ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINISEQUENCING) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH BETATHALASSAEMIA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINI-SEQUENCING) TRONG
CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSAEMIA

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 7/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SNP (MINI-SEQUENCING) TRONG
CHẨN ĐOÁN BỆNH BETA-THALASSAEMIA

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

ThS. BS. NGUYỄN KHẮC HÂN HOAN

NGUYỄN THỊ KIM NGÂN

ThS. BS. QUÁCH THỊ HOÀNG OANH

Tháng 7/2010


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy - Cô đã truyền đạt những kiến
thức quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
ThS.BS. Nguyễn Khắc Hân Hoan, ThS.BS. Quách Thị Hoàng Oanh đã tận tình
hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận.
Xin cảm ơn thầy cô và các anh chị tại Phòng Di Truyền Bệnh viện Từ Dũ đã tận
tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Các bạn bè thân yêu lớp Công Nghệ Sinh Học khóa 32 đã giúp đỡ và chia sẻ
cùng tôi những vui buồn trong suốt những năm học cũng như thời gian thực tập tốt
nghiệp.
Con xin chân thành cảm ơn Cha Mẹ đã luôn theo dõi, động viên cho con.
Chân thành cảm ơn

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010
Sinh viên

Nguyễn Thị Kim Ngân

i


TÓM TẮT
Thalassaemia nặng cần truyền máu để duy trì sự sống tuy nhiên truyền máu kéo
dài sẽ có biến chứng ứ sắt ở mô dẫn đến tổn thương các cơ quan gây tử vong cao.
Nước ta có tần suất bệnh β thalassaemia cao, chi phí điều trị lại quá lớn trong khi nước
ta lại có nguồn lực thấp không thể kham nổi chi phí này. Do đó, chẩn đoán trước sinh
là biện pháp phòng ngừa hiệu quả làm giảm gánh nặng bệnh tật lên xã hội. Vì thế việc
thành lập một chương trình phát hiện thalassaemia với những kỹ thuật di truyền thích
hợp tại Việt Nam là hết sức cần thiết. Vì những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật SNP (Mini-Sequencing) trong chẩn đoán bệnh β-Thalassaemia.
Kỹ thuật SNP được chúng tôi nghiên cứu để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh
bằng cách kiểm tra DNA của bố mẹ và thai nhi từ máu bố mẹ (10 mẫu) và nước ối thai
nhi (6 mẫu). Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật SNP xác định 8 loại đột biến gây bệnh β
thalassaemia phổ biến tại Việt Nam: –28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G
Æ T, codon 41/41 –TCTT, codon 71/72 +A, codon 95 +A, IVS2-654 C Æ T, codon
26 GAG Æ AAG. Trong quá trình nghiên cứu chúng tôi đã tiến hành thiết lập những
thông số cho các phản ứng PCR để xác định đột biến mất đoạn -619bp, phản ứng
SNPlex gồm 2 phản ứng multiplex và 1 phản ứng signleplex và đã xác định được 7
loại đột biến : –28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G Æ T, codon 71/72 +A,
codon 95 +A, IVS2-654 C Æ T, codon 26 GAG Æ AAG.

ii


SUMMARY
The thesis: "Technical Applications SNP (mini-sequencing) in the diagnosis of βThalassaemia”. 

Children with Thalaaemia major need blood transfusing regularly for all their
life – time. Gradually, there is iron overload in tissue leading to damage organs in the
body and causing death. Vietnam has a high frequency of disease β thalassemia,
treatment costs are too great, while our country has low resources that can not afford
these cost. Therefore, diagnosis before birth is effective measure to reduce the disease
burden on society. Thus the establishment of a detection program to thalassemia with
appropriate genetic engineering in Vietnam is very necessary.
We research technical SNP to diagnose before birth by testing the DNA of
parents and their prenatal child from parental blood (10 samples) and fetal amniotic
fluid (6 samples). The study use a technical SNP to identify eight types of mutations
causing β Thalassaemia commonly occurring in Vietnam: –28 A Æ G,
codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G Æ T, codon 41/41 –TCTT, codon 71/72 +A,
codon 95 +A, IVS2-654 C Æ T, codon 26 GAG Æ AAG. In the course of study,
we have conducted to establish parameters for PCR to identify mutants delete the 619bp, including two SNPlex reaction and a multiplex reaction and the reaction
signleplex

has

identified

seven

types

mutation:

–28 A Æ G, codon 17 AAG Æ TAG, IVS1-1 G Æ T, codon 71/72 +A, codon 95 +A,
IVS2-654 C Æ T, codon 26 GAG Æ AAG.

iii

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... i
TÓM TẮT ...............................................................................................................ii
SUMMARY ........................................................................................................... iii
MỤC LỤC ..............................................................................................................iv
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT .....................................................................vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................. viii
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................. 1 
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1 
1.2. Mục tiêu của đề tài .............................................................................................. 2 
1.3. Nội dung thực hiện .............................................................................................. 2 
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3 
2.1. Tổng quan về bệnh thalassaemia ......................................................................... 3 
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh thalassaemia ............................................................. 3 
2.1.2. Cấu trúc phân tử haemoglobin và gen tổng hợp globin ................................... 4 
2.1.3. Phân loại bệnh thalassaemia ............................................................................. 5 
2.1.4. Sự phân bố của bệnh thalassaemia ................................................................... 6 
2.1.5. Chi phí điều trị bệnh thalassaemia.................................................................... 8 
2.2. Bệnh học và di truyền bệnh β thalassaemia ........................................................ 8 
2.2.1. Cơ sở phân tử của bệnh .................................................................................... 8 
2.2.2. Đặc điểm lâm sàng ........................................................................................... 9 
2.2.3. Cơ chế bệnh học của β thalassaemia .............................................................. 11 
2.2.4. Cơ chế di truyền bệnh β thalassaemia ............................................................ 11 
2.2.5. Điều trị bệnh β thalassaemia .......................................................................... 11 
2.2.6. Sự lưu hành của gen β thalassaemia trên thế giới .......................................... 12 
2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β thalassaemia ............................................ 14 
2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng........................................................................................ 14 

2.3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng ................................................................................. 14 
iv


2.4. Các nghiên cứu ứng dụng trong chẩn đoán bệnh β thalassaemia ...................... 19 
2.4.1. Trên thế giới ................................................................................................... 19 
2.4.2. Tại Việt Nam .................................................................................................. 19 
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 21 
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..................................................................... 21 
3.2. Vật liệu .............................................................................................................. 21 
3.2.1. Mẫu bệnh phẩm .............................................................................................. 21 
3.2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 21 
3.2.3. Mồi.................................................................................................................. 22 
3.2.4. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 23 
3.2.5. Phương pháp tách chiết DNA ......................................................................... 24 
3.3. Phương pháp xét nghiệm ................................................................................... 25 
3.3.1. Phương pháp PCR xác định đột biến mất đoạn -619 bp ................................ 26 
3.3.2. Làm sạch sản phẩm thừa sau PCR ................................................................. 27 
3.3.3. Phản ứng SNPlex ............................................................................................ 27 
3.3.4. Tinh sạch sau phản ứng SNPlex ..................................................................... 29 
3.3.5. Điện di mao quản bằng máy CEQ 8000 ......................................................... 29 
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................... 32 
4.1. Kết quả ............................................................................................................... 32 
4.1.1. Kết quả sàng lọc đột biến mất đoạn -619bp ................................................... 32 
4.1.2. Kết quả sàng lọc 7 đột biến ............................................................................ 34 
4.2. Thảo luận ........................................................................................................... 37 
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 39 
5.1. Kết luận.............................................................................................................. 39 
5.2. Đề nghị .............................................................................................................. 39 
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 40 

PHỤ LỤC
 
 
v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ARMS:

amplification refractory mutation system

bp:

base pair

DNA:

deoxyribonucleic acid

dATP:

2’- deoxyadenosine - 5’ - triphosphate

dCTP:

2’- deoxycytidine - 5’ - triphosphate

dGTP:

2’- deoxyguanosin - 5’ - triphosphate

dTTP:

2’- deoxythymidine - 5’ – triphosphate

dNTP:

2’- deoxynucleotide – 5’ - triphosphate

EDTA:

ethylene diamine tetraacetid acid

Hb:

haemoglobin

kb:

kilobase

MCH:

mean corpuscular haemoglobin (thể tích trung bình hồng cầu)

MCV:

mean corpuscular volume
(lượng haemoglobin trung bình trong một hồng cầu)

MK:

marker (thang chuẩn)

MT

mutation (đột biến)

NST:

nhiễm sắc thể

PCR:

polymerase chain reaction

RNA:

ribonucleic acid

SNP:

single-nucleotide polymorphism

Taq:

Thermus aquaticus

TE:

Tris / EDTA

WT:

wile type

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Số liệu bệnh máu nhập viện tại khoa Huyết học lâm sàng, BVNĐ1 ....... 7
Bảng 2.2 Các đột biến β thalassaemia phổ biến ở một số nơi trên thế giới ........... 12
Bảng 3.1 Mồi dùng cho phản ứng PCR phát hiện đột biến mất đoạn -619 bp ...... 22
Bảng 3.2 Mồi dùng cho phản ứng SNPlex............................................................. 23
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng PCR xác định đột biến mất đoạn -619 bp ........... 26
Bảng 3.4 Chu trình luân nhiệt ................................................................................ 26
Bảng 3.5 Kích thước các sản phẩm DNA sau PCR ............................................... 27
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng bất hoạt sản phẩm PCR....................................... 27
Bảng 3.7 Thành phần của phản ứng SNPlex 1 ...................................................... 28
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng SNPlex 2 ............................................................. 28
Bảng 3.9 Thành phần phản ứng SNPlex 3 ............................................................. 28
Bảng 3.10 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng SNPlex .......................................... 29
Bảng 3.11 Thành phần phản ứng tinh sạch sau SNPlex ........................................ 29
Bảng 3.12 Thành phần điện di mao quản 1............................................................ 29
Bảng 3.13 Thành phần điện di mao quản 2............................................................ 30
Bảng 3.14 Kích thước sản phản phản ứng SNPlex điện di mao quản .................. 30
Bảng 4.1 Kết quả sàng lọc đột biến mất đoạn -619 bp .......................................... 33
Bảng 4.2 Kết quả sàng lọc 7 đột biến của 16 mẫu bệnh phẩm .............................. 36

vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc phân tử haemoglobin .................................................................. 4
Hình 2.2 Sự tổng hợp chuỗi globin trong các giai đoạn phát triển ở người ............ 4
Hình 2.3 Cụm gen α ................................................................................................. 5
Hình 2.4 Cụm gen β ................................................................................................. 5
Hình 2.5 Phân bố bệnh thalassaemia trên thế giới .................................................. 6
Hình 2.6 Bệnh nhân thalassaemia nặng phải cắt lách ............................................ 10
Hình 2.7 Cơ chế di truyền bệnh thalassaemia ....................................................... 11
Hình 2.8 Nguyên lý hoạt động của kỹ thuật ARMS-PCR ..................................... 16
Hình 2.9 Phương pháp minisequencing ................................................................. 18
Hình 2.10 Sơ đồ phân tích gen β globin bằng kỹ thuật multiplex minisequecing. 19
Hình 3.1 Bộ kit của Qiagen ................................................................................... 21
Hình 3.2 Máy ly tâm .............................................................................................. 24
Hình 3.3 Máy ủ nhiệt ............................................................................................. 24
Hình 3.4 Máy định lượng DNA ............................................................................. 24
Hình 3.5 Máy luân nhiệt ........................................................................................ 24
Hình 3.7 Máy chụp gel .......................................................................................... 24
Hình 3.6 Máy CEQ 8000 ....................................................................................... 24
Hình 3.8 Máy trộn mẫu .......................................................................................... 24
Hình 3.9 Bể điện di ................................................................................................ 24
Hình 3.10 Các bước thực hiện trong trong quá trình nghiên cứu .......................... 25
Hình 3.11 Nguyên tắc hoạt động của kit SNP ....................................................... 27
Hình 4.1 A, B Kết quả điện di sàng lọc đột biến mất đoạn -619 bp ...................... 32
Hình 4.2 Kết quả điện di mao quản SNPlex 1 của mẫu 1 ..................................... 34
Hình 4.3 Kết quả điện di mao quản SNPlex 2 của mẫu 1 ..................................... 35
Hình 4.4 Kết quả điện di mao quản SNPlex 3 của mẫu 1 ..................................... 35

viii

Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thalassaemia là tên chung cho một nhóm bệnh thiếu máu, di truyền lặn trên
nhiễm sắc thể thường. Bệnh thalassaemia gây ra giảm tạo haemoglobin và tăng phá
hủy hồng cầu. Kết quả là hồng cầu giảm về số lượng (thiếu máu) và chất lượng (hồng
cầu nhỏ, nhược sắc).
Mỗi năm, trên thế giới có khoảng 100000 em bé sinh ra mắc phải loại bệnh
trầm trọng của nhóm bệnh trên - phần lớn là người Ý, Hy Lạp, Trung Đông, Đông
Nam Á và Châu Phi. Và hiện bệnh đang hiện diện khắp nơi do tình trạng di dân.
Thalassaemialà bệnh di truyền rất phổ biến ở Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn
Độ, Châu Phi và Địa Trung Hải. Cứ 10 người thì có 1 người mang gen bệnh. Hiện thế
giới có khoảng 269 triệu người mang một gen đột biến. Riêng Việt Nam thống kê di
truyền quần thể cho thấy có 5,1 triệu người mang gen đột biến gây bệnh thalassaemia,
với 1700 trẻ sơ sinh bị bệnh sinh ra mỗi năm (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2009).
Bệnh thalassaemia là một gánh nặng cho xã hội nói chung và gia đình bệnh
nhân nói riêng, vì bệnh nhân phải truyền máu liên tục. Hiện nay nhu cầu về nguồn máu
phục vụ điều trị ngày càng cao. Ngoài ra, những tai biến về truyền máu cũng như hiện
tượng lây nhiễm do truyền máu là điều đáng quan tâm. Bệnh còn làm giảm khả năng
hoạt động xã hội của bệnh nhân.
Tại Việt Nam Bệnh viện Từ Dũ là bệnh viện duy nhất cả nước thực hiện được
kỹ thuật ARMS – PCR chẩn đoán trước sinh (chi phí một 1 triệu đồng/lần, sau 1-2
tuần có kết quả) để xác định thai nhi có mắc bệnh hay không (Nguyễn Khắc Hân
Hoan, 2009). Tuy nhiên, phương pháp này chỉ phát hiện được những đột biến đã biết
trước, những mẫu không phát hiện được đột biến thì phải đem đi giải trình tự, và cho
đến nay Việt Nam vẫn chưa có phương pháp nào khác để kiểm tra lại kỹ thuật
ARMS – PCR. Vì thế, cần thiết thực hiện kỹ thuật SNP (minisequencing), để kiểm tra
lại kỹ thuật ARMS-PCR góp phần phát hiện bệnh sớm và tư vấn cho gia đình bệnh
nhân. Kỹ thuật SNP là kỹ thuật phát hiện đột biến điểm mà bệnh β thalassaemia là do

đột biến điểm gây ra, nên kỹ thuật này là rất phù hợp.

1


1.2. Mục tiêu của đề tài
Kỹ thuật SNP được nghiên cứu để ứng dụng vào chẩn đoán trước sinh bằng
cách xác định đột biến DNA từ máu của bố mẹ và nước ối thai nhi.
1.3. Nội dung thực hiện
1.3.1. Xác định các thông số cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen β globin và
đồng thời phát hiện đột biến mất đoạn -619bp
1.3.2. Tinh sạch sản phẩm PCR bằng enzyme ExoSap-It
1.3.3. Xác định các thông số cho phản ứng multiplex hay singleplex SNP
1.3.4. Làm sạch sau phản ứng multiplex hay singleplex SNP
1.3.5. Điện di mao quản: Mini-sequencing

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về bệnh thalassaemia
2.1.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh thalassaemia
Thalassemia là bệnh thiếu máu di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến trên
thế giới. Bệnh đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ đầu thế kỷ 20. Vào
năm 1904, Jame. B. Herrick lần đầu tiên phát hiện bệnh thiếu máu hồng cầu hình liềm.
Năm 1925- 1927, Cooley và cộng sự đã mô tả những hình ảnh bất thường về hóa học
và X-quang, đó là những biểu hiện về thiếu máu gan, lách to, da vàng, xương mặt và
xương hộp sọ to và biến dạng ở trẻ em Italia.
Năm 1936, Whipple và Bradford mô tả những trường hợp bệnh nhân thiếu máu
giống những bệnh nhân của Cooley đã từng miêu tả và lần đầu tiên dùng thuật ngữ

Thalassemia vì tất cả bệnh nhân được báo cáo là người thuộc vùng Địa Trung Hải,
thuật ngữ Hy Lạp của từ này có nghĩa là “biển” (thalassa) và “thiếu máu” (anaemia).
Cuối thập niên 1940 là thời kỳ tiến bộ nhanh chóng về mọi mặt của lĩnh vực
haemoglobin (Hb) người. Năm 1948, Haldane là nguời đầu tiên cho rằng thalassaemia
xuất hiện với tần số cao trong dân cư vùng Địa Trung Hải ở thể dị hợp tử có khả năng
bảo vệ cơ thể khỏi tình trạng sốt rét nặng. Lĩnh vực này tiếp tục phát triển đến cuối
thập niên 50.
Năm 1959, Ingram và Stretton đã đưa ra mô hình lý thuyết quan trọng về cơ sở
di truyền của thalassaemia. Họ cho rằng có 2 loại thalassaemia chính là α và β, và vì
vậy họ cũng cho rằng 2 dạng biến thể của cấu trúc Hb là do sự bất thường của chuỗi α
globin hay β globin.
Thập niên 60 và 70 là giai đoạn có nhiều thành công lớn trong việc khám phá
cấu trúc của cụm gen α globin trên nhiễm sắc thể (NST) 16.
Cuối thập niên 70 và đầu thập niên 80, bản đồ gen của cụm gen α globin đã
được thiết lập. Cho đến nay đã có những hiểu biết đầy đủ hơn về cấu trúc bất thường
của các Hb gây nên bệnh thalassaemia.
Đến nay, các nhà khoa học đã phát hiện được một số lượng lớn các đột biến mất
đoạn và không mất đoạn gây bệnh α thalassemia và hơn 200 loại đột biến khác nhau
gây bệnh β thalassemia. Nhờ những hiểu biết về sinh lý bệnh và bệnh học phân tử mà
3


người mang gen bệnh thalassaemia được phát hiện sớm một cách dễ dàng và chương
trình chẩn đoán trước sinh đã được áp dụng ở rất nhiều nước trên thế giới (các nước
vùng Địa Trung Hải, Ấn Độ, Thái Lan…), làm giảm tần suất trẻ mới sinh mắc bệnh
thalassemia thể nặng (Trần Nguyễn An Phú, 2007).
2.1.2. Cấu trúc phân tử haemoglobin và gen tổng hợp globin

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử haemoglobin
(Nguồn: />Hb gồm 2 thành phần: phần protein là globin gồm 4 chuỗi polypeptide giống

nhau từng đôi một và các chuỗi này gắn với thành phần thứ hai là hem gồm 4 nhân qua
các vị trí gắn kết oxy (Trần Nguyễn An Phú, 2007).

Hình 2.2 Sự tổng hợp chuỗi globin trong các giai đoạn phát triển ở người
(Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
Ở người trưởng thành sự tổng hợp globin được điều hòa bởi 2 cụm gen α globin
và β globin nằm những vị trí riêng biệt trên NST 16 và NST 11.
4


Cụm gen α globin nằm trên nhánh ngắn, vùng 13 và tiểu vùng 3 của NST 16
(16p13,3), trên một đoạn DNA dài 30.000 cặp base. Trên mỗi NST 16 có 2 gen α.
Vùng mã hóa của gen được sắp xếp trong 3 exon và mã hóa cho 141 amino acid trong
đó exon 1 mã hóa cho 31 amino acid, exon 2 mã hóa cho 68 amino acid, exon 3 mã
hóa cho 42 amino acid.
HS40

ψζ1 ψα ψα1

ζ2

5’

-40kb

0

10kb

α2 α1

θ

20kb

3’HVR
3’

30kb

40kb

Hình 2.3 Cụm gen α (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
Cụm gen β nằm trên nhánh ngắn, vùng 15 và tiểu vùng 5 của NST 11
(11p15,5), trên đoạn DNA dài 73308 bp. Gen β mã hóa cho 141 amino acid. Exon 1
mã hóa cho amino acid từ 1-30, exon 2 mã hóa cho amino acid từ 31-104 và exon 3
mã hóa cho các amino acid từ 105-146. Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc
và chức năng của chuỗi β globin. Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là các
amino acid ưa nước. Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các amino acid kỵ nước.
Khi đột biến gen xảy ra, trình tự về mặt chức năng bị thay đổi. Các amino acid ưa
nước ở bề mặt có thể bị thay thế bởi các amino acid kị nước và tạo ra các thay đổi về
lý hóa dẫn đến sự giảm đàn hồi, gây ra sự không ổn định của phân tử.
LCR
5 4

3 2

ε

1

5’

-20kb

-10kb

0

Gγ
10kb

Aγ
20kb

ψβ
30kb

δ

3’HS

β
40kb

3’
50kb

60kb

 

Hình 2.4 Cụm gen β (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
2.1.3. Phân loại bệnh thalassaemia
Bệnh thalassaemia được phân loại dựa vào sự không tổng hợp hoặc giảm tổng
hợp chuỗi globin. Bệnh được chia làm hai loại chính là α thalassaemia và β
thalassaemia. Trong bệnh α thalassaemia giảm tổng hợp chuỗi α globin, β thalassaemia
giảm tổng hợp chuỗi β globin. Ngoài ra còn có nhiều loại hiếm gặp khác như: γ
thalassaemia, δ thalassaemia, εγδβ thalassaemia.
5


2.1.4. Sự phân bố của bệnh thalassaemia
2.1.4.1. Bệnh thalassaemia trên thế giới
Thalassaemia hiện diện với tần số khá cao ở vùng sốt rét do những người mang
gen thalassaemia có khả năng tự bảo vệ khỏi sốt rét một cách mạnh mẽ. Bệnh kéo dài
từ vùng Địa Trung Hải, qua Trung Đông, bán đảo Ấn Độ, Đông Nam Á và các quần
đảo ở Thái Bình Dương. Hiện nay, bệnh thalassaemia là vấn đề toàn cầu do tình trạng
di dân.Theo hiệp hội thalassemia có 1,5% dân số toàn thế giới mắc bệnh β thalassemia,
với khoảng 100.000 trẻ sinh ra hàng năm mắc bệnh này tuy nhiên chỉ có 60.000 trẻ
thalassemia nặng sống sót và được điều trị (Mã Phương Hạnh, 2009).

Hình 2.5 Phân bố bệnh thalassaemia trên thế giới
(Nguồn: www.bestofsicily.com/mag/art133.html).
Bệnh α thalassaemia tập trung tại Châu Phi, Trung Đông, bán đảo Ấn Độ và
Đông Nam Á, Địa Trung Hải. Tần suất cao ở một số đảo trên Thái Bình Dương, có thể
lên tới 80%. Về β thalassaemia, bệnh phổ biến ở Bắc Phi, Địa Trung Hải, một số nơi ở
Trung Đông, bán đảo Ấn Độ và Đông Nam Á. Tần suất ở các vùng này khoảng 1 –
20%. Hb E có tần suất cao ở bán đảo Ấn Độ và là dấu hiệu đặc trưng của Đông Nam
Á.Tần suất mang gen HbE ở Thái Lan, Lào và Campuchia có thể hơn 60%. Bệnh cũng

có tần số cao ở một số vùng thuộc Liên Xô cũ và Trung Quốc. Ở châu Phi
bệnh tương đối ít gặp.
Ở những vùng có tần số lưu hành bệnh cao, thường có một số đột biến mang
tính phổ biến chiếm đa số bên cạnh các đột biến có tỷ lệ thấp, ít gặp hơn. Các đột biến
này có tính đặc trưng cho từng dân tộc, từng vùng (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
6


2.1.4.2. Bệnh thalassaemia ở Việt Nam
Việt nam là một quốc gia đa dân tộc với 54 dân tộc, trong đó người Kinh là
nhóm dân tộc chính với khoảng 75 triệu dân phân bố khắp đất nước, các dân tộc thiểu
số còn lại chỉ chiếm khoảng 8,1 % dân số và đa số sống ở vùng cao nguyên. Tỉ lệ
bệnh thalasseamia ở nước ta dao động vào khoảng từ 1,5 % và 25%, tỉ lệ mắc bệnh cao
nhất ở nhóm dân tộc thiểu số đặc biệt là Tầy (11 %), Mông (25 %), Pako (8,33 %),
Catu (14 %) (Saovaros Svasti và ctv, 2002).
Tần suất người mang gen trung bình của bệnh α thalassaemia, β thalassaemia và
Hb E của dân tộc Kinh lần lượt là 5,35 %, 1,5 % và 4,9 %. Các dạng α thalassaemia
nghiêm trọng thường gây chết trong tử cung và không tạo gánh nặng lên sức khỏe
cộng đồng. Vì thế, chính β thalassaemia và Hb E mới là thách thức chủ yếu
(Trần Nguyễn An Phú, 2007).
Ở Việt Nam, theo báo cáo Viện Nhi bệnh chiếm 49% các trường hợp thiếu máu
tán huyết. Tại trung tâm truyền máu huyết học, bệnh huyết sắc tố chiếm 11,46% trong
đó β.Thalassemia chiếm 30,2% (Mã Phương Hạnh, 2009).
Bảng 2.1 Số liệu bệnh máu nhập viện tại khoa Huyết học lâm sàng, BVNĐ1
Năm

2001

2002

2003

2004

2005

2006

2007

Số ca

1291

1505

1563

1720

1876

2085

1872

Thalassemia

383

475

657

620

951

1007

735

Thiếu máu huyết tán

136

105

0

0

0

22

47

Suy tủy

72

90

101

86

106

123

135

Bạch cầu cấp

119

108

122

120

122

159

132

326

420

376

387

311

339

298

100

107

127

134

181

273

350

Xuất huyết giảm tiểu
cầu

Hemophilia

Số liệu thống kê của bệnh viện Nhi Đồng 1 (Mã Phương Hạnh, 2009).

Ước tính nước ta hiện có 5,12 triệu người mang gen β thalassaemia hoặc Hb E.
Với tỉ suất sinh 19,58/1000 thì có khoảng 1,57 triệu trẻ sinh ra mỗi năm trong số đó có
100 ngàn trẻ dị hợp tử gen bệnh và 1.700 trẻ đồng hợp tử hay dị hợp tử kép gen bệnh

7


và biểu hiện bệnh nặng. Như vậy, mỗi năm số lượng bệnh nhân sẽ tăng lên chồng chất
(Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
2.1.5. Chi phí điều trị bệnh thalassaemia
Chi phí dành cho các bệnh nhân thalassaemia bao gồm truyền máu
200.000 đ/125ml/ 10 kg/lần , thuốc và các điều trị cần thiết khác bao gồm thải sắt
180.000đ/ 0,5g/ 15kg/ngày và phẫu thuật, viện phí (Lâm Thị Mỹ, 2003). Cho đến nay
chưa có một tính toán cụ thể về chi phí cho điều trị bệnh thalassaemia ở Việt Nam. Ở
các nước có nguồn lực cao, chi phí cho điều trị và chăm sóc y tế hầu như được ngân
sách chính phủ trả. Tuy nhiên, các nước có nguồn lực thấp không thể kham nổi chi phí
này cho tất cả bệnh nhân. Vì thế bệnh nhân và gia đình phải chi trả cho việc điều trị.
Vấn đề này tạo gánh nặng lên gia đình bệnh nhân và xã hội.
Thực tế về vấn đề nguồn máu điều trị là một vấn đề nan giải nếu một bệnh nhân
được truyền máu mỗi hai hoặc ba tuần, tổng số lượng máu mỗi năm khoảng 52 đơn vị.
Nếu 1.700 sinh ra mắc bệnh mỗi năm được truyền máu đầy đủ thì lượng máu sử dụng
sẽ gần 1,77 triệu đơn vị. Tuy nhiên thực tế cho thấy hệ thống y tế của Việt Nam đang
thiếu nguồn hiến máu trong khi nhu cầu cho điều trị lại tăng lên. Gánh nặng do
thalassaemia gây ra chắc chắn sẽ làm tình trạng khan hiếm máu trầm trọng hơn
(Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
2.2. Bệnh học và di truyền bệnh β thalassaemia

2.2.1. Cơ sở phân tử của bệnh
Hiện nay trên thế giới có hơn 200 đột biến khác nhau gây bệnh β thalassaemia
đã được mô tả. Trong đó, chủ yếu là đột biến điểm, phần nhỏ là đột biến mất đoạn.
Các đột biến này có thể gây ra sai lệch trong quá trình phiên mã, quá trình cắt nối
RNA, làm xuất hiện mã dừng hoặc làm thay đổi quá trình đọc mã (Rund và ctv, 2005),
kết quả là làm giảm hay mất hoàn toàn tổng hợp chuỗi β globin. Có thể xếp các đột
biến thành 2 nhóm, gồm các đột biến gây mất hoàn toàn tổng hợp chuỗi β globin gọi là
β0 thalassaemia và các đột biến gây giảm tổng hợp chuỗi β globin gọi là
β+thalassaemia. Các đột biến β0 thalassaemia thường gây ra các biểu hiện lâm sàng
nặng hơn các đột biến β+thalassaemia. Những đột biến này có thể xảy ra ở vùng exon,
intron và vùng promoter, poly A (Trần Nguyễn An Phú, 2007).

8


2.2.1.1. Đột biến vùng promoter
Đã có 18 đột biến vùng promoter được phát hiện. Các đột biến ở vùng này gây
ảnh hưởng đến quá trình phiên mã do làm giảm khả năng kết hợp của enzyme RNA
polymerase và gây giảm nhẹ tổng hợp số lượng chuỗi β globin với các biểu hiện lâm
sàng của β+ thalassaemia. Ví dụ đột biến -28 AÆG (Trần Nguyễn An Phú, 2007).
2.2.1.2. Đột biến trong quá trình cắt nối RNA
Sau quá trình phiên mã, là quá trình cắt nối mRNA để loại bỏ các intron. Các
sai lệch trong quá trình này có thể gây ra mất hoàn toàn quá trình cắt nối bình thường
hoặc giảm một phần hoặc tạo ra vị trí cắt nối mới trên intron hoặc trên exon gây ra β+
hoặc β0 thalassaemia như các đột biến IVS1-1 G Æ T và đột biến IVS2-654 C Æ T
(Trần Nguyễn An Phú, 2007).
2.2.1.3. Đột biến tạo ra các mRNA không có chức năng
Đột biến vô nghĩa: xảy ra khi thay thế 1 nucleotide này bằng 1 nucleotide khác
làm xuất hiện mã dừng. Các chuỗi globin không hoàn chỉnh sẽ được tạo ra và nhanh
chóng bị thoái hóa. Các đột biến này gây ra kiểu hình β0 thalassaemia. Ví dụ đột biến

codon 17 AAG Æ TAG.
Đột biến dịch khung: xảy ra khi mất hoặc thêm 1 hoặc nhiều nucleotide vào
vùng mã hóa của gen dẫn đến kết quả là làm thay đổi khung đọc mã bình thường bắt
đầu từ vị trí thay đổi và làm mã dừng xuất hiện sớm, hậu quả là tạo ra các chuỗi β
globin không hoàn chỉnh. Các đột biến này gây kiểu hình β0 thalassaemia. Một số đột
biến thuộc loại này như đột biến codon 41/42 –TTCT, codon 71/72 +A, codon 95 +A
(Trần Nguyễn An Phú, 2007).
2.2.2. Đặc điểm lâm sàng
Theo đặc điểm lâm sàng, bệnh được phân loại thành 3 thể, gồm β thalassaemia
nặng, β thalassaemia vừa và β thalassaemia nhẹ (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
2.2.2.1. β thalassaemia nặng (β0 / β0 và β0 / β+ )
Được Cooley mô tả lần đầu vào năm 1925. Đây là hậu quả của tình trạng đồng
hợp tử của một đột biến hoặc dị hợp tử kép của hai đột biến. Những bệnh nhân thể này
đòi hỏi phải truyền máu và thải sắt thường xuyên để duy trì cuộc sống.
Bệnh đặc trưng bởi thiếu máu nặng xuất hiện trong vài tháng đầu của đứa bé,
thiếu máu da niêm nhợt nhạt, vàng da, gan lách to, xạm da, xương mặt và xương họp
sọ biến dạng: u trán, u chẩm, xương hàm trên dô, mũi tẹt, bụng chướng, tiêu chảy,
9


chậm phát triển trí não. Và dẫn đến những biến chứng ảnh hưởng đến đời sống là tình
trạng quá tải sắt gây rối loạn chức năng các cơ quan đặc biệt là cơ tim gây tử vong, rối
loạn hệ nội tiết (Mã Phương Hạnh, 2009). Hồng cầu nhỏ, nhược sắc, hình dạng hồng
cầu không đều, thể tích trung bình của hồng cầu (MCH < 27 pg) và số lượng Hb trung
bình trong một hồng cầu (MCV < 78 fl) giảm (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).

Vết cắt lách

Hình 2.6 Bệnh nhân thalassaemia nặng phải cắt lách
(tham khảo từ Mã Phương Hạnh, 2009).

2.2.2.2. β thalassaemia vừa (β+ / β+ )
Thể bệnh này thường là kết quả của sự kết hợp giữa 2 đột biến β+ hoặc giữa một
đột biến β+ và một đột biến β0. Bệnh nhân bị thiếu máu, lách to vừa phải, nhu cầu
truyền máu thấp, sống trưởng thành được. β thalassaemia / Hb E được coi là
thalassaemia trung gian. Tuy nhiên mức độ biểu hiện của bệnh rất thay đổi. Một
nghiên cứu trên 378 trường hợp cho thấy một nửa trong số này có biểu hiện nhẹ nhưng
một nửa có biểu hiện nặng.
2.2.2.3. β thalassaemia nhẹ (β+ / β, β0 / β)
Là tình trạng dị hợp tử một đột biến và hầu như không có triệu chứng gì, đôi
khi thiếu máu nhẹ hoặc không, chỉ phát hiện khi xét nghiệm máu hay điều tra phả hệ.
Cơ thể phát triển bình thường (Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2006).
10


2.2.3. Cơ chế bệnh học của β thalassaemia
Sau khi sinh, HbA tăng dần và chiếm chủ yếu. HbA gồm 2 chuỗi α và 2 chuỗi
β. Các đột biến gen β globin gây mất hay giảm số lượng chuỗi β globin làm cho chuỗi
α bị dư thừa. Các chuỗi này tạo thành các hạt không hòa tan, lắng xuống màng hồng
cầu trong máu ngoại biên làm hồng cầu bị phá hủy sớm gây tan máu, lắng vào hồng
cầu non ở tủy xương làm hồng cầu non chết trước khi trưởng thành nên sự tạo hồng
cầu không hiệu quả làm cho quá trình tạo hồng cầu lại càng tăng lên. Khi chuỗi β
giảm, các chuỗi γ và δ tăng để bù trừ làm tăng HbF (α2γ2) và HbA2 (α2δ2). Khi sự tổng
hợp chuỗi β globin giảm thì tổng hợp Hb cũng bị giảm gây biểu hiện hồng cầu nhược
sắc trong máu ngoại vi và tăng tạo hồng cầu trong tủy xương. Sự tăng hoạt động của
tủy xương làm cho xương bị biến dạng tạo ra vẻ mặt đặc biệt của bệnh nhân
thalassaemia. Tóm lại, sự thiếu hụt chuỗi β globin là điểm khởi phát trong cơ chế sinh
bệnh β thalassaemia (Androulla Eleftheriou, 2003).
2.2.4. Cơ chế di truyền bệnh β thalassaemia
β thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường theo qui luật của
Mendel. Trong gia đình nếu chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh thể dị hợp tử thì con

sinh ra có 50% khả năng mang gen bệnh, nếu cả cha và mẹ đều mang gen bệnh thì con
sinh ra có 50% khả năng mang gen bệnh và 25% khả năng con bị bệnh thể nặng.

Hình 2.7 Cơ chế di truyền bệnh thalassaemia
(Nguồn: />2.2.5. Điều trị bệnh β thalassaemia
Bệnh nhân thalassaemia thể vừa và nhẹ không cần điều trị, chỉ cần bổ sung sắt
khi cần thiết. Đối với thai phụ cần bổ sung thêm acid folic định kỳ.
11


Đối với bệnh nhân thiếu máu nặng cần truyền máu: truyền hồng cầu lắng mỗi
4 – 6 lần / tuần tùy theo mức độ huyết tán. Truyền máu sẽ duy trì lượng Hb bình
thường nên ngăn ngừa sự biến dạng mặt của trẻ, giúp trẻ phát triển bình thường, ngăn
ngừa lách to và cải thiện tình trạng suy tim.
Thải sắt theo chỉ định là khi lượng sắt trong cơ thể vượt quá 1000 ng/ml máu,
bệnh nhân phải trên 3 tuổi, và khi bệnh nhân thalassaemia thể nặng có biểu hiện cường
lách (số lượng hồng cầu lắng truyền trong một năm trên 250 ml/kg). Những điều trị
trên cũng để lại một số di chứng: lây những bệnh truyền nhiễm như HIV, giang mai,
sốt rét… hay nhiễm trùng do cắt lách (Mã Phương Hạnh, 2009).
Ngoài ra việc ghép tủy cũng là một phương án điều trị bệnh. Chi phí cho ghép
tủy rất tốn kém, không phải phù hợp với tất cả các bệnh nhân mà còn phụ thuộc vào
tuổi tác, tình trạng sức khỏe của bệnh nhân.
2.2.6. Sự lưu hành của gen β thalassaemia trên thế giới
Bảng 2.2 Các đột biến β thalassaemia phổ biến ở một số nơi trên thế giới
Quần thể

Đột biến

Kiểu hình

(1)

(2)

(3)

Người Việt

Người Đông Nam Á

-28 AÆG

β+

codon 17 AAGÆTAG

β0

codon 26 GAGÆAAG

Hb E

codon 41/42 –TTCT

β0

codon 71/72 +A

β+

IVS 2-654 CÆT

β+ nặng

codon 95 +A

β0

-28 AÆG

β+

codon 17 AAGÆTAG

β0

codon 26 GAGÆAAG

Hb E

IVS 1-5 GÆC
codon 41/42 –TTCT
IVS 2-654 CÆT

12

β+ nặng
β0
β+ nặng

Bảng 2.2 (tt) Các đột biến β thalassaemia phổ biến ở một số nơi trên thế giới
(1)
Người Trung Quốc

Người Ấn Độ

Người Địa Trung Hải

Người Trung Đông

(2)

(3)

-28 AÆG

β+

codon 17 AAGÆTAG

β0

codon 26 GAGÆAAG

Hb E

codon 41/42 –TTCT

β0

codon 71/72 +A

β+

IVS 2-654 CÆT

β+ nặng

codon 8/9 +G

β0

IVS 1-1 GÆT

β0

IVS 1-5 GÆC

β+ nặng

codon 41/42 –TTCT

β0

- 619 bp deletion

β0

IVS 1-1 GÆA

β0

IVS 1-6 TÆC

β+ nặng

IVS 1-110 GÆA

β+ nặng

codon 39 CAGÆTAG

β0

IVS 2-745 CÆG

β+

codon 8 –AA

β0

codon 8/9 +G

β0

IVS 1-5 GÆC

β+ nặng

codon 39 CAGÆTAG

β0

codon 44 –C

β0

IVS 2-1 GÆA

β0

(Trần Nguyễn An Phú, 2007).

13


2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β thalassaemia
2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng
Bệnh β thalassaemia thể nặng thường gặp ở trẻ dưới 5 tuổi với triệu chứng thiếu
máu huyết tán mãn: da niêm nhợt nhạt, vàng da, gan lách to, xạm da. Biến dạng xương
sọ: u trán, u chẩm, xương hàm trên dô, mũi tẹt. Chậm phát triển thể chất và tinh thần.
Đối với β thalassaemia thể vừa và nhẹ, có thiếu máu với mức độ thay đổi. Hầu
hết, người mang gen thể dị hợp tử không có triệu chứng và thường được phát hiện qua
xét nghiệm huyết học hay trong gia đình có người bị thalassaemia thể nặng. Cơ thể
phát triển bình thường chỉ một tỉ lệ nhỏ thalassaemia thể dị hợp tử có thiếu máu mạn
và lách to nhẹ (Mã Phương Hạnh, 2009).
2.3.2. Chẩn đoán cận lâm sàng
2.3.2.1. Xét nghiệm huyết đồ

Xét nghiệm huyết đồ cho nhiều chỉ số nhưng chỉ cần lưu ý đến chỉ số MCV và
MCH. Người nghi ngờ mang gen β thalassaemia có các chỉ số: MCV < 78 fl,
MCH < 27 pg và HbA2 ≥ 3,3%. Trong khi các chỉ số ở người bình thường là: MCV
(80 – 99 fl) và MCH (27 – 31 pg). Cũng cần quan tâm đến kết quả điện di ferritin để
loại trừ trường hợp thiếu máu do thiếu sắt. Chỉ số ferritin bình thường ở người nam là
25 – 300 ng/ml và nữ 16 – 160 ng/ml (Lâm Thị Mỹ, 2003).
2.3.2.2. Chẩn đoán di truyền phân tử
Một số kỹ thuật phát hiện đột biến dựa trên phương pháp PCR. Về nguyên tắc,
PCR một chu kỳ nhiệt độ sẽ bao gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:
Bước 1: nhiệt độ sẽ được đưa lên 94OC, ở nhiệt độ này các liên kết hydro của
mạch đôi DNA sẽ bị mất đi, nhờ vậy DNA đích bị biến tính thành các mạch đơn; giai
đoạn này gọi là giai đoạn biến tính.
Bước 2: nhiệt độ sẽ được hạ đến 55OC – 65OC là nhiệt độ thích hợp để các đoạn
mồi tìm đến bắt cặp bổ sung vào hai đầu của đoạn DNA đích, giai đoạn này gọi là giai
đoạn bắt cặp.
Bước 3: nhiệt độ được đưa lên 72OC là nhiệt độ thích hợp cho hoạt tính enzyme
Tap polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của
sợi DNA đích, bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung (Phạm Hùng Vân, 2009).

14


1. Kỹ thuật lai bằng các đầu dò đặc hiệu
Kỹ thuật lai bằng đầu dò đặc hiệu (Alelle Specific Oligonucleotide dot blot)
Bước 1: Đoạn DNA đích sẽ được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR.
Bước 2: Sản phẩm DNA được đem đi biến tính rồi nhỏ lên một màng nylon,
trên màng nylon đã gắn sẵn 2 loại đầu dò là 2 đoạn DNA ngắn, một đoạn sẽ bắt cặp
với đoạn DNA đột biến, một đoạn sẽ bắt cặp với đoạn DNA bình thường. Các đầu dò
này đã được đánh dấu trước bằng biotin hoặc horseradish ở đầu tận cùng 5’.
Bước 3: Sau khi lai và rửa ở nhiệt độ thích hợp, các dấu hiệu sẽ được phát hiện.

Kiểu gen của mẫu DNA được chẩn đoán nhờ quan sát sự hiện diện hay không hiện
diện của sản phẩm PCR trên các giếng gắn đầu dò bình thường hay đột biến.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể phát hiện nhiều đột biến cùng lúc.
Nhược điểm chi phát cao, phương pháp đồi hỏi kỹ thuật cao trong bước lai và rửa
(John Old và ctv, 2005).
2. Kỹ thuật Reverse Dot – blot
Phương pháp này được Saiki và cộng sự đưa ra vào năm 1989. Kỹ thuật nhằm
xác định các đột biến đã biết.
Bước 1: Các cặp đoạn dò oligonucleotide đặc hiệu bình thường và đột biến
được cố định trên màng nylon.
Bước 2: Màng nylon được lai với các đoạn DNA là sản phẩm của phản ứng
PCR mà mồi được đánh dấu ở đầu 5’ bằng biotin để sàng lọc các đột biến.
Đây là phương pháp có độ nhậy cao, nhưng có thể có dương tính giả, đòi hỏi tỉ
mĩ nên cần kỹ thuật viên có nhiều kinh nghiệm (John Old và ctv, 2005).
3. Kỹ thuật dùng hệ thống khuếch đại có tính chất trơ (ARMS)
Kỹ thuật ARMS được Newton và cộng sự đưa ra vào năm 1989. Kỹ thuật dựa
trên PCR cho phép phát hiện các đột biến điểm và các đột biến thêm đoạn hay mất
đoạn nhỏ bằng cách khuếch đại các allele đặc hiệu. Đây là phương pháp cho phép
nhanh chóng phát hiện đột biến sau khi điện di trên thạch agarose hay thạch
polyacrylamide và có thể phân biệt được các trường hợp đồng hợp tử và dị hợp tử.
Đoạn nucleotide có sự bổ sung không tương hổ ở đầu 3’ sẽ ngăn chặn sự kéo
dài của đoạn mồi trong phản ứng PCR.

15