XÂY DỰNG QUY TRÌNH REALTIME PCR XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR
XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2
Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện : PHAN THỊ PHƯƠNG THANH
Niên khóa

: 2006 – 2010

Tháng 7 năm 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
[\

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH REAL-TIME PCR

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG BẢN SAO GEN SMN2
Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Hướng dẫn khoa học
TS. LÊ HUYỀN ÁI THÚY

Sinh viên thực hiện
PHAN THỊ PHƯƠNG THANH

CN. NGUYỄN VĂN HƯNG

Tháng 7 năm 2010


LỜI CẢM ƠN
Trong cuộc sống, bất cứ thành quả nào đạt được đều do sự đóng góp công sức
của nhiều người, và tôi cũng không nằm ngoài quy luật đó.
Đầu tiên, con xin gửi đến ba mẹ và gia đình với những lời thiêng liêng nhất,
những người đã luôn hy sinh vì con, đã dành cho con những tình cảm tốt đẹp nhất để
nuôi dạy con nên người.
Em xin chân thành cảm ơn và xin gửi lời tri ân sâu sắc Ban Giám hiệu Trường
Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh và tất cả quý thầy cô Bộ môn Công nghệ
sinh học đã dạy dỗ và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt 4 năm học vừa qua.
Em xin chân thành cảm ơn cô Lê Huyền Ái Thúy, anh Nguyễn Văn Hưng đã
truyền đạt kiến thức và hướng dẫn, chỉ bảo nhiệt tình cho em những kiến thức quý báu
để có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

.

Em xin chân thành cảm ơn Giáo sư Maria Jędrzejowsk, giáo sư Monica

Stravarachi, giáo sư Wang Wenlan, giáo sư Zilfalil Bin Alwin đã cung cấp nguồn vật
liệu thí nghiệm và hướng dẫn cho em để em có thể hoàn thành tốt đề tài này.
Em xin cảm ơn Ban Giám Đốc cùng toàn thể các anh chị trong công ty Cổ phần
Công nghệ Việt Á đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian thực
hiện khóa luận.
Xin gửi đến các bạn cùng làm khóa luận lời cảm ơn đã giúp đỡ chia sẻ những
khó khăn và đóng góp ý kiến với tôi trong suốt thời gian qua. Chúc tất cả các bạn thực
hiện đề tài thành công tốt đẹp.
Xin cảm ơn tất cả các bạn đã chia sẻ những tâm sự, giúp đỡ, động viên và khích
lệ tôi rất nhiều trong suốt khoảng thời gian thực hiện đề tài và trong những năm tháng
học tập dưới mái trường này.
Xin chân thành cảm ơn
Phan Thị Phương Thanh

i


TÓM TẮT
Teo cơ tủy sống (SMA) là bệnh di truyền gen lặn trên NST thường, gây rối loạn
thần kinh, do các tế bào thần kinh kiểm soát cơ vận động trong tủy sống của người
bệnh chết dần đi, dẫn đến các cơ vận động bị thoái hóa và teo dần. Đây là bệnh do đột
biến mất đồng hợp lặn gen SMN1 ở 94% bệnh nhân. Gen SMN2 có độ tương đồng cao
với gen SMN1, có mặt ở tất cả các bệnh nhân nhưng không thể bù đắp cho sự thiếu hụt
gen SMN1. Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu cho thấy có sự tương quan giữa số lượng bản
sao gene SMN2 và mức độ trầm trọng của bệnh. Số bản sao gene SMN2 càng nhiều
thì các triệu chứng càng giảm. Do đó, chúng tôi xây dựng một quy trình real-time PCR
nhằm xác định số lượng bản sao gene SMN2, từ đó có thể dự đoán mức độ bệnh, các
triệu chứng có thể và tuổi thọ của bệnh nhân.
Đề tài sử dụng phương pháp real-time PCR với mẫu dò Taqman dựa trên
nucleotide khác biệt giữa SMN1 với SMN2. Hệ mồi và mẫu dò sử dụng từ công trình

nghiên cứu của Curet và ctv (2007) được khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trên lý thuyết
và thực nghiệm bao gồm khả năng hoạt động, nhiệt độ lai, độ nhạy và hiệu suất
khuếch đại. Hệ mồi- mẫu dò khi đã đạt các điều kiện cần thiết sẽ được thử nghiệm
nghiên cứu trên 32 mẫu bệnh phẩm gồm 20 mẫu bệnh phẩm của người Ba Lan, 4 mẫu
bệnh phẩm của người Malaysia và 8 mẫu bệnh phẩm đại trà của người Việt Nam.
Kết quả thu được cho thấy hệ mồi –mẫu dò được sử dụng có độ đặc hiệu cao và
chuyên biệt cho gen SMN2. Số bản sao gen SMN2 được xác định bằng phương pháp
2-ΔΔCt sử dụng beta-actin làm gen tham chiếu. Kết quả thử nghiệm hoàn toàn phù hợp
với số liệu đưa ra. Như vậy hệ mồi – mẫu dò và phương pháp Realtime PCR mà đề tài
chúng tôi nghiên cứu đã đem lại kết quả như mong đợi và đạt hiệu quả cao trong việc
xác định số lượng bản sao gen SMN2.

ii


SUMMARY
Constructing real-time PCR process determining the copy number of SMN2 gene
in Vietnamese.
The spinal muscular atrophies (SMAs) comprise a group of autosomal-recessive
disorders characterized by progressive weakness of the lower motor neurons. SMA
affects the nerves in an area of the spinal cord called the anterior horn. The nerve cells
become damaged, breaking the link between the brain and the muscles. SMA caused
by homozygous absence of SMN1 (survival motor neuron gene) in 94% of patients.
SMN2- the highly homologous gene, is present in all patients, but it can not
compensate for loss of SMN1.The copy number of SMN2 influence to serious disease
level. Therefore, we construct Real-time PCR process to determine the copy number of
SMN2 gene to predict disease level, symptom and longevity of SMA patients.
We developed a reliable quantitative real-time PCR method with Taqman probe
based on differ nucleotide between SMN1 and SMN2. Primer and probe is used from
research project of Curet (2007) is tested in theory and experiment including the active

ability, hybrid temperature, the sensitivity and amplification efficiency of the process.
The primer- probe system obtain satisfactory results will be studied in 32 clinical
samples including 20 Polish patient samples, 4 Malaysian patient samples and 8
Vietnamese samples.
The result show primer-probe system has high specificity for SMN2 gene. The
copy number of SMN2 gene was determined by 2-ΔΔCt method and beta-actin was used
as a reference gene. The copy number of SMN2 gene in accordance with data provided.
Hence, the primer- probe system in real-time PCR process to determine the copy
number of SMN2 gene has come up to our expectations. The development of genetic
techniques in the treatment of SMA will be more meaningful when we determine the
number of SMN2 gene copies by real -time PCR method.
Key words: SMA, SMN2, Real-time PCR, Vietnamese, Taqman.

iii


MỤC LỤC
Lời cảm ơn .................................................................................................................... i
Tóm tắt .......................................................................................................................... ii
Summary ...................................................................................................................... iii
Danh mục các từ viết tắt .............................................................................................. vii
Danh mục các bảng .................................................................................................... viii
Danh mục các hình ...................................................................................................... ix
Chương 1: Mở đầu ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu đề tài......................................................................................................... 2
1.3. Nội dung đề tài ....................................................................................................... 2
Chương 2: Tổng quan tài liệu ....................................................................................... 3
2.1. Đại cương về teo cơ tủy sống ................................................................................ 3
2.1.1. Sơ lược về bệnh teo cơ tủy sống......................................................................... 3

2.1.2. Các dạng của bệnh teo cơ tủy sống .................................................................... 4
2.1.3. Tình hình bệnh teo cơ tủy sống trên thế giới và Việt Nam ................................ 4
2.1.3.1. Trên thế giới .................................................................................................... 4
2.1.3.2. Việt Nam ......................................................................................................... 5
2.1.4. Tính di truyền của bệnh teo cơ tủy sống ............................................................ 5
2.1.5. Nguyên nhân di truyền học của bệnh teo cơ tủy sống........................................ 5
2.1.6. Chẩn đoán SMA ................................................................................................. 8
2.1.7. Chữa trị bệnh teo cơ tủy sống ............................................................................. 9
2.2. Phản ứng Real-time PCR....................................................................................... 9
2.2.1. Đại cương về PCR .............................................................................................. 9
2.2.1.1. Nguyên tắc của PCR ........................................................................................ 9
2.2.1.2. Thành phần PCR............................................................................................. 10
2.2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR...................................................................... 10
2.2.1.4. Số lượng chu kỳ của PCR............................................................................... 12
2.2.1.5. Thiết bị và dụng cụ cho PCR.......................................................................... 12
2.2.1.6. Các ưu điểm và hạn chế của PCR .................................................................. 12

iv


2.2.1.7. Quá trình PCR ................................................................................................ 14
2.2.2. Phương pháp Real-time PCR ............................................................................ 15
2.2.2.1. Các kiểu phản ứng của Real-time PCR .......................................................... 15
2.2.2.2. Một số lưu ý khi thực hiện Real-time PCR .................................................... 17
2.2.2.3. Allele Specific Real-time PCR ....................................................................... 19
2.2.2.4. Định lượng phản ứng Real-time PCR bằng gen tham chiếu .......................... 19
Chương 3: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu......................................................... 21
3.1. Vật liệu ................................................................................................................ 21
3.1.1.Vật liệu sinh học ................................................................................................. 21
3.1.2. Dụng cụ và hóa chất .......................................................................................... 21

3.1.2.1. Dụng cụ........................................................................................................... 21
3.1.2.2. Hóa chất .......................................................................................................... 21
3.2. Phương pháp ......................................................................................................... 22
3.2.1. Phương pháp tách chiết DNA ............................................................................ 22
3.2.1.1. Nguyên tắc tách chiết ..................................................................................... 22
3.2.1.2. Tiến hành tách chiết........................................................................................ 22
3.2.2. Phương pháp thiết kế - đánh giá primer ............................................................ 23
3.2.2.1. Thiết kế primer bằng phần mềm Annhyb ....................................................... 23
3.2.2.2. Thiết kế primer bằng phần mềm Clustal ........................................................ 24
3.2.3. Phương pháp Taqman Real-time PCR .............................................................. 24
3 .2.3.1. Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe ................. 24
3.2.3.2. Phản ứng Singleplex Taqman Real-time PCR ............................................... 26
3.2.3.3. Phản ứng Multiplex Taqman Real-timePCR.................................................. 26
3.2.4. Phương pháp định lượng tương đối dựa vào gen tham chiếu ........................... 26
3.2.4.1. Phương pháp Livak......................................................................................... 26
3.2.4.2. Phương pháp Plaffl ......................................................................................... 27
Chương 4: Kết quả và thảo luận .................................................................................. 28
4.1. Kết quả .................................................................................................................. 28
4.1. Kết quả lý thuyết .................................................................................................. 28
4.1.1.1. Kết quả chạy trên phần mềm Clustal.............................................................. 28
4.1.1.2. Kết quả chạy trên phần mềm Annhyb ............................................................ 32
4.1.1.3. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của primer bằng công cụ BLAST ................. 34
v


4.1.1.4. Kết quả khảo sát cấu trúc thứ cấp của hệ primer-probe ................................. 34
4.1.2. Kết quả thực nghiệm.......................................................................................... 36
4.1.2.1. Khảo sát khả năng khuếch đại của hệ primer-probe ...................................... 36
4.1.2.2. Kết quả khảo sát khả năng khuếch đại cho multiplex real-time PCR ............ 38
4.1.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu của hệ primer- probe ............... 42

4.1.2.4. Kết quả khảo sát độ nhạy cho hệ primer- probe ............................................. 42
4.1.2.5. Kết quả khảo sát hiệu suất khuếch đại ........................................................... 48
4.1.2.6. Kết quả xác định số lượng bản sao trên mẫu bệnh phẩm .............................. 49
4.2. Thảo luận .............................................................................................................. 51
Chương 5: Kết luận và đề nghi .................................................................................... 51
5.1. Kết luận................................................................................................................. 51
5.2. Đề nghị ................................................................................................................. 51
Tài liệu tham khảo ....................................................................................................... 52
Phụ lục

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool (chương trình BLAST)

Bp

Base pair (cặp base)

DNA

Deoxyribonucleic acid

DNTP

Deoxynucleoside triphosphat

DHPLC

Denaturing high performance liquid chromatography

FL

Full length

IDT

Intergrated DNA Technology (công ty IDT)

NCBI

National Centre for Biotechnology Information

PCR

Polymerase chain reaction.

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism

SMA

Spinal Muscular Atrophy (teo cơ tủy sống)

SMN

Survival Muscular Neurone

SMNΔ7

Survival Muscular neurone (SMN thiếu exon 7)

SNP

Single nucleotide polymorphism

snRNPs

Small nuclear ribonucleo proteins

TAE

Tris acid-EDTA.

Taq

Thermus aquaticus

Tm

Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1 Các type của bệnh teo cơ tủy sống. ................................................................4
Bảng 3.1 Sự tương quan giữa tỷ số 2-∆∆Ct và số lượng bản sao .....................................25
Bảng 4.1 Trình tự primer và probe sử dụng cho gen SMN2 và beta-actin. ..................26
Bảng 4.2 Cấu trúc thứ cấp của hệ primer và probe cho gen SMN2. ............................33
Bảng 4.3 Cấu trúc thứ cấp của hệ primer và probe cho gen beta-actin. .......................34
Bảng 4.4 kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ primer- probe cho gen SMN2. ...........34
Bảng 4.5 Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ primer- probe cho gen beta-actin. .....35
Bảng 4.6 Kết quả khảo sát phản ứng singplex của gen SMN2. ....................................36
Bảng 4.7 Kết quả khảo sát phản ứng singplex của gen beta-actin. ...............................37
Bảng 4.8 Kết quả khảo sát gen SMN2 và beta-actin trong phản ứng multiplex...........38
Bảng 4.9 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen SMN2. .......................39
Bảng 4.10 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen beta-actin. ................40
Bảng 4.11 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen SMN2. ..................................................41
Bảng 4.12 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen beta-actin. .............................................42
Bảng 4.13 Kết quả định lượng số bản sao trên mẫu chứng ........................................45
Bảng 4.14 Kết quả định lượng số bản sao trên mẫu bệnh phẩm...................................46

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Hệ thống thần kinh tủy sống. ..........................................................................3
Hình 2.2 Quá trình splicing của gen SMN. ...................................................................6
Hình 2.3 Tổ chức gen SMN. ..........................................................................................6
Hình 2.4 Các bước của một phản ứng PCR ..................................................................12
Hình 3.1 Nguyên tắc của kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe. ................24
Hình 4.1 Kết quả xếp gióng trình tự gen SMN1 và gen SMN2. ..................................29
Hình 4.2 Kết quả xếp gióng trình tự primer xuôi và gen SMN2. .................................29

Hình 4.3 Kết quả xếp gióng trình tự primer ngược và gen SMN2. ..............................30
Hình 4.4 Kết quả xếp gióng trình tự probe và gen SMN2. ...........................................30
Hình 4.5 Kết quả xếp gióng trình tự primer xuôi và gen beta-actin. ............................31
Hình 4.6 Kết quả xếp gióng trình tự primer ngược và gen beta-actin. .........................31
Hình 4.7 Kết quả xếp gióng trình tự probe và gen beta-actin.......................................32
Hình 4.8 Kết quả khảo sát trên phần mềm Annhyb cho gen SMN2 ........................... 33.
Hình 4.9 Kết quả khảo sát trên phần mềm Annhyb cho gen beta-actin. .....................34
Hình 4.10 Khảo sát khả năng khuếch đại hệ primer- probe cho gen SMN2 ................37
Hình 4.11 Khảo sát khả năng khuếch đại hệ primer- probe cho gen beta-actin. ..........38
Hình 4.12 Phản ứng singleplex cho gen SMN2............................................................40
Hình 4.13 Phản ứng singleplex cho gen beta-actin. .....................................................41
Hình 4.14 Phản ứng multiplex cho gen SMN2 và gen beta-actin. ...............................42
Hình 4.15 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen SMN2. .....................43
Hình 4.16 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai và độ đặc hiệu cho gen beta-actin. ................44
Hình 4.17 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen SMN2....................................................45
Hình 4.18 Kết quả khảo sát độ nhạy cho gen beta-actin. .............................................46
Hình 4.19 Kết quả khảo sát hiệu suất khuếch đại cho gen SMN2. ..............................47
Hình 4.20 Biểu đồ biểu diễn hiệu suất khuếch đại cho gen SMN2. .............................47
Hình 4.21 Kết quả khảo sát hiệu suất khuếch đại cho gen beta-actin. .........................48
Hình 4.22 Biểu đồ biểu diễn hiệu suất khuếch đại cho gen beta-actin. .......................48

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Teo cơ tủy sống SMA (Spinal Musclular Atrophy) là bệnh di truyền gen lặn trên
NST thường, đặc trưng là sự yếu liệt và teo các cơ tiến triển do sự thoái hóa các tế bào
vận động ở sừng trước tủy sống. Bệnh teo cơ tủy sống đứng hàng thứ hai trong các
nguyên nhân gây tử vong ở trẻ em trên thế giới.

Bình thường, mỗi người có 2 bản sao của gen SMN1 và nhiều hơn 2 bản sao của
gen SMN2 trong mỗi tế bào. Ở người mang SMA, cả 2 bản sao của gen SMN1 đều bị
biến đổi hoặc không hoàn chỉnh và có thể có 3 hoặc nhiều hơn các bản sao của gen
SMN2. Khi cả 2 bản sao của gen SMN1 bị mất đi hoặc bị biến đổi thì chỉ 1 số lượng
rất nhỏ hoặc thậm chí là SMN protein không được sản xuất từ gen này và khi đó thì
các protein SMN được sản xuất từ gen SMN2 sẽ thay thế những protein khiếm khuyết
từ gen SMN1. SMN protein giúp cho quá trình lắp ráp tổ chức tế bào của pre- mRNA
để trở thành phân tử mRNA trưởng thành và có thể thêm các chức năng cho các tế bào
thần kinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SMN protein có vai trò quan trọng trong việc
phát triển của sợi nhánh và trục thần kinh đóng vai trò truyền xung động thần kinh từ
sợi thần kinh đến sợi thần kinh và từ sợi thần kinh đến các cơ.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra ở đây chính là số lượng của protein SMN do gen SMN2
sản xuất. Một lượng SMN protein được sản xuất từ gen SMN2 nhưng chỉ một số
protein có kích thước và chức năng thật sự. Những phiên bản khác có kích thước nhỏ
hơn và rất dễ bị gãy vỡ. Protein này giống hệt với protein được sản xuất từ gen SMN1.
Do vậy, triệu chứng và sự tiến triển cũng như biểu hiện lâm sàng của chứng teo cơ
SMA phụ thuộc chặt chẽ vào số lượng bản sao của gen SMN2.
Việc phát hiện gen SMN2 bằng kỹ thuật sinh học phân tử mà cụ thể là bằng
phương pháp real-time PCR nhanh, nhạy sẽ giúp cho việc khảo sát được ảnh hưởng
của các bản sao của gen SMN2 đến mức độ bệnh SMA. Đây là nền tảng cho việc ứng
dụng sinh học phân tử vào liệu trình điều trị căn bệnh trên.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Để có thể hoàn thành tốt đề tài phải nắm vững các quy tắc và thao tác kỹ thuật
sinh học phân tử trong tách chiết DNA, cách pha PCR mix, sử dụng máy PCR và Real1


time PCR để khảo sát khả năng hoạt động, độ nhạy, nhiệt độ lai…. và cách tính số
lượng bản sao dựa trên gen tham chiếu theo phương pháp 2-ΔΔCt.
1.3. Nội dung đề tài
¾ Thiết kế hệ mồi- mẫu dò cho phản ứng Real-time PCR nhằm phát hiện gen

SMN2.
¾ Khảo sát các yếu tố cần thiết cho phản ứng như độ nhạy, nhiệt độ lai, khả năng
khuếch đại…
¾ Thử nghiệm quy trình lên một số mẫu bệnh phẩm.
Mục đích của từng nội dung sẽ được nói rõ hơn trong phần kết quả và thảo luận.

2


Chương 2 TỒNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về bệnh teo cơ tủy sống
2.1.1. Sơ lược về bệnh teo cơ tủy sống
Bệnh teo cơ tủy sống tên tiếng Anh là Spinal Muscular Atrophy (SMA) là bệnh
di truyền ảnh hưởng phần hệ thần kinh kiểm soát các hoạt động tự phát của cơ. Đây là
bệnh thuộc về cơ vì tác động chính của nó xảy ra ở các cơ không nhận được các tín
hiệu từ những tế bào thần kinh này. Bệnh teo cơ tủy sống SMA gây ra bởi việc mất đi
các tế bào thần kinh được gọi là các nơ-ron vận động trong tủy sống và được liệt vào
loại bệnh nơ-ron vận động.

Hình 2.1 Hệ thống thần kinh tủy sống. Tế bào thần kinh kiểm soát cơ (nơ-ron vận động)
hầu hết nằm ở tủy sống. Những phần nhô ra dài và giống như các dây nối các nơ-ron vận
động với các cơ của tứ chi và thân người. Bình thường các tín hiệu từ nơ-ron truyền đến các
cơ sẽ làm cho cơ co lại. Trong trường hợp bệnh teo cơ tủy, các nơ-ron vận động bị mất đi và
vì thế các cơ không thể hoạt động được. Những cơ nằm gần phần trung tâm của cơ thể (cơ
gần gốc) thường bị ảnh hưởng nhiều hơn những cơ nằm xa trung tâm (cơ xa gốc).Nguồn:
Rabaxy lab, India.

SMA là căn bệnh thứ hai phổ biến trên thế giới, đứng sau hội chứng Cystic
Fibrotic với tần số 1/10.000 ca sinh (Jablonka và ctv, 2000). SMA đặc trưng bởi sự
yếu và giảm trương lực cơ. SMA gây ảnh hưởng cho chân nhiều hơn cánh tay và các

cơ ở hông hay vai và có khuynh hướng ảnh hưởng tương đương giữa phần bên trái và
bên phải cơ thể. Trong hiều trường hợp của SMA, các cơ ngực bị ảnh hưởng dẫn đến
nhiều vấn đề về hô hấp.
2.1.2. Các dạng của bệnh teo cơ tủy sống
Theo Sumner (2006), Hofffmann và Werdnig mô tả SMA lần đầu tiên trong
nghiên cứu của mình vào năm 1893 và 1894. Kugelberg và Welander mô tả những

3


triệu chứng tương tự khởi phát muộn vào năm 1956. Dựa trên hệ thống phân loại của
Duboiwitz vào năm 1964, SMA được chia làm 4 dạng dựa trên khả năng vận động và
độ tuổi khởi phát gồm type I, type II, type III, type IV (Tsirikos và ctv, 2006). Bảng
2.1 so sánh sự khác nhau về đặc điểm, diễn tiến và độ tuổi khởi phát của từng type
bệnh.
Bảng 2.1 Các type của bệnh teo cơ tủy sống
Type I

Type II

Type III

- Là dạng nặng nhất. - Là dạng trung -Dạng nhẹ
- Khởi phát từ khi gian.

-Hiện diện ở người

-Khởi phát sau 18 trưởng thành (sau

sinh đến 6 tháng - Khởi phát từ 6 đến tháng tuổi

tuổi.

Type IV

-Yếu các cơ gần

18 tháng tuổi.

30 tuổi)
- Khởi phát ở tuổi

- Giảm chuyển động - Đặc trưng bởi sự -Có thể đi đứng trưởng thành
mà không cần sự - Tiến triển chậm.

của bào thai trước yếu các cơ gần.
khi sinh.

- Giảm khả năng hô trợ giúp.

- Yếu toàn diện.

hấp do cơ ngực yếu. -Đi không vững,

- Trương lực cơ - Không thể đứng khó có thể chạy.
yếu.

hay ngồi nếu không -Nhai và nuốt khó

- Thở bằng cơ dạ có sự trợ giúp.

khăn khi còn nhỏ

dày do cơ sườn yếu.

- Nhai và nuốt gặp -Tiến triển chậm.

- Mất phản xạ.

khó khăn.

- Thường bị thiểu - Thường bị vẹo cột
năng trí tuệ

sống khi lớn lên.

- Hầu hết chết ở
khoảng 2 tuổi.
Nguồn: www.ranbaxy.com.

2.1.3. Tình hình bệnh teo cơ tủy sống trên thế giới và Việt Nam
2.1.3.1. Trên thế giới
SMA phổ biến với tỷ lệ 1 trên 6000 đến 10000 ca sinh và tỷ lệ thể mang là 1/351/60 (Morrison và ctv, 2007; Su và ctv, 2005; Jablonka, 2000).
Theo Incidence và ctv ( 2003), tỷ lệ SMA type I tại Anh là 1 trên 25000 ca sinh
làm cho SMA trở thành căn bệnh di truyền thông thường gây tử vong cho trẻ sơ sinh,
tần số mang gen là 1 trên 160 và tần số thể mang là 1 trên 80. Dữ liệu nghiên cứu tại
4


Canada, Phần Lan, Hungary và Na-uy đã ghi nhận tỷ lệ SMA là 1 trên 25000 đến 1
trên 15000 với hầu hết các bệnh nhân type II và III ở các nước này. Ở Mỹ, tỷ lệ SMA

là 1 trên 24100 ca sinh, tần số thể mang SMA là 1 trên 50 ở chủng người da trắng.
SMA xảy ra ở nam giới nhiều hơn ở nữa giới. Tỷ lệ nam nữ đối với SMA là
2:1( Tsirikos và ctv, 2006).
Theo dự đoán về sự phát tán của bệnh, tỷ lệ SMA trong nhóm những cá nhân có
quan hệ huyết thống với nhau có dấu hiệu tăng cao. Ở Arập Xu- đăng, tỷ lệ tăng lên
đến 1 trên 518 ca sinh đã được báo cáo. Bệnh này còn phổ biến hơn đối với cộng đồng
Do Thái ở Israel với tỷ lệ là 1 trên 400 (www. ranbaxy.com).
Năm 1999, có khoảng 13,7 trường hợp được chẩn đoán mang SMA trong tổng
100.000 trẻ sơ sinh ở Ailen và khoảng 8 trường hợp trong tổng số 100.000 trẻ sơ sinh
được chẩn đoán mang SMA trên thế giới (Inanaccone và ctv, 2004). Còn trong các
nghiên cứu ở Brazil phát hiện 80% bệnh nhân SMA type I, 75% bệnh nhân type 2 và
61% bệnh nhân type III trong tổng số các bệnh nhân được chẩn đoán mang SMA.
(www. ranbaxy.com).
2.1.3.2. Ở Việt Nam
Đã có một số nghiên cứu được tiến hành nhưng vẫn chưa được nghiên cứu sâu và
kỹ lưỡng để tìm ra một tỷ lệ nhất định các bệnh nhân mắc chứng teo cơ tủy sống.
2.1.4.Tính di truyền của bệnh teo cơ tủy sống
Sự di truyền của SMA tuân theo mô hình di truyền trên NST thường. Một đứa
con sinh ra từ cha và mẹ mang SMA có 25% khả năng phát triển thành SMA. Đối với
cha mẹ mang SMA có 25% khả năng sinh con bình thường, 50% khả năng sinh con ở
thể mang và 25% khả năng sinh con với SMA.
2.1.5. Nguyên nhân phát sinh - Di truyền học của bệnh teo cơ tủy sống
Gen SMN được cấu thành từ 9 exons với một codon stop ở phần cuối của exon 7
gồm gen SMN1 và gen SMN2. Nguyên nhân gây ra bệnh teo cơ tủy sống ở hầu hết các
trường hợp là đột biến mất đồng hợp gen SMN1(hơn 90%) (Monani, 2006).
Gen SMN1 và gen SMN2 khác biệt bởi năm nucleotide, chỉ một nucleotide nằm
ở exon 7 (C→T) có nhiệm vụ cho sự cắt- nối chọn lọc (alternative splicing) của exon
7. Các bản phiên mã hoàn chỉnh hầu hết được sản xuất từ gen SMN1, trong khi đó
dạng phiên mã chủ yếu được mã hóa từ gen SMN2 bị thiếu exon 7 (SMN2Δ7) (Turner,
2004).

5


Hình 2.2 Cấu trúc gen giữa gen SMN1 và gen SMN2. SMN1 và SMN2 có thể phân biệt
bởi chỉ một nucleotide ( C→T) ở exon7 thuộc vùng mã hóa. Sự thay đổi C→T làm thay đổi
quá trình cắt nối chọn lọc cho pre- mRNA ở SMN2. Bản phiên mã SMN2Δ7 mã hóa một
protein không bền vững. (Wirth và ctv, 2006)

Hình 2.3 Quá trình splicing của SMN. Ở SMN1, yếu tố ESE (exonic splicing enhancer)
chứa cytosine (C) tại vị trí 6 của exon 7 được nhận biết bởi yếu tố SF2 (Splicing 2) hay yếu tố
ASF (alternative splicing factor) tác động với U2 snRNP (small nuclear ribonuclear protein)
để cắt bỏ intron 6. Yếu tố splicing khác (Tra2) sẽ thực hiện cắt nối thông qua các tác động với
yếu tố ESE ở vùng trung tâm của exon 7. Serine và Arginine (SR)- giàu protein có thể ảnh
hưởng đến sự cắt nối. Ở SMN2, uridine (U) được phiên mả từ Thymine (T) tại exon 7 ở vị trí
thứ 6 bị loại bỏ do sự gắn kết với hnRNPA1(heterogeneous nuclear ribonuclear protein)- yếu
tố cắt nối thụ động nên SF2/ ASF không còn nhận ra được nữa. Sự gắn kết với hnRNP A1 sẽ
ức chế U2 snRNP gắn kết, kết quả là có gần 90% bản phiên mã thiếu exon 7 và 10% bản
phiên mã được xem là hoàn chỉnh.(Lunn và ctv, 2008).

6


Theo nhiều nghiên cứu gần đây, bản phiên mã thiếu hụt exon 7 không ổn định,
điều này giải thích tại sao SMN2 không thể bù đắp cho sự thiếu hụt gen SMN1. Các
bản sao của gen SMN2 ảnh hưởng lên tính nghiêm trọng của SMA. SMN1 và SMN2
là các gen cần thiết để tạo ra một loại protein cần thiết cho sự sống còn của các tế bào
vận động ở sừng trước tủy sống gọi là survival motor neuron (SMN) protein. Các tế
bào này chịu trách nhiệm điều khiển sự vận động của cơ. Gen SMN2 sản xuất ra một
số protein nhưng chỉ một số protein có kích thước và chức năng thật sự. Hầu hết các
protein cần thiết đều do gen SMN1 sản xuất. SMN1 đột biến dẫn đến sự thiếu hụt

protein SMN cần thiết cho sự hoạt động của các noron dây thần kinh vận động. Nếu
không có SMN protein, các nơron thần kinh vận động sẽ chết và xung động thần kinh
sẽ không được truyền từ não đến cơ. Hậu quả là một số cơ sẽ mất khả năng hoạt động
bình thường, trở nên yếu đi và mất dần khả năng hoạt động (Tsirikos, 2006; Chan và
ctv, 2004; Monani và ctv, 2005).

Hình 2.4 Tổ chức gen SMN1 và SMN2. Kiểu gen SMN1 và SMN2 thường không ảnh
hưởng đến kiểu hình của các bệnh nhân SMA type III và IV. Sự tăng số lượng gen SMN2 do
hoán chuyển gen (gen conversation) làm tăng số lượng SMN protein hoàn chỉnh, tình trạng
bệnh nhẹ hơn. (Wirth và ctv, 2006).

7


SMN protein có khối lượng 38kDa gồm 294 aminoacid (Ogino và ctv, 2004)
trong khi đó bản phiên mã SMN2Δ7chỉ mã hóa SMN protein gồm 284 aminoacid.
Trong tế bào, SMN protein đóng vai trò quan trọng đối với mRNA trong việc tạo ra
các protein. mRNA mới hình thành phải trải qua một vài quá trình để trở thành phân tử
protein hoàn chỉnh. SMN protein giúp cho quá trình lắp ráp tổ chức tế bào của premRNA để trở thành phân tử mRNA hoàn chỉnh vì SMN protein cấu tạo một phần nên
snRNPs- yếu tố tham gia vào quá trình splicing. SMN protein có thể thêm các chức
năng cho các tế bào thần kinh. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng SMN protein có vai trò
quan trọng trong việc phát triển của sợi nhánh và trục thần kinh. Sợi nhánh và trục
thần kinh đóng vai trò truyền xung động thần kinh từ sợi thần kinh đến sợi thần kinh
và từ sợi thần kinh đến các cơ (Gabanella và ctv, 2005).
Đột biến gen SMN1 và gen SMN2 trên cả hai nhiễm sắc thể chưa được báo cáo.
Theo Ogino và ctv (2004), mức độ SMN protein phụ thuộc vào số lượng bản sao gen
SMN2 ở các bệnh nhân và SMN2 được nhận định là gen quyết định đến sự
tiến triển của SMA.
Bên cạnh dạng bệnh do gen lặn nằm trên NST thường của SMA, các dạng bệnh
khác đã được mô tả bao gồm dạng bệnh gen trội trên NST thường, dạng SMA liên kết

với NST X, SMA ngoại biên và SMA liên quan đến chứng khó thở (Tsirikos, 2006).
2.1.6. Chẩn đoán SMA
Việc chẩn đoán SMA cơ bản dựa trên các đặc điểm bệnh học đặc trưng, lịch sử
gia đình cũng hỗ trợ cho chẩn đoán. Nghiên cứu chẩn đoán bao gồm sinh thiết cơ, điện
cơ đồ và các phương pháp chẩn đoán bằng sinh học phân tử.
Sinh thiết cơ thường kỹ thuật tạo vết thương hở cần thiết để lấy được mẫu cơ . Ở
những trẻ vừa sinh, có triệu chứng xơ hóa cơ và không có sự thay đổi đặc trưng nào ở
đường kính các sợi cơ. Ở người trưởng thành, có hiện tượng thoái hóa và hoại tử trong
các bó cơ nở to bất thường.
Điện cơ đồ có thể được dùng để hỗ trợ cho việc chẩn đoán SMA. Tốc độ dẫn
điện trong hệ thống vận động giảm ở trẻ em bị ảnh hưởng nặng và tăng lên ít ở trẻ em
với mức độ nhẹ hơn. Sự run cơ có thể hiện diện trên biểu đồ điện tim.
Ngày nay việc chẩn đoán di truyền bệnh SMA bằng kỹ thuật sinh học phân tử
bao gồm PCR, PCR kết hợp với RFLP, DHPLC, Real-time PCR. Đặc biệt, Real-time
PCR là phương pháp nhanh, nhạy, tiết kiệm được nhiều thời gian, chi phí và được ứng
8


dụng nhiều nhất hiện nay. Về nội dung cụ thể của phương pháp sẽ được đề cập trong
phần vật liệu và phương pháp nghiên cứu.
2.1.7. Chữa trị bệnh teo cơ tủy sống
Để chữa trị căn bệnh teo cơ tủy sống, các phương pháp điều trị được phát triển
dựa trên cách thức thay đổi các bản sao của gen SMN2 để trở thành các bản sao có
kích thước và chức năng thực thụ bổ sung cho những bản sao thiếu hụt của gen SMN1
do đột biến. Do đó các tế bào thần kinh vận động sừng trước tủy sống sẽ thoát khỏi
tình trạng thoái hóa và các cơ sẽ hoạt động bình thường. Sự xác định gen SMN1,
SMN2 và protein của chúng gây bệnh SMA là kết quả của những nghiên cứu về gen trị
liệu. Khi bệnh nhân SMA thiếu SMN1 nhưng vẫn duy trì được gen SMN2, sẽ sản xuất
được một số protein SMN thì phương pháp trị liệu có khả năng nhất là tăng điều hòa
sự biểu hiện của gen SMN2. Các hợp chất đã được kiểm chứng để tăng sự biểu hiện

của gen SMN2 bao gồm acid valproic, sodium butyrat, phenyl butyrat, aclarubicin,
amino glycoside, tobramycin và amikacin đã có những kết quả invitro đáng kể. Acid
valproic đã được kiểm tra ở bệnh nhân SMA và đã chỉ rõ được sự gia tăng sản xuất
SMN trong nguyên bào sợi (Sumner, 2006).
2.2. Phản ứng Real-time PCR
2.2.1. Đại cương về PCR
PCR là viết tắt của phản ứng chuỗi dây chuyền (Polymerase chain Reaction) là
phương pháp khuếch đại DNA in vitro được giới thiệu bởi Kary Mullis vào năm 1985.
Nguyên tắc của PCR khá đơn giản nhưng kết quả của nó được đánh giá rất cao. Quá
trình phản ứng đơn giản hơn nhiều khi enzyme Taq polymerase được chọn vào năm
1988 và đưa đến khả năng thực hiện PCR tự động. Từ đó, một số ứng dụng trên nền
tảng PCR đã được phát triển khơi nguồn cho cuộc cách mạng hóa trong các chẩn đoán
phân tử tiến bộ và mang tính linh hoạt cao (Kubista và ctv, 2006).
2.2.1.1. Nguyên tắc PCR
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ bản của
sao chép DNA trong cơ thể như: đoạn DNA cần nhân mở xoắn thành hai mạch đơn,
cần có các cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược), cần nguyên liệu, điều kiện môi trường
thích hợp và enzym DNA polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng
hợp mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của mồi chuyên biệt (mồi). Mồi là một
đoạn oligonucleotide, có kích thước khoảng vài chục nucleotide, có khả năng bắt cặp
9


bổ sung với một đầu của mạch khuôn, các mồi này gồm một mồi xuôi (đoạn forward)
và một mồi ngược. DNA polymerase sẽ nối dài đoạn mồi để hình thành mạch mới
(Phạm Hùng Vân, 2009).
Tuy nhiên kỹ thuật PCR có khác là dùng nhiệt độ cao (94oC) tháo xoắn thay cho
helicase kết hợp với enzym DNA polymerase chịu nhiệt và hệ thống điều nhiệt cho
từng giai đoạn phản ứng tổng hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chủ động. Nhờ
kỹ thuật PCR mà với một lượng nhỏ DNA ban đầu chúng ta có thể thu được đủ lượng

DNA cần thiết để tiến hành các thí nghiệm về DNA.
2.2.1.2. Thành phần PCR
Thông thường PCR được thực hiện ở thể tích từ 10- 100 μl. Deoxynucleoside
triphotphates (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ở nồng độ 200 μM mỗi loại, 10 đến 100
pmol mỗi mồi, lượng muối phù hợp, đệm và DNA polymerase.
2.2.1.3. Các chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR
™

DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật

chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế
bào. Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1 microgam xuống còn
100 ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa, việc giảm lượng
mẫu ban đầu còn hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm phụ
không mong muốn. Một ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch
đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân huỷ từng phần như trong
các vết máu để lâu ngày, hoá thạch, tóc, móng tay của người đã chết.
™

Enzyme chịu nhiệt
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I. Vì đây là

enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp (phải thêm enzyme
mới vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân huỷ, nhiệt độ
lai thấp khiến sự khuếch đại kí sinh rất cao,…). Phương pháp PCR chuyển sang một
bước ngoặc mới cùng với sự phát hiện một DNA polymerase chịu nhiệt được tách
chiết từ một vi khuẩn suối nước nóng, Thermus aquaticus, enzyme này- Taq
polymerase- không bị phá huỷ ở nhiệt độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến
cuối quá trình phản ứng.

10


Ngày nay, nhiều polymerase đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng
chuyên biệt hay hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus
thermophilus có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã ngược khi có mặt
RNA khuôn và ion Mn2+ nhưng với sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg2+, Tth
polymerase lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA. Enzyme này cho phép khuếch đại
bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
™

Mồi
Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, có vai trò kéo dài

mạch của DNA polymerase. Do vậy việc thiết kế mồi phải được tiến hành thật chính
xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt của phản ứng PCR:
- Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi
và mồi ngược, và cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa
các phần khác nhau của một mồi.
- Nhiệt độ gắn mồi (Tm) của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành
phần nucleotide của các mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
- Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các
trình tự lặp lại trên gen.
- Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu
trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
- Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng phải được tính toán tối ưu bằng thực nghiệm. Nếu
nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại ký sinh, ngược lại sẽ làm hiệu
quả khuếch đại của phản ứng không cao.Giới hạn nồng độ mồi thường từ 10pmol cho
đến 50pmol cho một thể tích phản ứng (Pattyn và ctv, 2002; Neuvians và ctv, 2005).

™

Các thành phần khác của phản ứng PCR

- Dung dịch đệm PCR: dung dịch này có tác dụng cung cấp những ion cần thiết cho
phản ứng xảy ra. Tùy theo nguồn DNA polymerase mà nồng độ và pH của dung dịch
đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu sẽ thay đổi sao cho phù hợp. Thông thường, một
phản ứng PCR sẽ có dung dịch đệm điển hình là: 50mM KCl, 10mM Tris – HCl, pH
8.3 ở nhiệt độ phòng.
- MgCl2: có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động. Ngoài ra,
mồi, DNA bản mẫu, dNTPs, EDTA cũng có thể liên kết với MgCl2 và do đó sẽ cạnh

11


tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl2 cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại
ký sinh
- Các deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP): gồm bốn loại dATP, dTTP, dGTP,
dCTP là nguyên liệu tham gia tạo nên mạch DNA mới. Nồng độ của mỗi loại nu trong
mỗi phản ứng với nồng độ MgCl2 1.5 mM là 200- 250 mM. Nếu nồng độ dNTPs cao
sẽ làm giảm hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR, và sự mất cân bằng nồng độ giữa
các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.
- Các chất tăng cường: Trong phản ứng PCR, ngoài những thành phần cơ bản đôi khi
người ta còn bổ sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng PCR xảy ra hiệu
quả hơn, nhưng nếu dùng với liều lượng không thích hợp,các chất này sẽ có tác dụng
ngược lại, ảnh hưởng không tốt đến phản ứng đến PCR. Các chất tăng cường thường
là: betain, DMSO (dimethylsulfoxide), glycerol,…
2.2.1.4. Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, một phản ứng PCR thường không kéo dài hơn 40 chu kỳ vì phải
diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân

tỉ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên
nhân sau:
- Sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
- Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
- Các bản sao vừa được tổng hợp không được kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau.
2.2.1.5. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
- Thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi
nhiệt độ thật nhanh và chính xác.
- Mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần được tiến hành trên cùng một loại thiết bị.
- Ống phản ứng của cùng một nghiên cứu phải thuộc một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt
của các này cũng như độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tạo nhiệt của thiết bị có ảnh
hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại.
2.2.1.6. Các ưu điểm và hạn chế của kỹ thuật PCR
™

Ưu điểm

- Thời gian thực hiện nhanh: chỉ cần 3 giờ để khuếch đại một trình tự DNA được quan
tâm.

12


- Đơn giản và ít tốn kém: được thực hiện trong ống nghiệm có thể tích vào khoảng từ
10ml đến 50ml các thành phần phản ứng dựa vào các chu kỳ nhiệt.
- PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô.
™

Hạn chế

- Kích thước của trình tự cần khuếch đại: phương pháp PCR không hoạt động được với
những đoạn DNA lớn hơn 3kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dưới 1.5kb cho
kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác
định qua thực nghiệm.
- Sự ngoại nhiễm: nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của
những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng mở nắp các ống nghiệm
sau mỗi lần khuếch đại trong một khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ
khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ lửng trong
không khí và bám vào tường, cửa, thiết bị, dụng cụ… rồi nhiễm vào các phản ứng tiến
hành sau đó (Phạm Hùng Vân, 2009). Có thể khắc phục vấn đề này bằng một số biện
pháp sau:
- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân tích các sản
phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng vào các thao tác
khác. Đầu típ sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu
micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.
- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trước.
- Tất cả mọi thành phần của phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ, tính toán
sao cho đủ 1, 2 lần thao tác.
- Ngoài ra, các hãng sản xuất còn tung ra thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ
hoàn toàn sự ngoại nhiễm. Ví dụ hãng Perkin-Elmer-Cetus đề xuất việc sử dụng dUTP
thay vì dTTP; việc thay thế này không ảnh hưởng đến phản ứng. Trước mỗi lần phản
ứng kế tiếp, người ta cho thêm vào dung dịch phản ứng uracyglycosylase; enzyme này
sẽ phân hủy tất cả các DNA có mang dUTP nhiễm từ lần trước. Đồng thời, enzyme sẽ
bị phân hủy bởi nhiệt ngay từ lần biến tính đầu tiên. Bất lợi của các hệ thống này là giá
thành cao.
- Các sai sót gây ra do Taq polymerase: sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai
khá cao (10-4, nghĩa là cứ 1000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Ta không
13

thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt như đảm bảo sự cân bằng
nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm khuếch
đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức…
2.2.1.7. Quá trình phản ứng PCR:
Mỗi chu kỳ phản ứng PCR nhân bản DNA có 3 bước chính như mô tả ở hình sau:

Hình 2.4 Các bước của một phản ứng PCR. ().
Bước 1: Giai đoạn biến tính (denaturation). Trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn Tm của phân tử, thường ở 94-95oC trong vòng 30 giây- 1 phút, mạch DNA
đích được tách thành 2 mạch đơn.
Bước 2: Giai đoạn lai (hybridization). Nhiệt độ được hạ thấp đến khoảng 5565oC cho phép các mồi bắt cặp với khuôn: hai đoạn mồi sẽ liên kết với hai sợi đơn
DNA. Đoạn mồi xuôi gắn với đầu 5’ của mạch một. Đoạn mồi ngược gắn vào đầu 5’
của mạch hai. Quá trình tổng hợp cả hai đoạn đều theo hướng 5’-3’.
Bước 3: Giai đoạn kéo dài (elongation). Nhiệt độ tăng lên đến 72oC giúp cho
DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt tốt nhất. Thời gian tùy thuộc
vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút.
Sau chu kỳ cuối cùng đề hoàn tất phản ứng PCR thường có thêm một giai đoạn nữa là
giai đoạn bù (soaking), nhiệt độ được giữ ở 72oC trong vòng vài phút. Đây là giai đoạn
mà một số bản sao vì một lý do nào đó trong các giai đoạn sao chép của phản ứng
chưa đạt đến chiều dài đồng bộ so với các bản sao khác, sẽ tiếp tục kéo dài để hoàn tất

14