PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

NGUYỄN HƯNG


PCR
• Phương pháp PCR (Polymerase Chain
Reaction) do Karl Mullis và cộng sự phát minh
năm 1985. Thực chất đây là một phương pháp
tạo dòng in vitro không cần sự hiện diện của
tế bào.
• Ngày nay, PCR được dùng rất phổ biến trong
lĩnh vực sinh học.


Thành phần của phản ứng PCR
1. Primer (mồi)
2. DNA bản mẫu
3. MgCl2
4. dNTP
5. Enzyme
6. Thành phần khác


Enzyme dùng trong phản ứng PCR
Có nhiều enzym khác nhau được chọn tùy mục đích sử dụng:
Taq DNA polymerase (Thermus aquaticus)
Stoffel DNA polymerase
Vent/DeepVent DNA polymerase (Thermococcus litoralis)
Pfu DNA polymerase (Pyrococcus furiosus)
Tth DNA polymerase

UITma DNA polymerase


Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR

Ống eppendorf “ thành mỏng”

đầu típ có phin lọc


Chu trình nhiệt phản ứng PCR


Chu kỳ 1


Chu kỳ 2


Chu kỳ 3


Chu kỳ ……30 chu kỳ (Thường 40 chu kỳ)


Những hạn chế của phương pháp PCR
Giới hạn về kích thước của trình tự cần
khuếch đại
Sai sót của DNA polymerase trong quá trình
tổng hợp

 Ngoại nhiễm cao
Phụ thuộc rất lớn về thao tác
Thiết bị đắt tiền


MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP PCR
•RT-PCR
•Inverse PCR
•Nested PCR/semi nested PCR
•Multiplex PCR
•AP-PCR
•3’/5’ RACE PCR
•In situ PCR
•Real- time PCR
•Recombinant PCR


RT-PCR



Reverse transcriptase ( Enzyme phiên mã ngược)
Enzyme được sử dụng phổ biến nhất:
 AMV- RT ( Avian Myeloblastosis Virus) : là bền vững, chịu
nhiệt tốt ( -> 55oC
MMLV –RT ( Moloney Murin Leukaemia Virus) : hoạt tính
RNase H thấp hơn


Nested PCR/semi nested PCR

Sử dụng một cặp mồi “ ngoài” và 1 mồi/1 cặp mồi “ trong” để tăng tính đặc hiệu
và độ nhạy của phản ứng PCR


Multiplex PCR
Sử dụng nhiều hơn 1 cặp mồi trong 1 phản ứng PCR để phát hiện đồng thời
nhiều trình tự DNA của một tác nhân hay nhiều tác nhân


Inverse PCR ( PCR “đảo”)


AP-PCR ( Arbitrary Primed PCR)/ RAPD ( Random
Amplified polymorphic DNA)
Sử dụng tổ hợp các primer “ ngẫu nhiên” để xác định “ dấu ấn di truyền”
của loài


3’/5’ RACE ( Rapid Amplification of cDNA Ends)
Nhân bản hai đầu mút 5’ và 3’ của một trình tự exon với một mồi đặc
hiệu và một mồi “chung”


In situ PCR
Thực hiện phản ứng PCR ngay trên mô / tế bào

In situ PCR


In situ RT - PCR

Recombinant PCR ( PCR tái tổ hợp)