưởng rất chậm.
-

Nhu cầu O2: B.t là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng sống trong điều kiện

thiếu O2.
-

Độ pH: thích hợp với điều kiện kiềm, pH thích hợp là 7,5

2.1.4.4. Đặc điểm sinh hoá
-

Làm ngưng kết sữa.

-

Trong đường glucose, fructose, glycerin, tinh bột, maltose, trehalose sẽ hình

thành acid.

6


-

Indol (-), methyl red (+), VP (+), có tác dụng hòa tan trong môi trường huyết

ngựa agar, cianat (+), nitrate (+), citric (-), sunphat (-).
Bảng 2.1 Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Phản ứng sinh hoá

Kết quả

Indol

-

Methyl red

+

VP

+

Hoà tan huyết ngựa agar

+

Cianate

+

Nitrate

+

Citric

-

Sunphat

-

Glucose

Acid

Fructose

Acid

Glycerin

Acid

Tinh bột

Acid

Maltose

Acid

Trehalose

Acid

Ngưng kết sữa

+

2.1.5. Tính năng di truyền của Bacillus thuringiensis
2.1.5.1. Bộ gene của Bacillus thuringiensis
Genome của B. thuringiensis có kích thước khoảng 2,4 triệu đến 5,7 triệu cặp base
(Carlson và ctv, 1994). Bản đồ di truyền được xây dựng cho B. thuringiensis và đã so
sánh với bản đồ di truyền của B. cereus. Sự so sánh cho thấy chromosome của hai loài
tương đồng 50% (Carlson và Kostø, 1993; Carlson và ctv, 1996). Hầu hết các dòng B.
7


thuringiensis chứa một vài plasmid DNA từ 2kb đến lớn hơn 200kb (Carlton và
Gonzalez, 1985). Chúng chiếm đến 20% tổng số DNA (Aronson, 2002). Những gene
(cry gene) mã hoá cho protein tinh thể bào tử vỏ hầu hết chúng được mang trên
plasmid lớn (Li và ctv, 1991). Những nghiên cứu lai trình tự cho thấy rằng những gene
cry cũng được tìm thấy trong chromosome của B. thuringiensis (Carlson và ctv, 1994).
2.1.5.2. Những Cry gene
Những gene cry mã hoá cho protein tinh thể diệt côn trùng hầu hết chúng định vị
trên những plasmid lớn (Gonzales và ctv, 1982). Một vài gene độc tố (cry và cyt) đã
được tạo dòng và giải trình tự. Hiện nay đã có 32 nhóm gene cry và 2 nhóm gene cyt
với hơn 200 gene mã hoá protein tinh thể diệt côn trùng (ICP) (Crickmore và ctv,
1998).
Một vài dòng B. thuringiensis có thể chứa gene cry đa chức năng thường mang bên
sườn bởi yếu tố gene nhảy hoặc trình tự chèn. Do đó, những dòng này có khả năng
tổng hợp nhiều hơn một protein tinh thể bào tử vỏ (Thomas và ctv, 2001).
2.1.5.3. Phân loại gene độc tố
Các độc tố trừ sâu của các chủng B. thuringiensis trước đây đã được chia thành 4
nhóm chính: Cry I, Cry II, Cry III, Cry IV dựa theo hoạt tính của độc tố. Các protein

cry I độc với côn trùng cánh vảy, Cry II độc với cả cánh vảy và hai cánh, cry III độc
với côn trùng cánh cứng và Cry IV độc với côn trùng hai cánh. Các protein này lại
được chia thành các dưới lớp (A, B, C…) và dưới nhóm (a, b, c,..) theo trình tự của các
DNA của gen độc tố. Trong những năm gần đây, khi các chủng B. thuringiensis phân
lập được ngày càng tăng cũng như các gen của chúng được xác định, rõ ràng cách
phân loại đầu tiên không thể phù hợp với nhiều gen độc tố B. thuringiensis mới phát
hiện. Do vậy, một hệ thống phân loại mới được đưa ra . Trong sơ đồ phân loại mới các
protein trừ sâu (Cry protein) B. thuringiensis được phân chia dựa trên mức độ đa dạng
tiến hóa, được đánh giá bằng thuật toán nhất định.

8


Hình 2.2 Sơ đồ biểu diễn một cây chủng loại phát sinh của các cry protein. Cry1
và Cry7 có độ tương đồng nhỏ hơn 45%, Cry1A và Cry1B có mức giống nhau trong
khoảng 45 - 78% và Cry1Ab và Cry1Ae có mức giông nhau trong khoảng 78 - 95%.

/>
9


2.1.6. Phân loại Bacillus thuringiensis
Vi khuẩn Bacillus thuringiensis có quan hệ gần với Bacillus cereus, cho nên trong
phân loại còn có nhiều tranh luận. Có người cho rằng vi khuẩn B.t là vi khuẩn B.
cereus, nhưng có người cho nó là loài độc lập. Hai loài này khác nhau ở chỗ hình
thành tinh thể hay không, không sử dụng muối citrat; muối photphat sót lại của bào
mầm của B.t nhiều gấp 10 lần so với B. cereus. Với 3 đặc điểm khác nhau trên B.t là
một loài và có nhiều biến loài.
Vào năm 1962, Barjac và Bonnefoll đã nghiên cứu sinh hoá và huyết thanh học của
24 hệ tinh thể B.t và chia ra làm 8 biến loài.

Các biến loài khác nhau có sơ đồ điện esteraza khác nhau (Norris, 1964)
Vào năm 1974, Bergey căn cứ vào kiểu huyết thanh mà chia B.t ra làm 17 biến loài,
11 kiểu huyết thanh.
2.1.7. Sự khác nhau về độ độc của các biến loài B.t
Các biến loài khác nhau thì có độ độc khác nhau.
Tiêu chuẩn để chọn độ độc là kiểu huyết thanh, độ độc UI/mg, độ lớn của tinh thể.
2.1.8. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn B. thuringiensis
Tác dụng gây bệnh chủ yếu của vi khuẩn B.t đối với côn trùng là qua thức ăn vào
cơ thể. Sự sinh sản của vi khuẩn có thể làm cho côn trùng chết, nhưng chất độc do vi
khuẩn sinh ra làm côn trùng chết nhanh hơn. Tác dụng diệt sâu của vi khuẩn có mối
quan hệ mật thiết với cơ chế gây bệnh và vật chủ.
2.1.9. Chất độc của vi khuẩn B. thuringiensis
Chất độc của vi khuẩn B.t được chia làm 2 loại:
-

δ-endotoxin: tinh thể bào tử vỏ

-

exotoxin: sản phẩm trao đổi chất tiết ra ngoài cơ thể vi khuẩn bao gồm:

α -exotoxin, β - exotoxin, γ - exotoxin.

2.1.9.1. Exotoxin
a) α - exotoxin: α - exotoxin là protein bị nhiệt phá hoại (120oC trong 20 phút),
chúng được sinh ra trước khi hình thành bào mầm và tinh thể.
b) β - exotoxin
Được Meconne phát hiện đầu tiên vào năm 1959.
Đặc điểm của β - exotoxin

10


Không phải protein mà là chất adenilic, hầu hết có gốc photphatic, tỷ lệ
adenine:photphatic là 1:1,06 hoặc 1:1,08; có một số nghiên cứu tỷ lệ này là 1:1. Có
tính bền nhiệt (ổn định ở nhiệt độ 120oC trong 15 phút), có thể tan trong nước.
Kết cấu của chất độc ngoài bao gồm 2 loại adenilic acid có tên gọi là thuringiensin A và
thuringiensin B. Cả 2 đều có một adenin, 1 nucleose, 1 phosphoric acid và một hợp chất
cacbon chưa xác định. Chất độc A là tự do, chất độc B là kết hợp thành γ - endolipoide.
Được sinh ra trước khi hình thành bào mầm và tinh thể.
Phạm vi và hiệu quả diệt sâu của chất độc β
Phạm vi diệt sâu rộng có thể diệt được các loài thuộc bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ
cánh cứng, bộ cánh màng, rệp và nhện (Hempei, 1967).
c) γ - exotoxin: γ - exotoxin là loại enzym chưa xác định.
2.1.9.2. δ-endotoxin
Còn gọi là chất độc tinh thể, tinh thể protein.
a) Hình thái tinh thể
Tinh thể có dạng nhiều cạnh, cũng có loại tròn, bầu dục. Mỗi nang bào tử chỉ có
một tinh thể, đôi khi có hai tinh thể. Thành phần chủ yếu là protein. Dưới kính hiển vi
điện tử có thể thấy một số biến loài hình nón, hình bát diện trên có nhiều vân. Hình
thái tinh thể bào tử vỏ có liên quan đến gene mã hoá cho nó: tinh thể hình trùng
phương liên quan đến gene cry1 (Aranson và ctv, 1976), tinh thể hình khối liên quan
đến gene cry2 (Ohba và Aizawai, 1986), tinh thể hình vuông liên quan đến gene cry3
(Hernstadt và ctv, 1986), tinh thể hình không xác định liên quan đến gene cry4
(Federici và ctv, 1990).
b) Sự hình thành tinh thể
Dùng chất đồng vị đánh dấu chứng minh protein của tinh thể là do protein của tế
bào vi khuẩn cung cấp. Sự chuyển hoá đó là một quá trình, phát sinh vào thời kỳ đầu
của bào mầm. Protein tinh thể được tổng hợp khi xuất hiện kháng nguyên tinh thể. Sự
hình thành tinh thể liên hệ mật thiết với màng bào mầm (exosporium), nó được tổng

hợp trên màng bào mầm, thậm chí người ta còn cho rằng sự hình thành tinh thể là do
sự sản sinh quá lượng của màng bào mầm. (Donald B. Bechtel và Lee A. Bulla, 1976).
Sự hình thành bào mầm có quan hệ mật thiết với sự hình thành tinh thể. Cơ chế của
nó là ức chế hoạt động tổng hợp enzyme phân giải guanylic acid vì thế ngăn cản sự lợi

11


dụng glucose của vi khuẩn phân giải ra acetic acid và chất trao đổi acetic acid rất cần
thiết cho sự hình thành tinh thể độc.
Nhiều nhà khoa học ủng hộ quan điểm: Silic (Si) hình thành lưới để ngưng kết
protein. Morrison đã phân tích được trong tinh thể của biến loài B. thuringiensis. var
0,35 – 0,43% Si (trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2002).
c) Thành phần chất độc của tinh thể
Tinh thể không hoà tan trong nước hoặc các chất hữu cơ (clorofooc, acetol, ether),
nhưng có thể hoà tan trong dung dịch kiềm. Tinh thể có thể ổn định trong các dung
dịch có phạm vi pH rộng (4 - 12). Có thể bị biến đổi tính chất trong trichloroacetic
acid (CCl3COOH), HgCl. Có tính chịu nhiệt nhất định ở 65oC có thể giữ được 1 giờ,
80oC được 20 phút.
Tinh thể là protein có 18 loại acid amin tổ thành, hàm lượng acid amin của tinh thể
các biến loài khác nhau đều có điểm chung là tỷ lệ các acid glutamic, asparagic,
leucine là nhiều nhất, các acid methionic, tryptophane là ít nhất.
d) Cấu trúc của chất độc tinh thể
Trong quá trình phát sinh bào tử, B. thuringiensis sản xuất một hoặc nhiều protein
lớn bao gồm thể vùi kết tinh, delta (δ) endotoxins, có thể dễ dàng quan sát dưới kính
hiển vi tương phản pha. Có hai loại δ-endotoxins; cry (crystal) độc tố hoạt động thông
qua các thụ thể đặc trưng và những độc tố cyt (cytolytic) không đặc trưng với những
thụ thể không được biết đến (Höfte and Whitely, 1989; de Maagd và ctv, 2000). Cả hai
được phân loại trên cơ sở trình tự amino acid tương đồng của chúng. Bốn cấp bậc đã
được xác định tùy thuộc vào vị trí của nó trong một cây phát sinh loài. Protein ít hơn

45% trình tự amino acid tương đồng tương ứng ở cấp bậc thứ nhất, và 78% và 95% độ
tương đồng là ranh giới của cấp bậc thứ hai và thứ ba (de Maagd và ctv, 2001).
Ba cấu trúc của các dạng hoạt động của các protein độc tố cry1A, cry2, cry3A và
cyt2A đã được làm sáng tỏ nhờ kỹ thuật X-ray crystallography (Grochulski và ctv,
1995; Li và ctv, 1991; Li và ctv,, 1996). Cry proteins giống nhau một cách đáng chú ý,
mỗi cry protein có 3 miền. Đầu N của miền I bao gồm 6 vòng xoắn kép xung quanh
một chuỗi xoắn lõi trung tâm và tham gia vào việc chèn màng và sự hình thành lỗ.
Miền II có ba phiến với ba nếp gấp đối xứng. Đầu C của miền III bao gồm hai phiến
đối song song ( hình 2.3). Cả miền II và miền III có liên quan đến thụ thể nhận dạng và

12


liên kết. Ngoài ra, gần đây chức năng hình thành lỗ của miền III đã được tìm thấy (de
Maagd và ctv, 2001).
Ngược lại, cyt2A protein có một miền duy nhất trong đó hai lớp bên ngoài của
xoắn α quấn quanh một hỗn hợp phiến β (Schnepf và ctv, 1998). Không giống như
các cry protein , cyt protein không nhận ra các thụ thể đặc trưng trên biểu mô ruột và
thể hiện hoạt động tan huyết (Crickmore và ctv, 1998).

Hình 2.3 Cấu trúc của Cry protein
/>
Hình 2.4 Cấu của Cyt protein
showabstract.

13


e) Hiệu suất gây độc của tinh thể
Khi xác định độ độc của tinh thể, người ta phát hiện protein có phân tử lượng

200.000 Da cho côn trùng ăn sẽ gây độc, nhưng tiêm lại không độc; phân tử lượng
5.000 – 10.000 Da dù tiêm hay ăn đều gây độc. Gần đây người ta nghiên cứu ngoài
phân tử lượng ra tinh thể phải có nhiều polypeptid. Tuy thành phần không như nhau
nhưng đoạn cuối phải có aspartic acid.
Độ độc của tinh thể khác nhau tuỳ theo các biến loài. Tinh thể có hình dạng khác
nhau độ độc cũng khác nhau. Những tinh thể có hình dạng gần tròn có hiệu quả đối với
các loài sâu bộ cánh vảy, những tinh thể nhiều cạnh ngắn có độ độc không bằng loại
tròn nhưng vẫn mạnh, còn những tinh thể nhiều cạnh dài độ độc rất kém đối với nhiều
loài sâu.
f) Cơ chế gây bệnh của chất độc tinh thể
Khi vi khuẩn vào ruột giữa của côn trùng không hình thành các enzyme mà gây
độc chủ yếu là do chất độc tinh thể. Sau khi tinh thể hoà tan trong ruột côn trùng chỉ
mấy phút là côn trùng tê liệt, chỉ 55 phút là vách ruột bị vỡ, làm cho các tế bào thượng
bì ruột giữa rụng, để lộ màng đáy mỏng tạo điều kiện cho tế bào dinh dưỡng của vi
khuẩn xâm nhập. Nghĩa là sau khi sâu ăn vi khuẩn bào mầm nảy mầm tế bào dinh
dưỡng chui vào màng thực quản xâm nhập vào thượng bì ruột giữa bị phá hoại, cuối
cùng tế bào dinh dưỡng chui vào màng đáy các chất trong ruột lẫn với máu sâu non sẽ
chết.
Heimpel (1959) chỉ rõ ruột trước của sâu non có chứa proteasa có thể phân giải
protein tinh thể. Tinh thể có thể bị hoà tan trong ruột các loài sâu xám nhưng không
hình thành độc tố từ tiền độc tố. Tinh thể không hoà tan trong ruột ngài đêm rau cải
nên không hình thành chất độc, cho nên loài sâu này không nhạy cảm đối với vi khuẩn
B.t. Có người phân tích trong ruột sâu xanh rau cải có nhiều loại enzym, cho nên
người ta cho rằng protease làm cho tinh thể bị phân giải là phân tử có tác dụng gây độc.

14