Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây gạo

BỘ Y TẾ
TRƯ
ƯỜNG ĐẠI HỌC
C DƯỢC
C HÀ NỘ
ỘI
WY ZX

KIỀU THỊ BÍCH HU
UỆ

NGH
HIÊN CỨU
C
XÂY
Y DỰN
NG PH
HƯƠN
NG
P
PHÁP
P XÁC
C ĐỊN
NH HÀ
ÀM LƯỢN
L
NG MỘT
M
SỐ
Ố CHẤ
ẤT PH

HÂN LẬP
L
ĐƯỢ
Đ ỢC TỪ
Ừ
LÁ
Á CÂY
Y GẠO
O
KHÓA LUẬN
L
TỐT
T
NG
GHIỆP DƯỢC
D
SĨ

HÀ
H NỘI - 2013


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
WY ZX

KIỀU THỊ BÍCH HUỆ

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT
SỐ CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
LÁ CÂY GẠO
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
Nơi thực hiện:
1. Trung tâm kiểm nghiệm Dược phẩm và Mỹ
phẩm Hà Nội
2. Bộ môn Hóa phân tích – Độc chất Đại
học Dược Hà Nội

HÀ NỘI - 2013


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác
định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây Gạo”, ngoài sự làm việc
nghiêm túc, sự cố gắng, nỗ lực hết mình của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự
khích lệ từ phía nhà trường, thầy cô, gia đình và bạn bè.
Trước hết, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới:
PGS.TS. Thái Nguyễn Hùng Thu
người đã dành nhiều thời gian và tâm huyết hướng dẫn nghiên cứu, tạo mọi điều

kiện thuận lợi để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Đồng thời, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS.TS. Nguyễn Thái An
– Bộ môn Dược liệu, NCS. Hồ Thị Thanh Huyền, DS. Phạm Lê Minh đã cho tôi
những đóng góp quý giá về đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên Bộ môn
Hóa phân tích – Độc chất - trường Đại học Dược Hà Nội, các cán bộ Trung tâm
Kiểm nghiệm dược phẩm và mỹ phẩm Hà Nội đã hỗ trợ tôi trong quá trình nghiên
cứu.
Xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội, đặc biệt là
những thầy cô đã trực tiếp giảng dạy tôi suốt thời gian học tập tại trường.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn gia đình, bạn bè đã động viên tôi về mọi
mặt và giúp đỡ tôi tận tình trong quá trình học tập, nghiên cứu, là động lực không
nhỏ để tôi có kết quả ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, tháng 05 năm 2013
Kiều Thị Bích Huệ


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

MỤC LỤC
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
DANH MỤC HÌNH
DANH MỤC BẢNG

ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………………

1

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN………………………………………….………......

2

1.1. TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO……………………………………………..

2

1.1.1.

Đặc điểm thực vật……………………………………….…………

2

1.1.2.

Tính vị và công năng của cây Gạo………………………………… 2

1.1.3.

Bộ phận sử dụng…………………………………………………...

1.1.4.

Thành phần hóa học……………………………………………….. 3

3

1.2. TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO…………………………………………. 4
1.2.1.

Daucosterol………………………………………………………...

4

1.2.2.

Stigmasterol………………………………………………………..

5

1.2.3.

Mangiferin……………………………………………………...….. 6

1.2.4.

Lupeol……………………………………………………………...

1.2.5.

Taraxeryl acetat……………………………………………………. 8

1.2.6.

Taraxerol…………………………………………………….…….. 9

1.2.7.

7α-hydroxysitosterol…………………………………………..…..

7

10

1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO (HPLC)……………………………………………………..... 10
1.3.1.

Nguyên tắc của HPLC……………………………………………..

10

1.3.2.

Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký………………………

11


1.3.3.

Ứng dụng của kỹ thuật HPLC…………………………………..…. 12

1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS)……………..…

14

1.4.1.

Nguyên tắc…………………………………………………………

14

1.4.2.

Máy khối phổ………………………………………………….…... 14

1.4.3.

Ứng dụng của phân tích khối phổ trong định tính các chất…….….

1.4.4.

Một số kỹ thuật LC-MS…………………………………………… 17

16

CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………….…

18

2.1. ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ……………

18

2.1.1.

Đối tượng nghiên cứu……………………………………………...

18

2.1.2.

Dụng cụ thiết bị……………………………………………………. 18

2.1.3.

Hóa chất, thuốc thử………………………………………………... 18

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU……………………………………………......

19

2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……………………………………..…… 19
2.3.1.

Chuẩn bị mẫu thử………………………………………………….. 19

2.3.2.

Chuẩn bị dung dịch đối chiếu (chuẩn)……………………...……..

20

2.3.3.

Khảo sát và tìm điều kiện sắc ký………………………………..…

21

2.3.4.

Thẩm định phương pháp phân tích………………………………..

21

2.3.5.

Phương pháp xử lý số liệu…………………………………………

23

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ………………………...……… 24
3.1. HÀM ẨM VÀ HIỆU SUẤT CHIẾT CẮN TOÀN PHẦN…………………

24

3.1.1.

Hàm ẩm của dược liệu…………………………………………......

24

3.1.2.

Hiệu suất chiết……………………………………………………... 24

3.2. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ………………………………………...

24

3.3. XÁC ĐỊNH ĐỘ TINH KHIẾT CỦA CÁC HỢP CHẤT NGHIÊN CỨU…. 27


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

3.4. ĐỊNH TÍNH CÁC HỢP CHẤT TRÊN SẮC KÝ ĐỒ……………………… 30
3.5. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT
TRONG LÁ CÂY GẠO BẰNG HPLC……………………………………

32

3.5.1.

Kiểm tra sự phù hợp của hệ thống sắc ký……………………..….

3.5.2.

Độ lặp lại…………………………………………………………... 34

3.5.3.

Khoảng nồng độ tuyến tính……………………………………….

3.5.4.

Độ đúng………………………………………………………...….. 39

3.5.5.

Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ………..…..

42

3.6. ỨNG DỤNG ĐỊNH LƯỢNG CÁC CHẤT TRONG LÁ CÂY GẠO……..

43

3.7. BÀN LUẬN…………………………………………………………....…...

43

32

34

3.7.1.

Về phương pháp xử lý mẫu………………………………………... 43

3.7.2.

Về khảo sát điều kiện sắc ký…………………………………….… 43

3.7.3.

Về kết quả định lượng các chất trong lá cây Gạo………………….

44

3.7.4.

Về thẩm định phương pháp định lượng……………………………

44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………… 46
KẾT LUẬN………………………………………………………………… 46
ĐỀ XUẤT…………………………………………………………………... 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
ESI:

ion hóa bằng phun điện từ (Electronspray ionization)

GC-MS:

Sắc ký khí ghép khối phổ (Gas chromatography–mass spectrometry)

HO-1:

Heme oxygenase – 1

HPLC:

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

HUVEC:

LC-MS:

Tế bào thuộc màng trong ống dây rốn (Human umbilical vein
endothelial cell)
Sắc ký lỏng ghép khối phổ (Liquid Chromatography – Mass
Spectrometry)

LOD:

Giới hạn phát hiện (Limit of Detection)

LOQ:

Giới hạn định lượng (Limit of Qualification)

MeCN:

Acetonitril

MeOH:

Methanol

MS:

Khối phổ (Mass

NMR:

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

PDA:

Detector PDA (Photodiode Array)

RSD:

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

S/N:

Tín hiệu/nhiễu đường nền (Signal/Noise)

SD:

Độ lệch chuẩn (Standard Deviation)

SKĐ:

Sắc ký đồ

STT:

Số thứ tự

TP:

Thành phần

tR:

Thời gian lưu

UV-VIS:

Tử ngoại khả kiến (Ultraviolet visible)

Spectrometry)


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ……………………………………….

15

Hình 1.2. Sơ đồ bộ tứ cực chập ba…………………………………………….. 16
Hình 3.1. SKĐ của hỗn hợp 7 chất nghiên cứu………………………………..

26

Hình 3.2. SKĐ của dịch chiết toàn phần lá cây Gạo…………………………..

26

Hình 3.3. SKĐ của hợp chất mangiferin phân lập được từ lá Gạo …………… 27
Hình 3.4. SKĐ của hợp chất daucosterol phân lập được từ lá Gạo…………… 28
Hình 3.5. SKĐ của hợp chất 7α-hydroxysitosterol phân lập được từ lá Gạo…. 28
Hình 3.6. SKĐ của hợp chất lupeol phân lập được từ lá Gạo…………………

28

Hình 3.7. SKĐ của hợp chất taraxeryl acetat phân lập được từ lá Gạo……..… 29
Hình 3.8. SKĐ của hợp chất stigmasterol phân lập được từ lá Gạo…………... 29
Hình 3.9. SKĐ của hợp chất taraxerol phân lập được từ lá Gạo………………

29

Hình 3.10. Phổ khối lượng ứng với pic của mangiferin trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………………...

30

Hình 3.11. Phổ khối lượng ứng với pic của daucosterol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………..……

30

Hình 3.12. Phổ khối lượng ứng với pic của 7α-hydroxysitosterol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………..…….

31

Hình 3.13. Phổ khối lượng ứng với pic của lupeol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu………………..…….

31

Hình 3.14. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxeryl acetat trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu……………………...

31


Hình 3.15. Phổ khối lượng ứng với pic của stigmasterol trên
SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu…………………..….

32

Hình 3.16. Phổ khối lượng ứng với pic của taraxerol trên

SKĐ của mẫu thử và hỗn hợp chất đối chiếu…………………..…

32

Hình 3.17. SKĐ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu)……………………….… 33


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Độ ẩm bột dược liệu…………………………………………….…..

24

Bảng 3.2. Một số thông số thể hiện sự phù hợp của hệ HPLC đã lựa chọn…… 33
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát độ lặp lại với các chất nghiên cứu…….………….

34

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của mangiferin…….… 34
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của daucosterol……… 35
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính
của 7α-hydroxysitosterol……………………………………………

36

Bảng 3.7. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của lupeol……………

36

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxeryl acetat….

37

Bảng 3.9. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của stigmasterol……... 38
Bảng 3.10. Kết quả khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của taraxerol………..

38

Bảng 3.11. Tổng hợp kết quả khảo sát độ đúng của 7 hợp chất……………….. 39
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát độ đúng với mangiferin…………………………. 39
Bảng 3.13. Kết quả khảo sát độ đúng với daucosterol…………………………

40

Bảng 3.14. Kết quả khảo sát độ đúng với 7α-hydroxysitosterol………………

40

Bảng 3.15. Kết quả khảo sát độ đúng với lupeol………………………………

40

Bảng 3.16. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxeryl acetat…………………….. 41

Bảng 3.17. Kết quả khảo sát độ đúng với stigmasterol………………………... 41
Bảng 3.18. Kết quả khảo sát độ đúng với taraxerol……………………………

41

Bảng 3.19. Kết quả khảo sát LOD và LOQ (µg/ml) ………………………….

42

Bảng 3.20. Kết quả xác định hàm lượng từng chất trong
mẫu dược liệu nghiên cứu…………………………………………

42


-1-

ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây Gạo còn được gọi là Bông gạo, Mộc miên, Gòn…vốn là loài cây đã rất
quen thuộc đối với mỗi người dân Việt Nam, đặc biệt là người dân miền Bắc. Theo
kinh nghiệm dân gian, nhiều bộ phận của cây như vỏ thân, hoa và nhựa được sử
dụng để trị các bệnh như viêm loét dạ dày, viêm loét ngoài da, thấp khớp, bó gãy
xương, kiết lỵ [6], [15], [20]. Các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành nghiên
cứu hóa thực vật cũng như thử tác dụng sinh học của lá Gạo và cho những kết quả
rất đáng ngạc nhiên về tiềm năng chữa các bệnh “thời đại” như bảo vệ gan, hạ huyết
áp, hạ đường huyết [40], [44]…
Từ lá cây Gạo ở Việt Nam, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã nghiên cứu
về phương pháp chiết xuất và đã phân lập 07 hợp chất là 7-hydroxysitosterol,
daucosterol, mangiferin, lupeol, stigmasterol, taraxerol và taraxeryl acetat.
Ngày nay, trên thế giới xu hướng trở về với thiên nhiên, tìm kiếm nguồn

thuốc mới và sử dụng thuốc từ thảo dược ngày càng tăng. Ở Việt Nam, với lợi thế
về địa hình và khí hậu đã tạo ra nguồn tài nguyên cây cỏ vô cùng phong phú cũng
như nguồn dược liệu dồi dào cùng với tri thức sử dụng cây cỏ làm thuốc từ lâu đời.
Tuy nhiên, nhiều loài cây được sử dụng rộng rãi theo kinh nghiệm dân gian mà
chưa có hoặc có rất ít nghiên cứu có giá trị khoa học. Cần có các nghiên cứu xác
định hàm lượng các hợp chất đã tìm thấy trong dược liệu để đánh giá đúng tiềm
năng của nguồn dược liệu và góp phần tiêu chuẩn hóa nguyên liệu trong quá trình
hiện đại hóa các thuốc có nguồn gốc dược liệu. Do đó, đề tài “Nghiên cứu xây
dựng phương pháp xác định hàm lượng một số chất phân lập được từ lá cây
Gạo” đã được thực hiện nhằm các mục đích sau:
1. Xây dựng được một quy trình định lượng đồng thời một số hợp chất đã
được phân lập từ lá cây Gạo bằng phương pháp HPLC.
2. Ứng dụng phương pháp xây dựng được để sơ bộ xác định hàm lượng 7hydroxysitosterol,

daucosterol,

mangiferin,

lupeol,

stigmasterol,

taraxerol và taraxeryl acetat có trong một mẫu lá cây Gạo thu hái được.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien

mien phi
phi

-2-

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1.

TỔNG QUAN VỀ CÂY GẠO

1.1.1. Đặc điểm thực vật
Tên khoa học: Bombax malabaricum DC., họ Gạo (Bombacaceae).
Tên đồng nghĩa: Bombax ceiba L., Gossampinus malabarica (DC.) Merr.,
Salmalia malabarica (DC.) Schott et Endl, Bombax heptaphylla Cavl.
Tên khác: Gòn rừng, Mộc miên thụ, Mạy mìn, Mạy nghịu (Tày).
Cây gỗ to, cao tới 15m hay hơn. Thân có gai hình chùy và có bạnh vè ở gốc.
Cành mọc ngang với những gai hình nón; cành non dày, không gai. Lá mọc so le,
kép chân vịt, gồm 5-7 lá chét, hình mác hoặc hình trứng, gốc thuôn, đầu nhọn, dài
9-15 cm, rộng 4-5 cm, hai mặt nhẵn, mép nguyên, cuống chung dài hơn phiến lá,
dài từ 20-25cm.
Cụm hoa mọc ở đầu cành thành chùm, màu đỏ, nở trước khi cây ra lá từ
tháng 1 tới tháng 3, cuống hoa ngắn, nhỏ, khỏe. Hoa to, đều, lưỡng tính. Đài dầy,
hình chuông, có 5 răng tù và ngắn màu nâu xám, bao bọc lấy nụ hoa, khi hoa nở thì
rách ra thành 3-5 mảng không đều. Tràng 5 cánh nạc, rời nhau, mặt ngoài phủ lông
nhung. Nhị rất nhiều hợp thành 5 bó hoặc 6 bó (không thành ống), ngắn hơn cánh
hoa, bó nằm trong 2 cuống cánh khác nhau. Bầu thượng 5 ô, một vòi mang 5 đầu
nhụy, bầu hình nón, có lông màu trắng nhạt. Mùa hoa tháng 2 – 3, mùa quả tháng 5
– 7 [6], [7], [11], [15], [20].
1.1.2. Tính vị và công năng của cây Gạo
- Hoa Gạo có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, tiêu viêm,

thu liễm [5].
- Vỏ thân cây Gạo có vị đắng, tính mát, có tác dụng lợi tiểu, tiêu sưng, gây
nôn [18], khu phong, trừ thấp, tiêu thũng [5]. Theo tài liệu Ấn Độ, nước sắc vỏ thân
có tác dụng làm dịu viêm, cầm máu [5].
- Rễ có vị đắng, tính mát, có tác dụng kích thích, bổ, cũng có tác dụng gây
nôn và giảm đau [19], ngoài ra còn có tác dụng thanh nhiệt, lợi thấp, thu liễm, chỉ
huyết, tán kết, chỉ thống. Ở Indonesia, nước ép rễ có tác dụng hạ sốt [5].


-3-

- Lá Gạo được dùng rất tốt cho đái dắt, phát ban, chữa thiếu máu, chữa lỵ
[21], được sử dụng để điều trị thấp khớp, viêm da, nhiễm trùng da, phát ban, sưng
hạch, kiết lỵ, tiểu tiện khó khăn, chữa rắn cắn và có tác dụng nhuận tràng. Ngoài ra
còn được dùng trong các trường hợp thiếu máu, rong kinh, huyết trắng, vô sinh [22],
[32]. Theo y học cổ truyền phía Nam Pakistan, lá B.malabaricum DC. được sử dụng
như là một thuốc trị giun sán [29].
- Hạt bông Gạo làm tăng tiết sữa ở phụ nữ sau khi sinh [19].
- Nhựa gôm chích từ thân cây Gạo được dùng chữa lậu, kiết lỵ, cầm máu,
rong kinh, kích dục [5].
1.1.3. Bộ phận sử dụng
Toàn cây được sử dụng cho các mục đích khác nhau:
- Vỏ thân thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa xuân [19] nhưng cũng có tài
liệu cho rằng tốt nhất vào mùa hè [6]. Vỏ thân mang về cạo bỏ vỏ thô bên ngoài, rửa
sạch, thái nhỏ, phơi khô sắc uống hoặc dùng tươi giã nát để đắp ngoài [15].
- Lá non làm dịu và lợi sữa.
- Rễ, hoa, nhựa cũng dùng làm thuốc chữa bệnh.
- Gỗ dùng làm phao, làm hòm gỗ.
- Sợi quả dùng làm bông, nệm, gối.
1.1.4. Thành phần hóa học

Trong cuốn “Pharmacology of Bombax Ceiba Linn” (2012), VartikaJain và
Surendra K. Verma đã tổng hợp được trong lá có tannin, carbonhydrat, flavonoid,
courmarin, steroid, triterpenoid [49]. Từ lá cũng đã có những nghiên cứu phân lập
được Shamimin và Mangiferin [23], [44].
Trong khóa luận dược sỹ của Trần Thị Điểm Anh, đã kiểm tra định tính các
chất trong vỏ thân và kết quả cho thấy thành phần có courmarin, flavonoid, alkaloid,
saponin [3]. Mặt khác, một số nhà khoa học trên thế giới đã phân lập được các chất
Lupeol, Shamimicin từ vỏ thân cây Gạo [25], [45].
Theo Võ Văn Chi, hạt Gạo chứa chất béo, tinh dầu [6].


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

-4-

Trong tài liệu “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, nhựa gôm cây Gạo
có chứa acid catechutanic [15].
Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập và xác định được cấu trúc các
thành phần hóa học của cây Gạo là: Lupeol, Friedenin, Epicatechin, Sphingerin,
Daucosterol,

Stigmasterol,

Mangiferin,

Taraxeryl

acetat,

Taraxerol,

7α-

hydroxysitosterol, Ergosterol peroxide, Aurantiamid acetat, Octadeca-9,12-dienoic.
1.2.

TỔNG QUAN VỀ LÁ CÂY GẠO
Năm 1999, Faizi S. và Ali M. đã phân lập được shamimin – một flavonol C-

glycoside mới có dạng bột màu vàng nhạt từ dịch chiết ethanol của lá B.malabarium
DC.

có

cấu

trúc

2-(2,4,5-trihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-6-C-

glucopyranosylosy-4H-1-benzopyran-4-ori) [28].
Năm 2011 và 2012, từ dịch chiết methanol của lá khô B.malabaricum DC.,
NCS. Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được 7 chất là Daucosterol,
Stigmasterol,

Mangiferin,

Lupeol,

Taraxeryl

acetat,

Taraxerol,

7α-

hydroxysitosterol.
1.2.1. Daucosterol
1.2.1.1. Nguồn gốc
Năm 2012, Hồ Thị Thanh Huyền và cộng sự đã phân lập được Daucosterol
từ vỏ thân và lá cây gạo [12].
Theo [40], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập
được 120mg Daucosterol.
Theo [53], Daucosterol còn có trong rễ, thân, lá cây Plumbago zeylanica L.
với hàm lượng trong lá lớn nhất (từ 49,6mg – 96,7mg/100g dược liệu tùy theo thời
điểm thu hoạch).
Theo [26], từ 3kg hạt khô của cây Arctium lappa L. phân lập được 30mg
Daucosterol.
Ngoài ra, Daucosterol còn được phân lập từ cây mộc ký ngũ hùng
Dendrophtoe pentandra sống ký sinh trên cây mít Artocapus integrifolia và cây na


-5-

Annona squamosa [8], thân cây Thàn mát thuỳ dày (Millettia pachyloba – họ
Leguminocae) [14].
1.2.1.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C35H60O6 (M = 576,85 g/mol).

- Tên khoa học: Stigmast-5-en-3-yl D-glucopyranoside.
- Tính chất vật lý: Chất bột vô định hình màu trắng, t°nc = 284-286°C [8],
[14], tan trong MeOH, aceton, ethyl acetat, [α]D = −44,6°C (C = 0,9, pyridin) [33].
1.2.1.3. Tác dụng và công dụng
- Theo [34], nghiên cứu in vitro trên chuột của Lee JH và cộng sự tại đại
học Dongduk Women đã đưa ra kết quả Daucosterol giúp bảo vệ tế bào chuột bởi
nấm men Candida. Daucosterol có tác dụng điều hoà miễn dịch cơ thể, thông qua
việc làm tăng hoạt tính của tế bào CD4 và Th1 tại chuột, qua đó làm giảm sinh
trưởng của tế bào nấm men Candida albicans.
1.2.2. Stigmasterol
1.2.2.1. Nguồn gốc
Stigmasterol được tìm thấy trong vỏ thân và lá cây Gạo [13], ngoài ra
Stigmasterol còn được tìm thấy trong đậu nành bằng phương pháp HPLC [35].
Theo [41], từ 492,2g dược liệu khô cây Arctotis arctotoides có thể phân lập
được 30mg Stigmasterol.
Theo [49], nghiên cứu đã phân lập được 65mg Stigmasterol từ 10g lá cây
Rubus suavissimus, họ Rosoideae.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien

mien phi
phi

-6-

1.2.2.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C29H48O (M = 412,69 g/mol).

- Tên khoa học: (24S)-24-ethylcholesta-5,22-dien-3β-ol.
- Tính chất vật lý: Chất bột kết tinh màu trắng, t°nc = 170°C, tan trong các
dung môi hữu cơ thông thường, rất dễ tan trong benzen, ethyl ether, ethanol, không
tan trong nước, λmax = 257 nm, [α]D22 = −51°C (C = 2, cloroform) [24].
1.2.2.3. Tác dụng và công dụng
- Theo Richard E và cộng sự [43], Phytosterols có tác dụng làm giảm
Lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL-C), là một trong những chỉ số biểu thị mức độ
cholesterol máu. Một kết quả tương tự cũng được tìm thấy qua nghiên cứu [42] của
Padmanabhan P Nair và cộng sự, Stigmasterol có tác dụng giảm sự hấp thu
Cholesterol vào máu, do đó làm giảm nguy cơ béo phì và nguy cơ ung thu ruột.
- Stigmasterol còn được dùng làm nguyên liệu để tổng hợp progesterol [46].
Progesterol là một hormon quan trọng trong cơ thể. Progesterol có thể dùng một
mình để tránh thai và điều trị nhiều loại bệnh, bao gồm xuất huyết tử cung bất
thường, vô kinh, lạc nội mạc tử cung, ung thư vú, thận, ăn mất ngon và sụt cân do
AIDS. Do đó, việc tổng hợp ra progesterol mang tính thực tiễn rất cao.
1.2.3. Mangiferin
1.2.3.1. Nguồn gốc
Mangiferin có ở lá, vỏ thân và vỏ rễ cây xoài Mangiferin indica với hàm
lượng khác nhau tùy từng vùng và tùy từng giống xoài, khoảng 3% ở vỏ thân và
khoảng 1,6% ở lá [15].
Năm 2011, Nguyễn Thị Thúy đã phân lập được Mangiferin từ lá cây gạo
[18].

-7-

1.2.3.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C19H18O11 (M = 422,34 g/mol).

- Tên khoa học: 2-β-D-glucopyranosyl-1,3,6,7-tetrahydroxy-9H-xanthen-9on.
- Tính chất vật lý: Bột kết tinh mịn, màu vàng ánh lục, không mùi hay mùi
nhẹ [4]; hơi tan trong hỗn hợp aceton – nước (1 : 1), tan trong cồn metylic, cồn
etylic, thực tế không tan trong nước lạnh, cloroform [9]; t°nc = 258 - 261°C; phổ tử
ngoại của dung dịch chế phẩm 0,001% trong methanol, trong khoảng 220 – 400 nm
phải có hấp thụ cực đại ở các bước sóng 241±2 nm, 258±2nm, 316±2 nm, 366±2
nm [4].
1.2.3.3. Tác dụng và công dụng
- Mangiferin có tác dụng kháng virus đối với nhóm Herpes, cho hiệu lực ức
chế trên giai đoạn đầu quá trình tái sinh virus Herpes [51].
- Mangiferin có tác dụng kích thích miễn dịch trên cả 2 loại miễn dịch thể
dịch và miễn dịch tế bào [10].
- Ngoài ra, những nghiên cứu mới đây còn cho thấy mangiferin có tác dụng
hạ đường huyết do làm tăng độ nhạy cảm của mô tế bào đích với insulin và ức chế
thoái giáng tế bào glycogen ở gan [47].
1.2.4. Lupeol
1.2.4.1. Nguồn gốc
- Lupeol được tìm thấy trong các loại rau như bắp cải trắng, hạt tiêu, cà
chua; trong trái cây như ô liu, quả sung, xoài và trong cây thuốc như Bombax ceiba,
Tamarindus indica, Sebastiania adenophora… với hàm lượng rất khác nhau: quả ô
liu chứa 3µg/g quả, lá lô hội chứa 2803µg/g lá khô… [39].
- Năm 2012, Phùng Thị Hồng đã phân lập được lupeol từ vỏ thân cây Gạo

Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

-8-

với hàm lượng khoảng 20mg trong 700g vỏ thân khô [13].
1.2.4.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C30H50O (M = 426,72 g/mol).

- Tên khoa học: 3β-hydroxylup-20(29)en.
- Tính chất vật lý: Lupeol là tinh thể hình kim, màu trắng đục; tan tốt trong
dầu, đặc biệt là chuỗi monoglycerid, diglycerid và propylen glycol monocaprylat,
tan 6,7 – 10mg/ml ethanol ở 22°C, λmax = 350 nm [37].
1.2.4.3. Tác dụng và công dụng
- Lupeol đã được nghiên cứu để chứng minh các tác dụng dược lý khác
nhau trong cả điều kiện in vitro và in vivo. Chúng bao gồm các tác dụng có lợi đối
với tình trạng viêm, ung thư, viêm khớp, tiểu đường, bệnh tim mạch, độc tính trên
thận và nhiễm độc gan… [36], [39].
- Năm 2003, Young-Jea You và cộng sự tiến hành sàng lọc một số dược
liệu thu hái tại Việt Nam có tác dụng antiangiogenic cho thấy dịch chiết methanol
của vỏ thân cây Gạo (cụ thể là lupeol) có tác dụng antiangiogenic trên dòng tế bào
thuộc màng trong ống dây rốn (HUVEC) [38], [50].
1.2.5. Taraxeryl acetat
1.2.5.1. Nguồn gốc

- Năm 2012, Nguyễn Hải Ngọc đã phân lập được hai chất là Taraxeryl
acetat và Taraxerol từ lá cây Gạo [17].
1.2.5.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C32H52O2 (M = 468,75 g/mol)


-9-

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3β-yl acetate.
- Tính chất vật lý: t°nc = 303-305°C; [α]D = +10,5° (C = 1,8, cloroform)
[54].
1.2.5.3. Tác dụng và công dụng
- Tác dụng điều trị ung thư dạ dày do làm chậm quá trình phát triển của tế
bào ung thư dạ dày AGS [52].
1.2.6. Taraxerol
1.2.6.1. Nguồn gốc
- Ngoài xuất hiện trong lá cây Gạo, Taraxerol còn được tìm thấy trong vỏ
cây Cupania dentata (họ Sapindaceae) với 52,2 mg khi tiến hành chiết và phân lập
982g dược liệu khô [30].
1.2.6.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C30H50O (M = 426,72 g/mol).

- Tên khoa học: D-Friedoolean-14-en-3-ol.
- Tính chất vật lý: tinh thể màu trắng, tan trong benzene, chloroform, ether;
ít tan trong rượu; t°nc = 279 - 280°C; [α]D = +2,9 (C = 0,490, cloroform) [30].


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai

tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

- 10 -

1.2.6.3. Tác dụng và công dụng
- Tương tự như Taraxeryl acetat, Taraxerol cũng có tác dụng điều trị ung
thư dạ dày do làm chậm quá trình phát triển của tế bào AGS [52].
1.2.7. 7α-hydroxysitosterol
1.2.7.1. Nguồn gốc
- Thành phần 7α-hydroxysitosterol đã được phân lập từ lá cây Gạo vào năm
2012 [17].
- Bên cạnh đó, chất này cũng được tìm thấy trong hạt giống cây đậu đũa
Vigna sinensis [27].
1.2.7.2. Tính chất
- Công thức phân tử: C29H50O2 (M = 433,71 g/mol).

- Tên khoa học: 7α-hydroxy(3β)-Stigmast-5-en-3-ol.
- Tính chất vật lý: bột màu trắng, t°nc=219-220; [α]D = −45,0ºC (C=0,25,
CHCl3) [27].
1.2.7.3. Tác dụng và công dụng
- Theo [27], các thành phần trong hạt giống cây đậu đũa Vigna sinensis nói
chung và 7α-hydroxysitosterol nói riêng đều được đánh giá là hiệu quả trên Heme
oxygenase – 1 (HO-1) – một enzym được xem như là có tác dụng ngăn cản sự ly
giải heme thành carbon monoxid và sắt tự do, giúp tăng sự tác động của HO-1 trên
dòng tế bào HepG2.
1.3. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
1.3.1. Nguyên tắc của HPLC

HPLC là một kỹ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột
chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của
chúng giữa 2 pha, tức là liên quan đến ái lực tương đối của chất này với pha tĩnh và


- 11 -

pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột phụ thuộc vào các yếu tố trên. Các
chất sau khi ra khỏi cột sẽ được phát hiện bởi detector và được ghi lại nhờ máy ghi
và bộ phận xử lý số liệu thành SKĐ với các thông tin về pic của chất phân tích. Quá
trình tách sắc ký tốt thì hỗn hợp có bao nhiêu thành phần sẽ có bấy nhiêu pic riêng
biệt được tách ra trên sắc đồ.
Tùy thuộc vào cơ chế của quá trình tách sắc ký mà ta có những kỹ thuật sắc
ký khác nhau: Sắc ký phân bố, sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký loại cỡ,
sắc ký ái lực, sắc ký các đồng phân quang học. Trong đó sắc ký lỏng phân bố được
sử dụng rộng rãi nhất hiện nay [1], [16].
1.3.2. Các thông số đặc trưng cho quá trình sắc ký [1]
1.3.2.1. Thời gian lưu (tR)
Thời gian lưu tR là khoảng thời gian từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất
phân tích đến detector. Trên cùng một điều kiện HPLC đã chọn, thời gian lưu của
mỗi chất là hằng định, vì vậy có thể dùng thời gian lưu để phát hiện định tính các
chất.
Thời gian lưu phụ thuộc các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh.
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động.
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan.
- Trong một số trường hợp còn phụ thuộc pH của pha động.
1.3.2.2. Hệ số dung lượng k’
Hệ số dung lượng mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong cột:

trong đó: VS: thể tích pha tĩnh
VM: thể tích pha động
CS: nồng độ pha tĩnh
CM: nồng độ pha động
k' phụ thuộc vào bản chất chất phân tích, bản chất 2 pha phân tích, dựa vào
hệ số VS/VM.


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

- 12 -

Thường chọn k’= 1-5.
1.3.2.3. Số đĩa lý thuyết
Mỗi cột sắc ký có thể phân thành nhiều lớp mỏng xếp sát nhau gọi là đĩa lý
thuyết. Ở mỗi đĩa lý thuyết sẽ diễn ra sự phân bố cân bằng tức thời của chất tan giữa
pha tĩnh và pha động. Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực cột sắc
ký.

N: số đĩa lý thuyết
H: chiều cao pic
tR: thời gian lưu
W: chiều rộng của pic
1.3.2.4. Độ phân giải của cột

Độ phân giải của cột đánh giá khả năng tách định lượng hai chất trong hỗn
hợp trên cột sắc ký:

RS: độ phân giải
(tR)A: thời gian lưu chất A
(tR)B: thời gian lưu chất B
W1/2A: chiều rộng pic A ở phân nửa chiều cao của pic
W1/2B: chiều rộng pic B ở phân nửa chiều cao của pic
1.3.3. Ứng dụng của kỹ thuật HPLC
1.3.3.1. Định tính [2]
Người ta có thể dùng HPLC để định tính bằng một số cách sau:
- So sánh thời gian lưu của các chất phân tích trong dung dịch thử với thời
gian lưu của chất chuẩn chạy cùng điều kiện sắc ký.
- So sánh phổ (chồng phổ) UV-VIS của chất thử với chất chuẩn trên
detector DAD (có hệ số match > 0,995).
- Có thể kết nối HPLC – phổ IR hoặc HPLC – MS định tính dựa vào nhóm
chức (IR) hoặc số khối (MS).


- 13 -

1.3.3.2. Định lượng
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng
độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó.
Có 4 phương pháp định lượng thường được sử dụng trong sắc ký là:
- Phương pháp chuẩn ngoại
- Phương pháp chuẩn nội
- Phương pháp thêm chuẩn
- Phương pháp chuẩn hóa diện tích
Trong khuôn khổ của khóa luận này tôi xin trình bày cụ thể về phương pháp

chuẩn ngoại.
Đây là phương pháp định lượng cơ bản, trong đó cả 2 mẫu chuẩn và thử đều
được tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic
của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của
các chất trong mẫu thử.
Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa 1 điểm hoặc chuẩn hóa nhiều điểm:
 Chuẩn hóa một điểm
Chọn nồng độ của mẫu chuẩn xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử. Tính nồng độ
của mẫu thử theo công thức:
Cx =
Cx: Nồng độ mẫu thử.
CS: Nồng độ mẫu chuẩn.
Sx: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu thử.
SS: Diện tích của pic chất phân tích trong mẫu chuẩn.
 Chuẩn hóa nhiều điểm
Cách tiến hành: Chuẩn bị 1 dãy chuẩn với các nồng độ chất chuẩn tăng dần
rồi tiến hành sắc ký. Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi
điểm nồng độ chuẩn. Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều
cao H) của pic với nồng độ của chất chuẩn. Sử dụng đoạn tuyến tính của đường
chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định. Có thể tính theo 2 cách:


Ket-noi.com
Ket-noi.com kho
kho tai
tai lieu
lieu mien
mien phi
phi

- 14 -

- Áp dữ liệu diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất thử vào đường chuẩn sẽ
suy ra được nồng độ của nó.
- Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính mô tả quan hệ giữa diện tích
pic (hoặc chiều cao) với nồng độ của chất cần xác định.
S = a + b.C
S: Diện tích pic
a: Giao điểm của đường chuẩn với trục tung
b: Độ dốc của đường chuẩn
C: Nồng độ của chất thử.
Dựa vào phương trình hồi quy này ta tính được nồng độ của chất thử.
Cx = Error!
Chú ý: Độ lớn của diện tích pic Sx (hoặc chiều cao pic) mẫu thử phải nằm
trong đoạn tuyến tính của đường chuẩn [1], [16].
1.4.

TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ (LC-MS) [1]
LC-MS là kỹ thuật phân tích dựa trên sự kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao

và phân tích khối phổ. Sự kết hợp này tạo nên một hệ thống có những ứng dụng
rộng lớn trong phân tích.
1.4.1. Nguyên tắc
Khối phổ (Mass Spectrometry – MS) là kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng
và điện tích ion (m/z) được tạo thành trong pha khí từ phần tử hoặc nguyên tử mẫu.
Tỷ số này được biểu thị bằng đơn vị khối lượng nguyên tử hoặc bằng Dalton (Da).
Các ion được tạo thành trong buồng ion hóa, được gia tốc và tách riêng nhờ
bộ phân tích khối trước khi đến detector. Tín hiệu tương ứng với các ion sẽ được
thể hiện bằng một số vạch (pic) có cường độ khác nhau, tập hợp thành một khối phổ
đồ hoặc phổ khối, cung cấp thông tin để định tính, xác định cấu trúc và định lượng

các chất.
1.4.2. Máy khối phổ
1.4.2.1. Bộ nạp mẫu (Inlet)


- 15 -

Đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc rắn phải chuyên mẫu sang
dạng hơi bằng cách thích hợp. Có thể nạp mẫu trực tiếp hoặc nối với đầu ra của một
thiết bị phân tích khác như sắc ký khí, sắc ký lỏng siêu giới hạn (SFC), điện di mao
quản (CE).

Hình 1.1. Sơ đồ khối của máy khối phổ
1.4.2.2. Bộ nguồn ion (Ion source)
Ion hóa các phân tử, nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi, khử dung
môi để đưa tiếp ion vào bộ phân tích khối, cách ly phần tạo ion ở áp suất khí quyển
với bộ phận nằm trong chân không sâu. Và rút ra ngoài các phân tử trung hòa, ion
khác dấu có thể ảnh hưởng tới phép đo.
Các kỹ thuật ion hóa đã được phát triển và sử dụng là: Va chạm electron, ion
hóa hóa học, ion hóa bằng nguồn ion phun sương khử solvat, ion hóa hóa học ở áp
suất khí quyển, ion hóa bởi nguồn ion bằng giải hấp.
Trong đề tài này, chúng tôi sử dụng kỹ thật ion hóa bằng phun điện từ Electronspray ionization (ESI).
1.4.2.3.

Bộ phân tích khối (Mass Analyzer)

Tách các ion theo tỷ số m/z. Các ion được gia tốc và tách riêng nhờ tác dụng
của từ trường, điện trường để đi đến detector. Có thể phân bộ phận tích khối thành 4
loại:
- Bộ phân tích từ (Magnetic Analyser)

- Bộ phân tích tứ cực (Quadrupole)
- Bộ phân tích thời gian bay (Time of Flight Analyser – TOF)