NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH PROTOPLAST VÀ TẠO PHÔI VÔ TÍNH TRÊN CÂY TIÊU (Piper colubrinum L.)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH PROTOPLAST
VÀ TẠO PHÔI VÔ TÍNH TRÊN CÂY TIÊU
(Piper colubrinum L.)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: HUỲNH THANH KHOA

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 07/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU PHÂN TÁCH PROTOPLAST
VÀ TẠO PHÔI VÔ TÍNH TRÊN CÂY TIÊU
(Piper colubrinum L.)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

HUỲNH THANH KHOA

Tháng 07/2010


LỜI CẢM ƠN
Con thành kính ghi ơn Mẹ cùng các anh chị trong gia đình đã luôn tạo điều kiện và
động viên con trong suốt quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
− Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
− Các Thầy Cô thuộc Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô của trường
đã luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi.
− ThS. Nguyễn Vũ Phong đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
− Các bạn sinh viên cùng làm khóa luận tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Bộ môn
Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Chân thành cảm ơn.
Tháng 07 năm 2010
Huỳnh Thanh Khoa

i


TÓM TẮT
Đặc tính kháng bệnh chết nhanh của cây tiêu Piper colubrinum L. đang được
nghiên cứu để ứng dụng vào công tác sản xuất tiêu giống. Vì vậy, nhằm cung cấp
nguyên liệu ban đầu cho nghiên cứu nhân nhanh cây tiêu có chứa đặc tính kháng bệnh
chết nhanh nên chúng tôi thực hiên đề tài “Nghiên cứu phân tách protoplast và tạo
phôi vô tính trên cây tiêu Piper colubrinum L.”.
Nội dung chính của đề tài là nghiên cứu phân tách protoplast và tạo phôi vô tính
trên cây tiêu Piper colubrinum nhằm tạo ra nguồn nguyên liệu ban đầu cho nhu cầu
sản xuất tiêu giống có những đặc tính tốt.
Một số kết quả đã đạt được là lá tiêu được vô trùng tốt nhất ở nồng độ javel với
nước là 1: 3 (v/v) trong thời gian 20 phút. Môi trường tạo sẹo thích hợp nhất là môi
trường MS bổ sung 3 mg/L BA và 1 mg/L 2,4-D. Môi trường bổ sung từ 4,0 mg/L đến
6,0 mg/L Ki kết hợp với 1,0 mg/L BA đều cho cảm ứng phát sinh phôi từ mô sẹo của
cây tiêu Piper colubrinum L.. Protoplast của cây tiêu Piper colubrinum L. đã được
phân tách với dung dịch enzyme chứa 1% cellulase và 0,5% pectinase sau khi ủ ở 26oC
trong 24 giờ.

ii


SUMMARY
The thesis title “The study of protoplast isolation and somatic embryogenesis in
Piper colubrinum L.”.
Anti-rapiddeath particularly in Piper colubrinum L. is being studied for
application to the breeding. So, we have carried out this subject to provide the starting
material for pepper multiplication research containing anti-rapiddeath perticullarity.

The main contents of this project are to study protoplast isolation and somatic
embryogenesis in Piper colubrinum L. to create original material for seed production
needs containing good traits.
After study, we got some results. For sterile of Pepper colubrinum leaves the
optimal results were obtained with treatments using javel: water of 1: 2 (v/v) in 20
minutes. MS medium supplemented with 3,0 mg/L BA and 1,0 mg/L 2,4-D was the
most effective for callus formation from leaf. MS medium supplemented from 4,0
mg/L to 6,0 mg/L Ki and 1,0 mg/L BA was induced somatic embryogenesis from
Piper colubrinum callus. Protoplasts of Piper colubrinum L. were isolated with
enzyme solution containing 1,00 percent cellulase and 0,50 percent pectinase
incubated at 26oC in 24 hours.
Keywords: Protoplast isolation, somatic embryogenesis, Piper colubrinum L..

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i 
TÓM TẮT ..................................................................................................................... ii 
SUMMARY .................................................................................................................. iii 
MỤC LỤC .................................................................................................................... iv 
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... vii 
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... viii 
DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................ viii 
Chương 1 MỞ ĐẦU.......................................................................................................1 
1.1. 

Đặt vấn đề.........................................................................................................1 

1.2. 

Mục đích và yêu cầu.........................................................................................1 

1.2.1. 

Mục đích ...........................................................................................................1 

1.2.2. 

Yêu cầu .............................................................................................................1 

1.3. 

Nội dung thực hiện ...........................................................................................2 

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................3 
2.1. 

Giới thiệu khái quát về cây tiêu .......................................................................3 

2.1.1. 

Đặc điểm của cây tiêu ......................................................................................3 

2.1.2. 

Tình hình sản xuất và tiêu thụ tiêu trên thế giới và trong nước .......................4 

2.1.2.1.  Trên thế giới .....................................................................................................4 
2.1.2.2.  Trong nước .......................................................................................................5 

2.2. 

Giới thiệu về protoplast ....................................................................................6 

2.2.1. 

Đặc điểm của protoplast ...................................................................................6 

2.2.2. 

Ứng dụng của protoplast ..................................................................................7 

2.2.3. 

Phương pháp phân tách protoplast ...................................................................7 

2.2.4. 

Nuôi cấy protoplast ..........................................................................................8 

2.2.4.1.  Thành phần dinh dưỡng ...................................................................................8 
2.2.4.2.  Áp lực thẩm thấu của môi trường ....................................................................8 
2.2.4.3.  Mật độ dàn trải protoplast ................................................................................9 
2.2.4.4.  Tạo vách tế bào ................................................................................................9 
2.2.4.5.  Phát triển callus và tạo cây hoàn chỉnh ............................................................9 
iv


2.2.5. 

Dung hợp protoplast .........................................................................................9 

2.2.5.1.  Xử lý bằng NaNO3 ...........................................................................................9 
2.2.5.2.  Xử lý bằng Polyethylen glycol (PEG) ...........................................................10 
2.2.5.3.  Dung hợp bằng điện .......................................................................................10 
2.3. 

Phương pháp nuôi cấy phát sinh phôi vô tính ................................................10 

2.3.1. 

Phôi vô tính ....................................................................................................10 

2.3.2. 

Ý nghĩa nuôi cấy phôi vô tính ........................................................................10 

2.3.3. 

Sự hình thành phôi vô tính .............................................................................11 

2.3.4. 

Cơ chế phát sinh phôi vô tính.........................................................................11 

2.3.5. 

Các kiểu phát sinh phôi ..................................................................................12 

2.3.5.1.  Sự phát sinh phôi bất định ..............................................................................12 

2.3.5.2.  Sự phát sinh đa phôi vô tính ...........................................................................12 
2.3.5.3.  Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng ..............................................................12 
2.4. 

Những nghiên cứu về cây tiêu........................................................................12 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................16 
3.1. 

Thời gian và địa điểm thí nghiệm ..................................................................16 

3.2. 

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................16 

3.2.1. 

Đối tượng nghiên cứu.....................................................................................16 

3.2.2. 

Môi trường nuôi cấy .......................................................................................16 

3.2.3. 

Dung dịch sử dụng trong tách chiết protoplast ..............................................17 

3.3. 

Phương pháp nghiên cứu ................................................................................17 

3.3.1. 

Thí nghiệm 1: Xác định nồng độ javel và thời gian khử trùng ......................17 

3.3.2. 

Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và 2,4–D .....................18 

3.3.3. 

Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BA và Ki ..........................19 

3.3.4. 

Thí nghiệm 4: Khảo sát sự phân tách protoplast bằng hỗn hợp enzyme .......20 

3.4. 

Phương pháp xử lý số liệu ..............................................................................21 

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................22 
4.1. 

Thí nghiệm 1: Nồng độ javel và thời gian khử trùng thích hợp.....................22 

4.2. 

Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA và 2,4–D ...................................23 

4.3. 

Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ BA và Ki .........................................26 

4.4. 

Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của dung dịch enzyme .........................................29 

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................31 
v


5.1. 

Kết luận ..........................................................................................................31 

5.2. 

Đề nghị ...........................................................................................................31 

TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................32 
PHỤ LỤC 

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

2iP

6-(γ, γ-Dimethylallylamino) purine [2-isopentenyadenine]

BA

N6-Benzyladenine (6-Benzylaminopurine)

CPA

p-Chlorophenoxyacetic acid

Ctv

Cộng tác viên

CV

Hệ số biến động

IBA

Indole-3 Butyric acid

IPC

International Pepper Community

Ki

Kinetin

MS

Murashige và Skoog

NAA

α-Naphthaleneacetic acid

PEG

Polyethylen glycol

TDZ

Thidiazuron [N-phenyl-N’-(1, 2, 3-Thiadiazol-5-yl) urea]

VPA

Vietnam Pepper Association

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ javel và thời gian khử .......................... 17
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và 2,4-D ......................................... 18
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ BA và Ki .............................................. 19

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của dung dịch enzyme .................................... 20
Bảng 4.1 Kết quả khử trùng mẫu lá sau hai tuần nuôi cấy ........................................... 21
Bảng 4.2 Thời gian xuất hiện mô sẹo từ mô lá của cây tiêu ......................................... 22
Bảng 4.3 Tỷ lệ tạo sẹo ở các nghiệm thức .................................................................... 23
Bảng 4.4 Kết quả phân tách protoplast ở Piper colubrinum......................................... 28

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 4.1 Mẫu lá tiêu trên môi trường MS sau 2 tuần nuôi cấy .................................... 22
Hình 4.2 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 3 mg/L BA + 1 mg/L 2,4-D ..................... 24
Hình 4.3 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 5 mg/L BA + 0,5 mg/L 2,4-D .................. 24
Hình 4.4 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 5 mg/L BA + 1 mg/L 2,4-D ...................... 25
Hình 4.5 Mô sẹo trên môi trường bổ sung 3 mg/L BA + 0,5 mg/L 2,4-D ................... 25
Hình 4.6 Mô sẹo trên môi trường tạo phôi bổ sung 5,0 mg/L Ki ................................. 26
Hình 4.7 Mô sẹo trên môi trường tạo phôi bổ sung 4,0 mg/L Ki ................................. 26
Hình 4.8 Mô sẹo trên môi trường tạo phôi bổ sung 6,0 mg/L Ki ................................. 26
Hình 4.9 Mô sẹo trên môi trường tạo phôi bổ sung 0,0 mg/L Ki ................................. 26
Hình 4.10 Mặt cắt mô sẹo trên môi trường bổ sung 5,0 mg/L Ki .................................. 27

Hình 4.11 Mặt cắt mô sẹo trên môi trường bổ sung 4,0 mg/L Ki ................................ 27
Hình 4.12 Mặt cắt mô sẹo trên môi trường bổ sung 6,0 mg/L Ki ................................ 27
Hình 4.13 Mặt cắt mô sẹo trên môi trường bổ sung 3,0 mg/L BA ............................... 27
Hình 4.14 Protoplast quan sát ở vật kính 10X .............................................................. 29

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một nước nông nghiệp, chủ yếu trồng trọt là chính. Bên cạnh hoa
màu, cây ăn quả, cây công nghiệp ngắn ngày,...thì cây công nghiệp dài ngày cũng

được trồng nhiều và khá phổ biến. Ngoài chè, cà phê, cao su,… thì cây tiêu cũng mang
lại nhiều giá trị cho nền kinh tế của đất nước.
Sản lượng hồ tiêu xuất khẩu của nước ta trong những năm gần đây tăng lên đáng
kể. Tuy nhiên, hiện trạng trồng hồ tiêu của Việt Nam đang gặp phải một số hạn chế.
Đó là, cây hồ tiêu thường bị bệnh do khả năng chống chịu và kháng bệnh kém hơn so
với cây mọc hoang dại. Vì vậy, nếu không có những giải pháp đúng đắn, kịp thời thì
mặt hàng tiêu của Việt Nam sẽ giảm sút về lượng lẫn về chất.
Đặc tính kháng bệnh chết nhanh của cây tiêu Piper colubrinum L. đang rất được
quan tâm bởi các giống tiêu hiện nay không có đặc tính quan trọng này. Nhằm ứng
dụng đặc tính kháng bệnh chết nhanh vào công tác sản xuất giống, nhiều nghiên cứu
đã được thực hiện. Trong đó, nghiên cứu tạo gốc ghép từ Piper colubrinum L. đã đạt
được thành công.
Ngày nay, khoa học công nghệ phát triển mạnh mẽ không ngừng, nhất là công
nghệ tế bào đã đóng góp to lớn vào lĩnh vực cải tiến giống cây trồng nông nghiệp phục
vụ cho nhu cầu của con người. Nhằm cung cấp số lượng lớn cây giống làm gốc ghép
bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, đồng thời cùng với sự đồng ý của Bộ môn
Công nghệ Sinh học, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phân tách protoplast và
tạo phôi vô tính trên cây tiêu Piper colubrinum L.”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phân tách protoplast của cây tiêu Piper colubrinum L. bằng phương pháp sử
dụng hỗn hợp enzyme.
Nghiên cứu tạo phôi vô tính cây tiêu Piper colubrinum L..
1.2.2. Yêu cầu
Xác định số lượng protoplast của cây tiêu Piper colubrinum L. khi xử lý bằng
hỗn hợp dung dịch enzyme.
1


Xác định môi trường thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo và phôi vô tính của cây

tiêu Piper colubrinum L..
1.3. Nội dung thực hiện
Nuôi cấy lá của cây tiêu Piper colubrinum L. để tạo nguồn mẫu.
Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự tạo mô sẹo và phôi vô tính của cây tiêu
Piper colubrinum L..
Khảo sát ảnh hưởng của dung dịch enzyme đến sự phân tách protoplast của cây tiêu
Piper colubrinum L..

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu khái quát về cây tiêu
2.1.1. Đặc điểm của cây tiêu
Cây tiêu (Piper nigrum) có nguồn gốc từ miền Tây Nam Ấn Độ, nằm ở vùng
Ghats và Assam. Ở đây, cây tiêu mọc hoang dại trong rừng và được người Ấn Độ phát
hiện, sử dụng đầu tiên.
Vào khoảng 600 năm sau công nguyên, cây tiêu được người Hindu mang tới
Indonesia. Cuối thế kỷ XII, tiêu được trồng ở Mã Lai. Rồi đến thế kỷ XVIII, cây tiêu
được trồng ở Srilanka và Campuchia. Vào đầu thế kỷ XX, cây tiêu được trồng ở các
nước nhiệt đới như Mandagasca, Nigieria, Congo, Brazil, Mexico,…
Cây tiêu du nhập vào nước ta từ thế kỷ XVII nhưng mãi đến thế kỷ XVIII mới
bắt đầu phát triển khi người Trung Hoa di dân vào Campuchia ở dọc bờ biển vịnh Thái
Lan. Và lúc đó, ở nước ta cây tiêu được trồng chủ yêu ở Phú Quốc, Hòn Chông, Hà
Tiên; rồi sau đó lan ra các tỉnh khác như Thừa Thiên - Huế, Quảng trị,…
Cây tiêu thuộc loại thân thảo mềm dẻo được chia thành nhiều đốt, tại mỗi đốt có
một lá đơn, mọc cách và có hình trái tim. Ở nách lá có mầm ngủ có thể phát sinh thành
cành tược, cành lươn và cành ác (cành cho trái) tùy theo từng giai đoạn phát triển của
cây tiêu. Hệ thống rễ thường gồm từ 3 – 6 rễ cái và một chùm rễ phụ ở dưới mặt đất,
trên đốt thân còn có rễ bám. Cây tiêu ra hoa dưới dạng tự hình gié, treo lửng lẳng, dài

từ 7 – 12 cm tùy giống và điều kiện chăm sóc. Trên gié hoa có khoảng 20 – 60 hoa xếp
thành hình xoắn ốc, hoa tiêu lưỡng tính hay đơn tính.
Cây tiêu là cây đặc trưng của vùng nhiệt đới. Nhiệt độ thích hợp cho cây tiêu là
từ 10 – 35oC. Ánh sáng tán xạ nhẹ phù hợp cho sự sinh trưởng, phát dục và ra hoa đậu
quả của cây tiêu. Cây tiêu thích hợp với khí hậu nóng ẩm, lượng mưa trong năm cần từ
1500 – 2500 mm. Tuy vậy, tiêu cũng cần một giai đoạn hạn ngắn sau vụ thu hoạch để
phân hóa mầm hoa tốt và ra hoa đồng loạt vào mùa mưa năm sau. Đất đỏ basalt là
thích hợp nhất cho trồng tiêu.
Cây tiêu có thể sống lâu năm và có giá trị kinh tế cao. Tiêu được sử dụng làm gia
vị, sử dụng trong y dược, sử dụng trong công nghiệp hương liệu và được dùng làm
chất trừ côn trùng.
3


2.1.2. Tình hình sản xuất và tiêu thụ tiêu trên thế giới và trong nước
2.1.2.1. Trên thế giới
Theo thống kê của FAO, hiện nay trên thế giới có khoảng 70 quốc gia trồng tiêu.
Năm 1954 toàn thế giới có khoảng 64.000 tấn hột tiêu; năm 1978 là 160.000 tấn
hột tiêu; năm 1983 là 180.000 tấn hột tiêu. Đến năm 1989 – 1990 diện tích trồng tiêu
trên toàn thế giới đã tăng vọt và sản lượng đạt khoảng 185.000 tấn tiêu hột.
Năm 2007 sản lượng hạt tiêu thế giới ước giảm 25 – 30% so với năm 2006 (từ
289.230 tấn năm 2006 xuống 272.000 tấn năm 2007). Nguồn cung hạt tiêu trên thế
giới năm 2007 ước đạt 323.000 tấn trong khi nhu cầu lên tới 376.000 tấn, tức là thiếu
47.500 tấn.
Xuất khẩu hạt tiêu thế giới năm 2007 ước đạt 201.700 tấn so với 247.741 tấn
năm 2006. Trong mấy tháng đầu năm, trên thị trường hạt tiêu thế giới chỉ có Việt Nam
còn hàng dự trữ, sản lượng của Ấn Độ hầu như chỉ tiêu thụ trên thị trường nội địa.
Việt Nam – nước xuất khẩu hạt tiêu lớn nhất thế giới, chiếm khoảng 33% tổng
cung hạt tiêu toàn thế giới. Khối lượng hạt tiêu xuất khẩu của Việt Nam năm 2007 ước
giảm 14% so với năm 2006, tuy nhiên giá trị lại tăng 73%. Đứng thứ hai là Brazil với

15% và tiếp theo là Indonesia với 13%. Sản lượng hạt tiêu Brazil năm 2007 chỉ đạt
36.000 tấn trong khi của Việt Nam đạt khoảng 90.000 tấn, giảm mạnh so với 100.000
tấn của năm 2006. Ở Indonesia với sản lượng khoảng 25.000 tấn, nguồn cung năm
2007 đạt 35.000 tấn. Còn sản lượng hạt tiêu Ấn Độ năm 2007 chỉ khoảng 45.000 –
50.000 tấn; cộng với sản lượng dự trữ gối vụ 20.000 tấn và lượng nhập khẩu khoảng
15.000 tấn thì tổng cung tiêu năm 2007 chỉ vào khoảng 72.000 tấn.
Năm 2009, do sản lượng hạt tiêu ở Ấn Độ, Brazil và Indonesia giảm bởi thời tiết
xấu nên thị trường hạt tiêu thế giới năm 2009 luôn trong tình trạng thiếu cung, mặc dù
sản xuất tăng ở Việt Nam. Sản lượng hạt tiêu thế giới năm 2009 là 281.974 tấn. Trong
đó, Việt Nam vẫn là nước sản xuất hạt tiêu lớn nhất thế giới với 95.000 tấn, tiếp theo
là Ấn Độ với 50.000 tấn, Brazil với 37.000 tấn, Indonesia với 25.000 tấn, Malaysia với
22.000 tấn và Srilanka với 15.600 tấn (Nguồn: Reuters, Business Lines).
Ủy ban hạt tiêu thế giới (IPC) dự báo sản lượng hạt tiêu toàn cầu sẽ tăng 3%
trong năm 2010 đạt 290.742 tấn so với 281.974 tấn năm 2009. Mặc dù sản lượng tăng
nhưng xuất khẩu hạt tiêu thế giới sẽ giảm khoảng 12% do lượng dự trữ gối vụ giảm
mạnh. Mậu dịch hạt tiêu thế giới năm 2010 dự báo đạt 218.074 tấn, giảm so với
4


243.800 tấn năm 2009. Nguyên nhân do khủng hoảng kinh tế khiến nhiều khách hàng
lớn phải cắt giảm lượng dự trữ và giảm mua những hợp đồng dài hạn. Dự trữ hạt tiêu
thế giới được IPC dự báo là sẽ giảm 32% trong năm 2010, xuống 79.124 tấn so với
116.325 tấn năm 2009.
Các nước sản xuất tiêu nhiều nhất trên thế giới hiện nay là Việt Nam, Ấn Độ,
Brazil, Indonesia, Malaysia và Srilanka.
Trên thế giới mức tiêu thụ hạt tiêu hàng năm đạt khoảng 4 – 5%. Các sản phẩm
được trao đổi dưới dạng : tiêu đen, tiêu trắng, tiêu xanh và dầu nhựa tiêu. Hiện nay,
nước Mỹ đang đứng đầu về nhập khẩu tiêu với khoảng 1/3 lượng tiêu của thế giới. Sau
đó là các nước Nga, Đức, Pháp, Ý và thị trường của Anh. Bên cạnh đó, thị trường các
nước Trung Đông và Bắc Phi cũng đang tiêu thụ ngày càng nhiều.

2.1.2.2. Trong nước
Trước năm 1975, Miền Bắc được trồng chủ yếu ở Nghệ An, Quảng Bình và Miền
Nam được trồng ở Phú Quốc, Long Khánh, Lộc Ninh. Năm 1995 diện tích từng bước
gia tăng song biến động không ổn định bởi thiên tai, bệnh tật. Từ 1990 – 1995 do giá
tiêu bị giảm mạnh và không có thị trường tiêu thụ nên các vườn tiêu bị phá rất nhiều.
Từ năm 1996 các nước như Indonesia, Brazil,… bị ảnh hưởng của thiên tai, khu
vực Đông Nam Á bị khủng hoảng tài chính, nên giá tiêu đã gia tăng lên 4.000 USD/tấn
vào năm 2000, và đó là cơ hội thuận lợi cho hồ tiêu Việt Nam vươn lên chiếm lĩnh thị
trường hạt tiêu thế giới.
Năm 1997 – 1999 diện tích tiêu tăng từ 9.777 lên 15.461 ha. Diện tích tiêu tăng
nhanh nhất ở vùng Đông Nam Bộ từ 5.893 ha tăng lên 9.115 ha (chiếm 60,27% diện
tích tiêu của cả nước).
Năng suất tăng chậm và có sự sai khác rất lớn giữa các vùng và tỉnh có trồng
tiêu. Năng suất bình quân năm 1997 là 2,08 tấn/ha đến năm 1999 cũng chỉ đạt 2,12
tấn/ha nhưng cao nhất là ở vùng Đông Nam Bộ đạt 2,55 tấn/ha, trong khi năng suất
thấp nhất là ở vùng Bắc Trung Bộ chỉ đạt 0,75 tấn/ha (bằng 29,4% so với năng suất
tiêu của vùng Đông Nam Bộ). Đặc biệt tỉnh Bình Phước với diện tích thu hoạch 2.405
ha, năng suất đạt 3,8 tấn/ha (gấp 6,9 lần năng suất tiêu của tỉnh Quảng Bình).
Năng suất bình quân năm 1997 đạt 18.970 tấn. Sản lượng tiêu tính trên diện tích
cho thu hoạch theo thống kê năm 1997 là 13.007 tấn và năm 1999 tăng lên 18.970 tấn

5


song thực tế xuất khẩu năm 1999 đạt 34.000 tấn. Tổng lượng tiêu 3 năm 1997-1999 là
47.860 tấn trong khi lượng tiêu xuất khẩu lại là 74.500 tấn.
Từ năm 2001 đến nay, Việt nam luôn giữ vững được vị trí đứng đầu thế giới về
sản xuất và xuất khẩu hồ tiêu. Sản lượng thu hoạch hồ tiêu của Việt Nam đã dần đi vào
thế ổn định, ít tăng giảm về sản lượng trong những năm gần đây. Năm 2007 là 91.000
tấn, năm 2008 là 98.000 tấn. Và theo thông tin từ Hiệp hội hồ tiêu Việt Nam (VPA),

sản lượng vụ tiêu năm 2009 của cả nước đạt 105.000 tấn, cộng dồn với lượng tồn kho
năm trước chuyển sang khoảng 10.000 tấn, thì tổng nguồn cung cho thị trường sẽ là
115.000 tấn.
Nước ta chủ yếu sản xuất mặt hàng tiêu đen, thị trường tiêu thụ trong nước hàng
năm chỉ đạt khoảng 3.500 – 4.000 tấn/năm, còn phần lớn sản lượng tiêu dành cho xuất
khẩu. Theo Bộ Thương Mại, hạt tiêu Việt Nam đã xuất khẩu cho 30 nước trên thế giới.
Cả nước xuất khẩu từ 1996-1999 là 107.800 tấn (bình quân một năm 26.950 tấn), tốc
độ tăng 12%/năm.
Ba thị trường tiêu thụ tiêu lớn nhất của Việt nam đều có sự tăng trưởng mạnh: thị
trường Đức tăng gấp ba lần; Ấn Độ tăng gấp hai lần; và Mỹ tăng 39,82%. Xuất khẩu
hạt tiêu của Việt Nam trong năm 2009 ước tính đạt 128.000 tấn, đạt kỷ lục cao từ
trước tới nay.
2.2. Giới thiệu về protoplast
2.2.1. Đặc điểm của protoplast (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)
Protoplast là tế bào thực vật đã được tách bỏ thành tế bào. Lúc này, nguyên sinh
chất và các bào quan chỉ được bao bọc bởi màng nguyên sinh chất. Và màng tế bào
của tế bào trần là phần ngăn cách tế bào với môi trường xung quanh.
Protoplast có hai đặc điểm quan trọng:
Protoplast có khả năng tiếp nhận một đoạn DNA hay toàn bộ DNA lạ. Đặc tính
này chỉ thấy có ở tế bào vi khuẩn. Các tế bào nguyên thủy trong mô thực vật không có
đặc tính này. Khi tế bào thực vật được tách bỏ thành tế bào để tạo ra protoplast thì lúc
này protoplast có khả năng tiếp nhận vật liệu di truyền lạ giống như tế bào vi khuẩn.
Khi được đưa vào môi trường có đầy đủ chất dinh dưỡng thích hợp, protoplast có
khả năng tái sinh vách tế bào. Đây là đặc tính hết sức đặc biệt của protoplast. Nhờ đó,
protoplast mới phục hồi được toàn bộ chức năng của một tế bào nguyên thủy.

6


Khi protoplast tái tạo được vách và trở lại thành tế bào nguyên thủy, protoplast sẽ

lại có khả năng phát triển và phân chia hoàn toàn giống như những tế bào bình thường.
2.2.2. Ứng dụng của protoplast (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)
Khi tạo ra được protoplast, các nhà khoa học cho thấy khả năng vô cùng lớn của
nó trong nghiên cứu cũng như trong sản xuất.
Các nhà khoa học sử dụng protoplast như một đối tượng sinh học trong công tác
lai giống. Hoàn toàn có thể sử dụng các protoplast cùng loài để tiến hành lai giống.
Khi đó, vật chất di truyền của các cá thể trong cùng một loài có thể trao đổi cho nhau.
Kết quả là chúng ta thu nhận được tính trạng mới trong mỗi loài. Phương pháp này
giống như hiện tượng tiếp hợp ở vi khuẩn. Ngoài ra, các nhà khoa học dựa vào khả
năng tiếp nhận không chọn lọc các vật chất di truyền của protoplast để tiến hành lai
khác loài và từ đó tạo ra được tính đa dạng sinh học.
Các nhà khoa học còn sử dụng protoplast như cơ thể nhận các vật liệu di truyền
từ các giới sinh vật khác nhờ đặc tính tiếp nhận không chọn lọc của protoplast. Đây là
bước đột phá rất quan trọng trong Công nghệ Sinh học. Từ đó, các nhà khoa học sẽ có
khả năng tạo ra những giống mới không chỉ có đặc tính một loài, khác loài mà còn
khác cả giới sinh vật. Việc tái sinh protoplast thành một cây hoàn chỉnh đã được ứng
dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất.
Các nhà khoa học còn cho thấy hoàn toàn có thể sử dụng protoplast để sản xuất
các sản phẩm thứ cấp giống như phương pháp nuôi cấy tế bào đơn.
2.2.3. Phương pháp phân tách protoplast (Lê Văn Hoàng, 2007)
Có 3 phương pháp phân tách protoplast:
− Cơ học (không dùng các enzyme).
− Sử dụng enzyme tuần tự (qua hai bước).
− Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời).
Phương pháp cơ học tiến hành dựa trên cơ sở phá các mối liên kết của mô bằng
các dao sắt nhọn và giải phóng protoplast riêng rẽ. Phương pháp này cho hiệu suất
thấp. Nói chung, các protoplast thường được phân lập từ các tế bào không bào hóa cao
của các mô dự trữ như chồi hành, vảy hành của các loài thân hành, rễ củ cải, vỏ quả
của dưa chuột và rễ củ cải đường.
Phương pháp dùng enzyme có hiệu quả cao hơn rất nhiều so với phương pháp cơ

học, phương pháp enzyme cho phép tách được hàng gram protoplast. Các enzyme
7


được sử dụng là cellulase hoàn toàn không độc hại đối với tế bào. Do vách tế bào có
thành phần gồm pectin, cellulose, hemicellulose nên phải sử dụng hỗn hợp enzyme:
− Pectinase phân hủy pectin.
− Cellulase phân hủy cellulose.
− Hemicellulase phân hủy hemicellulose.
Ngoài ra, để protoplast không bị vỡ sau khi thành cellulose bị phân hủy thì cần
phải bổ sung những chất tăng áp lực thẩm thấu vào dung dịch enzyme để duy trì cân
bằng thẩm thấu giữa nội bào và môi trường bên ngoài.
2.2.4. Nuôi cấy protoplast (Lê Văn Hoàng, 2007)
2.2.4.1. Thành phần dinh dưỡng
Nói chung, môi trường nuôi cấy protoplast tương tự với môi trường nuôi cấy dịch
huyền phù tế bào và callus. Tuy nhiên, nồng độ của Fe, Zn và amonium dùng trong
môi trường nuôi cấy mô thực vật có thể là quá cao đối với nuôi cấy protoplast. Hầu hết
muối của môi trường B5 và MS có cải biến một ít là thích hợp. Tăng nồng độ Ca2+
trong môi trường nuôi cấy protoplast từ 2 – 4 lần so với bình thường có lợi cho việc
duy trì tính toàn vẹn của màng tế bào. Nồng độ sucrose thích hợp thường từ 3 – 5%.
Môi trường nuôi cấy protoplast sử dụng nitơ hữu cơ dạng CH và nitơ vô cơ NH4NO3
(20 mmol/L).
Các vitamin dùng trong nuôi cấy protoplast cũng giống trong môi trường nuôi
cấy mô tiêu chuẩn. Auxin và cytokinin sử dụng ở các tổ hợp nồng độ khác nhau để
cảm ứng tạo vách tế bào và kích thích phân chia trong các protoplast phân lập.
2.2.4.2. Áp lực thẩm thấu của môi trường
Trong quá trình phân lập và nuôi cấy, các protoplast cần được duy trì cân bằng áp
lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào cho tới khi tái sinh được vách tế bào vững
chắc. Khi chênh lệch áp lực thẩm thấu giữa môi trường và nội bào sẽ dẫn đến tình
trạng protoplast bị vỡ hoặc bị teo. Các chất điều chỉnh áp lực thẩm thấu trong môi

trường nuôi cấy protoplast và trong hỗn hợp enzyme là sorbitol, mannitol, glucose,
hoặc sucrose. Các protoplast sẽ sinh trưởng ổn định hơn trong dịch được tăng nhẹ áp
lực thẩm thấu.
Các chất phân ly ion cải thiện tốt khả năng sống sót của protoplast. Thông
thường các dung dịch enzyme được bổ sung các muối nhất định song song với các
nhân tố ổn định thẩm thấu không phân ly.
8


2.2.4.3. Mật độ dàn trải protoplast
Mật độ protoplast tối ưu là từ 104 – 105/ml. Tuy nhiên, các thí nghiệm lai soma
và phát sinh đột biến cần tạo dòng tế bào riêng rẽ, do đó phải dàn trải protoplast ở mật
độ thấp hơn (100 – 500/ml). Nuôi cấy ở mật độ thấp giúp dễ dàng phân lập và xác định
các khuẩn lạc lai khi có mặt của hệ thống chọn lọc.
2.2.4.4. Tạo vách tế bào
Quá trình hình thành vách tế bào có thể hoàn chỉnh trong vòng hai đến một vài
ngày mặc dù các protoplast trong nuôi cấy thường bắt đầu tái sinh vách tế bào ngay
sau khi phân lập một vài giờ. Vách tế bào được tạo thành bao gồm các vi sợi sắp xếp
lỏng lẽo, quá trình này đòi hỏi cung cấp nguồn carbon trong môi trường dinh dưỡng.
2.2.4.5. Phát triển callus và tạo cây hoàn chỉnh
Ngay sau khi tạo vách tế bào chung quanh protoplast, các tế bào được tái cấu trúc
đã tăng kích thước và sau một tuần xuất hiện sự phân chia tế bào đầu tiên. Sau 2 – 3
tuần, các khuẩn lạc tế bào có kích thước lớn được tạo thành và có thể cấy chuyển
chúng lên môi trường không có sự điều chỉnh áp lực thẩm thấu để phát triển callus.
Các callus này được cảm ứng để phân hóa cơ quan, hoặc tái sinh cây hoàn chỉnh.
2.2.5. Dung hợp protoplast
Một trong những áp dụng thực tế quan trọng nhất của protoplast là sự lai vô tính,
một quá trình thật sự quan trọng một khi không có sự tương thích trong lai hữu tính và
các phương pháp lai khác bị thất bại. Các protoplast có thể dung hợp với nhau một
cách tự nhiên trong suốt quá trình quá trình cô lập hay sự dung hợp này xảy ra trong

một điều kiện đặc biệt nào đó. Trong quá trình cô lập, sự dung hợp sẽ xảy ra giữa hai
hay nhiều tế bào ở gần nhau. Quá trình này xảy ra khi cầu liên bào giữa các protoplast
nằm kề nhau giãn ra và kết quả là nhân và tế bào chất của hai protoplast sẽ hòa chung
với nhau thành một đơn vị. Hiện tượng này xảy ra với tần số cao giữa các protoplast cô
lập từ mô sẽo hay huyền phù tế bào hơn là các protoplast cô lập từ lá.
2.2.5.1. Xử lý bằng NaNO3
Năm 1970, Power và cs đã dùng NaNO3 kích thích dung hợp hai protoplast.
Carlson và ctv (1972) cũng dùng phương pháp này để sản xuất cây lai soma đầu tiên
(Nicotiana glauca x N. langsdorffii). Tuy nhiên, phương pháp này cho hiệu suất thấp.

9


2.2.5.2. Xử lý bằng Polyethylen glycol (PEG)
Tác nhân kích thích dung hợp là polyethylen glycol (PEG). Khoảng 0,6 ml dung
dịch PEG làm thành một giọt protoplast và chuyển lên đĩa petri. Sau khi đậy nắp,
protoplast trong dung dịch PEG được nuôi ở nhiệt độ phòng trong 40 phút, pha loãng
dung dịch PEG bằng cách bổ sung 0,5 – 1 ml môi trường nuôi cấy protoplast sau mỗi
10 phút. Rửa protoplast với dung dịch không có tác nhân dung hợp và nuôi protoplast
trên môi trường nuôi cấy.
Nồng độ và trọng lượng phân tử của PEG quyết định sự thành công của sự dung
hợp. PEG có trọng lượng phân tử thấp không thể tạo ra sự dính chặt chắc chắn, trong
khi PEG trọng lượng phân tử cao cho hiệu quả dung hợp cao hơn. Xử lý PEG cùng với
pH/Ca2+ có hiệu quả tăng tần số dung hợp và khả năng sống của các protoplast.
Sau khi xử lý bằng tác nhân dung hợp, các protoplast được nuôi cấy theo phương
thức chuẩn.
2.2.5.3. Dung hợp bằng cách xung điện
Phương pháp này đơn giản hơn, nhanh hơn và hiệu quả hơn dung hợp bằng hóa
chất. Điều quan trọng hơn cả là dung hợp bằng điện không gây độc đối với tế bào.
Dùng các xung điện để đưa trực tiếp DNA ngoại lai vào trong tế bào thực vật, kỹ thuật

này đã làm tăng sự quan tâm về việc ứng dụng dung hợp bằng điện vào lĩnh vực di
truyền tế bào soma.
2.3. Phương pháp nuôi cấy phát sinh phôi vô tính
2.3.1. Phôi vô tính
Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính, bắt nguồn từ các tế bào dinh
dưỡng, còn gọi là tế bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình
phát triển, sinh lý nhưng không phải là sản phẩm của sự thụ tinh giữa giao tử đực và
giao tử cái, vì vậy không có quá trình tổ hợp di truyền, các phôi vô tính có nội dung di
truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra nó.
2.3.2. Ý nghĩa nuôi cấy phôi vô tính
Phôi vô tính giúp cho công tác vi nhân giống và sản xuất với số lượng lớn thực
vật bằng bioreactor.
Tạo hạt nhân tạo.
Là nguyên liệu cho việc chuyển gen ở thực vật.
Mở ra nhiều triển vọng mới trong công nghệ nuôi cấy tế bào.
10


2.3.3. Sự hình thành phôi vô tính
Sự hình thành phôi vô tính có thể qua hai con đường: trực tiếp và gián tiếp
Phôi soma trực tiếp được hình thành từ một tế bào hay một nhóm tế bào mà
không thông qua sự hình thành callus.
Phôi soma gián tiếp được hình thành chủ yếu từ callus.
Có hai bước dẫn đến sự hình thành phôi:
− Sự biệt hóa của tế bào có khả năng phát sinh phôi.
− Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành.
Ở mỗi giai đoạn của sự hình thành phôi. Từ việc tạo mô sẹo, nhân sinh khối mô
sẹo. phát sinh phôi rồi đến tái sinh phôi đều cần phải có môi trường thích hợp cho mỗi
giai đoạn và quan trọng nhất trong sự phát sinh phôi là cần phải có auxin và nitrogen.
Sự phát triển của phôi đều thông qua các giai đoạn của sự hình thành phôi như

tạo phôi dạng hình cầu, trái tim, thủy lôi và hình lá).
Các tế bào sinh phôi thường to, đẳng kích, có hoạt động biến dưỡng mạnh mẽ,
cường độ tổng hợp ribonucleic rất cao, tế bào chất đậm đặc, không bào nhỏ, dễ nhận
thấy, hạch nhân to và sậm màu, đặc biệt là các tế bào này có một lượng lớn các
ribosom, ty thể, lưới nội chất nhỏ và có vách rất dày (Dương Tấn Nhựt, 2007).
Khác với tế bào Eukaryote, hầu hết tế bào thực vật đều có khả năng phát sinh
thành phôi ở những điều kiện nhất định.
Phôi vô tính rất giống phôi hữu tính ở hình thái và sinh lý, nhưng không có quá
trình tái tổ hợp di truyền do phôi vô tính không phải là kết quả của sự kết hợp giao tử
đực và giao tử cái. Do đó, tất cả những cây con tái sinh bằng con đường này thì có vật
chất di truyền giống hệt với nhau và giống với các tế bào sinh dưỡng đã sinh ra chúng.
Dựa vào đặc tính này có thể tạo ra những cá thể mới bằng các trình tự gen lạ được
chèn thông qua các kỹ thuật Công nghệ Sinh học.
2.3.4. Cơ chế phát sinh phôi vô tính
Năm 1979, Fujimusa và Komamine nhận thấy: trong giai đoạn đầu của quá trình
phát sinh phôi trong hệ thống nuôi cấy thì quá trình phát sinh phôi trỉa qua bốn pha: 0,
1, 2, và 3.
Ở pha 0, những tế bào đơn (giai đoạn 0) hình thành những cụm tế bào có khả
năng phát sinh phôi (giai đoạn 1) trên môi trường có auxin. Trong suốt giai đoạn này,

11


những cụm tế bào hình thành từ những tế bào đơn có khả năng tạo phôi khi môi trường
nuôi cấy không có auxin, để hình thành những cụm tế bào giai đoạn 1.
Sau đó, pha 1 xuất hiện khi cấy chuyển những cụm tế bào giai đoạn 1 qua môi
trường không có auxin. Trong suốt pha 1, những cụm tế bào tăng sinh chậm và dường
như không biệt hóa.
Sau pha 1, sự phân bào xuất hiện nhanh trên một phần của những cụm tế bào,
dẫn đến việc hình thành những tế bào phôi hình cầu. Pha này được gọi là pha 2.

Được gọi là pha 3 khi những phôi hình cầu phát triển qua phôi hình tim và phôi
hình thủy lôi.
2.3.5. Các kiểu phát sinh phôi vô tính
2.3.5.1. Sự phát sinh phôi bất định
Các phôi vô tính có thể phát triển từ các tế bào hay các mô sẹo có liên quan của
một số loài thực vật nhiệt đới. Các phôi bất định có thể được tạo trực tiếp từ tế bào đơn
trên bề mặt của phôi non hay gián tiếp từ bề mặt của phôi non này. Phương pháp này
được sử dụng trong chương trình di truyền cải tạo giống như cứu các phôi bị chết non
do lai tạo.
2.3.5.2. Sự phát sinh đa phôi vô tính
Hiện tượng này xảy ra khi nuôi cấy các noãn non của thực vật hạt trần. Các khối
mô có khả năng tạo phôi cao, khi được cấy chuyển sang môi trường mới sẽ phát triển
và tăng trưởng thành phôi. Mô có khả năng phát triển thành phôi có thể phân biệt với
mô không có khả năng phát triển thành phôi do màu trắng của phôi và hóa đỏ khi
nhuộm bằng acetocarmine. Dưới ánh đèn tử ngoại tế bào phôi có thể phát huỳnh quang
màu xanh lá cây.
2.3.5.3. Sự phát sinh phôi soma do cảm ứng
Hiện tượng này do sự nuôi cấy lỏng các tế bào và mô sẹo sau khi các mô này
chịu các xử lý đặc biệt đem lại sự cảm ứng khả năng tạo phôi. Người ta đã thực hiện
nhiều nghiên cứu trên nhiều loài thực vật ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau để quan
sát khả năng tạo thành mô sẹo.
2.4. Những nghiên cứu về cây tiêu
Năm 2003, nghiên cứu nhân giống in vitro một số giống hồ tiêu sạch virus do
Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du và Đỗ Đăng Giáp thực hiện. Mẫu chồi sau khi lấy
được rửa sạch và sát trùng bằng cồn 70o rồi dung nước tẩy javel pha loãng 1/3 khử
12


trùng mẫu trong khoảng 30 – 40 phút. Có thể dùng HgCl2 (0,1%) hoặc ngâm trong
dung dịch kháng sinh Cefotaxine (1%) từ 1 – 2 giờ. Sau khi ngâm trong dung dịch

kháng sinh Cefotaxine 1% (1, 2, 24 giờ). Kết quả cho 20 – 70% mẫu bị nhiễm sau 7 –
14 ngày nuôi cấy. Khi bổ sung kháng sinh Cefotaxin (1%) vào môi trường nuôi cấy.
Kết quả cho khoảng 20 – 30% mẫu được vô trùng hoàn toàn sau 3 – 4 tuần nuôi cấy.
Đồng thời khi cấy chuyền sang môi trường mới không có kháng sinh, chồi mới không
bị tái nhiễm trở lại. Ngoài ra, thử nghiệm khử trùng bằng cách kết hợp dung dịch acid
benzoic bão hòa, dung dịch tẩy javel và kháng sinh. Kết quả thu được khoảng 40 –
50% mẫu khử trùng không tái nhiễm. Khả năng tạo chồi mới của đốt gốc là tốt nhất so
với đốt giữa và đốt ngọn. Khả năng tạo mô sẹo ở mỗi loại đốt cũng tương tự như ở tạo
chồi. Khi nồng độ BA hơn 5,0mg/L sẽ ức chế khả năng hình thành chồi. Nồng độ
NAA hoặc IBA càng cao thì khối mô sẹo tạo ra càng nhiều. Các mô sẹo trắng, xốp khi
cấy chuyền sang môi trường tạo chồi sẽ ít có khả năng tái tạo chồi. Môi trường MS có
bổ sung BA (5,0 mg/L), Ki (0,5 mg/L) và IBA (0,5 mg/L) là thích hợp cho khả năng
biệt hóa chồi từ mô sẹo. Ở nồng độ BA (3,0 mg/L), Ki (0,5 mg/L) và IBA (0,5 mg/L)
chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trường MS
thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi trường còn lại. Môitrường tạo rễ là
½ MS + NAA (0,1 – 1,0 mg/L) hoặc IBA (0,1 – 1,0 mg/L). Môi trường ½ MS có bổ
sung than hoạt tính (1,0 mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu, không cần sử
dụng Auxin cho mục đích ra rễ.
Năm 2006, Nguyễn Thị Kim Linh và ctv đã nghiên cứu nhân giống tiêu (Piper
nigrum L.) sạch virus bằng phương pháp nuôi cấy mô. Môi trường có sự kết hợp giữa
BA và 2,4-D đều có khả năng kích thích hình thành mô sẹo từ mẫu lá. Và tỷ lệ phát
sinh chồi cao trên môi trường MS có bổ sung BA 3,0 mgL và TDZ 0,3 mg/L.
Phương pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy như: đầu
rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trưởng thành (Mathews và Rao,
1984; Agarwal, 1988; Philip và ctv. 1992; Nazeem và ctv. 1993; Nirmal Babu và ctv.
1993; Joseph và ctv. 1996; Lissamma và ctv. 1996). Trong phương pháp vi nhân giống
cây tiêu bị gây trở ngại do sự nhiễm của vi sinh vật (Kelkar và Krishnamurthy, 1996).
Trong đó việc nuôi cấy hạt tiêu là ít bị nhiễm nhất. Tốc độ nhân chồi của tiêu khoảng 6
chồi / 90 ngày nuôi cấy. Các cây con in vitro phải được để trong phòng ẩm mát khoảng
20 – 30 ngày để cây con có điều kiện phát triển cứng cáp và thích nghi dần với điều

13


kiện sống bên ngoài. Cây tiêu in vitro phát triển khá tốt trên đồng ruộng. Qua báo cáo
sớm về phương pháp nuôi cấy in vitro cây tiêu (Chua 1981, Fitchet 1988), phenolic
được tiết ra từ vết cắt của mẫu cấy và vi sinh vật gây nhiễm nội sinh trong mẫu cấy
(Mohan 1985, Fitchet 1988) là hai yếu tố ngăn cản qui trình nhân giống in vitro cây
tiêu (Trích từ Nguyễn Hữu Định, 2005).
Các Protocorm của P. longum có tốc độ nhân dòng nhanh bắt đầu từ các đầu rễ
(Sarasan và ctv. 1993, Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995). Phương pháp vi
nhân giống cây tiêu P. chaba đã được Nirmal Babu và ctv (1993), Rema và ctv (1995)
tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và mô phân sinh ngọn đã giúp cây
con phát triển, ở cây tiêu P. longum và P.colurinum đã được báo cáo về vấn đề này
(Nirmal Babu và ctv. 1993). Các cây con in vitro của giống tiêu này đã được đánh giá,
thử nghiệm ở phòng thí nghiệm nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn Độ. Cây tiêu đã
được tái sinh từ lá và thân là: P. longum, P. betle, P. chaba, P. attenuatum và P.
colubrinum chúng tái tạo các cơ quan một cách trực tiếp hoặc gián tiếp (Bhat và ctv.
1992, Bhat, ctv. 1995, Rema và ctv. 1995, Madhusudhanan và ctv. 1996) (Trích từ
Nguyễn Hữu Định, 2005).
Năm 2000, Ajith anand và Chaluvadi Srinivasa Rao đã nghiên cứu quy trình
nhân giống nhanh Piper barberi in vitro thông qua nuôi cấy chồi đỉnh và đốt thân. Sự
phát sinh chồi tốt nhất của đốt thân trên môi trường bổ sung BA 4,43 µM và Ki 2,32
µM với 88%. Chồi phát sinh từ đốt thân thì gấp hai lần chồi phát sinh từ chồi đỉnh.
Môi trường MS bổ sung 2,22 µM BA và 0,46 µM Ki cho số lượng chồi bất định từ
đoạn cuối của lóng thân là 6,9 ± 0,58. Sau 9 tuần cấy chuyền tỷ lệ nhân chồi từ mẫu
cấy ban đầu là 82 chồi. Chồi in vitro được tạo rễ trên môi trường MS ½ và MS ¼ .
Chồi được cấy trên môi trường MS ¼ trong tối sinh ra 8 rễ với chiều dài 3,36 cm và tỷ
lệ sống đạt 98%. Cây in vitro được chuyển ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống đạt 75%.
Năm 2001, A. Yusuf và ctv đã nghiên cứu sự phát sinh phôi soma và tái sinh cây
từ lá của Piper colubrinum L.. Phôi soma được phát sinh trực tiếp từ lá in vitro trên

môi trường MS bổ sung µM BA và 0,46 µM Ki. Cây con được phát sinh từ phôi soma
trên môi trường MS có bổ sung 4,4 µM BA và 0,23 µM Ki. Và cây con được phát
triển trên môi trường MS bổ sung 2,4 µM IBA.
R. Ramakrishnan Nair và S. Dutta Gupta (2006) đã nghiên cứu tái sinh cây với
tần số cao thông qua quy trình tạo phôi vô tính thứ cấp trên Piper nigrum L.. Phôi vô
14


tính thứ cấp được hình thành từ phần chóp rễ của phôi soma đầu tiên. Môi trường SH
bổ sung 1,5% sucrose phát sinh phôi soma thứ cấp có tỷ lệ và số lượng cao nhất. Cây
con phát sinh từ phôi thứ cấp trên môi trường SH có bổ sung 3,0 và 4,5% sucrose.
Năm 2007, Resmi Paul và ctv đã nghiên cứu so sánh sự phân tách protoplast của
Piper nigrum L. và Piper colubrinum L.. Số lượng protoplast phân tách được cao nhất
ở Piper nigrum L. là 6,5 x 104 ủ trong 21 giờ với dung dịch enzyme chứa 1,0%
cellulase và 0,28% pectinase. Còn ở Piper colubrinum L., số lượng protoplast phân
tách cao nhất là 13 x 104 với dung dịch enzyme chứa 1,0% cellulase và 0,186%
pectinase được ủ trong 21 giờ. Mannitol 0,6M thì được sử dụng cho phân tách
protoplast ở cả Piper nigrum L. và Piper colubrinum L.
Năm 2008, Z. Zhang và ctv đã nghiên cứu nhân giống thành công cây Piper
methysticum. Chồi 15 ngày tuổi được phát sinh trên môi trường MS có bổ sung 0,5
mg/L BA và 0,5 mg/L IAA với kháng sinh. Sự phát sinh rễ in vitro được nuôi cấy
tr6en môi trường MS bổ sung 0,75 – 1,00 mg/L IAA (hoặc IBA) và 3% sucrose. Hầu
hết, rễ dài và khỏe được nuôi trên môi trường có bổ sung IBA. Hơn nữa, mô sẹo có
khả năng phát sinh phôi được cảm ứng trên môi trường MS có bổ sung 1,00 mg/L BA
và 0,1 mg/L IAA.

15