Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm tt

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
HỌC VIỆN QUÂN Y

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. Nguyễn Lĩnh Toàn
2. PGS.TS. Hồ Anh Sơn

Phản biện 1:

PGS. TS. Vũ Văn Khiên

Phản biện 2:

PGS. TS. Nguyễn Văn Ba

Phản biện 3:

PGS. TS. Nguyễn Thanh Thúy

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường
họp tại Học viện Quân y
Vào hồi:

giờ

ngày

tháng

Có thể tìm hiểu luận án tại:

1. Thư viện Quốc Gia
2. Thư viện Học viện Quân y

năm 2019


1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) là quá trình
bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên bởi sự tăng bất thường
các tế bào có khả năng xâm lấn hay lan rộng vào các bộ phận khác
của cơ thể. Là quá trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu
quả từ sự tích lũy tăng dần của đột biến gen, đột biến ngoài gen và
bất thường trong con đường tín hiệu nội bào Wnt. Số bệnh nhân bị
CRC và số ca tử vong do CRC vẫn tăng theo thời gian. Liệu pháp sử
dụng virus ly giải tế bào u để điều trị ung thư là một phương thức
biến sự sao chép của virus thành vũ khí tiêu diệt các tế bào ung thư
và hầu như không ảnh hưởng đến các tế bào lành. Các chủng virus
vaccin sởi (MeV) và quai bị (MuV) đã được chứng minh là có hiệu
quả điều trị ung thư người. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu đánh giá
hiệu quả kháng ung thư đại tràng người của phối hợp MeV và MuV.
Do đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “nghiên cứu tác dụng kháng ung
thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực
nghiệm” với các mục tiêu sau:
Mục tiêu:
1. Đánh giá khả năng gây độc tế bào và chết tế bào theo chương
trình của phối hợp virus vaccine sởi và quai bị trên dòng tế bào ung
thư đại tràng người HT-29 in vitro.
2. Đánh giá hiệu quả kháng u của phối hợp virus vaccine sởi và
quai bị trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u dòng tế

bào ung thư đại tràng người HT-29.
Tính cấp thiết:
Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của phối hợp
virus vaccine sởi (MeV) và quai bị (MuV) cả in vitro cũng như trên
mô hình cấy ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch, làm tiền đề cho các
nghiên cứu tiếp theo đánh giá tính an toàn, cơ chế tác dụng của phối
hợp MeV và MuV kháng ung thư, tiến tới các thử nghiệm lâm sàng ở
các giai đoạn khác nhau sử dụng phối hợp 2 virus vaccine này điều trị
bệnh nhân ung thư.


2
Đóng góp mới của luận án:
Hoàn thiện quy trình nuôi cấy tế bào ung thư đại tràng người HT29 in vitro và ghép u trên đùi chuột nude.
Đánh giá tác dụng kháng ung thư đại tràng người dòng tế bào HT29 của phối hợp MeV và MuV cả in vitro cũng như trên mô hình cấy
ghép trên chuột thiếu hụt miễn dịch. Từ đó làm cơ sở cho các nghiên
cứu tiếp theo tiến tới các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư.
Bố cục luận án:
Luận án có 140 trang, bao gồm: Đặt vấn đề (2 trang), Chương 1:
Tổng quan (36 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên
cứu (28 trang), Chương 3: Kết quả (32 trang), Chương 4: Bàn luận
(37 trang), Kết luận (2 trang), Kiến nghị (1 trang).
Luận án có 142 tài liệu tham khảo (tiếng Anh: 142).
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Ung thư đại trực tràng
1.1. Tình hình ung thư đại trực tràng
Trên thế giới, nó là loại ung thư phổ biến thứ ba ở nam giới và
phổ biến thứ hai ở nữ giới, là nguyên nhân đứng thứ ba gây tử vong
liên quan đến ung thư. Trong năm 2017, ước tính có khoảng 95.520
trường hợp ung thư đại tràng và 39.910 trường hợp ung thư trực tràng

mới được chẩn đoán tại Mỹ. Tỉ lệ mắc CRC rất đa dạng về tuổi,
chủng tộc, sắc tộc và kiểu mắc. CRC đang có xu hướng trẻ hóa người
mắc (dưới 50 tuổi).
1.2. Nguyên nhân ung thư đại trực tràng
1.2.1. Đột biến gen di truyền
Bệnh đa polyp tuyến và hội chứng Gardner: là do các đột biến di
chuyền ở gen coli gây polyp tuyến (APC), một gen ức chế khối u.
Hội chứng Lynch: là do những biến đổi ở các gen hỗ trợ sửa chữa
DNA, làm cho DNA bắt cặp sai, dẫn đến phát triển ung thư.
Hội chứng Peutz-Jeghers: là do những biến đổi di truyền ở gen ức
chế khối u,


3
1.2.2. Các đột biến gen mắc phải
Đột biến gen xảy ra trong thời gian sống và không truyền qua các
thế hệ, chúng chỉ có ở các tế bào sinh ra từ tế bào gốc bị đột biến.
CRC là do đột biến gen mắc phải gây ra nhiều hơn so với các đột
biến gen di truyền.
1.3. Cơ chế bệnh sinh của ung thư đại trực tràng
1.3.1. Gen, vi môi trường và di truyền ngoại gen (epigenetic)
Đột biến gen gây ra CRC: Bộ gen CRC có khoảng 13.000 gen đột
biến, nhưng chỉ có khoảng 69 đột biến gen điều khiển được đề xuất là
các đột biến có vai trò hình thành CRC. Các đột biến gen APC kéo
theo là đột biến xảy ra ở gen KRAS hoặc TP53, hoạt hóa con đường
tín hiệu Wnt làm khởi phát polyp tiến triển thành CRC. Đột biến gen
trong con đường tín hiệu yếu tố tăng trưởng chuyển dạng beta
(TGFβ), gen thụ cảm thể TGFβ loại II, cả gen SMAD2, SMAD4,
RUNX3 và TSP1 Ít gặp hơn là đột biến các gen MSH2, MSH6,
MLH1 và PMS2 cũng có vai trò hình thành CRC.

microRNA là phân tử điều hòa di truyền ngoại gen của CRC: có
một số microRNA tăng lên trong tế bào CRC so với tế bào đại trực
tràng bình thường như: miRNA-31, miRNA-183, miRNA-17-5,
miRNA-18a, miRNA-20a và miRNA-92, nhưng miRNA-143 và
miRNA-145 lại thấp hơn đáng so với tế bào bình thường.
Các microRNA ức chế khối u và microRNA gây ung thư: miRNA135a và miRNA-135b ảnh hưởng trực tiếp gen ức chế khối u APC và
kích hoạt tín hiệu con đường Wnt tạo ra CRC. miRNA-122a là một
chất ức chế khối u làm tăng biểu hiện gen APC. miRNA-21 tăng
trong tế bào ở giai đoạn sớm CRC, miRNA-21 là chất gây ung thư.
miRNA-143 và miRNA-145 cũng là chất ức chế khối u.
1.3.2. Tăng methyl hóa DNA trong ung thư đại trực tràng
Methyl hóa DNA là phản ứng cộng thêm một nhóm methyl vào
vị trí 5' của cytosine dưới xúc tác của enzyme DNA
methyltransferase để tạo thành 5-methyl cytosine. Tăng methyl hóa


4
làm bất hoạt gen, giảm quá trình tế bào chết theo chương trình, sửa
chữa DNA và kiểm soát chu trình tế bào.
1.3.3. Giảm methyl hóa DNA trong tế bào CRC
Giảm methyl hóa DNA làm mất ổn định hệ gen, điển hình là trong
yếu tố nhân kích thước dài rải rác 1 (LINE-1) hình thành CRC.
1.3.4. Thay đổi Histone trong tế bào CRC
Thể nhân là đơn vị cơ bản của nhiễm sắc thể, bao gồm một
octamer tạo bởi bốn histone lõi (H3, H4, H2A, H2B) xung quanh có
147 cặp base của DNA phủ bên ngoài, lõi histone chủ yếu là hình cầu
ngoại trừ “các đuôi” N- tận. Có ít nhất 8 loại thay đổi histone: acetyl
hóa, methyl hóa, phosphoryl hóa, ubiquityl hóa, sumoyl hóa, hóa
ADP-ribose hóa, proline isomerise hóa và citrulline hóa. Trong đó,
acetyl hóa và methyl hóa là loại phổ biến nhất gây ra CRC.

1.4. Liệu pháp MeV và MuV điều trị CRC
1.4.1. Sinh học MeV và MuV
MeV và MuV là các virus thuộc thành viên của họ
Paramyxoviridae, có đường kính khoảng 100-300nm, với một lõi
nucleocapsid xoắn chứa sợi RNA đơn (-). Hai protein màng: protein
fusion (F) có vai trò hợp nhất màng của virus với màng tế bào đích
và huyết tán; protein hemagglutinin (H) hay hemagglutinin
neuraminidase (HN) chịu trách nhiệm việc virus xâm nhập vào tế bào.
1.4.2. MeV và MuV lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng
1.4.2.1. Tế bào CRC có các thụ cảm thể đặc hiệu với MeV và MuV
MuV chủng Urabe sử dụng các sialoglycoprotein có chứa acid
sialic trên bề mặt tế bào ung thư như là thụ cảm thể đặc hiệu. MeV
chủng Edmonston sử dụng các thụ cảm thể đặc hiệu CD46, Nectin-4
trên bề mặt tế bào CRC.
1.4.2.2. MeV, MuV ly giải tế bào CRC nhờ các enzyme protease
Các protease có nhiều trong tế bào ung thư phân cắt glycoprotein
của virus, tạo điều kiện để virus xâm nhập vào tế bào, đại diện là các
matrix metalloproteinase.


5
1.4.2.3. MeV, MuV tận dụng các khiếm khuyết gen ở tế bào CRC
Các khiếm khuyết di truyền trong tế bào ung thư làm cho các tế
bào ung thư dễ bị nhiễm virus và tạo điều kiện cho virus nhân lên tốt
hơn mà hầu như không có ở tế bào bình thường.
1.4.3. Cơ chế MeV, MuV ly giải tế bào ung thư đại trực tràng
1.4.3.1. MeV và MuV ly giải trực tiếp tế bào CRC qua hình thành hợp bào
MeV và MuV ly giải tế bào ung thư bằng cách hòa màng tế bào
nhiễm virus và tế bào bình thường lân cận tạo thành hợp bào (tế bào
khổng lồ có nhiều nhân). Một tế bào nhiễm virus có thể hợp nhất 50100 tế bào lân cận tạo thành hợp bào.

1.4.3.2. MeV, MuV ly giải tế bào CRC qua trung gian miễn dịch đặc hiệu
MeV, MuV tạo ra 2 loại tín hiệu nguy hiểm là tín hiệu nguy hiểm
nội sinh (DAMP), các tín hiệu nguy hiểm ngoại sinh (PAMP), chúng
kích hoạt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu góp phần quan trọng ly giải tế
bào u như: sản xuất IFN, các cytokine, hoạt hóa tế bào NK, đại thực
bào, tế bào DC, tế bào lympho T.
Protein Hemagglutinin neuraminidase có vai trò như sialidase,
loại bỏ axit sialic khỏi bề mặt tế bào ung thư, bộc lộ kháng nguyên
ung thư, kích hoạt miễn dịch đặc hiệu tiêu diệt tế bào ung thư.
1.5. Các nghiên cứu lâm sàng của MeV và MuV
Bảng 1.1. Các thử nghiệm lâm sàng của MeV và MuV
Chủng
virus

Cách
điều trị

Liều, thời
gian điều trị

Bệnh

N.C lâm
sàng, bệnh
nhân (n)

Kết quả lâm sàng

Năm

1/5 bệnh nhân thoái triển hoàn toàn
u tiêm, 3/5 bệnh nhân thoái triển
một phần u tiêm, 2/3 bệnh nhân này
có thoái triển một phần các u ở xa.

2005

Virus sởi (MeV)
MeVEZ

Tiêm
nội u

102–103
TCID50

MeVCEA

Tiêm
màng
bụng

103–103
TCID50 (4
tuần/lần,
6 tháng)

MeVCEA

Tiêm

nội u

U lympho
T dưới da

Giai đoạn 1
(n = 5)

14/21 bệnh nhân có đáp ứng: thời gian
Ung thư
Giai đoạn 1
sống trung bình là 1 năm; 1 bệnh nhân
buồng trứng
(n = 21)
có thời gian sống 3,2 năm.
U nguyên bào
Giai đoạn 1
đệm đa dạng

Tiến triển

2010


6
MeVNIS

Truyền
tĩnh
mạch

Đa u tủy
108–109
TCID50
(4tuần/lần,
6 tháng)

Giai đoạn 1
(n=2)

MeVNIS

Tiêm
màng
bụng

MeVNIS

Tiêm màng
bụng

MeVNIS

Tiêm
nội u

MeVNIS

Tiêm
nội u

U thần kinh Giai đoạn 1
ngoại biên
(n=30)

MeVNIS
MeVCEA

Tiêm
nội u

MeVNIS

Tiêm
nội u

U nguyên bào Giai đoạn 2
đa dạng
(n=16)
U biểu mô
Giai đoạn 1
buồng trứng,
(n=37)
màng bụng
U biểu mô Giai đoạn 1
buồng trứng
(n=54)

Ung thư
Giai đoạn 1

buồng trứng
(n=16)

Quan sát thấy MV-NIS nhân lên
chọn lọc ở khối u, thoái triển hoàn
toàn u ác di căn ở 1/2 số bệnh nhân.
Thời gian sống trung bình của bệnh
nhân là 26,5 tháng

U trung biểu
Giai đoạn 1
mô màng phổi
Ung thư biểu
Giai đoạn 1
mô tế bào vảy
(n=12)
đầu và cổ, vú

Tiêm
nội u

2014

2015

Đang thực hiện

20122018

Đang thực hiện

20132018

Đang thực hiện

20172021

Đang thực hiện

20152019

Đang thực hiện

20122018

Đang thực hiện

20142021

Giai đoạn 2
(n = 90)

79/90 bệnh nhân đáp ứng với điều
trị và 37/79 bệnh nhân có thoái biến
khối u đáng kể hay hoàn toàn.

1974

Virus quai bị (MuV)
Chủng

Urabe

Tiêm nội u,
tĩnh mạch,
khí dung

Chủng
Urabe
Chủng
Urabe
giảm độc
lực

Tiên dưới
da, màng
bụng, nội
ngực và u

1.

105–107
TCID50

Ung thư
tiến triển

108–109
PFU

Ung thư

tiến triển

Giai đoạn 2
(n=200)

26/200 bệnh nhân có thoái biến khối
u; đa số bệnh nhân có các triệu
chứng khách quan nhẹ

1978

108–109
PFU

Ung thư
phụ khoa

Giai đoạn 2
(n = 22)

5/7 bệnh nhân đã mất hoàn toàn cổ
trướng hoặc tràn dịch màng phổi;
bệnh nhân có khối u lớn không đáp
ứng. Bệnh nhân tràn dịch màng
bụng hoặc màng phổi có đáp ứng

1988

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Động vật và chất liệu nghiên cứu
Chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c. Virus vaccine
sởi chủng Edmonton và quai bị chủng Urabe. Dòng tế bào Vero và ung thư
đại tràng người HT-29.
Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum)
và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), và các hóa chất khác…
Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V Apoptosis
Detection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; các kháng thể gắn


7
chất phát huỳnh quang phát hiện các tế bào miễn dịch ở lách chuột
2.1.2. Trang thiết bị sử dụng nghiên cứu
Thước kẹp đo u, máy camera, máy đo quang (OD), kính hiển vi quang
học, tủ ấm 370 C và 5% CO2, máy ly tâm, hệ thống flow cytometry, kính
hiển vi điện tử truyền qua và các dụng cụ tiêu hao phòng thí nghiệm...
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào
Tế bào HT-29 và Vero được lấy từ nguồnbảo quản âm sâu (-800C), rã
đông thật nhanh (<1 phút). Gieo tế bào vào đĩa nuôi cấy cùng với môi
trường DMEM. Khi tế bào phát triển, tách tế bào bằng trypsin-EDTA 1X.
2.2.2. Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ MeV và MuV
2.2.2.1. Tăng sinh MeV và MuV từ nguồn virus vaccine
Nhiễm MeV và MuV vào tế bào Vero. Sau 9-10 ngày nhiễm virus thu
dung dịch chứa MeV và MuV
2.2.2.2. Chuẩn độ virus bằng nghiệm pháp TCID50
Gieo tế bào Vero vào đĩa 96 giếng nồng độ 104/200µl/giếng. Nhiễm
MeV, MuV với nồng độ hòa loãng của stock virus từ 10-2 -10-9. Sau 5 ngày
nhiễm MeV, MuV sử dụng xanh methylen làm chất hiện màu, tính TCID50.

Công thức tính TCID50
I: Tính khoảng tỉ lệ (PD):
(%CPE ở nồng độ có %CPE trên 50%) – (50%)
(% CPE ở nồng độ có %CPE>50%) – (%CPE ở nồng độ có %CPE<50%)
II: Tính (-Log) nồng độ pha loãng có %CPE trên 50% (10 -3 sẽ là 3)
TCID50/ml = 10I+II/ml
(CPE: là giếng có tế bào nhiễm virus)
2.2.3. Đánh giá MeV, MuV gây độc tế bào bằng thử nghiệm MTT
- Nhiễm MeV, MuV vào tế bào HT-29 trên đĩa 96 giếng với nồng độ hòa
loãng 10-2 -10-8. Ở ngày nhiễm virus thứ 3, 4 và 5 cho dung dịch MTT vào
các giếng, đo độ hấp thụ quang (OD) ở bước sóng 570nm và tính kết quả.
2.2.4. Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV đánh giá tỉ lệ tế bào
chết theo chương trình và tế bào hoại tử bằng phương pháp dòng chảy
Tăng sinh tế bào HT-29 và gieo vào 5 đĩa nuôi cấy 6 giếng. Nhiễm MeV,
MuV vào tế bào HT-29 trên các đĩa 6 giếng. Thu tế bào ở các thời điểm


8
ngày thứ 3, 4, và 5 để đánh giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis và hoại tử.
2.2.5. Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo
chương trình và hoại tử bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy
Tế bào được xử lý và nhuộm theo hướng dẫn kèm theo bộ kit Fluorescein
isothiocyanate, Annexin V Apoptosis Detection kit (BD). Đánh giá tỉ lệ tế bào
chết apoptosis và hoại tử trên hệ thống FACS CANTO II (BD).
2.2.6. Phương pháp nuôi chuột chuột nude
Chuột nude chủng BALB/c, được nuôi trong phòng sạch.
2.2.7. Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người
HT-29 trên dùi chuột thiếu hụt miễn dịch và tính kích thước khối u
Tạo khối u trên đùi chuột nude: Tăng sinh tế bào HT-29. Chuẩn bị chuột
thiếu hụt miễn dịch, 6-8 tuần tuổi. Tiêm tế bào HT-29, nồng độ 106 tế

bào/chuột vào dưới da đùi chuột.
Đo kích thước khối u: Đo bằng thước kép chuẩn, đo 2 chiều
Công thức tính kích thước khối u: V=D x R2 x 0,5 (mm3).
V: thể tích khối u

D: chiều dài khối u

R: chiều rộng khối u

2.2.8. Phương pháp điều trị chuột nude bằng MeV, MuV
Có 4 nhóm (10 con/nhóm): nhóm điều trị phối hợp MuV+MeV; nhóm
điều trị MuV; nhóm điều trị MeV; nhóm chứng tiêm dung dịch PBS.
Tiêm MeV, MuV nội u, liều 107 PFU/lần/con, 2 lần/tuần, 3 tuần điều trị.
2.2.9. Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị
Theo dõi tình trạng sức khỏe chuột: cân nặng, vận động, đáp ứng kích
thích, màu sắc da của chuột, phân chuột.
So sánh kích thước u theo thời gian điều trị. Thời gian sống trung bình, tỉ
lệ sống, chết ở các nhóm nghiên cứu
2.2.10. Phương pháp phẫu tích lấy mô u và lách chuột ở các nhóm
nghiên cứu sau điều trị bằng MuV, MeV
Phẫu tích lấy lách và mô u phía ngoài (2-3 mm) ở chuột sau điều trị bằng
MeV, MuV, rửa sạch, (mô u thì cho vào dung dịch cố định tế bào làm siêu
cấu trúc là glutaraldehyte 2% trong đệm cacodylate có pH=7,3)


9
2.2.11. Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch ở lách chuột nude mang khối u tế bào
HT-29 điều trị bằng MuV, MeV bằng phương pháp phân tích tế bào dòng chảy
Phân lập tế bào từ lách chuột, nhuộm trypan blue kiểm tra tỉ lệ tế bào
sống (tế bào sống >95%), xác định số lượng tế bào xét nghiệm (106 tế bào).

Nhuộm tế bào lách bằng kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang: Kháng thể kháng
CD11b- tế bào bạch cầu dòng tủy, kháng thể kháng CD49b-tế bào NK, kháng thể
kháng CD11c-tế bào DC, kháng thể kháng CD11c-tế bào DC trưởng thành.
2.2.12. Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào
Soi, đọc kết quả trên kính hiển vi điện tử truyền qua JEM 1400, JEOL, Nhật
Bản (Khoa Hình thái - Viện 69, Bộ tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh).
2.13. Phương pháp phân tích kết quả
Sử dụng phần mềm SPSS.20, GraphPad Prism, có ý nghĩa thống kê khi p<0,05.
2.

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Tăng sinh dòng tế bào tế bào HT-29, Vero, MeV và MuV
Hình 3.1. Tế bào HT-29 phát triển
(A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X;
(C) ở vật kính 40X

Hình 3.2. Tế bào Vero phát triển
(A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính
20X; (C) ở vật kính 40X

3.
4.

Hình 3.3. Tế bào Vero nhiễm MeV, MuV
(A), (B) ngày thứ 3, 4: các tế bào nhiễm
virus co tròn, bong khỏi đáy; (C) nhiễm
ngày thứ 5: tế bào nhiễm virus hòa màng
tạo hợp bào; (D), (E) nhiễm ngày thứ 6,
7: hợp bào lan rộng; (F) nhiễm ngày thứ

9: hợp bào chết tạo ra xác tế bào (chú
thích bởi các mũi tên đen)


10
3.2. Chuẩn độ MeV, MuV theo phương pháp TCID50
Hình 3.4. Kết quả nhuộm xanh
methylen chuẩn độ TCIC50
TCID50 của MeV= 5x107,5/ml
TCID50 của MeV= 5x106,4/ml

5.

Chuẩn độ TCID50 MuV Chuẩn độ TCID50 MeV

3.3. MeV và MuV ly giải trực tiếp dòng tế bào HT-29 in vitro
3.3.1. Tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Hình 3.5. Hình ảnh tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV tạo hợp bào in vitro
3.3.2. Kết quả đánh giá gây độc tế bào ung thư đại tràng người HT-29 của
MeV, MuV bằng nghiệm pháp MTT
% tế bào sống
%

T B

so n g

150

100

14.
15.

50

16.
N gày 3

0
10

-2

10

-3

M eV + M uV

10

-4

10
M eV

-5

10

-6

10

M uV

-7

10

-8

C o n tr o l

Biểu đồ 3.1. KếT quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 3


11
% tế bào sống
%

T B

so n g

150

100

50

0

1 0

-2

1 0

-3

1 0

M u V + M eV

-4

1 0

-5

1 0

M eV

-6

1 0

-7

M uV

1 0

-8

N gày

4

C o n tr o l

Biểu đồ 3.2. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 4
% tế bào sống
%

T B

so n g

1 5 0

1 0 0

5 0

0
1 0

-2

1 0

-3

M u V + M eV

1 0

-4

1 0

-5

1 0

M eV

-6

1 0

-7

1 0

-8

M uV

N gày 5

C o n tr o l

Biểu đồ 3.3. Kết quả MTT tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV ngày thứ 5
3.4. Đánh giá tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết apoptosis
và hoại tử sau nhiễm MuV, MeV in vitro
17.
Hình 3.6. Biến đổi hình thái của tế
bào HT-29 chết theo chương trình
(A) ở vật kính 20X; (B) ở vật kính
10X; (C), (D) ở vật kính 40X.

18.
19.
20.
21.
22.
% tế bào apoptosis

%

23.

A p o p to s is

20

24.

15

25.

10

1 4 ,4 ± 2 ,9 1

8 ,8 ± 1 ,1 4
6 ,1 ± 0 ,9 6

5

1 ,6 7 ± 1 ,0 2

N gày 5

0
M uV

M e V

M uV+ M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV


12
% tế bào apoptossis sớm
%

A p o p to s is s o m

2 ,1 7 ± 0 ,6 5

3
1 ,7 7 ± 0 ,4 6
2

0 ,7 7 ± 0 ,1 2
1
0 ,1 7 ± 0 ,0 6
Ngày 5

0
M uV

M e V

M uV+

M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.5. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV
% tế bào apoptosis muộn
%

A p o p t o s is m u ô n

20
1 2 ,2 3 ± 2 ,7 5
15

7 ,0 3 ± 0 ,9 3

10
5 ,3 ± 0 ,8 5
5

1 ,5 ± 0 ,9 6

N gày 5

0
MuV

MeV

MuV+ MeV

C o n tr o l

Biểu đồ 3.6. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV
% tế bào hoại tử
%

T .B

h o a i tu

50
2 3 ,3 ± 1 9 ,1
40
1 9 ,1 ± 6 ,2

30

20

1 3 ,2 ± 1 ,6
7 ,7 ± 0 ,2

10

0

N gày 5
MuV

MeV

MuV +MeV

C o n tr o l

Biểu đồ 3.7. Tỉ lệ tế bào HT-29 hoại tử ở ngày thứ 5 nhiễm MeV, MuV


13
Hình 3.7. Kết quả phân tích dòng
chảy các tế bào ung thư đại tràng
người HT-29 nhiễm MeV, MuV ở
ngày thứ 5
(I) Nhóm nhiễm MuV;
(II) Nhóm nhiễm MeV;
(III) Nhóm nhiễm MuV+MeV
(Q1) vùng tế bào apoptosis sớm;
(Q2) vùng tế bào apoptosis muộn;
(Q4) vùng tế bào hoại tử
%%
tế bào
apoptosis
A p o p to sis
15

1 2 ,3 7 ± 1 ,1 2

10

4 ,3 7 ± 0 ,4 0

4 ,8 7 ± 0 ,3 1

5
1 ,6 7 ± 1 ,0 2

N gày 4

0
MuV

MeV

MuV +MeV

C o n tr o l

Biểu đồ 3.8. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV
% tế bào apoptosis sớm
%

A p o p t o s is s o m

5
2 ,9 7 ± 0 ,9
4

3

2

1

0 ,6 ± 0 ,1

0 ,5 3 ± 0 ,2 1
0 ,1 7 ± 0 ,0 6
N gày 4

0
M uV

M e V

M uV+

M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.9. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV
% tế bào apoptosis muộn
%

A p o p t o s is m u o n

15

9 ,4 ± 0 ,3 5
10

5

3 ,7 7 ± 0 ,4 5

4 ,3 3 ± 0 ,1 5
1 ,5 ± 0 ,9 6

N gày 4

0
M uV

M e V

M uV+

M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.10. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 4 nhiễm MeV, MuV


14

% tế bào hoại tử
%

T .B

h o a i tu

30

2 0 ,3 ± 1 1 ,0
1 9 ,1 ± 6 ,1

1 9 ,1 ± 6 ,2

20
1 2 ,6 ± 1 ,1

10

N gày 4

0
M uV

M e V

M uV+ M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.11. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 4 nhiễm MuV, MeV

1.
2.
3.
4.
5.

Hình 3.8. Kết quả phân tích
dòng chảy các tế bào ung thư đại
tràng người HT-29 nhiễm MeV,
MuV ở ngày thứ 4
(I) Nhóm nhiễm MuV
(II) Nhóm nhiễm MeV
(III) Nhóm nhiễm MuV+MeV
Q1: vùng tế bào apoptosis sớm
Q2: vùng tế bào apoptosis muộn
Q4 là vùng tế bào hoại tử

% tế bào apoptosis
%

A p o p to s is

8
5 ,4 3 ± 0 ,3 2
6
3 ,2 ± 0 ,1 7

3 ,7 7 ± 0 ,2 5

4
1 ,6 7 ± 1 ,0 2
2

N gày 3

0
M uV

M e V

M uV+ M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.12. Tỉ lệ tế bào apoptosis ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV


15
% tế bào apoptosis sớm
%

A p o p t o s is s o m

1 .5

0 ,8 3 ± 0 ,3 5
1 .0
0 ,6 ± 0 ,1

0 ,5 ± 0 ,0
0 .5
0 ,1 7 ± 0 ,0 6

N gày 3

0 .0
M uV

M e V

M uV+

M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.13. Tỉ lệ tế bào apoptosis sớm ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV
% tế bào apoptosis muộn
%

A p o p t o s is m u o n

4 ,6 ± 0 ,1

5

4

3

3 ,2 7 ± 0 ,2 5
2 ,6 ± 0 ,2
1 ,5 ± 0 ,9 6

2

1

N gày 3

0
M uV

M e V

M uV+ M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.14. Tỉ lệ tế bào apoptosis muộn ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV
%
tế bào
hoạitửtử
% Tế
bào hoại

Ngày 3

Biểu đồ 3.15. Tỉ lệ tế bào hoại tử ở ngày thứ 3 nhiễm MeV, MuV

16

Hình 3.9. Kết quả phân tích dòng
chảy các tế bào HT-29 nhiễm MeV,
MuV ở ngày thứ 3
(I) Nhóm MuV
(II) Nhóm MeV
(III) Nhóm MuV+MeV
Q1 là vùng tế bào apoptosis sớm
Q2 là vùng tế bào apoptosis muộn
Q4 là vùng tế bào hoại tử.

3.5. MeV, MuV kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29
cấy ghép trên chuột nude
3.5.1. Kết quả ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29
Bảng 3.1. Kết quả tạo khối u tế bào HT-29 trên đùi chuột nude
Số ngày sau tiêm tế
bào HT-29
Các chỉ số theo dõi
Số chuột có u
Tỷ lệ có u (%)

Ngày
Ngày
thứ 1
thứ 3
(n = 40) (n=40)

Ngày
thứ 5
(n=40)

Ngày
thứ 7
(n=40)

Ngày
thứ 8
(n=40)

0

10

24

32

40

0

25

60

80

100

Hình 3.10. Kết quả ghép u tế bào HT29 dưới da đùi chuột nude
(A) ngày thứ 3 sau tiêm tế bào HT-29;
(B) ngày thứ 5 sau tiêm tế bào HT-29;
(C) ngày thứ 7 sau tiêm tế bào HT-29; (D)
ngày thứ 8 sau tiêm tế bào HT-29.


17
3.5.2. Kết quả điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng
người HT-29 bằng MeV, MuV
Bảng 3.2. Kết quả theo dõi sức khỏe chuột sau điều trị MeV và MuV
Số
TT

Mức độ đánh giá

Tiêu chí theo dõi

Bình thường
40 con
40 con
40 con
40 con

Vận động
Đáp ứng với kích thích
Phân chuột
Da chuột

1
2
3
4

Kém
0
0
0
0

Trọng lượng chuột (gam)
T r o n g lu o n g
(g a m )

34
32
30
28
26
S a u d ie u t r i

24
M eV +M u V

MeV

MuV

C o n tr o l

OV

Biểu đồ 3.16. Thay đổi trọng lượng chuột sau điều trị bằng MeV, MuV
B

A

Biểu đồ 3.17. Kết quả kích thước khối u sau điều trị bằng MeV, MuV
(A): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ nhất
(B): So sánh kích thước u ở ngày điều trị thứ 29
N gày
60
5 1 ± 2 ,9
4 2 ,4 ± 9 ,2

4 3 ,2 ± 8 ,3

40
3 0 ,6 ± 2 ,1

20

0

Các nhóm NC
S au

M e V+ M uV

M uV

M e V

c o n tro l

d ie u

tr i

O V

Biểu đồ 3.18. So sánh thời gian sống trung bình của chuột sau điều trị MeV, MuV


18
% sống sót
100
MeV+MuV
MeV
MuV
Control

80

60

40

20

00

0

Số ngày

Biểu đồ 3.19. Kết quả tỉ lệ chuột còn sống sau điều trị bằng MuV, MeV
3.5.3. Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch trong lách chuột nude mang khối
u đại tràng dòng tế bào HT-29 được điều trị bằng MuV và MeV
3.5.3.1. Phân lập tế bào từ lách chuột nude điều trị MeV, MuV

Hình 3.11. Lách và tế bào lách chuột nude ở các nhóm nghiên cứu
3.5.3.2. Kết quả tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude
+-Tế bào bạch cầu dòng tủy
% CD11b
% C D 11b
+

2 5 ,6 5

40

30

1 6 ,3

20
8 ,4

10
3 ,2 7
0

C ác nhóm N C
M e V

M uV

M e V+ M e V

C o n tro l

% CD49b+-Tế bào NK
%

C D 49b

+

25
1 2 ,9 5
20

15

9 ,3 5
5 ,6

10

5

1 ,2 3

C ác nhóm N C

0
M e V

M uV

M e V+ M e V

C o n tro l


19

% CD11c+-Tế bào DC
%

C D 11c

+

30

1 4 ,5

9 ,8 5

20
9 ,4 5

10
1 ,6

C ác nhóm N C

0
M eV

M uV

M uV+ M e V

C o n tro l

% CD11c+-CD197+-Tế bào DC trưởng thành
%

C D 11c

+

- C D 197

+

4

1 ,8

3

1 ,0 5
2

1

0 ,0 5

0 ,0
C ác nhóm N C

0
M e V

M uV

M uV+ M e V

C o n tro l

Biểu đồ 3.20. Tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở lách chuột nude sau điều trị bằng
MeV và MuV.
3.5.4. Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị bằng MeV, MuV
26.

Hình 3.12. Hình ảnh siêu cấu trúc tế

27.

bào u HT-29 bình thường Mũi tên

28.

trắng: hình ảnh cấu trúc tế bào HT-29

29.

bình thường; Mũi tên trắng đứt đoạn:
30. các vi nhung mao tế bào bào HT-29
31.

B

A

D

E

C

F

32. Hình 3. 14. Hình ảnh siêu cấu trúc tế
33. bào u HT-29 sau điều trị MeV, MuV

(A) Tế bào HT-29 bình thường; (B)
C
Tế Bào HT-29 ngưng tụ nhiễm sắc
thể; (C), (D) Tế bào HT-29 phân
mảnh nhiễm sắc thể; (E) Tế bào HT34. 29 xuất hiện nhiều không bào; (F) Tế
35. bào HT-29 hoại tử.
36.
37.


20
38.
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN
4.1. Tăng sing MeV, MuV và Chuẩn độ TCID50
Chúng tôi tiến hành nhiễm MeV, MuV vào tế bào Vero để tăng
sinh virus vaccine. Tế bào Vero dòng tế bào được sử dụng phổ biến
để tăng sinh, sản xuất các virus vaccine trong đó có virus sởi và quai
bị.
Chuẩn độ MeV và MuV bằng nghiệm pháp TCID50 có sử dụng xanh
methylen là chất hiện màu, làm cho việc đọc kết quả rễ ràng và khách
quan hơn.
4.2. MeV và MuV ly giải tế bào u HT-29 in vitro
4.2.1. MeV và MuV ly giải trực tiếp tế bào HT-29 qua tạo hợp bào
in vitro
Kết quả nghiên cứu cho thấy chủng virus vaccine MeV và MuV
gây độc tế bào HT-29 có hiệu quả rõ ràng ở thời điểm nhiễm virus 25 ngày in vitro (hình 3.5). Tế bào HT-29 nhiễm MeV, MuV hình
thành hợp bào, đây là đặc trưng về khả năng ly giải tế bào u của MeV
và MuV (hình 3.4).
4.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào HT-29 của MeV, MuV
bằng nghiệm pháp MTT

Kết quả nghiệm pháp MTT của chúng tôi cũng cho thấy khả năng
ly giải tế bào HT-29 của MeV và MuV với tỉ lệ tế bào sống ở các
nhóm nhiễm MeV+MuV, MeV thấp hơn có ý nghĩa thống kê
(p<0,05) so với nhóm chứng ở các nồng độ pha loãng của virus từ 102
đến 10-6. Nhiễm phối hợp MeV và MuV cho hiệu quả ly giải tế bào
HT-29 in vitro tốt hơn nhóm nhiễm đơn virus với tỉ lệ tế bào sống ở
nhóm nhiễm phối hợp virus giảm có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với
nhiễm đơn virus ở cả 3 thời điểm nghiên cứu (nồng độ hòa loãng
virus: 10-2, 10-4 và 10-5). Li Feng Zhang và cộng sự (2014) cũng đã
đánh giá hiệu quả kháng tế bào ung thư của phối hợp MeV và MuV
trên dòng tế bào ung thư bạch cấu cấp, kết quả phối hợp MeV và
MuV kháng tế bào ung thư tốt hơn nhiều so với dùng đơn virus ở các
thời điểm từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 6 nhiễm virus.


21
4.3. MeV, MuV ly giải tế bào HT-29 thông qua kích hoạt con
đường tế bào chết theo chương trình in vitro
4.3.1. Hình thái tế bào chết apoptosis dưới kính hiển vi quang học
Quan sát tế bào HT-29 nhiễm MeV và MuV ở ngày thứ 3, 4 và 5
(hình 3.6a và 3.6b), tế bào HT-29 chết apoptosis có hình ảnh co tròn
lại tách rởi nhau ra, nổi lên khắp vi trường, nhân của tế bào kết đặc
lại. Ở hình 3.6c và 3.6d có độ phóng đại lớn hơn, nhân tế bào kết đặc
lại nằm lệch về một góc tế bào, phân mảnh hạt nhân, có những tế bào
hoại tử thứ phát. Kerr và cộng sự (1972) đã quan sát thấy tế bào thay
đổi hình thái khi trải qua quá trình apoptosis với những thay đổi như:
tế bào co tròn, có kích thước nhỏ hơn, tế bào chất dày đặc và các bào
quan dồn đống lại. Kết đặc nhân tế bào là kết quả của sự ngưng tụ
nhiễm sắc thể và đây là tính năng đặc trưng nhất của quá trình
apoptosis. Ziegler and P. Groscurth (2004) cũng sử dụng kính hiển vi

quang học quan sát tế bào trải qua quá trình apoptosis bao gồm các
biến đổi: sự ngưng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh hạt nhân.
4.3.2. Đánh giá tỉ lệ tế bào HT-29 chết apoptosis và hoạt tử bằng
phương pháp phân tích tế bào dòng chảy
Tỉ lệ tế bào chết apoptosis, apoptosis giai đoạn sớm và muộn ở
các nhóm nhiễm virus cao hơn có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với
nhóm chứng. Tỉ lệ tế bào chết apoptosis, apoptosis giai đoạn sớm và
muộn của nhóm nhiễm kết hợp 2 virus cao hơn có ý nghĩa thống kê
(p<0,05) so với nhóm nhiễm đơn virus. Điều này cho thấy có sự cộng
hưởng về tác dụng ly giải tế bào HT-29 của 2 loại virus này.
Chúng tôi cũng đánh giá tỉ lệ tế bào chết do hoại tử ở các thời
điểm nghiên cứu, đây cũng là một trong những cơ chế ly giải tế bào
HT-29 của MeV và MuV. Tỉ lệ tế bào bị hoại tử tăng lên không đồng
nhất giữa các nhóm nhiễm virus so với nhóm chứng. Vấn đề này có
thể là do từ ngày thứ 3 trở đi, các giếng không được thay môi trường
nuôi cấy, nên có cả tế bào chết do thiếu nuôi dưỡng. Thêm nữa, quá
trình thu mẫu tế bào để phân tích ở một cơ sở thí nghiệm cách xa có
thể đã làm cho các tế bào bị vỡ do yếu tố khách quan


22
4.4. MeV, MuV kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT29 trên chuột nude
4.4.1. Đánh giá độc tính của MeV và MuV trên chuột nude
Chuột ở các nhóm nghiêm cứu sau gây u hầu như không thay đổi
trọng lượng, trọng lượng giảm nhẹ sau 2-3 tuần tiêm, (không có ý
nghĩa thống kê với p>0,05). Chúng tôi đã sử dụng liều đến 107 PFU
của MeV và MuV để điều trị chuột nude mang khối u tế bào HT-29,
liều này cao gấp 103 lần so với liều thông thường (103-4 PFU) được sử
dụng để tiêm chủng. Tuy nhiên, các chỉ số đánh giá sức khỏe của
chuột đều bình thường (bảng 3.2).

4.4.2. MeV và MuV kháng u dòng tế bào HT-29 trên chuột nude
Ở ngày thứ 8 sau tiêm tế bào HT-29, khối u xuất hiện ở tất cả
chuột nude (bảng 3.1). MeV và MuV có tác dụng làm chậm phát
triển khối u tế bào HT-29 ghép trên đùi chuột nude bắt đầu từ ngày
thứ 3 sau tiêm, kích thước u trung bình của các nhóm điều trị bằng
MeV, MuV tăng chậm hơn nhóm chứng có ý nghĩa thống kê
(p<0,05), thời gian sống trung bình ở các nhóm điều trị bằng MeV,
MuV dài hơn và số chuột còn sống nhiều hơn có nghĩa thống kê
(p<0,05) so với nhóm chứng. Kết quả cũng cho thấy kích thước u
trung bình của nhóm tiêm phối hợp MeV và Muv tăng chậm hơn các
nhóm tiêm đơn virus có ý nghĩa thống kê (p<0,05), thời gian sống
trung bình ở nhóm điều trị phối hợp MeV và MuV dài hơn và số
chuột còn sống nhiều hơn có nghĩa thống kê (p<0,05) so với nhóm
tiêm đơn virus. Bên cạch đó, việc phân chia liều lượng, với liều 107
PFU và liệu trình điều trị như vậy là cần thiết để tăng khả năng ly
giải tế bào u của virus. Tiêm virus nội u nhiều lần hiệu quả hơn so
với tiêm tổng liều duy nhất.
4.3.3. MeV, MuV kích thích tăng sinh các tế bào miễn dịch ở
chuột nude mang khối u tế bào HT-29
Tỉ lệ các tế bào bạch cầu dòng tủy, NK, DC và tế bào DC trưởng
thành ở các nhóm điều trị bằng MeV, MuV cao hơn hẳn so với nhóm
chứng. Đặc biệt, tỉ lệ các tế bào miễn dịch ở nhóm điều trị phối hợp


23
MeV và MuV cao hơn đáng kể so với nhóm điều trị đơn virus. Với
sự liên quan chặt chẽ giữa đáp ứng kháng u tế bào HT-29 và tăng tỉ lệ
các tế bào miễn dịch ở lách chuột, chúng tôi đưa ra kết luận là tế bào
miễn dịch ở lách chuột tăng cao có mối quan hệ chặt chẽ với tăng
hiệu quả ly giải tế bào ung thư ở các nhóm điều trị bằng MeV, MuV,

đặc biệt là khi phối hợp 2 virus này.
4.3.4. Kết quả phân tích siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người
HT-29 cấy ghép trên chuột nude sau điều trị bằng MeV, MuV
Kết quả cho thấy có hình ảnh siêu cấu trúc tế bào HT-29
đang trong quá trình chết apoptosis bao gồm: sự xuất hiện của hạt
nhân kết đặc lại (ngưng tụ chromatin ở ngoại vi nhân tế bào), phân
mảnh nhân và hình thành vật thể apoptosis (hình 3.13b, 3.13c,
3.13d); Tế bào co tròn lại và bề mặt trở nên nhẵn (hình 3.13b), có
mặt nhiều không bào, hình thành các tế bào bọt (hình 3.13e). Như
vậy, điều trị bằng MeV và MuV có thể tạo ra tác dụng kháng khối u
tế bào HT-29 trên chuột nude qua trung gian con đường chết tế bào
apoptosis. Kết quả này phù hợp với kết quả của nhiều tác giả như:
Yang và cộng sự (2016) cũng đã đánh giá siêu cấu trúc tế bào HT-29
chết apoptosis bằng kính hiển vi truyền qua sau điều trị bằng
quercetin, Waziri PM và cộng sự (2016) cũng đã nghiên cứu biến đổi
hình thái tế bào HT-29 trong quá trình apoptosis sau điều trị bằng
clausenidin.
KẾT LUẬN
1. Phối hợp MeV và MuV có khả năng ly giải trực tiếp và kích
hoạt con đường chết tế bào apoptosis in vitro ở dòng tế bào HT29
MeV và MuV ly giải trực tiếp tế bào HT-29 bằng tạo hợp bào. Tỉ
lệ tế bào sống ở các nhóm nhiễm virus thấp hơn so với nhóm chứng
(p<0,05). Nhóm nhiễm phối hợp virus có tỉ lệ tế bào sống thấp hơn so
với nhóm nhiễm đơn virus (p<0,05).
MeV và MuV có khả năng kháng tế bào bằng cách kích hoạt con
đường tế bào chết apoptosis, với: tỉ lệ tế bào chết apoptosis ở các