Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUNG

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG
THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG
TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ DUNG
1301056

XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
IMIPENEM VÀ CILASTATIN TRONG
THUỐC TIÊM BẰNG SẮC KÍ LỎNG
TƯƠNG TÁC THÂN NƯỚC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Vũ Ngân Bình
Nơi thực hiện:
Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất

HÀ NỘI - 2018

LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ các thầy cô giáo, gia
đình và bạn bè. Cho đến nay khi khoá luận đã hoàn thiện, tôi xin phép được bày tỏ
lòng biết ơn sâu sắc và chân thành nhất đến họ.
Đầu tiên, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới ThS. Vũ Ngân Bình - Bộ môn Hóa
phân tích và Độc chất - Trường Đại học Dược Hà Nội, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ
bảo và động viên tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm. Tôi cũng xin bày tỏ lòng
kính trọng và biết ơn tới PGS.TS Phạm Thị Thanh Hà và PGS.TS Vũ Đặng Hoàng
đã tận tình hướng dẫn, chỉ ra hướng nghiên cứu trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên ở
Bộ môn Hóa phân tích - Độc chất và Bộ môn Vật lý - Hóa lý đã tạo điều kiện cho tôi
thực hiện khóa luận.
Tôi cũng xin cảm ơn Ban giám hiệu, các phòng ban, các thầy cô giáo và các cán
bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội - những người đã dạy bảo và trang bị cho
tôi những kiến thức khoa học nền tảng trong suốt năm năm học qua.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên
tôi vượt qua những khó khăn trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Hà Nội, ngày 18 tháng 05 năm 2018
Sinh viên

Nguyễn Thị Dung


MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Tổng quan về imipenem và cilastatin ........................................................ 2
1.1.1. Đặc điểm của imipenem và cilastatin ................................................. 2
1.1.2. Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin ..... 3
1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước .......................................... 5
1.2.1. Pha tĩnh ............................................................................................... 5
1.2.2. Pha động ............................................................................................. 6
1.2.3. Cơ chế tách.......................................................................................... 7
1.2.4. Ưu điểm ............................................................................................... 8
1.2.5. Nhược điểm ......................................................................................... 9
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 10
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 10
2.2. Nguyên vật liệu ........................................................................................ 10
2.2.1. Hóa chất ............................................................................................ 10
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ ................................................................................ 10
2.2.3. Chuẩn bị mẫu .................................................................................... 11
2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động ............................................................ 12
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 12


2.3.1. Phương pháp nghiên cứu .................................................................. 13
2.3.2. Thẩm định phương pháp ................................................................... 15
2.4. Áp dụng phương pháp .............................................................................. 18
2.5. Xử lý kết quả ............................................................................................ 18
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ...................... 19
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký ......................................................................... 19
3.1.1. Khảo sát pha tĩnh ............................................................................. 19
3.1.2. Khảo sát pha động ............................................................................ 20
3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu ............................................................. 23
3.1.4. Khảo sát về thể tích tiêm mẫu .......................................................... 23

3.1.5. Lựa chọn bước sóng phát hiện .......................................................... 24
3.2. Phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin ....................... 24
3.3. Thẩm định phương pháp .......................................................................... 25
3.3.1. Độ phù hợp hệ thống ......................................................................... 25
3.3.2. Độ chọn lọc ....................................................................................... 25
3.3.3. Khoảng nồng độ tuyến tính ............................................................... 26
3.3.4. Độ lặp lại........................................................................................... 28
3.3.5. Độ đúng ............................................................................................. 29
3.3.6. Độ thô ................................................................................................ 31
3.4. Ứng dụng phương pháp phân tích chế phẩm trên thị trường ................... 32
3.4.1. Công thức tính ................................................................................... 32
3.4.2. Kết quả định lượng ............................................................................ 32
3.5. Bàn luận chung ......................................................................................... 33


3.5.1. Ưu điểm của phương pháp ................................................................ 33
3.5.2. Nhược điểm của phương pháp .......................................................... 34
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................... 35
4.1. Kết luận .................................................................................................... 35
4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 35


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên tiếng Anh

Tên tiếng Việt

ACN

Acetonitrile

Acetonitril

CIL

Cilastatin

Cilastatin

DHP-1

Enzyme dehydropeptidase-I

Enzym dehydropeptidase-I

HILIC

Hydrophilic Interaction Chromatography Sắc ký lỏng tương tác thân nước

HPLC

High Performance Liquid

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chromatography
IMI

Imipenem

Imipenem

IPC

Ion – pair Chromatography

Sắc kí tạo cặp ion

NPLC

Normal Phase Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng pha thuận

LC-MS

Liquid Chromatography - Mass

Sắc kí lỏng khối phổ

Spectrometry
RPLC

Reversed Phase Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng pha đảo

UV

Ultraviolet

Tử ngoại


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI và CIL ......................................................... 2
Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng ............. 4
Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát ........................................................ 14
Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn .................................................. 16
Bảng 2.3. Quy trình pha các mẫu chạy của độ đúng........................................... 18
Bảng 3.1. Kết quả độ phù hợp hệ thống………………………………………..25
Bảng 3.2. Kết quả độ chọn lọc ............................................................................ 26
Bảng 3.3. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính.................................................... 26
Bảng 3.4. Kết quả độ lặp lại trong ngày và khác ngày ....................................... 29
Bảng 3.5. Kết quả độ đúng của CIL .................................................................... 30
Bảng 3.6. Kết quả độ đúng của IMI .................................................................... 30
Bảng 3.7. Kết quả độ thô ..................................................................................... 31
Bảng 3.8. Kết quả định lượng imipenem trong chế phẩm .................................. 33
Bảng 3.9. Kết quả định lượng cilastatin trong chế phẩm .................................... 33


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin ..................................................... 3
Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC ....................................................................... 7
Hình 3.1. Kết quả khảo sát pha tĩnh .................................................................... 19
Hình 3.2. Kết quả khảo sát thành phần pha động ............................................... 20
Hình 3.3. Kết quả khảo sát tốc độ dòng .............................................................. 23
Hình 3.4. Phổ hấp thụ của IMI………………………………………................24

Hình 3.5. Phổ hấp thụ của CIL…………………………………………………24
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của Cilastatin ................................................................................................. 27
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích
pic của imipenem ................................................................................................ 28


ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong công tác phòng và điều trị
bệnh, đặc biệt là các bệnh do nhiễm khuẩn. Các kháng sinh nhóm β-lactam được sử
dụng rất phổ biến ở Việt Nam nhưng tỷ lệ vi khuẩn kháng thuốc cũng khá cao, trong
số đó có imipenem [5]. Imipenem có phổ tác dụng rất rộng trên phần lớn các vi khuẩn
Gram dương, Gram âm, ưa khí, kị khí và bền vững với các β-lactamase của vi khuẩn
nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp cấp cứu nặng,
khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. Tuy nhiên, nó lại bị phân hủy bởi enzym
dehydropeptidase-I (DHP-I) ở ống thận, do vậy nó thường được kết hợp với cilastatin,
một chất ức chế DHP-I, trong các chế phẩm thuốc tiêm [3],[16]. Theo Cục Quản lí
Dược Việt Nam, từ năm 2010 đến tháng 12 năm 2015 có 15 số đăng kí trong nước và
47 số đăng kí nước ngoài với chế phẩm chứa hai hoạt chất trên [4]. Để đảm bảo được
hiệu quả điều trị của imipenem trong lâm sàng cũng như giảm tỷ lệ vi khuẩn kháng
thuốc, cần kiểm soát tốt hàm lượng của imipenem trong các chế phẩm được sản xuất
và lưu hành tại Việt Nam.
Imipenem và cilastatin chủ yếu được phân tích bằng kỹ thuật sắc kí tạo cặp ion vì
chúng có độ phân cực cao [2],[13],[20]. Tuy nhiên, kỹ thuật này có nhược điểm là sử
dụng chất tạo cặp ion có khả năng lưu giữ trên cột rất tốt nên thông thường sẽ không
thể dùng cột để phân tích pha đảo với đối tượng khác [8]. Một kỹ thuật khác có thể
dùng để phân tích hai hợp chất trên là sắc kí lỏng tương tác thân nước (HILIC). HILIC
sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh phân cực nên lưu giữ tốt các hợp chất phân cực
như imipenem và cilastatin. Theo tôi tìm hiểu, tính đến nay trên thế giới mới có một số
ít nghiên cứu sử dụng HILIC để định lượng imipenem và cilastatin trong chế phẩm,

còn tại Việt Nam hiện chưa có nghiên cứu nào được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề
tài: “Xây dựng phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc tiêm
bằng sắc kí lỏng tương tác thân nước” với hai mục tiêu chính:
1. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích imipenem và cilastatin trong thuốc
tiêm bằng HILIC.
2. Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng imipenem và cilastatin trong một
chế phẩm thuốc tiêm trên thị trường.

1


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về imipenem và cilastatin
1.1.1. Đặc điểm của imipenem và cilastatin
Imipenem (IMI) là một kháng sinh carbapenem trong nhóm β-lactam, có phổ tác
dụng rất rộng nên được sử dụng như là kháng sinh hàng thứ ba cho những trường hợp
cấp cứu nặng, khi các thuốc khác không có hiệu quả [3]. IMI thường được kết hợp với
cilastatin (CIL) để ức chế sự phân huỷ của IMI ở thận bởi enzyme DHP-I. Đặc điểm
cấu tạo và một số tính chất lý hóa của IMI và CIL được liệt kê trong bảng 1.1.
Bảng 1.1. Một số đặc điểm của IMI và CIL
Đặc điểm

IMI

CIL

Công thức cấu
tạo

Công thức

C12H17N3O4S

C16H26N2O5S

299,3

358,4

Acid (5R,6S)-6-[(R)-1-hydroxy

acid (Z)-7-[[(R)-2-amino-2-

ethyl]-3-[[2[(iminomethyl)

carboxyethyl]sulphanyl]-2-

phân tử
Phân tử lượng
(g/mol)
Danh pháp

amino]ethyl]sulphanyl]-7-oxo-1- [[[(1S)-2,2-dimethylcyclopropyl]
azabicyclo[3.2.0]hept-2-en-2-

carbonyl]amino]hept-2-enoic

carboxylic
Tính chất vật lí Bột màu trắng, trắng ngà hay Bột vô định hình màu trắng hay
vàng nhạt. Hơi tan trong nước, hơi vàng, hút ẩm. Rất dễ tan trong

khó tan trong methanol [2].

nước và methanol, khó tan trong
ethanol khan [2].

Tính chất hóa

pka1 = 3,2 và pka2 = 9,9.

pka1 = 2,53 và pka2 = 9,14.

học

Lg P = -3,9 [24].

Lg P = -1,3 [23].

Độ ổn định

Bị phân hủy trong môi trường
acid và base.

2


Hiện nay, tại Việt Nam có nhiều chế phẩm chứa hỗn hợp IMI và CIL đang được
lưu hành. Các hàm lượng hay được sử dụng là IMI 500 mg (hoặc 750 mg) và CIL 500
mg (hoặc 750 mg) với dạng bột để pha tiêm bắp; IMI 250 mg (hoặc 500 mg) và CIL
250 mg (hoặc 500 mg) với dạng bột để pha tiêm truyền tĩnh mạch [3].
1.1.2. Một số phương pháp phân tích đồng thời imipenem và cilastatin

Trên thế giới có một số nghiên cứu về phân tích đồng thời IMI và CIL trong chế
phẩm. Phương pháp quang phổ đạo hàm được áp dụng để phân tích đồng thời hai chất
này [9],[17]. Tuy nhiên, do IMI dễ bị phân hủy thành thienamycin [16] có cấu trúc gần
giống IMI (hình 1.1) nên việc sử dụng phương pháp quang phổ đạo cần cân nhắc tới
khả năng bị phân hủy của IMI.

Hình 1.1. Công thức cấu tạo của Thienamycin
Kĩ thuật sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay được sử dụng để phân tích IMI và
CIL trong chế phẩm do có thể tách riêng được tạp chất. IMI và CIL là những hợp chất
phân cực có khả năng hấp thu ánh sáng vùng tử ngoại (UV) nên phương pháp hay
được sử là sắc kí tạo cặp ion (IPC) và HILIC kết nối với detector tử ngoại. Trong đó,
IPC được sử dụng phổ biến hơn và được quy định trong một số dược điển [2],[13],[20].
Chất tạo cặp ion được sử dụng ở đây là natri hexansulfonat do nó có khả năng tạo cặp
với các nhóm chức amin của IMI và CIL. Sản phẩm tạo thành sau khi tạo cặp ion có
độ phân cực kém hơn so với IMI và CIL, do đó chúng được lưu giữ tốt hơn trên pha
tĩnh kém phân cực. Việc sử dụng kĩ thuật sắc kí tạo cặp ion có ưu điểm là sử dụng các
loại cột pha đảo thông dụng hiện nay. Tuy nhiên, nó có nhược điểm là chất tạo cặp ion
lưu giữ rất tốt trong cột, do vậy thường không thể sử dụng cột để phân tích pha đảo.
HILIC là kĩ thuật mới hơn có khả năng phân tích trực tiếp IMI và CIL do có khả năng
lưu giữ tốt các chất phân cực. Bảng 1.2 tóm tắt một số thông tin về các nghiên cứu ở
Việt Nam và trên thế giới về phân tích đồng thời IMI và CIL bằng sắc kí lỏng.

3


Bảng 1.2. Một số nghiên cứu về phân tích IMI và CIL bằng sắc kí lỏng
STT

Tác giả

Phương

Điều kiện tiến hành

pháp

Pha tĩnh

Pha động

Kết quả
Bước

tR CIL

tR IMI

sóng
1

2

Dược điển

Cột C18 (250 x 4,6

Natri hexansulfonat trong dung dịch đệm

Việt Nam V

mm, 10 µm) duy trì

phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng 2 ml/phút.

[2]

ở 50 ± 1oC.

Dược điển

IPC

IPC

Nhật 16 [13]

Cột C8 (200 x 4,6

Acid 3-(N-morpholino) propansulfonic,

mm, 10 µm) duy trì

natri 1-hexan sulfonat và dinatri dihydrogen

ở khoảng 50oC.

ethylendiamin tetracetat dihydrat trong

254 nm

Khoảng

250 nm

3 phút

nước, pH 7,0.
3

USP 38 [20]

IPC

Cột C18 (300 x 4,6 Natri 1-hexansulfonat trong dung dịch đệm

254 nm

mm) duy trì ở 50 ± phosphat pH 6,8. Tốc độ dòng khoảng 2 ml/

4

Natalija
Nakov [16]

HILIC

1oC.

phút.

Cột Purospher

Hỗn hợp ACN : amoni format (45 mM, pH

STAR (150 × 4,6

5,5) = 68:32 (v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút.

mm, 5 µm) duy trì ở
25°C.

4

254 nm

3,5 phút

4,8 phút


Trên thế giới hiện nay mới có một số ít nghiên cứu sử dựng HILIC để phân tích
IMI và CIL trong chế phẩm. Nghiên cứu của N. Nakov [16] sử dụng pha động gồm
hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch đệm amoni format 45 mM, pH 5,5 để phân tích
IMI và CIL trong chế phẩm cho kết quả về thời gian lưu của các chất ngắn (dưới 5
phút). Tuy nhiên, nghiên cứu này còn hạn chế là hệ số kéo đuôi của cilastatin lớn
(AS(CIL)= 1,6), hệ số chắn của đường chuẩn cao (Y-intercept của CIL và IMI lần lượt là
-2,6% và -8,8%). Hiện nay ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về phân tích IMI và
CIL trong chế phẩm bằng HILIC được công bố. Vì vậy, tôi tiến hành đề tài với mục
đích xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong chế phẩm bằng HILIC và cải
thiện được các hạn chế của nghiên cứu trên.

1.2. Tổng quan về sắc kí lỏng tương tác thân nước
HILIC là kĩ thuật sắc kí lỏng sử dụng pha tĩnh phân cực giống sắc kí lỏng pha
thuận (NPLC) và pha động phân cực giống sắc kí lỏng pha đảo (RPLC) [7]. So với
RPLC, HILIC có khả năng lưu giữ tốt hơn các chất phân cực. So với NPLC, HILIC sử
dụng dung môi pha động ít độc hại hơn và tăng khả năng hòa tan các chất phân cực.
Đối tượng phân tích của HILIC thường là các hợp chất phân cực, như các acid amin
[6], peptid [14], kháng sinh [21], carbohydrat [10]…
1.2.1. Pha tĩnh
Pha tĩnh sử dụng trong HILIC là những bề mặt phân cực, phổ biến nhất là silica và
dẫn xuất của nó. Ngoài ra, các pha tĩnh polyme cũng có thể được sử dụng trong HILIC
[7]. Tuy nhiên, có thể do giá thành đắt và độ phân giải thấp hơn so với các cột silica
nên số lượng cột polyme trên thị trường cũng như các nghiên cứu về HILIC trên cột
polyme là không nhiều.
Dựa vào cấu tạo hóa học, pha tĩnh silica lại được chia thành 2 loại là silica không
dẫn xuất và silica dẫn xuất hóa.
- Silica không dẫn xuất:
Hạt silica có chứa nhóm silanol (-SiOH), đóng vai trò thiết yếu tạo nên bề mặt
phân cực của silica. Ưu điểm của pha tĩnh silica không dẫn xuất là không bị pha động
có pH thấp thủy phân, cắt các liên kết và rửa trôi như các pha tĩnh pha liên kết. So với
RPLC, các pha tĩnh silica không dẫn xuất cải thiện độ nhạy 2 đến 10 lần khi tách các hợp
chất phân cực [8]. Nhược điểm của nó là có thể xảy ra hiện tượng quá tải cột.

5


- Silica dẫn xuất hóa: Theo trạng thái tích điện, pha tĩnh silica dẫn xuất hóa được chia
thành các nhóm sau:
+ Trung tính: amid, diol, cyanopropyl, cyclodextrin…
+ Lưỡng cực: sulfoalkyl betain…
+ Tích điện dương: amino propyl, silica bao latex…

+Tích điện âm: silica liên kết poly(succinimid), poly aspartic, poly hydroxyethyl A,
poly sulfoethyl A.
Pha tĩnh silica không dẫn xuất được sử dụng phổ biến hơn loại dẫn xuất hóa do rẻ
hơn và khả năng lưu giữ tốt với nhiều chất.
1.2.2. Pha động
HILIC sử dụng pha động là các dung môi hữu cơ thân nước như acetonitril (ACN)
cùng với một lượng nhỏ nước [7]. Hỗn hợp 60 - 97% ACN trong nước hoặc đệm dễ
bay hơi thường được sử dụng. Với pha tĩnh silica trần, lượng nước yêu cầu ít nhất là 3%
đủ để hydrat hóa hoàn toàn các hạt pha tĩnh [18]. Tuy nhiên, bất kỳ một dung môi
không proton đồng tan với nước nào cũng có thể được sử dụng làm pha động cho
HILIC (ví dụ như dioxan hoặc tetrahydrofuran). Alcol cũng có thể được sử dụng, tuy
nhiên cần dùng ở nồng độ cao để đạt được cùng một mức độ lưu giữ các chất phân tích
so với các dung môi khác [11].
Dưới đây là danh sách các dung môi theo chiều tăng lực rửa giải:
Aceton < isopropanol ~ propanol < acetonitril < ethanol < dioxan < dimethyl
formamid ~ methanol < nước [7].
Thông thường, khi giảm độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian lưu của
chất phân tích.
Đệm thường được sử dụng để kiểm soát pH pha động và lực ion. Trong HILIC,
chúng làm thay đổi sự phân cực của chất phân tích và pha động, cũng như trạng thái
tồn tại của bề mặt pha tĩnh, dẫn đến những thay đổi khác biệt trong việc lưu giữ, do
vậy làm thay đổi thời gian lưu của chất phân tích. Đối với chất phân tích có nhiều dạng
ion hóa, như thuốc kháng sinh aminoglycosid, pH thường được điều chỉnh để đảm bảo
rằng các chất phân tích chỉ tồn tại một dạng ion duy nhất [7]. Đối với các chất phân
tích trung tính (ví dụ carbohydrat) không cần sử dụng đệm trong pha động. Nếu trong
cơ chế kiểm soát việc lưu giữ có sự đóng góp của tương tác ion, nồng độ đệm tăng sẽ

6

làm giảm thời gian lưu. Trong trường hợp tương tác ion không ảnh hưởng đến việc lưu
giữ, tăng nồng độ đệm sẽ làm tăng thời gian lưu, ảnh hưởng đến solvat hóa cũng như
hình dạng pic sắc ký (pic kéo đuôi, khả năng phục hồi pha tĩnh kém). Nồng độ đệm
thường sử dụng là 2-20 mM (nồng độ 20 mM chỉ sử dụng trong trường hợp tỷ lệ dung
môi hữu cơ trong pha động nhỏ hơn 90%) [19]. Các loại đệm hay được sử dụng là đệm
acetat và đệm format do có khả năng bay hơi, thuận lợi trong việc kết nối với detector
khối phổ. Đệm phosphat ở nồng độ thấp cũng có thể được sử dụng trong trường hợp
phân tích không sử dụng detector khối phổ. Đệm phosphat có ưu điểm là có khoảng
pH đệm rộng do dó phân tách tốt nhiều chất, tuy nhiên lại dễ bị tủa trong ACN tỷ lệ
cao. Việc sử dụng các muối khác (chẳng hạn như natri perclorat 100-300 mM) có thể
được sử dụng để tăng sự phân cực của pha động nhằm đạt được rửa giải mong
muốn. Tuy nhiên do các muối này không dễ bay hơi nên việc này không thuận lợi để
sử dụng trong sắc kí lỏng kết nối với khối phổ [7].
HILIC có thể được thực hiện ở chế độ đẳng dòng hoặc chế độ gradient với tỷ lệ cao
dung môi hữu cơ khi bắt đầu và kết thúc với tỷ lệ thấp dung môi hữu cơ.
1.2.3. Cơ chế tách
Về cơ bản, có ba cách để mô phỏng về cơ chế tách trong HILIC: thứ nhất là sự
phân bố chất phân tích giữa pha động và pha tĩnh; thứ hai là sự hấp phụ của chất phân
tích lên bề mặt của pha tĩnh; thứ ba pha động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh, tiếp theo các
chất phân tích phân bố lên lớp hấp phụ này [7]. Hiện nay, cách mô phỏng thứ ba được
thừa nhận rộng rãi. Hình 1.2 minh họa cơ chế tách này:

Hình 1.2. Cơ chế tách trong HILIC

7


Theo cơ chế này, khi pha động di chuyển qua pha tĩnh phân cực, một phần pha
động hấp phụ lên bề mặt pha tĩnh tạo thành một lớp chất lỏng chứa nước bao trên bề
mặt pha tĩnh. Chất phân tích khi đi qua cột sắc kí sẽ được phân bố giữa pha động và

lớp chất lỏng thân nước bao xung quanh pha tĩnh này. Như vậy, chất phân tích càng
phân cực, nó sẽ được lưu giữ lâu hơn trong lớp nước trên bề mặt pha tĩnh. Nói cách
khác, quá trình phân tách phụ thuộc vào độ phân cực của chất phân tích và lớp solvat
hoá trên bề mặt pha tĩnh. Khi nồng độ ACN (hoặc một số dung môi hữu cơ khác) tăng
lên, nước tương tác mạnh hơn với bề mặt của pha tĩnh phân cực. Khi nồng độ của
nước trong pha động thấp hơn 20%, hấp phụ nước có thể là nhiều lớp, và lượng nước
hấp phụ có thể cao hơn nhiều so với lượng nước trong dung môi [7]. Nói chung, thông
thường khi tăng tỷ lệ dung môi hữu cơ trong pha động, hay nói cách khác là giảm độ
phân cực của pha động thì thời gian lưu của chất phân tích trong HILIC cũng sẽ tăng
theo [8]. Trong trường hợp pha tĩnh có mang điện tích, chất phân tích có thể có thêm
các tương tác tĩnh điện với pha tĩnh.
1.2.4. Ưu điểm
HILIC có những ưu điểm vượt trội so với các phương pháp sắc kí khác khi phân
tích các chất phân cực. Trong RPLC, do sử dụng pha động phân cực và pha tĩnh kém
phân cực nên các chất phân tích phân cực mạnh sẽ không được lưu giữ hoặc lưu giữ
kém. Trái lại, trong HILIC chất phân tích được phân bố ở cả lớp dung môi thân nước
bao trên bề mặt pha tĩnh và pha động khan nước, từ đó tăng lưu giữ các chất phân tích
phân cực. NPLC hoặc IPC hay được sử dụng trong việc phân tích các hợp chất phân
cực. Tuy nhiên, do NPLC sử dụng dung môi pha động độc hại và khả năng hòa tan
chất phân tích phân cực [8] kém nên nó không phải là phương pháp tối ưu cho việc
phân tích các chất phân cực. Khác với NPLC, HILIC sử dụng các dung môi thân thiện
hơn (như ACN, nước… ), và hòa tan tốt chất phân tích phân cực. IPC có nhược điểm
lớn là cột sau khi đã sử dụng bằng phương pháp này thường không thể sử dụng cho
mục đích khác, tốn nhiều thời gian để ổn định hệ thống và rửa cột do chất tạo cặp ion
bị lưu giữ mạnh hoặc tạo liên kết với pha tĩnh. Chính vì những lí do trên mà HILIC có
ưu diểm vượt trội khi phân tích các hợp chất phân cực.

8

HILIC sử dụng pha động có nồng độ dung môi hữu cơ cao có độ nhớt thấp nên có
thể tiến hành được ở áp suất thấp hơn. Độ nhớt thấp cũng cho phép cột có khả năng
làm việc ở tốc độ dòng cao, giảm thời gian phân tích [7].
Với các chất phân cực hấp thụ UV kém như các acid amin, HILIC có thể định
lượng trực tiếp các chất tại bước sóng thấp do sử dụng dung môi có bước sóng tới hạn
thấp [6]. Khi phân tích các hợp chất này bằng RPLC cần phải dẫn xuất hóa, vì vậy gây
khó khăn cho việc định tính và định lượng chất. Trong khi đó, pha động HILIC
(thường sử dụng ACN có bước sóng tới hạn là 190 nm [1]) cho phép lưu giữ ở thời
gian lưu thích hợp, xác định trực tiếp nhiều chất tại bước sóng thấp cỡ 200 nm, giảm
bớt công đoạn tạo dẫn xuất trong định tính, định lượng chất.
HILIC có khả năng kết nối với detector khối phổ [22] nhờ pha động có chứa lượng
lớn dung môi hữu cơ đồng tan với nước, dễ hóa hơi, thích hợp với LC-MS. Đối với
RPLC, khi phân tích các hợp chất phân cực thường sử dụng pha động chứa tỷ lệ nước
cao, khó hóa hơi nên không phù hợp với LC-MS. Ngược lại, pha động không phân cực
của NPLC không những độc hại với môi trường mà rất khó hoà tan các dược chất phân
cực, giảm tỷ lệ ion hoá của chất phân tích, có thể gây nhiễu nền hoặc tín hiệu kém [8]
khi phân tích bằng LC-MS.
1.2.5. Nhược điểm
Bên cạnh các ưu điểm đã trình bày ở trên, HILIC cũng có một số nhược điểm như:
- Thời gian đạt được cân bằng lâu hơn RPLC.
- Pha tĩnh silica kém lưu giữ các anion.
- Tương tác phức tạp, nhiều lớp, khó kiểm soát hơn RPLC và NPLC.
- Phụ thuộc quá nhiều vào dung môi acetonitril, khó tìm lựa chọn thay thế.

9


CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam của Merck Sharp &

Dohme Corp. Mỗi lọ chứa một lượng bột tương đương với 500 mg imipenem và 500
mg cilastatin. Ngoài ra, chế phẩm còn chứa natri bicarbonat vô khuẩn là tá dược không
có hoạt tính.
2.2. Nguyên vật liệu
2.2.1. Hóa chất
- Thuốc tiêm truyền tĩnh mạch Tienam: Nhà sản xuất Merck Sharp & Dohme Corp., số
lô sản xuất: N026757 và N023795, hạn dùng: 27/04/2019 và 13/02/2019.
- Chuẩn imipenem: Hàm lượng 93,74% của Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.
- Chuẩn cilastatin natri: Hàm lượng 95,54% Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương.
- Tá dược natri bicarbonat: Nhà sản xuất CTCP DPDL PHARMEDIC – Việt Nam.
- Acetonitril dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức.
- Methanol dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức.
- Acid phosphoric: Sản xuất bởi Scharlau – Tây Ban Nha.
- Kali dihydro phosphat: Sản xuất bởi Merck – Đức.
- Acid acetic băng dùng cho HPLC: Sản xuất bởi Merck – Đức.
- Acid formic dùng cho MS: Sản xuất bởi Merck – Đức.
- Natri hydroxyd: Sản xuất bởi Merck – Đức.
- Nước cất hai lần.
2.2.2. Thiết bị, dụng cụ
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1200 series và phần mềm chemstation.
- Cột sắc kí: Cột Supelco Ascentis Silica (250 x 4,6 mm, 5 µm) (Sigma Aldrich) và cột
Hypersil Silica (200 x 4,6 mm, 5 µm) (Agilent).
- Máy lắc Labinco L46 (Đài Loan).
- Máy lọc hút chân không Rocker 400.
- Màng lọc cellulose 0,45 µm.
- Cân phân tích Sartorius TE214S và cân phân tích METTLER – TOLEDO XPE 105 –
Thụy Sĩ (d = 0,01 mg).
- Máy siêu âm Ultrasonic LC60H (Hà Lan).

10

- Máy đo pH Mettler Tolero .
- Pipet chính xác 1,00 ml, 1,50 ml, 2,00 ml, 3,00 ml, 4,00 ml, 5,00ml, micro pipet 1001000 µl (Đức).
- Bình định mức: 5,00 ml, 10,00 ml, 20,00 ml, 100,0ml.
- Tủ lạnh sâu PANASONIC MDF-594.
- Các dụng cụ khác: pipet Pasteur, cốc có mỏ, ống đong, đũa thủy tinh, vial.
2.2.3. Chuẩn bị mẫu
- Dung môi pha mẫu: Hút 40 ml nước vào bình định mức 100,0 ml, bổ sung ACN vừa
đủ, lắc đều thu được hỗn hợp dung môi pha mẫu ACN : nước theo tỷ lệ 60:40.
- Mẫu placebo tự tạo: Cân chính xác khoảng 12,0 mg natri bicarbonat vào bình định
mức 100,0 ml. Hòa tan trong 40 ml nước, bổ sung nước vừa đủ, lắc đều thu được dung
dịch natri bicarbonat 120 ppm. Hút 0,50 ml dung dịch này vào bình định mức 10,00 ml,
bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch placebo 6 ppm (dựa theo cách
pha mẫu của DĐVN V [2]).
- Dung dịch chuẩn đơn gốc: Cân chính xác khoảng 21,4 mg chuẩn IMI và 22,2 mg
CIL natri vào hai bình định mức 10,00 ml; hòa tan trong 4,00 ml nước, sau đó thêm
ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch chuẩn đơn IMI và CIL nồng độ 2000 ppm.
Từ dung dịch này pha thành dung dịch chuẩn đơn nồng độ 150 ppm.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp: Hút 5,00 ml của mỗi dung dịch chuẩn đơn nồng độ 2000
ppm vào bình định mức 20,00 ml; bổ sung dung môi pha mẫu vừa đủ, lắc đều thu được
dung dịch chuẩn hỗn hợp chứa nồng độ 500 ppm của từng chất. Từ dung dịch này,
dùng pipet chính xác và bình định mức pha thành các dung dịch có nồng độ 250 ppm,
200 ppm, 150 ppm, 100 ppm và 75 ppm.
- Dung dịch mẫu thử:
+ Xác định khối lượng bột trong chế phẩm: Cân toàn bộ chế phẩm (sau khi đã loại bỏ
nắp nhôm bảo vệ) được khối lượng m1 (g). Chuyển toàn bộ phần bột vào cốc thủy tinh
khô và sạch, dùng bông tẩm cồn, lau sạch lượng bột dính trên lọ và nắp. Cân khối
lượng vỏ được m2 (g). Khối lượng bột trong chế phẩm bằng (m1-m2) g tương ứng với
500 mg IMI và 500 mg CIL.

+ Cân chính xác khoảng 10,65 mg thuốc tiêm Tienam vào bình định mức 10,00 ml,
hòa tan trong 4,00 ml nước, bổ sung ACN vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử có

11


nồng độ khoảng 500 ppm của IMI và CIL. Hút 1,50 ml dung dịch thử trên vào bình
định mức 5,00 ml; bổ sung dung môi vừa đủ, lắc đều thu được dung dịch thử 150 ppm.
- Các dung dịch trên được bảo quản trong tủ lạnh âm sâu ở -80 oC.
2.2.4. Chuẩn bị dung môi pha động
- Dung dịch acid phosphoric 0,5% và 0,1 %: Hút 750 µl H3PO4 đặc pha vào 250 ml
nước, khuấy đều, thu được dung dịch H3PO4 0,5%. Pha loãng 50 ml dung dịch này
bằng nước để được 250 ml dung dịch H3PO4 0,1%.
- Dung dịch đệm phosphat 5 mM (pH 6,80): Cân chính xác khoảng 170,0 mg KH2PO4
vào cốc có mỏ, hòa tan trong 80 ml nước, thêm nước đến khoảng 200 ml, khuấy đều.
Chỉnh đến pH 6,80 bằng dung dịch NaOH 0,5 M. Chuyển vào bình định mức 250,0 ml,
thêm nước vừa đủ, lắc đều.
- Dung dịch đệm phosphat 20 mM (pH 2,50): Cân chính xác 1,6320 g KH2PO4 vào cốc
có mỏ 100 ml, hòa tan trong 80 ml nước cất hai lần. Rót vào bình định mức 500,0 ml,
thêm nước vừa đủ. Lắc đều. Chỉnh đến pH 2,50 bằng dung dịch H3PO4 20 mM (210 µl
H3PO4 đặc pha trong 200 ml nước trong bình định mức).
- Dung dịch HCOOH 0,05%; 0,1% và 0,2%: Hút 410 µl HCOOH pha trong 250 ml
nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,2%. Pha loãng 100 ml dung dịch
HCOOH 0,2% bằng nước để được 200 ml dung dịch HCOOH 0,1%. Hút 100 µl
HCOOH pha trong 250 ml nước, khuấy đều thu được dung dịch HCOOH 0,05%.
- Dung dịch CH3COOH 1% và 0,1%: Hút 2 ml CH3COOH băng pha trong 200 ml
nước, khuấy đều thu được dung dịch CH3COOH 1%. Hút 240 µl CH3COOH băng pha
trong nước vừa đủ 250 ml, khuấy đều.
- Dung dịch đệm acetat 10 mM (pH 4,75): Hút 140 µl CH3COOH băng pha trong 200
ml nước, điều chỉnh đến pH 4,75 bằng dung dịch NaOH 0,5 M, thêm nước vừa đủ 250

ml.
Các dung dịch trên được lọc qua màng 0,45 µm và siêu âm trước khi sử dụng.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp phân tích IMI và CIL trong thuốc tiêm bằng HILIC.
Tiến hành khảo sát các điều kiện sắc kí sau:
+ Pha tĩnh
+ Pha động: thành phần, tỷ lệ, nồng độ, pH, tốc độ dòng

12


+ Dung môi pha mẫu
+ Thể tích tiêm
+ Bước sóng phát hiện
- Thẩm định phương pháp phân tích IMI và CIL trong chế phẩm thuốc tiêm bằng
HILIC theo hướng dẫn của ICH [12] với các tiêu chí sau:
+ Độ đặc hiệu
+ Độ phù hợp hệ thống
+ Khoảng nồng độ tuyến tính
+ Độ lặp lại
+ Độ đúng
+ Độ thô
- Ứng dụng phương pháp trên xác định hàm lượng IMI và CIL trong thuốc tiêm
Tienam trên thị trường.
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên nghiên cứu của N. Nakov [16] về phân tích IMI và CIL bằng HILIC trong
chế phẩm thuốc tiêm, kết hợp với điều kiện trang thiết bị của phòng thí nghiệm, tôi
tiến hành khảo sát các điều kiện chạy sắc kí như sau:
2.3.1.1. Khảo sát pha tĩnh
Cột silica có thể sử dụng làm pha tĩnh HILIC, loại cột này có giá thành rẻ, sẵn có,

vì vậy, tôi lựa chọn cột hai cột silica có độ dài khác nhau, cùng kích thước hạt nhồi cột
5 µm để tiến hành khảo sát:
- Cột Supelco Ascentis Silica kích thước 250 x 4,6 mm: Cột đã sử dụng chạy pha
thuận trước đây, được hoạt hóa lại bằng isopropanol để chạy HILIC.
- Cột Hypersil Silica kích thước 200 x 4,6 mm: Cột mới được hoạt hóa bằng
isopropanol.
Dựa vào hình dạng pic sắc kí và thời gian phân tích để lựa chọn cột.
2.3.1.2. Khảo sát pha động
Tiến hành khảo sát thành phần pha động, tỷ lệ, nồng độ, pH và tốc độ dòng. Dựa
vào khả năng tách các chất, mức độ ổn định của đường nền và thời gian lưu của IMI
và CIL để lựa chọn pha động thích hợp. Bảng 2.1 dưới đây mô tả các điều kiện pha
động mà tôi đã tiến hành khảo sát:

13


Bảng 2.1. Các điều kiện pha động khảo sát
Pha tĩnh

Pha động

Tỉ lệ

Tốc độ

(v/v)

(ml/phút)

70:30

1
1

ACN : H3PO4 0,1%

75:25

1,2
1,5

ACN : H3PO4 0,5%
Cột Supelco
Ascentis Silica

ACN : đệm phosphat 5 mM (pH 6,80)

80:20

1

70:30

1

70:30

1

75:25

1

(250 x 4,6 mm,

ACN : HCOOH 10 mM

70:30

1

5 µm)

ACN : đệm acetat 10 mM (pH 4,75)

70:30

1

70:30

1

75:25

1

70:30

1

70:30

1

75:25

1

90:10

1

ACN : HCOOH 20 mM

70:30

1

ACN : HCOOH 50 mM

70:30

1

70:30

1

60:40

1

70:30

1

ACN : CH3COOH 0,1%
ACN : nước

MeOH : H3PO4 0,1%

ACN : CH3COOH 1%
Cột Hypersil
Silica (200 x
4,6 mm, 5 µm)

ACN : H3PO4 0,1%

60:40

1
1,2
1

ACN : đệm phosphat 20 mM, pH 2,50

60:40

0,8

0,5

14


2.3.1.3. Khảo sát dung môi pha mẫu
Pha mẫu trong hỗn hợp dung môi ACN và nước như trong nghiên cứu N. Nakov
[16] nhưng với các tỷ lệ khác nhau gồm 75:25 và 60:40 (v/v). Tiến hành chạy sắc ký,
dựa vào hình dáng của pic sắc ký và chi phí để lựa chọn dung môi pha mẫu thích hợp.
2.3.1.4. Khảo sát thể tích tiêm
Tiến hành chạy sắc kí ở hai thể tích tiêm mẫu là 10 µl và 5 µl, dựa vào hình dạng
pic và độ cân xứng của pic để lựa chọn thể tích tiêm mẫu thích hợp.
2.3.1.5. Khảo sát bước sóng phát hiện
Tiến hành quét phổ trên pic sắc kí của hai chất chuẩn trong khoảng bước sóng từ
190 nm đến 400 nm. Lựa chọn bước sóng thích hợp của mỗi chất.
2.3.2. Thẩm định phương pháp
Phương pháp phân tích IMI và CIL bằng HILIC được thẩm định theo các tiêu chí
sau theo hướng dẫn của ICH [12]:
- Độ phù hợp hệ thống
- Độ chọn lọc
- Khoảng nồng độ tuyến tính
- Độ lặp lại
- Độ đúng
- Độ thô
2.3.2.1. Độ phù hợp hệ thống
- Chuẩn bị: Pha mẫu chuẩn hỗn hợp nồng độ 150 ppm bằng cách hút 1,50 ml dung
dịch chuẩn hỗn hợp nồng độ 500 ppm vào bình định mức 5,00 ml, thêm dung môi pha
mẫu vừa đủ, lắc đều.
- Tiến hành: Xác định tính phù hợp của hệ thống bằng cách tiêm lặp lại 6 lần liên tiếp
một mẫu chuẩn hỗn hợp ở nồng độ 150 ppm. Ghi lại thời gian lưu và diện tích pic của

các lần sắc ký.
- Yêu cầu: Chênh lệch diện tích pic, thời gian lưu giữa các lần tiêm của cùng một mẫu,
biểu thị bằng độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) không lớn hơn 2,0% [2].
2.3.2.2. Độ chọn lọc
- Chuẩn bị các mẫu sau:
+ Mẫu dung môi pha mẫu: Chuẩn bị như mục 2.2.3.

15


+ Mẫu placebo tự tạo: Pha dung dịch natri bicarbonat 6 ppm như mục 2.2.3.
+ Mẫu chuẩn đơn thành phần IMI, CIL 150 ppm: Hút 1,50 ml chuẩn đơn gốc vào bình
định mức 20,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều.
+ Mẫu chuẩn hỗn hợp gồm hai thành phần IMI và CIL nồng độ 150 ppm của mỗi chất:
Hút 3,00 ml chuẩn hỗn hợp gốc vào bình 5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều.
+ Mẫu thử nồng độ 150 ppm của mỗi chất: Hút 1,50 ml dung dịch mẫu thử vào bình
5,00 ml, bổ sung dung môi vừa đủ. Lắc đều.
- Tiến hành: Chạy sắc ký các mẫu trên, so sánh các pic trên sắc ký đồ thu được.
- Yêu cầu:
+ Trên sắc kí đồ của dung dịch mẫu trắng và dung dịch placebo không được xuất hiện
pic tại vị trí của hoạt chất chính. Nếu có thì ảnh hưởng của mẫu placebo (AH%) ≤ 1%.
+ Trên sắc kí đồ của dung dịch thử có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống
kê với thời gian lưu của chất chuẩn trong sắc kí đồ của mẫu chuẩn. Pic của chất cần
phân tích phải tinh khiết (Độ tinh khiết của pic sắc kí > 0,995). Chồng phổ của chất
phân tích với chất chuẩn cho hệ số Match ≥ 0,999. Nếu xuất hiện pic tạp chất, thì phải
tách khỏi pic chất thử với độ phân giải Rs > 1,5.
2.3.2.3. Khoảng nồng độ tuyến tính
- Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp có nồng độ IMI và CIL khoảng từ 75 ppm
đến 250 ppm từ dung dịch chuẩn hỗn hợp 500 ppm. Bảng 2.2 mô tả quy trình pha các
mẫu dường chuẩn:

Bảng 2.2. Quy trình pha các mẫu đường chuẩn
Nồng độ (ppm)

Hệ số pha loãng

V dung dịch

Bình định mức (ml)

500 ppm (ml)
75

6,7

1,50

10,0

100

5

1,00

5,0

150

3,3

1,50

5,0

200

2,5

2,00

5,0

250

2

5,00

10,0

- Tiến hành chạy sắc ký, xây dựng phương trình hồi quy, xác định hệ số tương quan (R)
và hệ số chắn tại nồng độ 100% (Y-intercept).

16