PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN 10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR (INTERSIMPLE SEQUENCE REPEATS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
*****************

HOÀNG THỊ LIỄU

PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN
10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR
(INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEATS)

Chuyên ngành: Trồng trọt
Mã số : 60.62.01
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Hướng dẫn Khoa học:
TS. BÙI MINH TRÍ

Thành phố Hồ Chí Minh, Tháng 06/2011


PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN
10 DÒNG VÔ TÍNH CAO SU BẰNG KỸ THUẬT ISSR
(INTER-SIMPLE SEQUENCE REPEATS)
HOÀNG THỊ LIỄU

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

TS. ĐỖ NGỌC DIỆP
Công ty Cổ phần Đường Biên Hòa

2. Thư ký:

PGS.TS TRẦN VĂN MINH
Viện Sinh học Nhiệt đới TP. HCM

3. Phản biện 1:

TS. NGUYỄN HỮU HỔ
Viện Sinh học Nhiệt đới TP. HCM

4. Phản biện 2:

TS. VÕ THÁI DÂN
Đại học Nông Lâm TP. HCM

5. Ủy viên:

PGS. TS. PHAN THANH KIẾM
Đại học Nông Lâm TP. HCM

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên là Hoàng Thị Liễu, sinh ngày 14 tháng 03 năm 1981, tại xã Vĩnh
Trung, huyện Vĩnh Linh, tỉnh Quảng Trị.
Tốt nghiệp PTTH tại Trường Trung học Phổ thông Hùng Vương, thành phố
Pleiku, tỉnh Gia Lai năm 1999.
Tốt nghiệp Đại học ngành Nông học, hệ chính qui tại Trường Đại học Nông
Lâm, thành phố Hồ Chí Minh năm 2004.

Quá trình công tác:
Từ 2004 - 2009, là cán bộ nghiên cứu phụ trách công trình “Nhân giống mới
cây cao su” và tham gia các công trình thuộc đề tài “Lưu giữ nguồn gen cây cao su”
tại Bộ môn Giống, Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam.
Tháng 9 năm 2009, theo học Cao học ngành Trồng trọt tại Trường Đại học
Nông Lâm, Thủ Đức, thành phố Hồ Chí Minh.
Địa chỉ liên lạc: 1543 Đại lộ Bình Dương, phường Hiệp An, thị xã Thủ Dầu
Một, tỉnh Bình Dương.
Điện thoại: Cơ quan: 06503.564596; Di động: 0907499262.
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số
liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Hoàng Thị Liễu

iii


LỜI CẢM TẠ
Lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ đã sinh thành và nuôi dạy con trưởng thành.
Lời cảm ơn chân thành đến chồng, con trai và gia đình bên chồng đã giúp đỡ
động viên và tạo điều kiện trong quá trình học tập.
Lời tri ân sâu sắc xin gởi đến Thầy - TS. Bùi Minh Trí, đã dìu dắt, giúp đỡ
cho tôi rất nhiều trong quá trình học tập từ Đại học đến Cao học, và cũng là người

hướng dẫn khoa học cho tôi thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm tạ đến:
- ThS. Lại Văn Lâm - Viện trưởng Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam (VCS)
và Ban lãnh đạo Viện đã tạo điều kiện nghiên cứu và cấp kinh phí đào tạo.
- ThS. Lê Mậu Túy - Trưởng Bộ môn Giống cùng toàn thể cán bộ công nhân
viên Bộ Môn Giống - VCS đã giúp đỡ, tạo điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành
khóa học và luận văn tốt nghiệp.
- ThS. Lê Thị Thùy Trang - Phụ trách Phòng thí nghiệm CNSH, VCS đã giúp
tôi xây dựng đề cương, dự toán kinh phí và thiết lập các thí nghiệm trong đề tài.
- Ban Giám hiệu, Phòng đào tạo Sau Đại học, các quý thầy cô khoa Nông
học - Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giảng dạy, hướng
dẫn và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học thuận lợi.
Cuối cùng xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và động viên của anh, chị, em,
bạn bè, đồng nghiệp và toàn thể thành viên lớp CHTT - 09.

HOÀNG THỊ LIỄU

iv


TÓM TẮT
Đề tài "Phân tích mối quan hệ di truyền và nhận diện 10 dòng vô tính cao su
bằng kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)” được thực hiện tại Viện
Nghiên cứu Cao su Việt Nam, Lai Hưng, Bến Cát, Bình Dương, thời gian từ tháng
06/2010 đến tháng 2/2011. Mục tiêu của đề tài là phân tích mối quan hệ di truyền và
nhận diện 10 dvt cao su trong bảng cơ cấu giống khuyến cáo giai đoạn 2006 - 2010.
Đề tài sử dụng kỹ thuật ISSR dựa trên quy trình của Weising và ctv. (2005), trong
đó thành phần phản ứng PCR được điều chỉnh phù hợp với vật liệu và điều kiện thí
nghiệm.
Kết quả thu được là thành phần phản ứng PCR đã được điều chỉnh phù hợp

với nồng độ Taq 1,25 U và nồng độ mồi là 1 M. Hai mươi mồi ISSR qua sàng lọc
đã thu được 6 mồi gồm T28, T30, T31, T33, T34 và T38 cho sản phẩm đa hình và
ổn định trên 10 dvt cao su nghiên cứu. Phân tích PCR với 6 mồi này trên 10 dvt đã
tạo ra được 53 băng DNA dao động trong khoảng 180 - 2600 bp, trong đó có 26
băng đa hình, chiếm tỷ lệ 49,1 %. Hệ số tương đồng di truyền giữa các dvt dao động
trong khoảng 0,810 đến 0,937, trung bình là 0,873. Kết quả phân tích mối quan hệ
di truyền dựa trên hệ số DICE bằng phần mềm NTSYSpc 2.1 cho thấy, ở mức
tương đồng đi truyền 0,876, các dvt chia làm 3 nhóm: nhóm I gồm các dvt có phổ
hệ gần gũi: LH 88/236, LH 88/72 và RRIC 121; nhóm II gồm 2 dvt có cùng phổ hệ
là LH 90/952 và LH 90/1094; nhóm III gồm các dvt LH 83/85, LH 83/87, RRIM
600 và PB 260. Bên cạnh đó, dvt IAN 45/873 tách ra khỏi 3 nhóm trên ở mức tương
đồng 0,848. Kết quả trên cho thấy sự phân bố các dvt ở các nhóm có liên quan đến
phổ hệ, nguồn gen và xuất xứ của chúng. Các dvt cao su nghiên cứu có mối quan hệ
di truyền gần gũi, tuy nhiên giữa chúng vẫn có sự khác biệt, điều này thể hiện rõ
qua kết quả phân tích 3D - PCA. Sự khác biệt dựa trên cơ sở hình ảnh về kích thước
và vị trí băng DNA của 10 dvt cao su với 6 mồi ISSR cũng chính là cơ sở để nhận
diện 10 dvt cao su nghiên cứu. Qua đó, quy trình nhận diện 10 dvt cao su bằng kỹ
thuật ISSR cũng đã được xây dựng.

v


ABSTRACT
The study “Genetic relationships and clonal identification among 10 rubber
clones using ISSR (Inter-simple Sequence Repeats)” was carried out at Rubber
Research Intitute of Vietnam, from June, 2010 to February, 2011. The objectives of
this study were to evaluate the genetic relationships among 10 elite clones, selected
from breeding recomendation classes of the period 2006 - 2010 and to identify
them. The ISSR technique based on an earlier published ISSR protocol by Weising
et al., 2005 was applied to do the study.

The contents of PCR were optimized with levels 1.25 U of Taq and 1 M of
primer. Twenty ISSR primers were screened and 6 primers including T30, T31,
T34, T33, T28 and T38 produced clear, stable and polymorphic fragments of all
samples. A total of 53 amplified fragments ranging from 180 - 1600 bp were
detected on 10 clones, of which 26 were polymorphic (49.1 %). The Dice similarity
coefficient values ranged from 0.810 - 0.937; the mean of values was 0.873.
UPGMA cluster analysis based on Dice genetic similarity segregated the studied
clones into 3 clusters at the value 0.876. The cluster I is formed from 3 clones
having close relatives: LH 88/236, LH 88/72 and RRIC 121. The cluster II consist
of two clones having the same parents: LH 90/952 and LH 90/1094. The cluster III
is formed by the others. Besides, the clone IAN 45/873 separated from all the three
above-mentioned clusters at 0.848. The dendrogram indicated that the distribution
of clones in groups related to genetic resources, genealogy and locations of all
clones. Although the studied clones had close relative, genetic difference among
them (as expressed by size and number of DNA bands) indicated by the results of
3D - PCA analysis was quite clearly. Based on data of bands DNA with 6 primers
that would be trusted evident for identification of the 10 clones, the identification
protocol of rubber clones by ISSR was built.

vi


MỤC LỤC
TRANG
Trang tựa
Trang chuẩn y ............................................................................................................... i
Lý lịch cá nhân ............................................................................................................ii
Lời cam đoan ............................................................................................................. iii
Cảm tạ ........................................................................................................................ iv
Tóm tắt ........................................................................................................................ v

Abstract ...................................................................................................................... vi
Mục lục......................................................................................................................vii
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... x
Danh sách các hình và sơ đồ .....................................................................................xii
Danh sách các bảng ................................................................................................. xiii
Chương 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ........................................................................................................ 2
1.4. Phạm vi đề tài .............................................................................................. 3
Chương 2. TỔNG QUAN ......................................................................................... 4
2.1. Giới thiệu tổng quát về cây cao su ............................................................. 4
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại ............................................................................... 4
2.1.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................... 4
2.1.3. Điều kiện sinh thái .................................................................................... 6
2.1.4. Đặc điểm di truyền cây cao su.................................................................. 6
2.1.5. Nguồn gen cây cao su trên thế giới .......................................................... 6
2.1.5.1. Nguồn gen cao su Đông Nam Á (Wickham) ........................................ 6
2.1.5.2. Nguồn gen cao su Amazon.................................................................... 7
2.1.6. Tình hình sản xuất cao su trên thế giới .................................................... 8

vii


2.1.7. Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam ..................................................... 9
2.2. Giới thiệu về các loại chỉ thị di truyền ...................................................... 10
2.2.1. Chỉ thị hình thái...................................................................................... 10
2.2.2. Chỉ thị phân tử................... ..................................................................... 10
2.3. Một số kỹ thuật sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu quan hệ di
truyền và nhận diện giống cây trồng ........................................................ 11

2.3.1. Kỹ thuật điện di Isozyme........................................................................ 11
2.3.2. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ............. 12
2.3.3. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) .............. 13
2.3.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .................... 13
2.3.5. Kỹ thuật PCR ......................................................................................... 14
2.3.6. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) ............................................. 16
2.3.7. Kỹ thuật ISSR (Inter-simple Sequence Repeats) ................................... 17
2.3.8. So sánh giá trị một số loại chỉ thị DNA ................................................. 20
2.4. Các nghiên cứu về mối quan hệ di truyền và nhận diện giống cao su ...... 22
2.4.1. Nghiên cứu về quan hệ di truyền trên cây cao su trong và ngoài nước. 22
2.4.2. Nghiên cứu nhận diện giống cao su ngoài nước .................................... 25
2.4.2.1. Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị hình thái.................. 25
2.4.2.2. Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị isozyme .................. 26
2.4.2.3. Nghiên cứu nhận diện giống cao su bằng chỉ thị DNA ....................... 27
2.4.3. Nghiên cứu nhận diện giống cao su trong nước ..................................... 28
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................... 30
3.1. Thời gian và địa điểm ................................................................................ 30
3.2. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................... 30
3.2.1. Các dòng vô tính cao su nghiên cứu ...................................................... 30
3.2.2. Mồi và hóa chất thí nghiệm .................................................................... 31
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 32
3.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................ 32
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu .............................................................................. 32

viii


3.3.2. Phương pháp ly trích, định tính và định lượng DNA.............................. 34
3.3.3. Thành phần hóa chất và chương trình nhiệt cho phản ứng PCR - ISSR .. 34
3.3.4. Phương pháp phân tích kết quả ................................................................. 37

3.3.4.1. Sàng lọc các mồi cho đa hình............................................................... 37
3.3.4.2. Đánh giá tính ổn định của kỹ thuật PCR - ISSR .................................. 37
3.3.4.3. Phân tích mối quan hệ di truyền của 10 dvt cao su nghiên cứu ........... 37
3.3.4.4. Nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu .................................................... 38
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 39
4.1. Ly trích DNA của các dvt cao su nghiên cứu ............................................ 39
4.2. Điều chỉnh thành phần phản ứng PCR - ISSR .......................................... 41
4.3. Kết quả phân tích ISSR .............................................................................. 43
4.3.1. Đánh giá tính đa hình của các mồi ISSR nghiên cứu.............................. 43
4.3.2. Đánh giá khả năng lặp lại của kỹ thuật ISSR.......................................... 44
4.3.3. Mối quan hệ di truyền của 10 dvt cao su nghiên cứu ............................. 46
4.3.4. Nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu ....................................................... 52
4.3.4.1. Cơ sở dữ liệu ........................................................................................ 52
4.3.4.2. Tiến trình nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu .................................... 53
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................. 55
5.1. Kết luận ...................................................................................................... 55
5.2. Đề nghị ....................................................................................................... 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 57
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 63

ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
 A, C, G, T : Adenine, Cystosine, Guanine, Thymine
 AC: Acre ; RO: Rondonia; MT: Matto Grosso: Các Bang của BraZil
 AGROINFO (Agronomical Information): Trung tâm Thông tin Phát triển
 NN PTNT: Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn
 AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
 ALP: Amplified Length Polymorphism

 AP - PCR: Arbitrarily Primed Polymerase Chain Reaction
 BMG: Bộ môn Giống
 Bp: Base pair
 CIRAD: Center International Research Agriculture Development
 CTAB: Cetyltrimethyl Amonium Bromide
 Ctv: Cộng tác viên
 DAG: Dự án Giống
 DNA: Deoxyribonucleic acid
 dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
 Dvt: Dòng vô tính
 EDTA: Ethylenediaminetetraacetate
 IAN (Institutut Agronomico de Norte): Viện nghiên cứu Nông nghiệp Norte,
Brazil
 IRSG (International Rubber Study Group): Tập đoàn Nghiên cứu Cao su Quốc tế
 IRCA (Institut de Recherches sur le Caoutchouc en Afrique): Viện Nghiên cứu
Cao su Côte d’Ivoire
 IRRDB (International Rubber Reserch Development Board): Hiệp hội Nghiên
cứu và Phát triển Cao su Thế giới
 ISSR: Inter-simple Sequence Repeats
 KDT: Kiểu di truyền

x


 LH: Lai hoa
 L: 100 bp Molecular Ladder
 MWL: Molecular Weight Ladder
 NST: Nhiễm sắc thể
 OD: Optical density
 PCR: Polymerase Chain Reaction

 PB (Prang Bersar): Một bang của Malaysia
 QTL (Quatitative trait loci): Các locus qui định tính trạng số lượng
 RAPD: Random amplified polymorphic DNA
 RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
 RNA: Ribonucleic acid
 RRIC (Rubber Research Institute of Ceylon): Viện Nghiên cứu Cao su Sri-Lanka
 RRII (Rubber Research Institute of India): Viện Nghiên cứu Cao su Ấn Độ
 RRIM (Rubber Research Institute of Malaysia): Viện Nghiên cứu Cao su
Malaysia
 RRIV (Rubber Research Institute of Viet Nam): Viện Nghiên cứu Cao su VN
 SN: Kí hiệu vườn lưu trữ quỹ gen cây cao su
 SSR: Simple Sequence Repeats
 SSCP: Single-strand Conformation Polymorphism
 ST: Sơ tuyển
 Ta (Anealing temperature): Nhiệt độ bắt cặp
 TAE: Tris - Acetate - EDTA
 TE: Tris - EDTA
 Tm (Melting temperature): Nhiệt độ tan chảy
 U (unit): Đơn vị hoạt tính
 VN: Việt Nam
 W: Wickham
 WA: Wickham x Amazon

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1. Một số đặc điểm hình thái cây cao su ........................................................ 5
Hình 2.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR................................................................. 15
Hình 2.3. Ví dụ về việc phát hiện microsatellites .................................................... 16
Hình 2.4. Kỹ thuật ISSR primer đơn (AG)8, unanchored (a), 3’-anchored (b) và
5’-anchored (c) ........................................................................................ 18
Hình 3.1. 100 bp molecular ladder (L) ..................................................................... 36
Hình 4.1. Kết quả định tính 30 mẫu DNA của 10 dvt cao su nghiên cứu ................ 39
Hình 4.2. Kết quả PCR với mồi T29 ở 5 nồng độ Taq trên dvt IAN 45/873 (a) và
dvt RRIM 600 (b) .................................................................................... 42
Hình 4.3. Kết quả PCR với 5 nồng độ mồi T29 và dvt IAN 45/873 (a) và dvt
RRIM 600 (b) ........................................................................................... 42
Hình 4.4. Kết quả thể hiện tính ổn định của mồi T30 trên 10 dvt nghiên cứu qua
lần thực hiện phản ứng PCR ..................................................................... 45
Hình 4.5. Kết quả phân tích PCR với các mồi T30 (a), T38 (b), T33 (c), T34 (d),
T28 (e) và T31 (f) ..................................................................................... 47
Hình 4.6. Phân nhóm di truyền của 10 dvt theo phương pháp UPGMA dựa trên hệ
số DICE, phân tích bằng chương trình SAHN trong phần mềm
NTSYSpc 2.1 ............................................................................................ 48
Hình 4.6. Phân nhóm di truyền của 10 dvt theo phương pháp UPGMA dựa trên hệ
số DICE, phân tích 2D - PCA bằng chương trình EIGEN của phần mềm
NTSYSpc 2.1 ............................................................................................ 51
Sơ đồ 4.1. Quy trình nhận diện 10 dvt cao su nghiên cứu ........................................ 54

xii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1. Sản lượng cao su thiên nhiên thế giới và một số nước sản xuất chính
(đơn vị 1000 tấn). ............................................................................................. 8
Bảng 2.2. Diện tích và năng suất cao su tại một số nước năm 2007 ............................... 8
Bảng 2.3. Diện tích và sản lượng cao su của Việt Nam qua các giai đoạn ..................... 9
Bảng 2.4. Các cách gọi khác nhau của kỹ thuật ISSR - PCR và kỹ thuật tương tự . 19
Bảng 2.5. So sánh chi phí và lĩnh vực áp dụng của một số loại chỉ thị phân tử ....... 21
Bảng 3.1. Một số đặc điểm của 10 dvt cao su nghiên cứu ....................................... 30
Bảng 3.2. Đặc điểm của 20 mồi ISSR nghiên cứu ................................................... 31
Bảng 3.3. Nơi thu thập mẫu của 10 dvt cao su nghiên cứu ...................................... 33
Bảng 3.4. Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR - ISSR (Weising và ctv, 2005) .. 35
Bảng 4.1. Kết quả định lượng DNA của 30 mẫu lá li trích ...................................... 40
Bảng 4.2. Nồng độ thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với các mồi ISSR ...... 43
Bảng 4.3. Kết quả đánh giá tính đa hình của 6 mồi ISSR trên 10 dvt nghiên cứu ... 44
Bảng 4.4. Hệ số tương đồng di truyền của 10 dvt cao su nghiên cứu ...................... 48
Bảng 4.5. Giá trị Eigen của các dvt cao su nghiên cứu qua phân tích 3D - PCA .... 52

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là loại cây trồng có giá trị kinh tế
cao, cung cấp nguyên liệu thiết yếu cho phát triển công nghiệp, có đặc tính phù hợp
cho trồng rừng và xóa đói giảm nghèo nên được nhà nước quan tâm đầu tư. Vì thế,
diện tích trồng cao su nước ta không ngừng tăng trong những năm qua. Và vấn đề
giống đã trở thành mối quan tâm hàng đầu trong việc đầu tư thâm canh cây cao su.
Trong công tác lai tạo và tuyển chọn giống cao su tại các Viện Nghiên cứu

Cao su, phần lớn các dòng vô tính làm bố mẹ lai được chọn chủ yếu dựa vào các
tính trạng kinh tế (trong đó, sản lượng, sinh trưởng và khả năng chống chịu bệnh hại
được ưu tiên hàng đầu) nhằm mong muốn tạo ra các con lai có sản lượng cao, sinh
trưởng khỏe và chống chịu được các loại bệnh hại. Chính vì vậy, quần thể giống
được lai tạo ra sẽ có những đặc tính chung về di truyền. Những thông tin về quan hệ
di truyền của quần thể này trên cơ sở DNA sẽ góp phần hỗ trợ các nhà lai tạo giống
trong việc hoạch định các tổ hợp lai nhằm hạn chế khả năng xói mòn gen có thể xảy
ra do lai tạo có định hướng. Do đó, việc sử dụng chỉ thị phân tử để phân tích mối
quan hệ di truyền của quần thể giống đang được sử dụng trong nghiên cứu và sản
xuất là thực sự cần thiết.
Bên cạnh đó, vấn đề quản lý tập đoàn giống trong nghiên cứu và sản xuất
cũng không kém phần quan trọng. Sự nhầm lẫn giống trong nghiên cứu cũng như
sản xuất sẽ dẫn đến những thiệt hại về công sức và chi phí đầu tư. Ngoài ra, vấn đề
bảo hộ giống cây trồng cũng đang được quan tâm đặc biệt đối với các nước trồng
cao su. Hiện nay có nhiều phương pháp nhận diện giống cao su và mỗi phương
pháp đều có những ưu, nhược điểm riêng và phạm vi ứng dụng riêng. Trong đó,
1


phương pháp sử dụng các loại chỉ thị DNA để nhận diện giống đã được chứng minh
là cho kết quả chính xác và đáng tin cậy hơn các phương pháp khác.
Inter-simple Sequence Repeats (ISSR) là một trong số các chỉ thị DNA được
ứng dụng phổ biến trên cây trồng do có nhiều ưu điểm như: cho tính đa hình cao, có
khả năng lặp lại, dễ thực hiện, kết quả nhanh, không cần biết trước thông tin di
truyền của đối tượng nghiên cứu và có khả năng phân biệt các cá thể gần gũi nhau
về di truyền. Mặt khác, kỹ thuật ISSR có chi phí phân tích vừa phải, có độ tin cậy
và dễ thực hiện nên được khuyến cáo ở các phòng thí nghiệm có trang bị vừa phải
và hiện được ứng dụng rộng rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ di truyền và nhận
diện giống trên nhiều loài cây trồng (Akagi và ctv, 1996; Sankar và Moore, 2000;
Reddy và ctv, 2002; Armau và ctv, 2003).

Với những vấn đề đặt ra và tính khả thi của kỹ thuật ISSR, đề tài: “Phân tích
mối quan hệ di truyền và nhận diện 10 dòng vô tính cao su bằng kỹ thuật ISSR
(Inter-Simple Sequence Repeats)” thực sự cần thiết và phù hợp với điều kiện cũng
như chiến lược nghiên cứu của Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Phân tích mối quan hệ di truyền 10 dvt cao su có thành tích nông học xuất
sắc trong bảng cơ cấu giống khuyến cáo giai đoạn 2006 - 2010 nhằm góp phần hỗ
trợ công tác lai tạo giống cao su.
- Lập cơ sở dữ liệu ISSR tham chiếu cho việc nhận dạng 10 dvt cao su nghiên
cứu để phục vụ cho công tác quản lý tập đoàn giống trong nghiên cứu và sản xuất.
1.3. YÊU CẦU
Phản ứng PCR với các mồi ISSR có khả năng lặp lại, các mồi ISSR cho các
băng DNA đa hình và đặc trưng để phân biệt được các dvt nghiên cứu.

2


1.4. PHẠM VI ĐỀ TÀI
- Nghiên cứu được thực hiện trong điều kiện của Phòng Thí nghiệm Công
nghệ Sinh học - Viện Nghiên cứu Cao su Việt Nam từ tháng 6/2010 – 2/2011.
- Đề tài chỉ phân tích mối quan hệ di truyền và nhận diện trên 10 dvt cao su
thuộc cơ cấu bộ giống khuyến cáo giai đoạn 2006 - 2010 nên chưa đủ cơ sở để nhận
diện cho tất cả các dvt trong toàn bộ bảng cơ cấu giống và các dvt sử dụng trong lai
tạo cũng như trong sản xuất.

3


Chương 2
TỔNG QUAN

2.1. GIỚI THIỆU TỔNG QUÁT VỀ CÂY CAO SU
2.1.1. Nguồn gốc, phân loại
Theo Campagnon (1986), cây cao su loài Hevea brasiliensis thuộc chi
Hevea, họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae). Trong chi Hevea, còn có 9 loài khác đều cho
mủ cao su nhưng chỉ có loài Hevea brasiliensis là có ý nghĩa về kinh tế và được
trồng rộng rãi nhất. Tất cả các loài thuộc chi Hevea đều là loài bản địa của vùng
Amazon, Nam Mỹ và phân bố trong tự nhiên trên một vùng rộng lớn nằm giữa vĩ độ
60 Bắc và 150 Nam, giữa kinh độ 460 Tây đến 770 Đông, bao trùm các nước: Brazil,
Bolivia, Peru, Colombia, Ecuador, Venezuela, Guiyane thuộc Pháp. Ngoài vùng
xuất xứ trên, người ta không tìm thấy cây cao su xuất hiện ở các nơi khác trên thế
giới (trích dẫn bởi Trần Thị Thúy Hoa, 1998).
2.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây cao su (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) là loại cây trồng lâu năm, có chu
kì khai thác 25 - 30 năm. Cây cao su có một số đặc điểm hình thái như sau:
- Cao su là loài thân gỗ, sinh trưởng nhanh, trong tình trạng hoang dại cây có
thể cao 30 - 50 m, vanh thân lên tới 5 - 7 m. Tuy nhiên, trong điều kiện sản xuất,
chiều cao cây tối đa từ 25 - 30 m.
- Vỏ cây cao su có 3 lớp, lớp ngoài cùng gọi là tầng mộc thiêm, kế đến là lớp
trung bì có nhiều tế bào đá và một ít ống mủ, trong cùng là lớp nội bì cấu tạo bởi tế
bào libe và hệ thống ống mủ.
- Mủ cao su là dung dịch thể keo, có màu trắng sữa hoặc hơi vàng tùy giống.

4


- Lá cao su là lá kép gồm có 3 lá chét với phiến lá nguyên mọc cách. Cây có
thời kì rụng lá qua đông, lá rụng hoàn toàn sau đó ra bộ lá mới.
- Hoa cao su nhỏ, hình chuông, màu vàng, đơn tính đồng chu, khó tự thụ do
hoa đực và hoa cái không chín cùng lúc. Cây cao su ra hoa khi được 5 - 6 tuổi và
bắt đầu ra hoa vào tháng 2 - 3 trong điều kiện Việt Nam.

- Quả dạng quả nang gồm 3 - 4 ngăn, chứa 3 - 4 hạt, quả tự khai, hạt khá lớn,
kích thước thay đổi từ 2 - 3,5 cm. Vỏ hạt cứng, đầu hạt có lỗ nảy mầm. Trong hạt
có chứa nhiều dầu, dễ mất sức nảy mầm. Cây cao su rụng trái trong tháng 8 - 9 hàng
năm.
- Bộ rễ của cây cao su rất phát triển, rễ cọc có thể dài đến 10 m khi trưởng
thành và gặp đất có cấu trúc tốt, 80 - 85 % rễ bàng tập trung chủ yếu ở tầng đất mặt
0 - 30 cm (Nguyễn Thị Huệ, 2006).

Thân

Hoa
Cao su rụng lá
qua đông

Lá

Mặt cạo

Quả

Rễ bàng

Hệ thống ống mủ

Hạt

mủ
vỏ

Hình 2.1. Một số đặc điểm hình thái cây cao su

5


2.1.3. Điều kiện sinh thái
Vùng sinh thái tự nhiên của cây sao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm, khá đa
dạng. Cây cao su thích hợp với vùng có lượng mưa trung bình từ 1500 đến 2000
mm/năm, không có mùa khô hoặc mùa khô từ 1 đến 5 tháng, nhiệt độ thích hợp
nhất là 25 - 30 0C. Cây trưởng thành có sức chịu hạn tốt, phát triển trong điều kiện
tối thiểu 1600 - 1700 giờ nắng/năm và điều kiện gió nhẹ (1 - 3 m/s). Nếu tốc độ gió
lớn hơn 17 m/s thì cây sẽ bị gãy đổ. Cây cao su ưa đất hơi chua, độ pH khoảng 4,5 5,5 và không chịu ngập. Đất trồng cao su yêu cầu phải có tầng đất mặt dày, không
úng, địa hình ít dốc là tốt nhất (Nguyễn Thị Huệ, 2006).
2.1.4. Đặc điểm di truyền cây cao su
Cây cao su có bộ nhiễm sắc thể 2n = 36. Các đặc tính như sinh trưởng, sản
lượng, khả năng kháng bệnh đều là những tính trạng đa gen, di truyền theo phương
thức cộng hợp và khả năng phối hợp chung quan trọng hơn khả năng phối hợp riêng
(Tan và ctv, 1975). Cho đến nay, chưa có bằng chứng về sự tự bất tương hợp ở cây
cao su, mặc dù thường khi giao phấn chéo cho tỉ lệ đậu trái cao hơn tự thụ. Hiện
nay, nghiên cứu đặc điểm di truyền ở cây cao su qua thống kê sinh học (di truyền
định lượng) tuy bắt đầu muộn hơn các nghiên cứu khác, nhưng đã có những đóng
góp cho việc định hướng chương trình cải tiến giống cao su. Trong những năm gần
đây, các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm hỗ trợ cho công tác cải tiến giống cao
su đã được thực hiện, dẫn đầu là CIRAD (Center International Research Agriculture
Development) - Pháp, Ấn độ, Malaysia và Thái Lan.
2.1.5. Nguồn gen cây cao su trên thế giới
2.1.5.1. Nguồn gen cao su Đông Nam Á (Wickham)
Cây cao su trở thành cây trồng từ khi Henry Wickham, nhà thực vật học
người Anh, đã thu 70000 hạt cao su năm 1876 từ vùng quanh sông Tapojos, hữu
ngạn sông Amazon và chuyển về công viên hoàng gia Anh ở Kiew, trong đó chỉ có
4 % hạt nảy mầm, được khoảng 2700 cây. Sau 2 tháng, 1919 cây được chuyển sang

6


Sri Lanka và sống khoảng 90 %, 18 cây chuyển sang Indonesia chỉ sống được 2 cây,
50 cây chuyển sang Singapore nhưng không sống. Năm 1877, một đợt chuyển 22
cây từ Kiew sang Singapore đã thành công và sau đó phát triển rộng khắp Mã Lai.
Từ năm 1833, cây cao su ở Sri - Lanka và Mã Lai có hạt và trở thành nguồn giống
cung cấp cho nhiều nước ở Châu Á và Châu Phi. Nguồn vật liệu do Wickham sưu
tập được xem là thủy tổ của hầu hết diện tích cao su Châu Á và Châu Phi
(Baulkwill, 1989). Nguồn gen cao su do Wickham thu thập để hình thành đồn điền
ở các nước phương Đông chỉ thuộc một vùng rất nhỏ ở hạ lưu sông Amazon giáp
với nhánh sông Tapajoz nên phần lớn các con lai có quan hệ họ hàng với nhau, khó
tiếp tục lai tạo vì cận huyết thống (Ong và ctv, 1983).
2.1.5.2. Nguồn gen cao su Amazon
Nhận thức được vấn đề vốn di truyền hạn hẹp, xói mòn gen qua quá trình
dòng vô tính hoá sẽ là một hạn chế lớn cho tương lai công tác cải tiến giống cao su
nên các nước trồng cao su trên thế giới đã cố gắng khắc phục bằng cách di nhập bổ
sung nguồn di truyền loài Hevea brasiliensis từ vùng nguyên quán Amazon. Nhìn
chung, những đợt sưu tập nguồn di truyền mới trong những năm 1950 từ vùng
nguyên quán Amazon sau đợt giống Wickham chỉ mang tính rời rạc và hiệu quả sử
dụng chưa cao. Đến năm 1981, các Viện nghiên cứu cao su thuộc IRRDB đã hợp tác
thực hiện một đợt thám hiểm vùng rừng rậm Amazon để sưu tập quỹ gen cây cao su
và đây là một sự kiện quan trọng nhất trong lịch sử về sưu tập giống cao su. Cuộc
thám hiểm được tiến hành ở vùng thuộc các bang phía Tây Brazil là Acre (AC),
Rondonia (RO) và Matto Grosso (MT) (Ong và ctv, 1983). Năm 1984, các nguồn gen
này được phân phối cho các nước thành viên ở Châu Á và Châu Phi. Từ Malaysia,
nguồn gen này đã được phép nhân giống ở Guadeloupe để kiểm dịch bệnh rụng lá
Nam Mỹ (South American Leaf Blight: SALB) trước khi chuyển về 2 trung tâm trên
và phân bố cho các nước thành viên của hiệp hội từ năm 1984 (Ong và Tan, 1987).

7


2.1.6. Tình hình sản xuất cao su trên thế giới
Theo tổng hợp của Trung tâm thông tin - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông
thôn (AGROINFO) (2008), các nước sản xuất cao su thiên nhiên lớn trên thế giới
gồm có: Thái Lan, Indonesia, Malaysia và Việt Nam. Năm 2008, Thái Lan tiếp tục
dẫn đầu về sản lượng cao su thiên nhiên, Indonesia là nước đứng thứ 2 và kế đến là
Malaysia (xem Bảng 2.1). Sản lượng cao su thiên nhiên trên thế giới chủ yếu do tiểu
điền nắm giữ, với tỉ lệ 76 - 78 %, phần còn lại là sản xuất cao su quốc doanh (đại
điền). Hiện trên thế giới, các nước có năng suất cao su bình quân dẫn đầu đó là Ấn
Độ, Thái Lan, Việt Nam và Malaysia. Trong đó, Ấn Độ là nước có năng suất cao su
bình quân cao nhất với 1767 kg/ha/năm (xem Bảng 2.2)
Bảng 2.1. Sản lượng cao su thiên nhiên thế giới và một số nước sản xuất chính
(đơn vị 1000 tấn)
Thế giới, quốc gia/Năm

2006

2007

2008

Thế giới

9846

9725

10000

Thái Lan

3137

3056

3100

Indonesia

2797

2797

2860

Malaysia

1284

1200

1260

Việt Nam

522

549

644

(Nguồn: AGROINFO, tổng hợp từ số liệu của IRSG, 2008)
Bảng 2.2. Diện tích và năng suất cao su tại một số nước năm 2007
Diện tích

Diện tích đại điền

Diện tích tiểu điền

Năng suất

(1000 ha)

(1000 ha)

(1000 ha)

(kg/ha/năm)

Thái Lan

2433,9

19,5

2414,5

1706

Indonesia

3414

513

2901

1008

Malaysia

1229

52

1177

1424

Ấn Độ

630

65

565

1767

549,6

310

239

1640

Quốc gia

Việt Nam

(Nguồn: AGROINFO, tổng hợp từ số liệu của IRSG, 2008)
8


2.1.7. Tình hình sản xuất cao su ở Việt Nam
Quá trình sản xuất cây cao su ở Việt Nam đã có nhiều biến động trong suốt 2
thập kỷ qua. Ở Việt Nam, diện tích và sản lượng cây cao su liên tục tăng qua các
giai đoạn (xem Bảng 2.3). Với mức sản lượng của năm 2008, sản xuất cao su ở Việt
Nam hiện đứng thứ 5 trên thế giới (chiếm khoảng 5,4 % sản lượng cao su thế giới),
chỉ sau Thái Lan, Indonesia, Malaysia và Ấn Độ (AGROINFO, 2008). Định hướng
phát triển cao su đến 2015 là tiếp tục quy hoạch và mở rộng diện tích cả nước để đạt
được 850 nghìn ha. Đến năm 2020, việc đầu tư phát triển cây cao su chủ yếu tập
vào thâm canh tăng năng suất trên diện tích đã có, thay thế các giống cũ bằng những
giống mới có tiềm năng năng suất cao trên diện tích trồng tái canh (AGROINFO,
2008). Bên cạnh đó, thị trường xuất khẩu cao su cũng có nhiều thuận lợi. Hiện nay,
Việt Nam xuất khẩu cao su trên hơn 70 nước và vùng lãnh thổ trên thế giới với thị

trường xuất khẩu lớn nhất là Trung Quốc. Năm 2008, kinh ngạch xuất khẩu sang thị
trường Trung Quốc đạt 952,5 triệu USD, thị trường Hàn Quốc đạt 40,3 triệu USD,
kế đến là thị trường Đài Loan, Malaysia, Đức, Mỹ, Nhật Bản.
Bảng 2.3. Diện tích và sản lượng cao su của Việt Nam qua các năm
Năm

Diện tích
(ha)

Diện tích tăng
(ha)

Diện tích khai thác
(ha)

Sản lượng
(tấn)

1990

221700

-

81083

57900

1995

278400

56700

146885

124700

2000

412000

17100

238000

290800

2001

415800

3800

240600

312600

2002

428800

13000

253700

331400

2003

440800

12000

266745

363500

2004

450075

10100

305335

400100

2005

480200

26100

331400

468600

2007

549600

69400

-

601700

2008

601800

52200

-

644200

(Nguồn: AGROINFO, 2008; Tổng cục thống kê Việt Nam, 2006)

9


2.2. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOẠI CHỈ THỊ DI TRUYỀN
Các loại chỉ thị di truyền đã và đang được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu
di truyền và chọn giống hiện đại. Trong phân tích nguồn di truyền và cải tiến giống
cây trồng, kỹ thuật sử dụng chỉ thị được ứng dụng để nghiên cứu và tìm kiếm các
dấu hiệu di truyền (genetic marker) cho từng cá thể, từng giống, loài. Các loại chỉ
thị được di truyền theo các định luật di truyền của Mendel và thông qua sự liên kết
của chúng với những gen quan trọng và giúp dễ dàng trong việc phát hiện những
khác biệt trong thông tin di truyền của từng cá thể (Lefebvre và ctv, 1995). Có hai
loại chỉ thị di truyền: chỉ thị hình thái (morphological marker) và chỉ thị phân tử
(molecular marker), trong đó, chỉ thị phân tử gồm có chỉ thị sinh hóa (biochemical
marker) và chỉ thị DNA.
2.2.1. Chỉ thị hình thái
Những chỉ thị hình thái thông thường tương ứng với các tính trạng chất
lượng (qualitative trait) mà ta có thể ghi nhận bằng mắt thường. Một tính trạng hình
thái được kiểm soát bởi một locus đơn lẻ, có thể được sử dụng như một chỉ thị di
truyền. Chỉ thị hình thái dễ dàng phát hiện và sự xuất hiện của chúng cho chúng ta
biết về một giai đoạn phát triển hay một trạng thái sinh lý của cây trồng (Lefebvre
và ctv, 1995). Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của chỉ thị này là nó chịu tác động
của môi trường.
2.2.2. Chỉ thị phân tử
Chỉ thị phân tử là một đặc điểm phân tử hay đặc điểm hóa học có khả năng
định lượng và di truyền, gồm có 2 loại đó là chỉ thị sinh hóa và chỉ thị DNA.
 Chỉ thị sinh hóa
Chỉ thị sinh hóa là chỉ thị có bản chất protein được sinh ra từ sự thể hiện gen
(gene expression) và bao gồm chỉ thị isozyme và các loại protein dự trữ. Những
protein này được phân lập và nhận diện bằng kỹ thuật điện di hay nhuộm màu
(Lefebvre và ctv, 1995). Do là sản phẩm trực tiếp của gen nên chỉ thị sinh hóa ổn

10


định hơn chỉ thị hình thái. Chỉ thị isozyme đã được ứng dụng hiệu quả trong nhận
diện giống và phân tích đa dạng di truyền trên cây cao su, tuy nhiên có một số hạn
chế như: số lượng chỉ thị ít (14 loci trong loài Hevea brasiliensis) và mức đa hình
thấp nên khó có thể nhận biết sự khác biệt giữa các giống gần nhau về mặt di truyền
(Leconte ctv, 1994; Seguin ctv, 1995).
 Chỉ thị DNA
Chỉ thị DNA là một đoạn DNA sử dụng để đánh dấu hay truy theo một vị trí
(locus) trên nhiễm sắc thể (NST). Những chỉ thị DNA mang đầy đủ các đặc tính của
một chỉ thị di truyền điển hình. Dựa trên chuỗi phản ứng polymerase gọi là PCR
(Polymerase Chain Reaction) và trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA, chỉ thị
DNA được chia làm 2 nhóm: (1) nhóm chỉ thị DNA dựa trên PCR gồm: ALP,
AFLP, SSR, RADP, AP - PCR hay ISSR; (2) nhóm chỉ thị DNA dựa trên cơ sở
đánh dấu thăm dò và lai giữa DNA gồm RFLP, minisatellite (Semagn và ctv, 2006).
Chỉ thị DNA có ưu điểm hơn chỉ thị hình thái và chỉ thị isozyme do: (1) đo lường
trực tiếp các vật liệu di truyền; (2) có nhiều chỉ thị trong quần thể; (3) không ảnh
hưởng của môi trường; (4) nhanh, kỹ thuật đơn giản dễ ứng dụng; (5) có thể áp
dụng với nhiều đối tượng; (6) cần một lượng nguyên liệu tối thiểu; (7) có vị trí trên
bản đồ di truyền; (8) cho lượng thông tin cao, đáng tin cậy (Satoni và ctv, 2000).
2.3. MỘT SỐ KỸ THUẬT SỬ DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN
CỨU QUAN HỆ DI TRUYỀN VÀ NHẬN DIỆN GIỐNG CÂY TRỒNG
2.3.1. Kỹ thuật điện di isozyme
Isozyme là các protein xúc tác cùng một phản ứng enzyme, được qui định
bởi các allen khác nhau trên cùng một locus. Các protein này có khối lượng phân tử
khác nhau và điểm đẳng điện khác nhau, vì thế chúng có thể di chuyển với tốc độ
khác nhau trong điện trường, từ đó, chúng tạo ra những đặc điểm đặc trưng trên gel
điện di và hiển thị bằng phương pháp nhuộm màu. Việc sử dụng chỉ thị isozyme

khá rẻ tiền, cho kết quả nhanh, vật liệu có thể sử dụng trong một thời gian dài,
không phụ thuộc tác động của môi trường nên trước đây, chỉ thị này được sử dụng

11