XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN SỐNG Lactobacillus PROBIOTIC TRONG CÁC SẢN PHẨM BỔ SUNG VI KHUẨN PROBIOTIC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*************

HUỲNH QUẾ TRANG

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN SỐNG Lactobacillus
PROBIOTIC TRONG CÁC SẢN PHẨM BỔ SUNG
VI KHUẨN PROBIOTIC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BẢO QUẢN CHẾ BIẾN NÔNG SẢN VÀ VI SINH THỰC PHẨM

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
*************

HUỲNH QUẾ TRANG

XÁC ĐỊNH SỐ LƯỢNG VI KHUẨN SỐNG Lactobacillus
PROBIOTIC TRONG CÁC SẢN PHẨM BỔ SUNG
VI KHUẨN PROBIOTIC

Ngành: Bảo Quản Chế Biến Nông Sản và Vi Sinh Thực Phẩm

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Người hướng dẫn: TS. VŨ THỊ LÂM AN
ThS. HOÀNG HOÀI PHƯƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 8/2010
i


LỜI CẢM ƠN
Thành kính khắc ghi công ơn sinh thành và dạy dỗ của cha mẹ để cho con được
khôn lớn thành người, những người thân đã chăm sóc và động viên con trong suốt thời
gian qua.
Chân thành ghi nhớ công ơn dạy dỗ của các thầy cô trường đại học Nông Lâm,
đặc biệt là thầy cô khoa Công Nghệ Thực Phẩm, đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ và tạo điều
kiện thuận lợi cho em học tập trong suốt thời gian học tập tại giảng đường đại học.
Xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến cô Vũ Thị Lâm An, giảng viên khoa Công Nghệ
Thực Phẩm - Trường đại học Nông Lâm, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Xin gửi lời cám ơn tới chị Hoàng Hoài Phương cùng các anh, chị tại Viện Vệ
Sinh Y Tế Công Cộng Thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện
cho em thực hiện đề tài.
Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè, những người luôn bên tôi
cùng tôi chia sẻ suốt quãng đời sinh viên, các bạn đã động viên giúp đỡ tôi rất nhiều
trong thời gian làm khóa luận tốt nghiệp.
Kính chúc mọi người sức khỏe và thành công. Tôi xin chân thành cảm ơn!
Thành phố Hồ Chí Minh ngày 6 tháng 8 năm 2010
Huỳnh Quế Trang

ii

TÓM TẮT
Probiotic là một dạng thực phẩm chức năng có bổ sung các vi sinh vật có lợi đã
được biết đến và sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới từ nhiều năm qua. Đa số vi khuẩn
probiotic có trong sản phẩm là các loài khác nhau thuộc giống Lactobacillus và
Bifidobacterium. Một vi khuẩn được sử dụng như vi khuẩn probiotic phải mang lại lợi
ích sức khỏe cho cơ thể vật chủ, không gây bệnh và còn sống khi qua đường tiêu hóa
vật chủ. Để có được những lợi ích cho sức khỏe, sản phẩm probiotic phải đảm bảo đủ
lượng vi khuẩn cho đến thời hạn sử dụng cuối của sản phẩm và số lượng tối thiểu là 106
CFU/g sản phẩm. Nhằm đánh giá chất lượng của một sản phẩm probiotic trên thị
trường, cụ thể là số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus probiotic và so sánh với thông
tin trên sản phẩm chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát số lượng vi khuẩn sống
Lactobacillus probiotic trong các sản phẩm bổ sung vi khuẩn probiotic”.
Đề tài được thực hiện tại Viện Vệ Sinh Y Tế Công Cộng Thành phố Hồ Chí
Minh - 159 Hưng phú, Phường 8, Quận 8, Thành phố Hồ Chí Minh – từ 19/4/2010 đến
30/07/2010. Chúng tôi tiến hành khảo sát 40 mẫu sản phẩm bổ sung vi khuẩn probiotic
khác nhau được thu mua tại thành phố Hồ Chí Minh nhằm xác định số lượng vi khuẩn
sống Lactobacillus probiotic trong các sản phẩm bổ sung vi khuẩn probiotic theo TCVN
5522:1991 và TCVN 7849:2008.
Sau khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi đã xác định 21/40 mẫu có số vi khuẩn
sống Lactobacillus probiotic nhiều hơn 106 CFU/g sản phẩm (52,5%), trong tổng số 31
mẫu có công bố lượng vi khuẩn sống Lactobacillus probiotic trên bao bì có 8 mẫu đạt
lượng vi khuẩn đã công bố (25,8%).

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... ii 

TÓM TẮT .................................................................................................................... iii 
MỤC LỤC .................................................................................................................... iv 
CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................................... vii 
DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... viii 
Trang .............................................................................................................................. viii 
DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... ix 
Chương 1 ........................................................................................................................1 
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1 
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................1 
1.2. Mục đích...................................................................................................................2 
1.3. Ý nghĩa đề tài ...........................................................................................................2 
Chương 2 ........................................................................................................................3 
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..............................................................................................3 
2.1. Khái quát về probiotic ............................................................................................3 
2.1.1.  Khái niệm ..........................................................................................................3 
2.1.2.  Sản phẩm có bổ sung vi khuẩn probiotic .......................................................3 
2.1.3.  Vai trò của probiotic ........................................................................................4 
2.1.3.1. 

Đối với sức khỏe đường ruột .......................................................................4 

2.1.3.2. 

Đối với dinh dưỡng và hoạt tính sinh học ..................................................4 

2.1.3.3. 

Đối với hệ thống miễn dịch ..........................................................................4 

2.1.3.4. 

Bất dung nạp lactose ....................................................................................5 

2.1.3.5. 

Dị ứng.............................................................................................................5 

2.1.3.6. 

Ung thư ..........................................................................................................5 

2.1.4.  Các giống vi khuẩn sử dụng trong sản phẩm probiotic ...............................6 
2.1.4.1. 

Yêu cầu đối với vi khuẩn probiotic .............................................................6 

2.1.4.2. 

Tính an toàn của vi khuẩn probiotic...........................................................7 

2.1.4.3. 

Các vi khuẩn probiotic được sử dụng phổ biến .........................................8 
iv


2.1.5.  Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sống sót của vi khuẩn
probiotic trong sữa và biện pháp cải thiện..................................................................8 
2.1.5.1. 

Tác động qua lại giữa các vi khuẩn ............................................................8 

2.1.5.2. 

Ảnh hưởng của acid ....................................................................................10 

2.1.5.3. 

Ảnh hưởng của oxy .....................................................................................10 

2.1.5.4. 

Ảnh hưởng của nhiệt độ .............................................................................11 

2.2. Tình hình sử dụng sản phẩm probiotic ...............................................................11 
2.3. Tổng quan về Lactobacillus ..................................................................................12 
2.3.1.  Đặc tính của Lactobacillus spp. .....................................................................12 
2.3.2.  Đặc điểm phân loại.........................................................................................13 
2.3.3.  Đặc tính Lactobacillus acidophilus................................................................14 
2.3.4.  Đặc tính Lactobacillus casei...........................................................................16 
2.4. Môi trường phân lập Lactobacillus spp., Lb. acidophilus, Lb. casei ................16 
2.4.1.  Lactobacillus spp. ...........................................................................................16 
2.4.2.  Lactobacillus acidophilus ...............................................................................18 
2.4.3.  Lactobacillus casei ..........................................................................................18 
2.5. Phương pháp sinh học phân tử để định danh Lb. acidophilus và Lb. casei .....19 
2.6. Các nghiên cứu về xác định số lượng vi khuẩn sống probiotic trong các sản
phẩm probiotic .............................................................................................................19 
Chương 3 ......................................................................................................................22 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................22 
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................22 

3.2. Vật liệu nghiên cứu ...............................................................................................22 
3.2.1.  Vật liệu ............................................................................................................22 
3.2.2.  Dụng cụ và thiết bị .........................................................................................22 
3.2.2.1. 

Dụng cụ ........................................................................................................22 

3.2.2.2. 

Thiết bị .........................................................................................................23 

3.2.3.  Hóa chất và môi trường .................................................................................23 
3.2.3.1. 

Hóa chất .......................................................................................................23 

3.2.3.2. 

Môi trường ..................................................................................................23 

3.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................25 
v


3.3.1.  Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn Lactobacillus spp. theo TCVN
5522:1991 ......................................................................................................................25 
3.3.2.  Phương pháp xác định số vi khuẩn Lb. acidophilus giả định theo TCVN
7849:2008 ......................................................................................................................26 
3.3.3.  Xác định Lb. acidophilus và Lb. casei ...........................................................28 
Chương 4 ......................................................................................................................41 

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................................41 
4.1. Định lượng Lactobacillus spp. theo TCVN 5522:1991 .......................................41 
4.1.1.  Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc Lactobacillus spp. ...........................41 
4.1.2.  Thử catalase và nhuộm Gram ......................................................................30 
4.1.3.  Kết quả định lượng vi khuẩn Lactobacillus spp. (Phụ lục 3) .....................31 
4.2. Định lượng Lb. acidophilus giả định theo TCVN 7849:2008.............................32 
4.2.1.  Kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc và đặc tính của Lb. acidophilus ....32 
4.2.2.  Thử catalase và nhuộm Gram ......................................................................33 
4.2.3.  Kết quả định lượng Lb. acidophilus (Phụ lục 3) ..........................................34 
4.3. Xác định Lb. acidophilus và Lb. casei ..................................................................35 
4.4. Kết quả chung .......................................................................................................36 
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................................................38 
5.1. Kết luận ..................................................................................................................38 
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................38 
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................40 
PHỤ LỤC .....................................................................................................................47 

vi


CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B.

Bifidobacterium

BS

Bác sĩ

CFU

Colony Forming Units

ctv

Cộng tác viên

DGGE

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

DNA

Deoxyribonucleic acid

FAO

Food and Agriculture Organization

ISAPP

International Scientific Association for Probiotic and Prebiotic

ISO

International Standard Organization

Lb.

Lactobacillus

MRS

de Man, Rogosa and Sharpe

rRNA

Ribosom Ribonucleic acid

S.

Streptococcus

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TS

Tiến sĩ

WHO

World Health Organization

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 2.1: Vi khuẩn probiotic trong GRAS .....................................................................7 
Bảng 2.2: Tác động qua lại giữa các vi khuẩn probiotic ................................................9 
Bảng 2.3: Chất có hoạt tính kháng khuẩn do Lactobacillus spp. sinh ra......................13 
Bảng 2.4: % G+C của những loài thuộc phức hợp Lb. acidophilus .............................14 
Bảng 2.5: Một số khác biệt sinh hóa của Lb. acidophilus với các vi khuẩn khác trong
giống Lactobacillus .......................................................................................................15 
Bảng 2.6: Môi trường phân biệt Lactobacillus và các vi khuẩn lên men lactic khác ...17 
Bảng 2.7: Các nghiên cứu đánh giá sản phẩm probiotic thương mại ...........................20 
Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ..........................................................23 
Bảng 3.2: Khả năng lên men 4 loại đường dùng thí nghiệm của Lb. casei, Lb.
acidophilus và Lb. bulgaricus .......................................................................................28 
Bảng 4.1: Kết quả định lượng Lactobacillus spp. theo TCVN 5522:1991 ..................31 
 

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Các nghiên cứu về lợi ích của vi khuẩn probiotic ..................................................... 6 
Hình 3.1: Sơ đồ xác định tổng số Lactobacillus spp. theo TCVN 5522:1991 ........................ 26 
Hình 3.2: Sơ đồ xác định số lượng Lb. acidophilus theo TCVN 7849:2008 .......................... 27 
Hình 4.1: Khuẩn lạc Lactobacillus spp. trên thạch MRS ........................................................ 41 
Hình 4.2: Khuẩn lạc Lactobacillus spp. điển hình trên MRS khi quan sát dưới kính hiển ở vật
kính 4×: hình sao (trái), hình thấu kính (phải).......................................................................... 30 
Hình 4.3: Khuẩn lạc Lactobacillus spp. điển hình trên MRS khi quan sát dưới kính hiển ở vật
kính 4× (trái) và 10× (phải) ...................................................................................................... 30 
Hình 4.4: Hình dạng Lactobacillus spp. phân lập được........................................................... 31 
Hình 4.5: Khuẩn lạc Lb. acidophilus trên môi trường MRS: trên đĩa thạch (trái) và quan sát
dưới kính hiển vi vật kính 4× (phải) ......................................................................................... 32 

Hình 4.6: Lb. acidophilus trên ống nghiêng MRS ................................................................... 33 
Hình 4.7: Hình dạng Lb. acidophilus phân lập được ............................................................... 34 
Hình 4.8: Kết quả phản ứng lên men đường của Lb. bulgaricus (từ trái sang: ống đối chứng,
salicin, cellobiose, mannitol, sorbitol) ...................................................................................... 35 
Hình 4.9: Kết quả phản ứng lên men đường của Lb. casei (từ trái sang: ống đối chứng,
salicin, cellobiose, mannitol, sorbitol) ...................................................................................... 35 
Hình 4.10: Kết quả phản ứng lên men đường của Lb. acidophilus (từ trái sang: ống đối
chứng, salicin, cellobiose, mannitol, sorbitol) .......................................................................... 36 

ix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thực phẩm - nguồn dinh dưỡng cho con người là một vấn đề vô cùng quan
trọng và luôn được quan tâm. Thế nhưng trong một thời gian dài, y học hiện đại chỉ
quan tâm tới giá trị dinh dưỡng mà quên lãng vai trò y học của thực phẩm. Gần đây,
với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, các nhà khoa học không chỉ phát hiện, trích ly và
thử nghiệm các hoạt chất sinh học mà còn khám phá các tác dụng sinh học của thực
phẩm đối với các quá trình bệnh lý. Từ đó khái niệm thực phẩm chức năng dần được
hình thành. Probiotic - một trong số các loại thực phẩm chức năng được biết đến - với
những lợi ích mà mình mang lại đã và đang được tin tưởng và sử dụng rộng rãi trên
toàn thế giới.
Để sản phẩm probiotic có những tác dụng mong muốn thì cần phải phải đảm
bảo số lượng tế bào còn sống sót trong sản phẩm suốt thời gian tồn trữ cho đến khi tiêu
thụ. Số vi khuẩn trong sản phẩm cần phải lớn hơn nhu cầu của người sử dụng để bù lại
số vi khuẩn mất đi khi di chuyển trong đường ruột và dạ dày.
Tuy chưa có quy định cụ thể về số lượng vi khuẩn probiotic và số lượng này có
thể khác nhau tùy loài, nhưng khuyến cáo các sản phẩm probiotic phải có lượng tối

thiểu là 106 CFU/g hoặc ml sản phẩm (Kailasapathy và Rybka, 1997). Như vậy, có thể
nói chất lượng của một sản phẩm probiotic thể hiện ở số lượng vi khuẩn probiotic còn
hoạt động có trong sản phẩm.
Hiện nay trên thị trường Việt Nam có khá nhiều sản phẩm công bố chứa vi
khuẩn probiotic, chủ yếu là Lactobacillus spp và Bifidobacterium spp. Trong đó các
loài Lactobacillus được sử dụng nhiều nhất là Lactobacillus acidophilus và
Lactobacillus casei. Các sản phẩm này đều công bố một số lượng lớn vi khuẩn
probiotic trong sản phẩm. Tuy nhiên, câu hỏi đặt ra là số lượng vi khuẩn probiotic
trong sản phẩm thực tế có đúng như công bố trên bao bì sản phẩm hay không?
1


Nhằm đánh giá số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus probiotic bán tại thị
trường Thành phố Hồ Chí Minh, chúng tôi thực hiện đề tài “Khảo sát số lượng vi
khuẩn sống Lactobacillus probiotic trong các sản phẩm bổ sung vi khuẩn probiotic”.
1.2. Mục đích
Xác định số lượng vi khuẩn sống Lactobacillus probiotic trong các sản phẩm bổ
sung vi khuẩn probiotic trên thị trường thành phố Hồ Chí Minh và so sánh với số
lượng công bố trên bao bì.
1.3. Ý nghĩa đề tài
Xác định số lượng vi khuẩn Lactobacillus probiotic trong các sản phẩm
probiotic để cung cấp thông tin cho người tiêu dùng.
Việc xác định một số sản phẩm có số lượng vi khuẩn probiotic thấp, không phù
hợp với công bố trên bao bì là một cảnh báo cho cơ quan chức năng có thẩm quyền
quan tâm đến việc kiểm tra số lượng vi khuẩn probiotic.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về probiotic
2.1.1. Khái niệm
Probiotic có thể được định nghĩa là những vi khuẩn sống mang lại những lợi ích
sức khỏe cho cơ thể vật chủ chủ yếu bằng cách duy trì và/hoặc cải thiện cân bằng hệ vi
khuẩn trong đường ruột (Fuller, 1989; Salminen, 2001)
2.1.2. Sản phẩm có bổ sung vi khuẩn probiotic
Vi khuẩn probiotic được bổ sung vào các món ăn phổ biến như sữa và các sản
phẩm từ sữa như sữa đặc, bánh ngọt, kem, yoghurt, phomai… Ngoài ra, trên thị trường
còn có các dạng chế phẩm probiotic như thuốc viên, multivitamin bổ sung probiotic,
thực phẩm ăn kiêng, ngũ cốc...
 Tiêu chuẩn đối với sản phẩm probiotic:
Các sản phẩm probiotic phải có đủ số lượng vi khuẩn để đảm bảo các hiệu quả
đã công bố. Ở nhiều quốc gia trên thế giới, với các sản phẩm sữa lên men là phải có
Lb. acidophilus (107 CFU/g) và Bifidobacterium (106 CFU/g) (Talwalkar và
Kailasapathy, 2003). Ở Nhật, Hiệp hội sữa lên men và các sản phẩm nước giải khát kết
hợp vi khuẩn lactic (Fermented Milk and Lactic Acid Beverages Association) yêu cầu
sản phẩm sữa lên men phải có ít nhất 107 CFU/ml Bifidobacterium, trong probiotic
yoghurt đòi hỏi có ít nhất 106 CFU/ml vi khuẩn probiotic hoạt động (Hattingh và
Viljoen, 2001).
Các nước vẫn chưa có quy định cụ thể về số lượng probiotic yêu cầu, chỉ có
một số nguyên tắc khống chế số lượng vi khuẩn probiotic được sử dụng như logo
“Live and Active Culture” - của NYA (The National Yoghurt Association) Mỹ yêu
cầu sản phẩm có 108 CFU/g vi khuẩn lactic trong thời gian sản xuất (Hattingh và
Viljoen, 2001).

3


Nhìn chung, để mang lại những hiệu quả đối với sức khỏe, sản phẩm probiotic

cần có số lượng vi khuẩn probiotic là 106 CFU/g sản phẩm cho đến ngày hết hạn sử
dụng (Kailasapathy và Rybka, 1997).
2.1.3. Vai trò của probiotic
Các vi khuẩn probiotic nếu còn sống sau khi qua hệ tiêu hóa vật chủ sẽ hoạt
động và mang đến nhiều lợi ích cho sức khỏe của vật chủ đó. Những lợi ích này đã
được nghiên cứu từ nhiều năm chủ yếu bao gồm ngăn ngừa hay điều trị chứng tiêu
chảy, cải thiện cân bằng vi sinh vật đường ruột nhờ hoạt tính kháng khuẩn, hỗ trợ tiêu
hóa đường lactose đối với những bệnh nhân bị chứng bất dung nạp đường lactose,
ngăn ngừa dị ứng thực phẩm, tăng cường hệ thống miễn dịch, chống ung thư (Isolauri,
2001; Andersson và ctv, 2001), chống oxy hóa và sơ vữa động mạch (Kullisaar và ctv,
2002).
2.1.3.1. Đối với sức khỏe đường ruột
Theo một số nghiên cứu cho thấy một số vi khuẩn như Lb. rhamnosus GG, Lb.
casei, B. bifidum và Streptcoccus thermophilus có tác dụng điều trị chứng tiêu chảy do
dùng nhiều kháng sinh, tiêu chảy ở người du lịch và tiêu chảy do rotavirus ở trẻ em
(Johnston và ctv, 2006; Hickson và ctv, 2007; Beausoleil và ctv, 2007; Guarino và ctv,
2008). Vi khuẩn probiotic có vai trò quan trọng trong hệ thống tiêu hóa, hiệu quả trong
điều trị chứng viêm ruột (Saiggioro, 2004).
2.1.3.2. Đối với dinh dưỡng và hoạt tính sinh học
Các sản phẩm lên men với vi khuẩn probiotic có sự gia tăng hàm lượng acid
folic trong sữa chua, bifidus milk và kefir. Tăng niacin và riboflavin trong sữa chua,
vitamin B12 và B6 trong phomai (Shahani và Chandan, 1979). Những acid béo chuỗi
ngắn như acid lactic, acid propionic và acid butyric do vi khuẩn lên men lactic sinh ra
có thể giúp duy trì pH thích hợp, bảo vệ cơ thể trước các tác nhân gây bệnh trong
màng nhầy ruột kết (Kneifel, 2000).
2.1.3.3. Đối với hệ thống miễn dịch
Vi khuẩn probiotic góp phần cải thiện hệ thống miễn dịch của cơ thể, tăng
cường đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu, có thể do sự hoạt hóa đại thực
bào, gia tăng cytokine và/hoặc tăng cường hoạt động của immunoglobulins, tăng hàm
lượng globulin (Forchielli và Walker, 2005; Anukam và ctv, 2008)

4


2.1.3.4. Bất dung nạp lactose
Khi sử dụng các loài vi khuẩn probiotic thích hợp như S. thermophilus, Lb.
bulgaricus và vài loài Lactobacilus khác trong các sản phẩm sữa lên men có thể làm
giảm triệu chứng bất dung nạp lactose bằng cách cung cấp enzyme lactase từ vi khuẩn
vào đường ruột và dạ dày (da Cruz và ctv, 2007; The Dairy Council, 2009).
2.1.3.5. Dị ứng
Vi khuẩn probiotic có hiệu quả trong chống dị ứng bằng cách cải thiện chức
năng rào cản của màng nhầy. Thêm vào đó, việc sử dụng probiotic ở trẻ em có thể
giúp phát triển hệ thống miễn dịch. Lactobacillus GG có thể làm giảm vài triệu chứng
dị ứng thực phẩm (Isolauri, 2001).
2.1.3.6. Ung thư
Nhiều nghiên cứu đã cho thấy vi khuẩn probiotic có thể làm giảm nguy cơ ung
thư ruột kết và ung thư bàng quang. Ngoài ra có tác dụng khử chất độc gây ung thư có
trong cơ thể và làm chậm sự phát triển của các khối u bướu (Brady và ctv, 2000;
Wollowski và ctv, 2001), giảm sự nguy hiểm của ung thư gan (Nezami và ctv, 2006)
Ngoài ra, probiotic có tác dụng làm giảm nồng độ cholesterol trong huyết thanh
(Nguyen và ctv, 2007), ngăn chặn, điều trị các bệnh hô hấp như bệnh cúm hay viêm
phổi ở trẻ em (Reid, 2008).
Các nghiên cứu trên thế giới về lợi ích của vi khuẩn probiotic được thể hiện
trong Hình 2.1

5


Ngăn chặn bệnh
truyền nhiễm ở
người du lịch

Góp phần làm
giảm chứng
loãng xương

Kích thích sự sản
sinh interferon
gamma
Kích thích đại thực
bào, tế bào bạch
huyết, globulin miễn
dịch

Sự sản xuất
kháng sinh
Điều trị bệnh
Tác động cạnh
tiêu chảy liên
tranh
quan đến kháng
sinh

Điều chỉnh
mất cân bằng
vi khuẩn
đường ruột
Kích thích hệ
thống miễn
dịch

Gia tăng acid
lactic L(+)

Thiết lập hàng
rào kháng lại các
vi sinh vật không
mong muốn

Hiệu quả
cạnh tranh
chống vi sinh
vật gây bệnh

Bám dính
màng nhầy
PROBIOTIC

Sản xuất kháng
thể đặc hiệu
Cải thiện hấp
thu canxi

Chống virut

Hiệu quả
dinh dưỡng
Cải thiện hệ
tiêu hóa

Chống ung thư

Làm giảm thiểu
một số enzyme
trong phân

Hiệu quả
điều trị bệnh

Cung cấp
vitamin hòa tan
trong nước

Góp phần làm
giảm chứng
loãng xương

Bù đắp sự thiếu
hụt βgalactosidase

Tác động đến
từng bộ phận
hay toàn bộ cơ
thể

Ngăn chặn các
sản phẩm gây
thối rữa

Ngăn chặn thừa
cholesterol
trong máu

Điều trị nhiễm
trùng đường
niệu sinh dục

Hình 2.1: Các nghiên cứu về lợi ích của vi khuẩn probiotic (Kneifel và ctv, 2000)
2.1.4. Các giống vi khuẩn sử dụng trong sản phẩm probiotic
2.1.4.1. Yêu cầu đối với vi khuẩn probiotic
Một vi khuẩn được sử dụng như là vi khuẩn probiotic cần phải đảm bảo được
các yêu cầu sau:
Các vi khuẩn này phải cư trú bình thường trong đường ruột con người, duy trì
khả năng sống sót và hoạt động chuyển hóa trong ruột non, tồn tại qua được ống tiêu
hóa với số lượng lớn, có khả năng lấp đầy hệ sinh thái ruột và có những tác động tích
cực trong ruột và mang lại lợi ích cho cơ thể vật chủ.

6


Để tồn tại được trong hệ tiêu hóa, vi khuẩn probiotic cần có sức đề kháng đối
với muối mật trong ruột non, điều kiện của dạ dày (pH 1 - 4), các enzyme trong đường
ruột (lysozyme) và những độc tố chuyển hóa được sinh ra trong quá trình tiêu hóa
(Gilliland, 1989; Hyun và Shin, 1998; Sandholm và ctv, 2002; Da Cruz và ctv, 2007).
Ngoài ra những chủng probiotic còn được đánh giá tốt khi chúng phát triển tốt
và nhân lên với số lượng lớn trong sản phẩm lên men (Hattingh và Viljoen, 2001).
2.1.4.2. Tính an toàn của vi khuẩn probiotic
Theo Marteau (2002), về mặt lý thuyết, probiotic gây ra 4 tác động: sự tiêm
nhiễm cơ thể, hoạt động chuyển hóa có hại, sự kích thích miễn dịch quá mức ở các cá
thể nhạy cảm và sự chuyển gen (trích dẫn bởi WHO và FAO, 2002).
Tuy nhiên khả năng gây bệnh của Lactobacillus và Bifidobacterium khá thấp
(Sanders M.E, 2007) việc bổ sung Lactobacillus và Bifidobacterium vào thực phẩm từ

trước đến nay được nhìn nhận là an toàn. Các nghiên cứu trên thế giới ở nhiều loại
thực phẩm khác nhau đã chứng minh vi khuẩn này sống hội sinh với hệ vi sinh vật của
động vật có vú và xác minh tính an toàn của chúng (WHO và FAO, 2002). Nhiều vi
khuẩn probiotic nằm trong danh sách GRAS (Generally Reconignized as Safe - được
công nhận là an toàn) (WHO và FAO, 2002; Sanders , 2007; Mathur và Singh., 2005).
Bảng 2.1: Vi khuẩn probiotic trong GRAS
Streptococcus

S. thermophilus
S. lactis
S. lactis subsp. diacetylactis

Lactobacillus

Lb. acidophilus
Lb. bulgaricus
Lb. lactis

3 loài Leuconostoc
(Sanders , 2007)

7


Thông tin về việc sử dụng probiotic vẫn được yêu cầu phải thể hiện trên nhãn
sản phẩm với các nội dung sau:
 Tên giống, loài và chủng sử dụng.
 Số lượng tối thiểu của mỗi giống vi khuẩn probiotic ở cuối thời gian bảo quản.
 Liều lượng đề nghị để mang lại hiệu quả sử dụng (tùy thuộc vào nhu cầu cho
sức khỏe).

 Những lợi ích mang lại cho sức khỏe.
 Điều kiện bảo quản thích hợp.
 Thông tin liên lạc với công ty cho các thắc mắc của khách hàng.

(WHO và FAO, 2002)
2.1.4.3. Các vi khuẩn probiotic được sử dụng phổ biến
Lactobacilli: Lb. acidophilus, Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. rhamnosus, Lb.
johnsonii, Lb. reuteri, Lb. bulgaricus, Lb. salivarius, Lb. fermentum, Lb. plantarum,
Lb. crispatus, Lb. gasseri
Bifidobacteria: B. animalis, B. breve, B. infantis, B. longum, B. adolescentis, B.
lactis, B. bifidum.
Vi khuẩn lactic khác: Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis,
Lactococcus lactis.
Streptococcus thermophilus, S. salivarious.
Vi khuẩn không thuộc nhóm vi khuẩn lên men lactic: Bacillius subtilis,
Clostridium butyricum, Propionibacterium freudenreichii.
Nấm men: Saccharomyces boulardii, Saccharomyces cerevisiae
(Sanders và Klaenhammer, 2001; Heyman và Ménard, 2002)
2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phát triển và sống sót của vi khuẩn
probiotic trong sữa và biện pháp cải thiện
2.1.5.1. Tác động qua lại giữa các vi khuẩn
Khi sản xuất sữa lên men, có sự kết hợp sử dụng vi khuẩn sữa chua truyền
thống (Lb. bulgaricus và S. thermophilus) với probiotic để tạo hiệu quả công nghệ,
dinh dưỡng và lợi ích sức khỏe. Tuy nhiên, giữa hai nhóm vi khuẩn này có tương tác
lẫn nhau, các tương tác này có thể có lợi hoặc không thậm chí tạo ra những biến đổi

8


không mong muốn trong sản phẩm trong quá trình sản xuất và bảo quản (Bellengier và

ctv, 1997).
Cơ chế tác động của vi khuẩn lactic với các vi khuẩn khác phức tạp và vẫn chưa
được hiểu hết. Nhìn chung, các vi khuẩn tác động đến nhau theo 4 kiểu: kích thích, cản
trở, ức chế hoàn toàn và không có tác động (Vinderola và ctv, 2002).
Vi khuẩn lactic sẽ tạo ra môi trường bất lợi cho các loài khác qua việc sản sinh
acid lactic và các acid hữu cơ khác, H2O2, cạnh tranh dinh dưỡng, gây ra những biến
đổi điện thế oxi hóa khử, tạo kháng sinh (Dave và Shah, 1997; Kullisaar và ctv, 2002;
Oliveira và ctv, 2008).
Tác động qua lại giữa một số vi khuẩn probiotic được trình bày trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Tác động qua lại giữa các vi khuẩn probiotic
Lb. bulgaricus- S. thermophilus, Lactococcus lactis
Quan hệ bất lợi

Lb. bulgaricus- Lb. acidophilus
Lb. acidophilus- Lb. casei, Bifidobacterium
S. thermophilus, Lactococcus lactis - vi khuẩn probiotic
Lactococci- Streptococci

Không ảnh hưởng
nhau

Lactococcus lactis - Lactobacillus
Lb. bulgaricus- Lb. casei, Bifidobacterium
(Nguồn: Vinderola và ctv, 2002)

Tuy nhiên, theo một số tác giả khác, Lb. bulgaricus hoạt động sản sinh một
lượng lớn acid gây hại đối với Bifidobacterium, Lb. acidophilus sống cộng sinh tốt với
Bifidobacterium khi hai loài được bổ sung với tỷ lệ phù hợp (Kneifel và ctv, 1993).
Để khắc phục những ảnh hưởng bất lợi giữa các vi khuẩn, cần lựa chọn kỹ
lưỡng các loài. Đối với sản phẩm sữa lên men, biện pháp hiệu quả là cho lên men hai

lần. Giai đoạn lên men đầu với vi khuẩn probiotic diễn ra trong 2 giờ, sau đó lên men
nhờ vi khuẩn sữa chua truyền thống. Điều này cho phép vi khuẩn probiotic ở giai đoạn
cuối của phase lag (phase tiềm sinh) hoặc giai đoạn đầu của phase log (phase cấp số),
từ đó có thể phát triển ưu thế trong quần thể vi sinh vật và phát triển với số lượng lớn.
Đồng thời, giai đoạn lên men đầu với S. thermophilus, lượng oxy trong sữa giảm đáng
9


kể do S. thermophilus có khả năng sử dụng oxy cao, đóng vai trò đuổi thải oxy trong
sản phẩm tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn probiotic (Shankar và
Davies, 1976).
2.1.5.2. Ảnh hưởng của acid
Mỗi vi khuẩn có khả năng sống sót hoặc phát triển tối ưu trong một giới hạn
nhất định của acid.
Các nghiên cứu cho thấy, Lb. acidophilus có khả năng chống chịu acid tốt hơn
so với Bifidobacterium spp, Lb. bulgaricus và S. thermophilus (Hood và Zottola, 1988;
Shah, 2000).
Đối với các sản phẩm sữa lên men, vấn đề cần quan tâm là sự acid hóa quá mức
do Lb. bulgaricus gây ra, làm giảm đáng kể lượng vi khuẩn probiotic trong sữa (Shah
và ctv, 1995; Hattingh và Viljoen, 2001). Sự acid hóa quá mức có thể được ngăn chặn
bằng cách kiểm soát pH (pH > 5) (Varnam và Sutherland, 1994; trích dẫn bởi Hattingh
và Viljoen, 2001), làm giảm nhiệt độ bảo quản xuống đưới 3-4 oC và bổ sung whey
protein cô đặc (Kailasapathy và Rybka, 1995; trích dẫn bởi Hattingh và Viljoen,
2001). Áp dụng “sốc nhiệt” (58 oC trong 5 phút) đối với sữa chua (Marshall, 1992)
trước khi bổ sung vi khuẩn probiotic.
Nhiều vi khuẩn Lactobacillus spp. mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe, tuy
nhiên do không chịu được acid và mật trong hệ tiêu hóa nên không phát huy được hiệu
quả đối với sức khỏe vật chủ (Dave và Shah, 1997; Kneifel và ctv, 2000).
Một biện pháp hiệu quả để bảo vệ vi khuẩn chống lại acid hay mật từ hệ tiêu
hóa là bọc vi khuẩn trong nang. Phương pháp này tạo thành rào cản giúp bảo vệ vi

khuẩn chống lại các tác động bên ngoài, làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn
(Maragkoudakis và ctv, 2006).
2.1.5.3. Ảnh hưởng của oxy
Đặc tính sinh thái của các chủng vi khuẩn probiotic là kị khí hoặc vi hiếu khí,
do đó oxy sẽ gây độc và làm chết các chủng này dẫn đến hậu quả là mất đi đặc tính
chức năng của sản phẩm. Vi khuẩn probiotic không sinh catalase - enzyme cần thiết để
phá hủy hydro peroxyd dẫn đến sự tích tụ của các độc tố trong quá trình chuyển hóa
như anion peroxide (O2-), OH-, H2O2 và gây chết vi khuẩn (da Cruz và ctv, 2007).

10


Điều này có thể khắc phục bằng cách dùng chất chống oxy hóa như vitamin C
(Dave và Shah, 1997) hay dùng cystein làm giảm điện thế oxy hóa khử, đồng thời
cung cấp năng lượng cho vi khuẩn probiotic (Hattingh và Viljoen, 2001) hoặc dùng
bao bì thủy tinh hay plastic không thấm khí để hạn chế sự xâm nhập của oxy vào sản
phẩm trong bảo quản (Dave và Shah, 1997; da Cruz và ctv, 2007).
2.1.5.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ xử lý sữa: chế độ xử lý nhiệt thích hợp loại bỏ oxy hòa tan, việc loại
bỏ oxy phân tử và phóng thích amino acid chứa lưu huỳnh làm giảm điện thế oxy hóa
khử từ đó làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn probiotic trong sữa. Đồng thời, xử
lý nhiệt cũng làm giảm lượng vi khuẩn có hại, tăng giá trị dinh dưỡng cho sữa.
Nhiệt độ ủ: nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của probiotic là 37 oC (Kneifel và ctv,
1993), khi nhiệt độ lên đến 45 oC thì Lb. bulgaricus sẽ phát triển vượt trội, sản sinh
một lượng lớn acid, H2O2, kháng sinh, gây hại đối với vi khuẩn probiotic (Shah, 1995).
Nếu lên men sữa ở 37 oC sẽ tạo hiệu quả hợp tác giữa Lb. bulgaricus và vi kuẩn
probiotic hơn là hiệu quả cạnh tranh, casein được vi khuẩn sữa chua phân hủy thành
amino acid chuỗi dài, sau đó tiếp tục được cắt thành các amino acid chuỗi ngắn, amino
acid tự do bởi Lb. acidophilus và S. thermophilus.
Nhiệt độ bảo quản: nhiệt độ khả năng chịu đựng nhiệt độ bảo quản thấp của Lb.

acidophilus tốt hơn Bifidobacterium spp. và S. thermophilus (Hughes và Hoover, 1995,
Kailasapathy và Rybka, 1995). Theo nghiên cứu của Mortazavian và ctv (2006), bảo
quản sữa chua ở 2 oC là tối ưu cho khả năng sống sót của Lb. acidophilus, trong khi
đối với Bifidobacterium là 8 oC.
2.2. Tình hình sử dụng sản phẩm probiotic
Ở Nhật, sữa chua chứa Bifidobacterium chiếm hơn 1/3 tổng sản phẩm sữa chua.
Còn ở Pháp, số sản phẩm chứa Bifidobacterium và Lb. acidophilus tăng đến 300% và
chiếm 4% tống sản phẩm sữa trên thị trường, gần đây 11% sản phẩm sữa chua Pháp
chứa Bifidobacterium. Tại Đức, với sản phẩm Biogarde - một trong những sản phẩm
chứa Bifidobacterium đầu tiên - bán ra trên 400 triệu sản phẩm trong năm 1976 và
được sản xuất bởi 45 công ty sữa. Tại Đan mạch sản phẩm probiotic với tên gọi là
Cultura được giới thiệu là thực phẩm hoàn toàn an toàn và dễ tiêu hóa. Các sản phẩm
này cũng được sản xuất ở Canada, Ý, Phần Lan, Anh, Brazil. Tại Mỹ và Úc, sản phẩm
11


bifidus được giới thiệu những năm gần đây (Hughes và ctv, 1991; trích dẫn bởi Shah,
2000)
Tại Việt Nam, sản phẩm probiotic đã được ưa chuộng và sử dụng rộng rãi trong
những năm gần đây. Các dạng sản phẩm phổ biến trên thị trường bao gồm các loại
cốm vi sinh, thuốc viên, sữa chua... được sản xuất trong nước, chuyển giao công nghệ
sản xuất từ nước ngoài, nhập khẩu nguyên liệu hay nhập khẩu sản phẩm từ nước ngoài.
2.3. Tổng quan về Lactobacillus
2.3.1. Đặc tính của Lactobacillus spp. (Batt, 2000)
Lactobacillus là giống vi khuẩn được sử dụng chủ yếu trong các sản phẩm
probiotic. Dựa vào % G+C, Lactobacillus spp. được xác định có trên 25 loài riêng biệt,
% G+C của Lactobacillus spp. vào khoảng 32-53%, rộng hơn nhiều so với các vi
khuẩn lactic khác.
Lactobacillus spp. là trực khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di
động, kích thước từ 0,5 - 1,2 × 1 - 10 µm tùy loài. Tuy nhiên ở một số điều kiện tăng

trưởng, Lactobacillus spp. có thể có dạng hình cầu.
Lactobacillus spp. sống kị khí tùy ý, thường tăng trưởng kém khi có không khí
nhưng đôi lúc được kích thích tăng trưởng khi có 5% CO2, là vi khuẩn rất khó nuôi
cấy, chúng chỉ sinh trưởng tốt trong các môi trường dinh dưỡng phức tạp. Đặc tính này
của Lactobacillus spp. được khai thác để khảo sát chức năng của vitamin hay các chất
dinh dưỡng vi sinh vật khác.
Lactobacillus spp. có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 5-53oC.
Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu 30 oC - 40 oC, pH 5,5 - 6,2 (da Cruz và ctv, 2007), ngừng
phát triển ở pH dưới 4 (Shah, 2000).
Việc sản sinh chất có hoạt tính kháng khuẩn của Lactobacillus spp. đã được
quan tâm nghiên cứu trong nhiều năm. Các chất có hoạt tính kháng khuẩn do
Lactobacillus spp. tạo ra có khả năng ức chế nhiều loại vi sinh vật gây hư hỏng thực
phẩm cũng như các vi khuẩn lactic khác. Bảng 2.3 trình bày các chất có hoạt tính
kháng khuẩn do Lactobacillus spp. sinh ra.

12


Bảng 2.3: Chất có hoạt tính kháng khuẩn do Lactobacillus spp. sinh ra
Chất có hoạt tính kháng khuẩn
Vi khuẩn sản xuất
Lb. acidophilus

Lactacin B
Lactacin F
Acidophilucin A
Acidocin A
Acidocin B
Acidocin JCM1132
Acidocin J1229

Lactobin A

Lb. amylovorus

Lacticins A

Lb.delbrueckii ssp. lactis

Lacticins B
Gassericin A

Lb. gasseri

Reutericin 6

Lb. reuteri

Fermenticin

Lb. fermentum

Lactocin LP27

Lb. helveticus

Helveticin J
Brevicin 37

Lb. brevis

Lactobrevin
lactobacillin
Caseicin 80

Lb. casei

Plantaricin A

Lb. plantarum

Plantacin B
Lactolin
Sakacin A

Lb. sake

Lactocin S
Bulgarin

Lb. bulgaricus
(Barefoot và Netteles, 1993; Klaenhammer và Russell,2000)

2.3.2. Đặc điểm phân loại
Có thể phân loại Lactobacillus spp. theo nhiều cách khác nhau: dạng tương
đồng DNA-DNA, các đặc tính sinh trưởng như nhiệt độ, pH, nồng độ muối, hay dựa
13


vào thành phần sản phẩm cuối để xác định kiểu lên men carbohydrate (đồng hình, dị
hình), sự thủy giải arginine, peptidoglycan hoặc khả năng sinh khí từ các nguồn carbon

(glucose và gluconate) (Batt, 2000).
2.3.3. Đặc tính Lactobacillus acidophilus (Klaenhammer và Russell, 2000)
Lb. acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân trẻ em, sau
đó tiếp tục được phân lập từ đường ruột người, động vật, từ phân trẻ được uống sữa và
người lớn với khẩu phần ăn có nhiều sữa, lactose hay dextrin. Là vi khuẩn vi hiếu khí,
có khả năng sống hiếu khí nếu môi trường giữ yên tĩnh, tuy nhiên Lb. acidophilus sẽ
phát triển tốt nhất trong điều kiện kị khí.
Lb. acidophilus là trực khuẩn Gram dương, kích thước khoảng 0,5 - 1,0 × 2 - 10
µm, hai đầu tròn, xếp thành cặp hoặc chuỗi ngắn. Năm 1980, được phân vào phức hệ
Lb. acidophilus. Phức hệ này gồm 6 loài vi khuẩn lên men đồng hình: Lb. acidophilus,
Lb. crispatus, Lb. amylovorus, Lb. gallinarum, Lb. gasseri, Lb. johnsonii. Trong đó
Lb. acidophilus được xem là loài vi khuẩn probiotic quan trọng nhất, mang lại nhiều
lợi ích cho sức khỏe trong hệ vi khuẩn dạ dày ruột.
Bảng 2.4: % G+C của những loài thuộc phức hợp Lb. acidophilus
Loài

%G+C

Lb. acidophilus

34-37

Lb. crispatus

35-38

Lb. amylovorus

40-41

Lb. gallinarum

36-37

Lb. gasseri

33-35

Lb. johnsonii

33-35
(Nguồn: Klaenhammervà Russell, 2000)

Lb. acidophilus lên men đồng hình bắt buộc. Đường hexose được lên men chủ
yếu thành acid lactic theo con đường Embden-Meyerhof-Parnas (EMP). Chúng có
aldolase và thiếu phosphoketolase. Không lên men gluconate và pentose, sinh cả hai
đồng phân D và L - acid lactic. Nhu cầu dinh dưỡng phức tạp sử dụng amino acid tự
do, peptide, vitamin, nucleotid và yêu cầu lượng oxy thấp.
14


Bảng 2.5: Một số khác biệt sinh hóa của Lb. acidophilus với các vi khuẩn khác
trong giống Lactobacillus
Loài
Lb.
Đặc điểm

acidophilus

Lb. casei

Lb.

Lb.

Lb.

plantarum

gasseri

johnsonii

Amygdalin

+

+

+

+

+

Cellobiose

+

+

+

+

+

Fructose

+

+

+

Glucose

+

+

+

+

+

Glycogen

+

-

-

-

-

Galactose

+

+

+

+

+

Lactose

+

+

-/v

v

v

Maltose

+

-

+

v

+

Mannitol

-

+

+

-

-

Mannose

+

+

+

+

+

Melibiose

v

-

+

v

v

Raffinose

-

-

-/+

v

v

Rhamnose

-

-

-

-

-

Salicin

+

+

+

+

+

Sucrose

+

-

+

+

+

Trehalose

v

+

+

v

v

Xylose

-

-

-

-

-

(BioMéux, Pháp; Klaenhammer và Russell, 2000)
Ghi chú: + : > 90% chủng dương tính; - : > 90% chủng âm tính; v: bất định; /: sau 24/48 giờ ủ

Lb. acidophilus cũng có thể sản xuất nhiều loại hợp chất kháng khuẩn khác
nhau như acid lactic (> 85%), hydro peroxide và nhiều loại kháng sinh khác nhau.

15