NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG Agrobacterium tumefaciens

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
***************

LÂM NGỌC VÂN THANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI
TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG
NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG
Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 02/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
***************

LÂM NGỌC VÂN THANH

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI
TRƯỞNG THÀNH VÀ TIỀN PHÔI THÔNG
NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG
Agrobacterium tumefaciens

Chuyên ngành

: Công nghệ Sinh học

Mã số

: 60.42.80

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hướng dẫn Khoa học:
1. TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN
2. TS. LÊ ĐÌNH ĐƠN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 02/2012


NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN Bt (CryIAb) VÀO PHÔI TRƯỞNG THÀNH
VÀ TIỀN PHÔI THÔNG NHỰA (Pinus merkusii) BẰNG
Agrobacterium tumefaciens

LÂM NGỌC VÂN THANH

Hội đồng chấm luận văn:
1. Chủ tịch:

PGS.TS TRẦN CÔNG LUẬN
Trung tâm Sâm và Dược liệu TP. HCM

2. Thư ký:

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

                                 ĐH Nông Lâm TP. HCM
3. Phản biện 1:

TS. BÙI MINH TRÍ

                                 ĐH Nơng Lâm TP. HCM 
4. Phản biện 2:

TS. LÊ THỊ DIỆU TRANG

                                 ĐH Nông Lâm TP. HCM 
5. Ủy viên:

TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

                                 Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam bộ

ĐẠI HỌC NƠNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
HIỆU TRƯỞNG

i


LÝ LỊCH CÁ NHÂN
Tôi tên Lâm Ngọc Vân Thanh sinh ngày 13 tháng 07 năm 1983 tại Bến Tre.
Con Ông Lâm Tấn Phú và Bà Nguyễn Thị Túy Vân.
Tốt nghiệp Tú tài tại Trường Trung học phổ thơng Bình Long, tỉnh Bình
Phước, năm 2001.
Tốt nghiệp Đại học ngành Cơng nghệ Sinh học hệ chính quy tại Đại học

Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh năm 2006.
Từ năm 2007 đến nay theo học Cao học ngành Công nghệ Sinh học tại Đại
học Nơng Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Tình trạng gia đình: Độc thân.
Địa chỉ liên lạc: 19/30 Nguyễn Cửu Đàm, P. Tân Sơn Nhì Q. Tân Phú TP
HCM.
Điện thoại: 0918448221
Email:

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tơi cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tôi.
Các số liệu, kết quả trong luận văn là trung thực.
Ký tên

Lâm Ngọc Vân Thanh

iii


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin chân thành bày tỏ lịng cảm ơn sâu sắc đến:
Q Thầy Cơ trường Đại học Nơng Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tận tâm hướng
dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Thầy Vương Đình Tuấn và thầy Lê Đình Đơn đã tận tình hướng dẫn tơi
hồn thành cơng trình nghiên cứu này.
Q Nhà trường, Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học và
Môi trường, Phân viện nghiên cứu khoa học Lâm nghiệp Nam bộ, Viện Sinh học

Nhiệt đới và Phòng Sau Đại học đã tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành khóa
học.
Anh Nguyễn Xn Cường và chị Phan Thị Mỵ Lan đã giúp đỡ tôi trong thời
gian thực tập.
Gia đình, các bạn đã động viên, chia sẻ và góp ý cho tơi trong suốt q trình
học tập và nghiên cứu.

iv


TÓM TẮT
Đề tài: “Nghiên cứu chuyển gen Bt (CryIAb) vào phôi trưởng thành và tiền
phôi thông nhựa (Pinus merkusii) bằng Agrobacterium tumefaciens” được tiến hành
tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, đại học Nông Lâm
TPHCM, Phân viện khoa học kỹ thuật lâm nghiệp Nam bộ và Viện Sinh học Nhiệt
đới TP HCM, thời gian từ tháng 8/2009 đến 5/2011. Mục tiêu của đề tài là tạo được
vật liệu biến nạp mang gen Cry IAb đồng thời xác định được một vài thơng số phục
vụ q trình chuyển gen và chọn lọc vật liệu biến nạp gen.
Kết quả cho thấy nồng độ kanamycin thích hợp chọn lọc phơi trưởng thành
thơng nhựa dịng 6 là 60 mg/l, tiền phôi soma thông nhựa là 35 mg/l. Nồng độ
timentin để diệt khuẩn dư đối với phơi trưởng thành dịng 6 và tiền phơi soma dịng
31 là 400 mg/l. Đối với q trình biến nạp gen vào phơi trưởng thành có sự tương
tác giữa thời gian đồng nuôi cấy và nồng độ vi khuẩn, OD600nm= 0,9 kết hợp với 3
ngày đồng nuôi cấy cho kết quả thể hiện GUS cao nhất. Tuy nhiên, phôi sau biến
nạp không phát triển hay chết dần trên môi trường chọn lọc chứa kanamycin.
Trong biến nạp gen vào tiền phơi soma thơng nhựa dịng 31, có sự tương tác
giữa từng cặp yếu tố và cả ba yếu tố: thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy
và mật số vi khuẩn. Thực nghiệm cho thấy tiền phơi soma dịng 31 biến nạp với thời
gian lây nhiễm 90 phút, OD600nm= 0,6 và đồng nuôi cấy trong tối 2 ngày cho kết quả
tốt nhất. Tiền phôi chuyển gen phát triển trên môi trường chọn lọc bổ sung

kanamycin trong 8 tuần, tỷ lệ thể hiện GUS từ 75 – 100% số cụm tiền phôi. Kết quả
phản ứng PCR đã ghi nhận sự hiện diện của gen Cry1Ab (khoảng 520 bp) trong tế
bào tiền phôi biến nạp gen.

v


SUMMARY
The study on “Transformation Bt (CryIAb) gene into zygotic embryos and
embryogenic tissues of Pinus merkusii Jungh & De Vries by Agrobacterium
tumefaciens” was carried out at the Research Institute for Biotechnology and
Environment (Nong Lam University), Forestry Science Sub-Institute of South
Vietnam, Institute of Tropical Biology Ho Chi Minh city. Aim of the study is to
obtain transgenic lines of Pinus merkussi carrying Cry IAb gene and to find out
important factors necessary for transformation and selection processes.
The results showed that kanamycin at 60mg/l was an appropriate concentration
for selection of the transformed zygotic embryos and 35 mg/l for embryogenic
tissues. Timentin, an another antibitotic, at 400 mg/l was suitable for elimination of
exceeded A. tumefaciens.
The data also revealed that there was an interaction between time of cocultivation and concentration of the bacteria i.e. concentration of OD600nm= 0,9 in
combination with a 3 day co-cultivation resulted in the highest GUS expression.
However, transformed embryos did not develop or died slowly on the selective
medium afterwards.
Experiments on transforming CryIAb gene into embryogenic tissues of the line
No. 31, on the other hands, had also shown that there was an interaction between
each pair of factors and three factors: time of infection, co-cultivation time and
concentration of bacteria. The results showed that infection of 90 minutes with
concentration of OD600nm= 0,6 then cocultivation for 2 day in the dark produced the
best GUS expression. Samples from the transformed materials cultured eight weeks
on the selection medium showed GUS expression from 75 to 100% . PCR reaction

with primers corresponding to Cry1Ab gene has confirmed presence of CryIAb in
the transformed materials with 520bp.

vi


MỤC LỤC
CHƯƠNG

TRANG

Trang tựa
Trang Chuẩn Y............................................................................................. i
Lý Lịch Cá Nhân..........................................................................................ii
Lời Cam đoan ...........................................................................................iii
Lời Cảm ơn ............................................................................................... iv
Tóm tắt ....................................................................................................... v
Summary ................................................................................................... vi
Mục lục .................................................................................................... vii
Danh sách từ viết tắt ................................................................................. xi
Danh sách các hình .................................................................................xiii
Danh sách các bảng .................................................................................. xiv
1. MỞ ĐẦU ........................................................................................................ 1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và yêu cầu ...................................................................................... 2
1.2.1 Mục tiêu ..................................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu....................................................................................................... 2
1.2.3 Giới hạn đề tài ............................................................................................ 2
2. TỔNG QUAN ................................................................................................ 3
2.1 Thông nhựa ................................................................................................... 3

2.1.1 Phân loại ..................................................................................................... 3
2.1.2 Đặc điểm .................................................................................................... 3
2.1.3 Tình hình phân bố và giá trị sử dụng của thông nhựa................................ 4

vii


2.1.4 Tiền phơi soma ........................................................................................... 6
2.1.5 Tình hình nghiên cứu giống thông kháng sâu bệnh hiện nay .................... 7
2.2 Giới thiệu về gen Cry .................................................................................... 8
2.2.1 Bacillus thuringensis .................................................................................. 8
2.2.2 Gen cry ..................................................................................................... 10
2.2.3 Tạo dịng vơ tính gen Cry......................................................................... 11
2.3 Kỹ thuật biến nạp gen ................................................................................. 12
2.3.1 Phương pháp trực tiếp .............................................................................. 12
2.3.2 Phương pháp gián tiếp.............................................................................. 13
2.3.2.1 Đặc điểm Agrobacterium tumefaciens ................................................. 14
2.3.2.2 Cơ sở phân tử của phương pháp chuyển gen gián tiếp
thông qua Agrobacterium tumefaciens ............................................... 14
2.3.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong cải thiện giống cây rừng .............. 16
2.3.3.1 Thành tựu biến nạp gen trong lâm nghiệp ......................................... 16
2.3.3.2 Thành tựu biến nạp gen trên thông ..................................................... 17
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................ 20
3.1 Nội dụng .................................................................................................... 20
3.2 Thời gian và địa điểm................................................................................ 20
3.2.1 Thời gian ................................................................................................ 20
3.2.2 Địa điểm ................................................................................................. 20
3.3 Vật liệu, dụng cụ và hoá chất .................................................................... 20
3.3.1 Vật liệu ................................................................................................... 20
3.3.2 Dụng cụ và thiết bị ................................................................................. 21

3.3.2.1 Dụng cụ và thiết bị dùng cho quá trình chuyển gen ........................... 21

viii


3.3.2.2 Dụng cụ và thiết bị dùng cho tách chiết DNA và phản ứng PCR ....... 22
3.3.3 Hóa chất ................................................................................................. 22
3.3.3.1 Môi trường nuôi vi khuẩn ................................................................... 22
3.3.3.2 Môi trường nuôi cấy ............................................................................ 23
3.3.3.3 Dung dịch X - Gluc ............................................................................. 24
3.3.3.4 Hóa chất ly trích DNA và phản ứng PCR ........................................... 24
3.4 Phương pháp nghiên cứu........................................................................... 24
3.4.1 Chuẩn bị vi khuẩn ................................................................................. 24
3.4.2 Nghiên cứu kỹ thuật biến nạp Bt/CryIAb vào phôi trưởng thành
thông nhựa ........................................................................................... 25
3.4.2.1 Phương pháp thu phơi ......................................................................... 25
3.4.2.2 Thí nghiệm 1: Thử nghiệm nồng độ kháng sinh kanamycin
dùng chọn lọc phôi trưởng thành ........................................................ 25
3.4.2.2 Thí nghiệm 2: Đáp ứng của phơi trưởng thành với timentin
dùng để diệt vi khuẩn dư .................................................................... 26
3.4.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn
và thời gian đồng ni cấy đến q trình biến nạp ......................... 26
3.4.3 Nghiên cứu kỹ thuật biến nạp Bt/cryIAb vào
tiền phơi soma thơng nhựa ........................................................... 27
3.4.3.1 Thí nghiệm 4: Thử nghiệm nồng độ kháng sinh kanamycin
dùng chọn lọc tiền phơi soma ............................................................... 27
3.4.3.2 Thí nghiệm 5: Đáp ứng của tiền phôi soma với timentin và

ix

cefotaxime dùng để diệt vi khuẩn dư .................................................... 27
3.4.3.3 Thí nghiệm 6: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ vi khuẩn,
thời gian lây nhiễm, thời gian đồng nuôi cấy đến quá
trình biến nạp ............................................................................... 27
3.4.4 Chọn lọc tế bào tiền phôi soma đã biến nạp ............................................ 29
3.4.5 Kiểm tra kết quả biến nạp gen bằng phản ứng PCR ................................ 29
3.4.5.1 Tách chiết DNA từ tiền phôi soma ....................................................... 29
3.4.5.2 Phản ứng PCR ....................................................................................... 30
3.4.6 Phương pháp xử lý số liệu........................................................................ 30
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 31
4.1 Nghiên cứu kỹ thuật biến nạp Bt/cryIAb vào phôi
trưởng thành thông nhựa ............................................................................................. 31
4.1.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát nồng độ kanamycin dùng chọn lọc
phơi trưởng thành .................................................................................. 31
4.1.2 Thí nghiệm 2: Đáp ứng của phôi trưởng thành với timentin dùng
để loại vi khuẩn dư………………………………………………………33
4.1.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ vi
khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến quá trình biến nạp ....................... 33
4.1.4 Quá trình diệt khuẩn dư sau đồng ni cấy ............................................. 37
4.1.5 Q trình chọn lọc phôi trên môi trường chứa kanamycin ..................... 38
4.2 Nghiên cứu kỹ thuật biến nạp Bt/CryIAb vào tiền phôi soma
thông nhựa. ........................................................................................... 40
4.2.1 Thí nghiệm 4: Khảo sát nồng độ kanamycin thích hợp chọn lọc tiền
phơi soma sau biến nạp .......................................................................... 40
4.2.2 Thí nghiệm 5: Đáp ứng của tiền phơi soma đối với timentin
và cefotaxim dùng để diệt vi khuẩn dư ……………………………… 43

x

4.2.3 Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm,
nồng độ vi khuẩn và thời gian đồng ni cấy đến q trình biến nạp... 44
4.2 4 Q trình diệt khuẩn dư và chọn lọc tiền phơi soma sau biến nạp…….52
4.3 Kiểm tra kết quả chuyển gen bằng phản ứng PCR ..................................... 56
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 58
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................. 60
PHỤ LỤC

xi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS: acetosyringone
ATPase: adenosine triphosphatase
BA: 6-benzylaminopurine
Bt: Bacillus thuringinesis
bp: base pair
CaMV 35S: Cauliflower mosaic virus 35S promoter
CTAB: cetyl trimethyl ammonium bromide
Ctv: cộng tác viên
Cry: Crystal
DNA: deoxyribonucleic acid
2,4 – D: 2,4 - Dichlorophenoxyacetic acid
EDTA: etylendiamin tetra acetic acid
GUS: β - glucuronidase gene
hpt: hygromycin phospho transferase gene
LB: Luria Bertani broth
kb: kilo base
gfp: green fluorescent protein

gen vir: virulent gene
µg: microgram
µl: micro litre
nptII: neomycin phosphotransferase gene
nm: nano meter
mg: milligram
mm: milli meter
µM: micromol/litre
OD: optical density
NAA: 1-naphthaleneacetic acid

xii


PCR: Polymerase chain reaction
PEG: polyethylen glycol
pH: Hydrogen ion concentration
T - DNA: transferring DNA
TE: Tris – etylen diamin tetra acetic acid
rpm: rotations per minute
uidA: β - glucuronidase gene
X – Gluc: 5 - bromo - 4 - chloro - 3 - indolyl - β - D - glucuronic acid

xiii


DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH

TRANG

Hình 2.1 Thơng nhựa .......................................................................................... 5
Hình 2.2 Hạt chín thơng nhựa ............................................................................ 5
Hình 2.3 Tiền phơi soma thơng nhựa ................................................................. 7
Hình 3.1 Plasmid pCAMBIA 2301/CryIAb ..................................................... 21
Hình 4.1 Phôi trưởng thành trên môi trường TE bổ sung kanamycin .............. 32
Hình 4.2 Phơi trưởng thành sau đồng ni cấy ............................................... 36
Hình 4.3 Phơi trưởng thành sau đồng ni cấy quan sát dưới kính hiển vi ..... 36
Hình 4.4 Phơi trưởng thành thể hiện GUS quan sát dưới kính hiển vi ............ 36
Hình 4.5 Phơi trưởng thành trên mơi trường TE bổ sung timentin và
kanamycin ......................................................................................... 38
Hình 4.6 Phơi trưởng thành không phát triển trên môi trường chọn lọc ......... 38
Hình 4.7 Phơi trưởng thành trên mơi trường chọn lọc ..................................... 39
Hình 4.8 Tiền phơi trên mơi trường LVM bổ (10): 328 - 333.
10. Douches D.S, Li.W, Zarka D., Coombs J., Pet W., Grafius E. and Elnas T.,
2002. Development of Bt – cry5 insect resistant potato lines “Spunta – G2”
and “Spunta – G3”. Hortscience 37(7): 1103 – 1107.
11. Escobar A.M. and Denkera M.K., 2003. Agrobacterium tumefaciens as an agent
of disease. Plant Science 8(8): 380 – 386.
12. Gartland M. A. K., Crow M. R., Fenning M. T. and. Gartland S. J., 2003.
Genetically modified trees: production properties and potential. Journal of
Arboriculture 29(5): 259 – 267.
13. Ghedira R., 2010. T-DNA transfer, integration, stability and quantification in
transgenic plants. Doctor (PhD) in Sciences, Biotechnology, Grent
university, pp 1 - 38.
14. Grant J.E., Cooper P.A. and Dale T.M., 2004. Transgenic Pinus radiata from
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of cotyledons. Plant Cell
Rep 22: 894 - 902.

64


15. Grace L. J., Julia A. Charity J. A., Gresham B., Kay N.and Walter C., 2005.
Insect-resistant transgenic Pinus radiata. Plant cell rep 24: 103 – 111.
16. Gustavo A. R., Joel G. C., Roberto V. P. and Camylo A. P., 1998.
Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation.
Electronic Journal of Biotechnology 1(3).
17. Handerson A. R. and Walter C., 2007. Genetic Engineering in Conifer
Plantation Forestry. Ausgabe 55 (6): 253 – 263.
18. Hansen O.K., Kjar D.E., and Sirikul W., 2001. Geoghaphic genetic pattern of
Pinus merkusii in Thailand based on a provenance trial – implication for the
conversation of genetic resource. Forest genetic 8 (3): 237 – 243.
19. Kikuchi R., Sage – One K., Kamada H and Ono M., 2005. Efficient
transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens with a ternary
plasmid in Pharbitis nil. Plant Biotechnology 22: 295 – 302.
20. Klimaszewska K., Lachance, D., Pelletier, G., Lelu, M.-A., and Séguin, A.
(2001). Regeneration of transgenic Picea glauca, P. mariana, and P. abies
after cocultivation of embryogenic tissue with Agrobacterium tumefaciens.
In Vitro Cell. Dev Biol Plant 37: 748 – 755.
21. Lachance D., Hamel L.P., Pelletier F., Valero J., Chapman K., Frankenhuyzen
K.V. and Seguin A., 2007. Expression of a Bacillus thuringensis Cry1Ab
gene in trangenic white spruce and its efficacy against the spruce budworm
(Choristoneura fumifeana). Tree Genetics and Genomes 3: 153 - 167.

65


22. Lee M. P.,Yeun L.H. and Abdullah R., 2006. Expression of Bacillus
thuringiensis insecticidal protein gene intransgenic oil palm. Electronic

Journal of Biotechnology 9: 117 - 126.
23. Leroy T., Herry A.M., Royer M., Altosar I., Fructos R., Duris D. and Philippe
R., 2000. Genetically modified coffee plant expressing the Bacillus
thuringesis cryIAc gene for resistance to leaf miner. Plant Cell Report 19:
382 – 389.
24. Levee V., Garin E., Klimaszewska K. and Seguin A., 1999. Stable genetic
transformation of white pine (Pinus strobus L.) after cocultivation of
embryogenic tissue with Agrobacterium tumefaciens. Mol Breed 5: 429 –
440.
25. Litvay J. D., Verma, D. C., and Johnson, M. A. (1985) Influence of loblolly pine
(Pinus taeda L.) culture medium and its components on growth and somatic
embryo of the wild carrot (Daucus carota L.). Plant Cell Rep 4: 325 – 328.
26. Liu Z. X., Li H. L., Lou H. R., Zhang Y. J and Zhang Y. H., 2010. Transgenic
Pinus armandii plants containing BT obtained via electroporation of seedderived embryos. Scientific Research and Essays 5(22): 3443 – 3446.
27. Maila J., Pavingerova D., Cvrckova H., Briza J., Postal J. and Sima P., 2009.
Tolerance of Norway spruce (Picea abies [L.] Karst.) embryogenic tissue to
penicillin, carbapenem and aminoglycoside antibiotics. Journal of forest
science 55(4): 156 – 161.

66


28. Malabadi R.B.and Nataraja K., 2007a. Gene transfer by particle bombartment of
embrygenic tissue derived from vegetative shoot apices of mature trees of
Pinus roxburghii. American Journal of Plant Physiology 2: 90 - 98.
29. Malabadi R. B and Nataraja K., 2007b. Stable transformation and recovery of
transgenic plants by particle bombardment in Pinus wallichiana A. B. Jacks
(Himalayan blue pine). Biotechnology 6 (1): 105 – 111.
30. Malabadi R. B and Nataraja K., 2007c.A biolistic approach for the production of
transgenic plants using embryogenic tissue in Pinus kesiya Royle ex Gord

(Khasi pine). Biotechnology 6: 86 - 92.
31. Malabadi R. B., Jaime A.T. and Nataraja K., 2008. Agrobacterium tumefaciensmediated genetic transformation of Pinus kesiya Royle ex Gord (Khasi
pine). The Asian and Australasian Journal of Plant science and
Biotechnology 2(1): 7 - 14.
32. Maldonado G. J and Crespillo R., 2001. Efficient preparation of Maritime Pine
(Pinus pinaster) protoplasts suitable for transgene expression analysis. Plant
Molecular Biology Reporter 19: 361 – 366.
33. Mamidala P. and Nanna S.R., 2009. Influence of antibiotics on regeneration
efficiency in tomato. Plant Omics Journal 2(11): 135 – 140.
34. Merkle S. A. and Dean J. D., 2000. Forest tree biotechnology. Current Opinion
in Biotechnology 11: 298 – 302.

67


35. Patnalk P.,Vishnudasan D and Khurana P. 2006. Agrobacterium-mediated
transformation of mature embryos of Triticum aestivum and Triticum durum.
Current science 91(3): 307 – 315.
36. Parasharami V.A., Naik V.B., Arnold S.V., Nadgauda R.S.and Clapham D.H.,
2006. Stable transformation of mature zygotic embryos and regeneration of
transgenic plants of chir pine (Pinus roxbughii Sagr.). Plant Cell Rep 24: 708
- 714.
37. Poupin M. J and Jonhson P. A, 2005. Transgenic trees for new era. In Vitro
Cell. Del. Biol 41: 91 – 101
38. Rajamohan F., Hussian S.R., Cotrill Z. A., Gould F. and Dean D. H., 1996.
Mutations at Domain II, Loop 3, of Bacillus thuringiensis CryIAa and
CryIAb d-Endotoxins Suggest Loop 3 Is Involved in Initial Binding to
Lepidopteran Midguts. The Journal of Biological Chemistry 271(41): 25220
- 25226.
39. Schnepf and et al, 1998. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins.

Microbiol Mol Biol Rev 62 (3): 775 - 806.
40. Tang W., Tian Y., Ouyang F., 1997. Preliminary student on establishment of
genetic transformation system in Loblolly Pine. Journal of Forestry
Research 8: 201 - 205.
41. Tang W., Ouyang F. and Guo, 1998. Plant regeneration through organogenesis
from callus induced from mature zygotic embryo of loblolly pine. Plant Cell
Rep 17: 557 – 560.

68


42. Tang W., 2000. Genetic transformation of loblolly pine using mature zygotic
embryo by Agrobacterium tumefaciens. Journal of forestry research 11(4):
215 – 222.
43. Tang W., 2001. Conifer genetic engineering: Particle bombardment and
Agrobacterium - mediated gene transfer and its application in future forests.
Journal of forestry research 12(4): 220 – 228.
44. Tang W., Guo J. and Ouyang F., 2001. Plant regeneration from embryogenic
cultures initiated from mature loblolly pine zygotic embryos. In Vitro Cell.
Dev Bi l-Plant 37: 558 – 563.
45. Tang W. and Tian Y., 2003. Transgenic loblolly pine (Pinus taeda L.) plants
expressing a modified δ-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis with
enhanced resistance to Dendrolimus punctatus Walker and Crypyothelea
formosicola Staud. Journal of Experimental Botany 54 (383): 835 – 844.
46. Tereso S., Miguel C., Zoglauer K., Carolina V. and Oliveira M., 2006. Stable
Agrobacterium-mediated transformation of embryogenic tissues from Pinus
pinaster Portuguese genotypes. Plant Growth Regul 50: 57 – 68.
47. Tian L. and Seguin A., 2004. Microprojectile Particle Effect on Stable
Transformation of Black Spruce Via Bombardment. Plant Molecular Biology
Reporter 22: 199a –199f.

48. Tohifar M., Mosavi M., Yazdani S. and Golabchian R., 2008. Agrobacterium
mediated transformation of cotton (Gossypium hirsutum) using a synthetic
cry1Ab gene for enhanced resistance against Heliothis armigera. Iranian
Journal of Biotechnology 6(3): 164 – 172.

69


49. Trontin F., Harvengt L.,Garin E., Vernaza M., Arancio L., Hoebeke J., Canlet F.
and Paques M., 2002. Towards genetic engineering of maritime pine (Pinus
pinaster Ait.). Ann. For. Sci. 59: 687 – 697.
50. Trontin J. F., Walter C., Klimaszewska K., Park Y. J. and Walter L.A., 2007.
Recent Progress in Genetic Transformation of Four Pinus spp.Transgenic
Plant Journal 1(2): 314 – 329.
51. Walter C., Grace L. J., Wagner A., White D.W. R., Walden A. R., Donaldson
S. S., Hinton H., Gardner R.C. and Smith D. R., 1998. Stable transformation
and regeneration of transgenic plants of Pinus radiata D. Don. Plant Cell
Reports 17: 460 – 468.
52. Xing J. Y., Ji Q., Yang Q., Luo M. Y., Li Q. and Wang X., 2008. Studies on
Agrobacterium - mediated genetic transformation of embryogenic suspension
cultures of sweet potato. African Journal of Biotechnology 7 (5): 534 – 540.
Website
53. www.caycanhthanglong.com.vn/A71B2295/cay-thong-hai-la-thong-nhua.html

70


PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: Thành phần môi trường TE (Tang và ctv, 2000)
NH4NO3 400 mg.l-1, KNO3 340 mg.l-1, MgSO4 720 mg.l-1, KH2PO4 170mg.l-1, KCl

1900 mg.l-1,Ca(NO3)2556 mg.l-1,CaCl2 64,18 mg.l-1, FeSO4 27,8 mg.l-1, Na.EDTA
37,26 mg.l-1, KI 0,83 mg.l-1, H3BO3 6,2mg.l-1, MnSO4 25,5mg.l-1, ZnSO4 25,8 mg.l1

, Na2MnO4 0,25 mg.l-1, CuSO4.5H2O 0,025 mg.l-1, NiCl2 0,025 mg.l-1, myo-

inositol 0,1 mg.l-1, glycine 0,5 mg.l-1, nicotine 0,5 mg.l-1, pyridoxyl 0,1 mg.l-1,
glucose 30 g.l-1, agar 8 g.l-1.
PHỤ LỤC 2: Thành phần môi trường LVM (Livay và ctv, 1985)
NH4NO3 820 mg.l-1, KNO3 950 mg.l-1, MgSO4 925 mg.l-1, KH2PO4 17 mg.l-1, CaCl2
1,1 mg.l-1, KI 4,15 mg.l-1, H3BO3 31 mg.l-1, MnSO4 21 mg.l-1, ZnSO4 43 mg.l-1,
Na2MoO4 1,25 mg.l-1, CuSO4.5H2O 0,5 mg.l-1, CoCl2 .6H2O 0,13 mg.l-1, Fe-EDTA
40 mgl-1, thiamin 0,1 mg.l-1, nicotine acid 0,5 mg.l-1, pyridoxyl 0,1 mg.l-1, myo inositol 10 mg.l-1.
PHỤ LỤC 3: Kết quả thí nghiệm 1: tỷ lệ phơi trưởng thành (%) sống trên môi
trường TE bổ sung kanamycin
NT

Sau 2 tuần

Sau 4 tuần

Lần 1 Lần 2 Lần 3

Lần 1 Lần 2

Sau 6 tuần
Lần 3 Lần 1

Lần 2 Lần 3

T1(đc)

100

100

100

100

100

100

90

90

100

T2

100

100

100

70

70

80

40

50

40

T3

100

90

100

60

70

60

30

30

40

T4

100

100

90

50

60

40

20

30

20

T5

90

90

100

40

30

40

0

0

0

Kiểm tra sự đồng nhất về biến lượng
Tests for Homogeneity of Variances
---------------------------------Cochran's C test: 0.25
P = 1
Bartlett's test: B = 1
P(0) = 1
Hartley's test: 1

P> 0,05 nên biến lượng các nghiệm thức đồng nhất, không cần chuyển đổi dữ liệu.


3.1 Kết quả thống kê thí nghiệm 1: tỷ lệ phôi trưởng thành (%) sống sau 2 tuần
trên môi trường TE bổ sung kanamycin


One-Way Analysis of Variance
------------------------------------------------------------------------------Data: KA61.var2
Level codes: KA61.NT
Labels:
Means plot: LSD
Confidence level: 95

Range test: Duncan
Analysis of variance
---------------------------------------------------------------------------Source of variation
Sum of Squares
d.f.
Mean square
F-ratio Sig.
level
---------------------------------------------------------------------------Between groups
93.33333
4
23.333333
1.167
.3818
Within groups
200.00000
10
20.000000
---------------------------------------------------------------------------Total (corrected)
293.33333
14
0 missing value(s) have been excluded.
Multiple range analysis for KA61.var2 by KA61.NT
---------------------------------------------------------------------------Method: 95 Percent Duncan
Level
Count
Average
Homogeneous Groups
---------------------------------------------------------------------------T5
3

93.333333
X
T3
3
96.666667
X
T4
3
96.666667
X
T1
3
100.000000
X
T2
3
100.000000
X
------------------------------------------------------------------------------contrast
difference
limits
T1 - T2
0.00000
8.13818
T1 - T3
3.33333
8.13818
T1 - T4
3.33333
8.13818

T1 - T5
6.66667
8.13818
T2 - T3
3.33333
8.13818
T2 - T4
3.33333
8.13818
T2 - T5
6.66667
8.13818
T3 - T4
0.00000
8.13818
T3 - T5
3.33333
8.13818
T4 - T5
3.33333
8.13818
---------------------------------------------------------------------------* denotes a statistically significant difference.