β GALACTOSIDASE từ BACILLUS

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BACILLUS
CÓ KHẢ NĂNG SINH ENZYME β-GALACTOSIDASE
VÀ BƯỚC ĐẦU XÁC ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA
ENZYME


MỤC LỤC

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
Chữ viết tắt
NA
NB
Abs
v/v
Cs
B.sub

Chữ tiếng Anh
Nutrient Agar
Nutrient broth
Absorbance
Volume/volume

Nghĩa tiếng Việt
Môi trường thạch dinh dưỡng
Môi trường canh thang
Độ hấp thụ
Thể tích/Thể tích
Cộng sự

Bacillus subtilis

2


DANH MỤC BẢNG

3


DANH MỤC HÌNH

4


PHẦN I - MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Enzyme β-galactosidase còn được gọi là lactase, là enzyme xúc
tác cho quá trình thủy phân và chuyển hóa các gốc β-D-galactozyl,
trong đó có sự thủy phân lactose thành glucose và galactose (Davail
và cs, 1994).
Nhờ khả năng phân giải lactose mà β-galactosidase được sử
dụng nhiều cho ngành công nghiệp thực phẩm, đặc biệt là trong
ngành công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa. βgalactosidase được sử dụng để thủy phân lactose nhằm làm tăng
khả năng tiêu hóa sữa cho người bị dị ứng với lactose, cải thiện các
chức năng của các sản phẩm từ sữa, bổ sung vào quá trình lên men
bơ sữa để tránh sự kết tinh lactose và tăng độ ngọt của sản phẩm.
Ngoài ra trong y dược, chúng được sử dụng làm thuốc trợ tiêu hóa
cho những người thiếu khả năng hấp thụ lactose (Trương Nam Hải và
cs, 2004). Enzyme β-galactosidase có khả năng chịu nhiệt và chịu pH
axit đóng vai trò quan trọng trong quá trình thủy phân lactose ở các

sản phẩm chế biến nhiệt độ cao và các sản phẩm sữa lên men. Sữa
đã được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hương
liệu, phô mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng
sữa để ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi chế biến các sản phẩm sữa
cô đặc, các sản phẩm sữa cần gia nhiệt. Hơn nữa việc sử dụng βgalactosidase có khả năng hoạt động ở pH axit trong sản xuất sữa
chua và phomat sẽ làm tăng quá trình axit hóa, bởi vì thủy phân
lactose thường là bước làm chậm tốc độ của quá trình, làm giảm thời
gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc và
hương vị cho phomat (Parmjit S Panesar và cs, 2010).
β-galactosidase có thể tìm thấy ở thực vật, vi khuẩn, các cơ
quan động vật, nấm men, nấm mốc (Lê Xuân Phương, 2001). Trong số
các nguồn thu nhận enzyme từ động vật, thực vật, vi sinh vật thì
5


việc thu enzyme từ vi sinh vật tỏ ra là phương pháp ưu việt hơn cả vì
vi sinh vật sinh sản nhanh, sinh khối nhỏ, nhưng tỉ lệ enzyme trong
tế bào lớn. Mặt khác, môi trường dinh dưỡng lại rẻ tiền, dễ kiếm nên
quy trình sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi
cao và ít tốn kém (Ngô Xuân Mạnh và cs, 2006).
Trong các loài vi khuẩn được nghiên cứu và sản xuất βgalactosidase, vi khuẩn Bacillus được các nhà khoa học nghiên cứu
nhiều bởi đây là loài vi khuẩn phân bố nhiều trong tự nhiên, tồn tại
được trong các điều kiện khác nhau, nhiều loài được coi là an toàn
trong thực phẩm. Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này có đặc
tính cao và khả năng sinh enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại
bào của những vi sinh vật khác (Nguyễn Văn Cách và cs, 2008). Vì
vậy chúng ta dễ tìm ra chủng có enzyme đặc tính chịu nhiệt.
Cho đến nay trên thế giới và Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu về
tuyển chọn vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh β-galactosidase.Tuy
nhiên việc nghiên cứu và đưa vào ứng dụng sản xuất của βgalactosidase có đặc tính chịu nhiệt, chịu axit còn rất hạn chế.

Xuất phát từ thực tế đó mà đề tài: “Nghiên cứu tuyển chọn
vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme β- galactosidase
và bước đầu xác định một số đặc tính của enzyme ” được tiến
hành.
1.2. Mục đích, yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Tuyển chọn và định danh vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh
enzyme β- galactosidase chịu nhiệt, chịu axit.
1.2.2. Yêu cầu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme
β-galactosidase.
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt.

6


- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt, pH 4.
- Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt, pH 4 bằng phương pháp xác định trình tự
gen 16S rRNA.

PHẦN II - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về enzyme β-galactosidase
2.1.1. Enzyme β-galactosidase
β-galactosidase

(β-D-galactoside

galactohydrolase

E.C.3.2.1.23) là enzyme có khả năng xúc tác cho hai kiểu phản ứng:
phản ứng thủy phân và phản ứng chuyển gốc galactozyl. Phản ứng
thủy phân chính của β-galactosidase là thủy phân đường đôi lactose
thành hai đường đơn glucose và galactose, và trong một số trường
hợp enzyme tham gia phản ứng transgalactosylation chuyển gốc
galactose đến cơ chất lactose tạo galactose-oligosaccharides (GOS)
(Davail và cs, 1994). Galactose-oligosaccharides cùng với fructooligosaccharides được nghiên cứu nhiều nhất tạo ra prebiotic
oligosaccharides có lợi cho con người bằng cách kích thích sự tăng
trưởng và hoạt động của vi khuẩn có lợi trong hệ tiêu hóa của người.

7


Hình 2.1. Sơ đồ thủy phân lactose của enzyme β-galactosidase
2.1.2. Nguồn thu nhận
Lactase trong tự nhiên có thể tìm thấy ở các loài thực vật, động vật và vi sinh
vật. Tuy nhiên, tính chất của enzym được thu nhận từ các nguồn khác nhau có sự khác
nhau rõ rệt. Enzyme được sản xuất từ vi sinh vật ngày càng nhiều, là giới vi sinh vật
duy nhất được sử dụng như nguồn sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp. Nguồn
enzyme từ động vật và thực vật rất khó triển khai theo quy mô công nghiệp vì những
hạn chế sinh lí và hạn chế kỹ thuật. So với động vật và thực vật, vi sinh vật có rất
nhiều ưu điểm (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Những ưu điểm đó là:
Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh
Trong một thời gian ngắn, ta có thể thu được một lượng sinh khối rất lớn. Nhiều
nghiên cứu cho thấy rằng trong một ngày đêm, tốc độ tạo sinh khối ở vi sinh vật cao
gấp hàng ngàn lần so với tốc độ tăng sinh khối của động vật và thực vật. Để đạt được
tốc độ tăng sinh khối lớn như vậy, vi sinh vật phải chuyển hóa một khối lượng cơ chất
rất lớn. Cũng từ nghiên cứu trên E.coli, nhiều nhà khoa học cho thấy rằng trong vòng

24 giờ, vi khuẩn E.coli có thể chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn hơn một ngàn
lần khối lượng cơ thể chúng. Để chuyển hóa được khối lượng cơ chất lớn như vậy,
chúng phải tổng hợp ra được lượng enzyme rất lớn. Bởi vì, mọi chuyển hóa cơ chất
trong tế bào là do enzyme đảm nhận. Chính vì thế, nếu sử dụng vi sinh vật như nguồn
sinh học để sản xuất enzyme rất có lợi. Trong một khoảng thời gian ngắn, không
những ta thu được lượng sinh khối lớn (để thu enzyme nội bào) mà còn thu được
lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính riêng rất cao.
Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao
Ưu điểm này gắn liền với tốc độ chuyển hóa cơ chất và gắn liền với tốc độ sinh
sản và phát triển của vi sinh vật.
Vi sinh vật rất thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp

8


Trong sản xuất này, quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của
vi sinh vật hoàn toàn không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài. Trong khi đó, sản xuất
enzyme từ nguồn thực vật và động vật không thể đưa vào quy mô công nghiệp được.
Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và
dễ kiếm
Đây cũng chính là lợi thế rất quan trọng. Nhờ đó, ta có thể làm giảm giá thành
sản phẩm và có thể sản xuất ở mọi nơi trên thế giới.
2.1.3. Enzyme β-galactosidase từ vi khuẩn
β-galactosidase ở vi khuẩn có thể ở dạng ngoại bào hoặc nội bào
(Dalvai và cs, 1994). Enzyme ngoại bào dễ tách, không phải phá vỡ tế
bào, không lẫn chung với các thành phần nội bào, nếu có chỉ là một
enzyme ngoại bào khác, có tính bền vững mạnh, phương pháp tinh
sạch dễ và rẻ tiền. Enzyme nội bào khó tách, phải phá vỡ tế bào,
thường lẫn chung với các chất khác của tế bào sau khi phá vỡ (axit
nucleic, chất nguyên sinh, lipid,…), chỉ bền vững ở trong môi trường

nội bào, phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy trình công nghệ
phức tạp, giá thành đắt. β-galactosidase ngoại bào được tổng hợp
sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân các
hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức
Lượng, 2004). Đây là một enzyme thích ứng điển hình, được tổng hợp
khi trong môi trường chỉ có lactose hay các chất có cấu trúc tương tự
lactose như axit lactobiotic. β-galactosidase của vi khuẩn có khối
lượng phân tử khá lớn (trên 100 kDa), thường hoạt động tối ưu ở 37ºC
trong điều kiện môi trường pH trung bình 6.0-8.0 (Trương Nam Hải và
cs, 2004).
Vi khuẩn E.coli là đối tượng được nghiên cứu đầu tiên. Cấu trúc
bậc ba của enzyme từ E.coli cũng như cơ chế điều hòa phiên mã của
gen lacZ đã được khẳng định tạo điều kiện cho việc nghiên cứu kỹ
hơn về cơ chế xúc tác của enzyme này. Mặc dù vậy, việc sử dụng
enzyme này vào các quá trình sinh học chỉ được kiểm nghiệm ở quy
mô phòng thí nghiệm do vi khuẩn này không được phép có mặt trong
9


thực phẩm. Lĩnh vực chủ yếu của enzyme từ vi khuẩn E.coli này là
trong nghiên cứu sinh học phân tử, trong kỹ nghệ và trong hóa miễn
dịch.
Enzyme β-galactosidase từ Streptcoccus thermophiles – một
trong những vi khuẩn được sử dụng ở công nghệ chế biến các sản
phẩm lên men từ sữa cũng đã được sử dụng để thủy phân lactose
trong sữa ở quy mô công nghiệp do tính bền nhiệt mà độ an toàn khi
được sử dụng dưới dạng phụ gia thực phẩm. Nó cũng được dùng làm
chất xúc tác cho quá trình sản xuất các galactose-oligosaccharides
từ lactose do hoạt tính chuyển hóa galactozyl của nó cao. Đối với vi
khuẩn chúng có thể phát triển tối ưu trong dải pH từ 6.5 đến 7.5.

Chúng kém phát triển ở pH dưới 4 hoặc trên 8 (Coenen và cs, 2000).
Một số β-galactosidase từ vi khuẩn để có hoạt tính cần phải có
mặt các ion hóa trị 1 hoặc các ion hóa trị 2. Ví dụ như βgalactosidase từ S.restivirgula cần phải có mặt nhiều ion kim loại
hóa trị 2 để đạt đến độ bền nhiệt và hoạt tính tối đa. Tuy nhiên một
số β-galactosidase khắc lại không cần sự có mặt của các ion kim loại
như enzyme từ Rhizobium melioti (Toru Nakayama và cs, 1996).
2.1.4. Phương pháp thu nhận enzyme
Để thu nhận enzyme từ nguồn vi sinh vật, người ta dùng môi trường đặc trưng
cho từng nhóm vi sinh vật. Hiện nay, hai phương pháp nuôi mặt và nuôi bề sâu là hai
phương pháp dùng phổ biến nhất.
2.1.4.1. Phương pháp nuôi bề mặt
Theo Nguyễn Đức Lượng (2004) phương pháp nuôi về mặt thích hợp cho quá
trình nuôi nấm mốc, vi khuẩn, xạ khuẩn. Môi trường nuôi cấy là rắn hoặc xốp.
Phương pháp này có ưu điểm đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi cao về thiết
bị, không đòi hỏi vô trùng tuyệt đối. Tuy nhiên, nó lại có nhược điểm là tốn diện tích
mặt bằng, khó cơ khí hóa, khó tự động hóa được toàn bộ quá trình, chi phí nhân công,
điện nước… cho một sản phẩm cao, sản phẩm tạo thành không được tinh sạch.
2.1.4.2. Phương pháp nuôi bề sâu
10


Phương pháp nuôi bề sâu hay lên men chìm là phương pháp được dùng cho cả
vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí, phổ biến rộng nhất trong quy trình lên men công nghiệp,
vì có thể kiểm soát được toàn bộ các khâu trong quá trình một cách dễ dàng.
Phương pháp này có ưu điểm tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây
chuyền, chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp,
dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn, các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự
động hoá. Nó cũng có những nhược điểm như đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị
nhiễm trùng toàn bộ. Vì vậy, những thiết bị lên men chìm cần phải chế tạo đặc biệt cẩn
thận, chịu áp lực cao, đòi hỏi kín và làm việc với điều kiện vô trùng tuyệt đối (trong

nuôi cấy bề mặt có thể loại bỏ phần đã nhiễm trùng, các phần khác vẫn còn dùng
được). Hơn nữa trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật
chỉ sử dụng được oxy hoà tan trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc
sạch tạp trùng, hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi
cấy (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
2.1.5. Ứng dụng của β-galactosidase trong công nghiệp chế biến sữa
Enzym lactase có vai trò vô cùng to lớn trong ngành công nghiệp thực phẩm nói
chung và ngành công nghiệp chế biến sữa nói riêng, ứng dụng chính là trong thủy
phân lactose trong sữa, tách lactose thành glucose và galactose (Davail và cs, 1994).
Thủy phân lactose trong whey là một trong ứng dụng quan trọng của β-galactosidase
trong ngành công nghiệp chế biến sữa, giúp làm tăng độ ngọt của sản phẩm
(Rosenberg M, 2006). Enzyme này được sử dụng trong ngành công nghiệp sữa để sản
xuất sữa và các sản phẩm sữa không có lactose, khắc phục tình trạng không dung nạp
lactose ở con người (Haju và cs, 2012).
Ngoài ra, sữa được thủy phân lactose được sử dụng cho việc chế biến hương liệu
sữa, phô mai, và sữa chua. Sự thủy phân lactose trong sữa và dùng sữa chế biến thực
phẩm cũng ngăn ngừa sự kết tinh lactose khi đông lạnh sữa và sản phẩm sữa cô đặc.
Hơn nữa việc sử dụng sữa đã thủy phân trong sản xuất sữa chua và pho mát sẽ làm
tăng quá trình axit hóa, bởi vì thủy phân lactose thường là bước làm chậm tốc độ của
quá trình, làm giảm thời gian đông đặc của sữa chua và tăng tốc độ phát triển cấu trúc
và hương vị cho pho mat (Parmjit S Panesar và cs, 2010). Chất lượng của sữa
đông lạnh và kem làm từ sữa cũng được cải thiện đáng kể khi thêm enzym lactase. Nó
11


chống lại sự kết tinh đường lactose bằng cách thủy phân thành glucose và galactose và
làm giảm cấu trúc cát sạn.
Từ những ứng dụng thực tiễn trên mà β-galactosidase đã được
các nhà khoa học quan tâm để tách chiết enzyme từ nhiều nguồn vi
sinh vật khác nhau, để có tiến hành nghiên cứu sản xuất ở quy mô

công nghiệp.
2.1.6. Tình hình nghiên cứu sản xuất β-galactosidase trong và ngoài nước
Trên thế giới việc tạo dòng và nghiên cứu sản xuất enzyme βgalactosidase đã được biết đến từ lâu. Gần đây, một vài công trình
tiêu biểu của Petzelbauer và cs, 2000, Hanson và Adlercreutz, 2001,
Splechtna và cs, 2001, Park và cs, 2008, Petzelbauer và cs, 2002,…
được trích dẫn trên các tạp chí quốc tế lớn cho thấy nguồn gen mã
hóa β-galactosidase đã được phân lập từ các nguồn vi khuẩn khác
nhau và được tạo dòng và biểu hiện trong E.coli. Một số công trình
công bố về tạo dòng và biểu hiện β-galactosidase từ Lactobacillus
reuteri 103X và Bacillus megaterium (Li JM, 2005). Lauro et al. (2008)
đã nhân bản, thể hiện, tinh khiết và đặc trưng một betagalactosidase

(Aaβ-gal)

từ

vi

khuẩn

thermoacidophilic

Alicyclobacillus acidocaldarius, các tái tổ hợp Aaβ-gal là hoạt động
tối ưu và ổn định ở nhiệt độ 65ºC. Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs, 2006
nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme lactase ở 2 chủng Lactobacilus reuteri L103 và
L461. Đây là nghiên cứu hoàn toàn cơ bản, cho thấy 2 enzyme biểu hiện ở 2 tiểu phần
(2 chuỗi peptide có trọng lượng là 35kDa và 85kDa). Các enzyme này có khoảng pH
hoạt động khá hẹp, một enzyme từ pH 3.8 – 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8
(chủng L103). Kết quả nghiên cứu này sau đó được trình bày tại Hội nghị lần thứ V,
Trường Đại học Khoa học Hà Nội, 2006, và đã đăng trong tạp chí quốc tế. Nhóm tác

giả này về sau có một số nghiên cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp
galactooligosaccharides mang hoạt tính sinh học.
Ở Việt Nam Nguyễn

Văn

Cách

(2008) đã

tạo dòng

β-

galactosidase từ Aspergillus oryzae và xác định một số tính chất lýhóa của nó. Trần Văn Giang, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi
12


(2008) đã tạo dòng và phân tích trình tự gen mã hóa β-galactosidase
từ chủng Bacillus subtilis G1. Ngoài ra còn có công trình nghiên cứu
của Trương Nam Hải và cộng sự với đề tài cấp quốc gia “Nghiên cứu,
phân lập và tạo chủng giống bằng kỹ thuật di truyền để sinh tổng
hợp enzyme beta-galactosidase có hiệu suất cao và ứng dụng trong
thực phẩm” đã thành công trong biểu hiện của và xác đinh hoạt tính
β-galactosidase nhưng việc biểu hiện trong E.coli lại không an toàn
trong thực phẩm, protein thu được đa phần nằm trong dạng thể vùi
dẫn đến gặp khó khăn trong việc thu hồi enzyme có hoạt tính cao
ứng dụng trong quy mô công nghiệp. Vì vậy, ở Việt Nam những
nghiên cứu về β-galactosidase mới dừng lại ở nghiên cứu cơ bản và
chưa đưa vào sản xuất enzyme này. Kế thừa những thành quả đạt

được chúng tôi đưa ra mục tiêu sẽ tuyển chọn và định danh được các
chủng Bacillus, một trong những đối tượng được chú trọng nghiên
cứu từ lâu do những ưu điểm nổi bật so với Escherichia coli. Khả
năng không gây bệnh (B. subtilis được Hiệp hội Thuốc và Thực phẩm
của Mỹ FDA coi là “genereally regarded as safe”- GRAS) và khả năng
chịu đựng các điều kiện nuôi cấy, bảo quản khắc nghiệt hơn (Driks,
1999) là những ưu điểm nổi trội của vi sinh vật này so với E.coli .
Enzyme thu nhận được sẽ được xác định hoạt tính, kiểm tra khả
năng chịu nhiệt, pH axit có thể sử dụng trong các quá trình chế biến
cần phải gia nhiệt ở nhiệt độ cao trong các sản phẩm sữa chua đồ
uống lên men. Đây là hướng mới của đề tài so với các nghiên cứu
trên.
2.2. Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus
2.2.1. Các đặc điểm chung của vi khuẩn Bacillus
Vi khuẩn Bacillus là những vi khuẩn Gram dương. Thuộc chi
Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một
đầu. Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử
khác bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện

13


hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc. Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc
chuỗi và chuyển động bằng tiên mao.

Hình 2.2. Hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram của vi khuẩn Bacillus
Nhờ khả năng sinh bào tử nên vi khuẩn Bacillus có thể tồn tại
trong thời gian rất dài dưới các điều kiện khác nhau và rất phổ biến
trong tự nhiên nên có thể phân lập từ rất nhiều nguồn khác nhau như
đất, nước, trầm tích biển, thức ăn, sữa,…nhưng chủ yếu là từ đất nơi

mà đóng vai trò quan trọng trong chu kỳ C và N ( Priest FG và
Grigorova R, 1991).
Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và
hoại sinh nhờ sử dụng các chất hữu cơ đa dạng như đường, amino
aid, acid hữu cơ… Một vài loài có thể lên men carbohydrate tạo
thành glycerol và butanediol, một vài loài như Bacillus megaterium
thì không cần chất hữu cơ để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần
amino axit, vitamin nhóm B. Hầu hết đều là loài ưa nhiệt trung bình
với nhiệt độ tối ưu là 30-45ºC, nhưng cũng có một số loài ưa nhiệt
với nhiệt độ tối ưu là 65ºC (Rosovitz M J và cs, 1998).
Đa số Bacillus sinh trưởng với pH = 7, một số phù hợp vói pH =
9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với với pH = 2-6
như Bacillus acidocaldrius (Nguyễn Thị Trần Thụy, 2009).

14


2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus
2.2.2.1. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong công nghệ thực phẩm
Vi khuẩn Bacillus có khả năng tiết ra môi trường các enzyme thủy phân như αamylase, β-glucanase, xylanase, protease, β-galactosidase khi sống trên môi trường có
cơ chất tương ứng (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Thực tế, vi khuẩn Bacillus được ứng
dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất, chế biến thực phẩm như sữa, bia, bánh kẹo…
và trong công nghiệp sản xuất các enzyme (β-galactosidase, protease, lipase…).
Trong ngành công nghệ sản xuất sữa và các sản phẩm chế biến từ sữa: enzyme

β-galactosidase được bổ sung để tránh hiện tượng kết tinh trong lên men bơ sữa, tăng
độ ngọt của sản phẩm.
Trong ngành công nghệ sản xuất nước quả: enzyme glucanase và pectinase sẽ
phá hủy hoàn toàn màng tế bào, làm giảm độ nhớt và tăng độ đồng thể các loại nước
quả (Nguyễn Đức Lượng, 2004).

Trong công nghệ sản xuất bia: chế phẩm enzyme amylase, protease và
glucanase được sử dụng để ngăn chặn sự tạo thành các diaxetyl, giúp rút ngắn thời
gian lên men bia (Nguyễn Đức Lượng, 2004).
Trong công nghệ sản xuất cà phê: sử dụng kết hợp phức hệ enzyme cellulase và
pectinase để xử lý bóc vỏ cà phê và tăng khả năng trích ly dịch quả trong sản xuất cà
phê.
2.2.2.2. Ứng dụng của vi khuẩn Bacillus trong các lĩnh vực khác
Trong đời sống, vi khuẩn Bacillus được ứng dụng rộng rãi trong quá trình sản suất.
Trong công nghệ sản xuất giấy và bột giấy: các loại enzyme được bổ sung trong
khâu nghiền bột, tẩy trắng, và xeo giấy có vai trò quan trọng, gỗ được xử lý với các
endoglucanase và hỗn hợp các enzyme hemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng
khuếch tán hóa chất vào phái trong gỗ và hiệu quả khử ligin.
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi: bổ sung enzyme β- glucanase trực
tiếp cho vào thức ăn sẽ cho phép tăng hấp thu và chuyển hóa thức ăn của động vật.
Trong công nghệ sản xuất dung môi hữu cơ: bổ sung enzyme phá hủy thành tế
bào như xellulase, hemixellulase giúp tăng lượng đường tạo ra dẫn tới tăng hiệu suất
thu hồi rượu lên 1.5% (Đặng Thị Thu và cs, 2012).
Trong công nghệ xử lý nước thải và sản xuất phân bón vi sinh: sản xuất enzyme
cellulase thủy phân cellulose trong rác thải. Vì vậy, nước thải của nhà máy giấy, cơ sở
chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung chế phẩm chứa hệ cellulase đem lại hiệu quả
cao (Trần Đình Toại, 2007).
15


2.2.3. Khả năng sinh β-galactosidase của vi khuẩn Bacillus
Các chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp mạnh mẽ và đồng thời nhiều
enzyme khác nhau hoặc một enzyme nhất định nào đó, β-galactosidase từ vi khuẩn
Bacillus rất ổn định, đồng thời vi khuẩn Bacillus sản xuất enzyme ngoại bào nên dễ
dàng cho việc thu nhận. Nhờ có khả năng chịu nhiệt của một số chủng vi
khuẩn Bacillus, nên enzyme ngoại bào của loài vi khuẩn này cũng có

tiềm năng cao về enzyme chịu nhiệt.
Li và cs, 2008 đã tiến hành tinh sạch và xác định các đặc tính của βgalactosidase từ vi khuẩn Bacillus megaterium 2-37-4-1 cho thấy β-galactosidase hoạt
động mạnh nhất ở pH 7.5-8.0 ở nhiệt độ 55ºC và hoạt động ổn định ở pH 6.0-9.0 ở
nhiệt độ thấp hơn 40ºC.
Nghiên cứu của Chen và cs, 2008 đã chỉ ra được nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt
động của β-galactosidase của vi khuẩn Bacillus Stearothermophilus là ở 70ºC và pH
7.0. Xác định được độ bền nhiệt của enzyme này ở 65ºC trong 50 giờ và 70ºC trong 9
giờ thì hoạt độ β-galactosidase vẫn giữ được 50% so với ban đầu. Enzyme chịu nhiệt
tái tổ hợp của vi khuẩn này ứng dụng cho cả hai quá trình thủy phân lactose và sản
xuất galactose-oligosaccharites trong chế biến sữa.
Các nghiên cứu chỉ ra được tính bền nhiệt của các chủng vi
khuẩn Bacillus chủ yếu hoạt động ở pH trung tính, các nghiên cứu về
khả năng hoạt động ở pH axit của vi khuẩn Bacillus vẫn còn hạn chế.
Vì vậy mà việc nghiên cứu khả năng sinh β-galactosidase có khả
năng chịu nhiệt và chịu pH axit từ vi khuẩn Bacillus để ứng dụng
trong các ngành công nghiệp thực phẩm trở nên vô cùng cấp thiết.

16


PHẦN III - VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
160 chủng vi khuẩn Bacillus từ bộ sưu tập giống của khoa Công nghệ thực phẩm
– Học viện Nông Nghiệp Việt Nam (bảng 3.1) được sử dụng để nuôi cấy và xác định
hoạt tính enzyme beta-galactosidase.
Bảng 3.1. Nguồn phân lập của các chủng vi khuẩn Bacillus
ST
T
1

2
3
4

Nguồn phân lập
Tương ớt
Dạ cỏ
Nước thải nhà máy
sữa
Đất thải nhà máy
sữa

Kí
hiệu
mẫu

Số
chủn
g

Kí hiệu chủng
vi khuẩn
Bacillus

A
B
NT

36
94

10

ĐT

20

A1.1 đến A3.6
B1.1 đến B9.4
NT.2.01 đến
NT.2.10
ĐT.01 đến
ĐT.20

Tổng số
chủng vi
khuẩn
Bacillus

160

3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm trung tâm khoa học và công nghệ thực
phẩm, khoa Công nghệ thực phẩm- Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
3.1.3. Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8/2016 đến 1/2017
3.1.4. Môi trường nuôi cấy thí nghiệm
Bảng 3.2. Môi trường phân lập, giữ giống NA (Mirac Yilmaz và cs, 2006)
Thành phần
Pepton
NaCl

Cao thịt
Agar
Nước cất
pH 7

Nồng độ (g/l)
10g
5g
5g
20g
1 lít

Bảng 3.3. Môi trường hoạt hóa NB (Mirac Yilmaz và cs , 2006)
Thành phần
Pepton

Nồng độ (g/l)
10g
17


NaCl
Cao thịt
Nước cất
pH 7.

5g
5g
1 lít

3.1.5. Dụng cụ, hóa chất
Bảng 3.4. Dụng cụ sử dụng nghiên cứu
Dụng cụ
Bể ổn nhiệt (Water Bath
JSWB 22T)
Cân phân tích
Màng lọc protein Thermo
ScientificTM Pierce
Máy lắc ổn nhiệt
(Eppendort
Thermomixer Comfot)
Máy li tâm (Herolab
Hicen21C)
Máy li tâm (Mikro 2204
Hettich)
Máy li tâm (Mini Spin plus)
Máy khuấy từ (IKA RH basic
2)
Máy voltex (Maxit mix II)
Nồi hấp ALP
Tủ nuôi cấy (Orbital
incubator
Shaker gyromax TM 727)
Máy quang phổ (UV 1800)
Máy đo pH (Thermo
Scientific)
Tủ cấy Air stream CESCO
Tủ sấy Memmert

Mục đích

Xuất xứ

Ổn nhiệt độ, dừng phản ứng
enzym
Cân hóa chất với độ chính
xác cao
Cô đặc protein

Hàn Quốc
Mỹ
Đức

Xác định hoạt tính enzyme

Đức

Li tâm thu nhận enzyme

Đức

Li tâm thu mẫu vòng quay
nhỏ
Li tâm eppendort tốc độ lớn

Đức

Khuấy đều hóa chất, mẫu

Đức

Làm đều mẫu nghiên cứu,
hóa chất
Hấp khử trùng môi trường
nuôi cấy vi sinh vật, dụng
cụ
Nuôi cấy vi sinh vật

Mỹ

Xác định độ hấp thụ quang
của mẫu
Xác định pH của mẫu hóa
chất
Cấy vi sinh vật vào môi
trường
Sấy khô dụng cụ

Bảng 3.5. Hóa chất sử dụng nghiên cứu
18

Đức

Nhật
Mỹ
Nhật
Singapore
Singapore
Mỹ

Hóa chất

Mục đích sử dụng

Xuất xứ

Cao nấm men

Nuôi cấy vi sinh vật

Trung Quốc

Cao thịt

Nuôi cấy vi sinh vật

Trung Quốc

Pepton

Nuôi cấy vi sinh vật

Trung Quốc

NaCl

Nuôi cấy vi sinh vật

Trung Quốc

Đường lactose
monohydrate
Agar

Nuôi cấy vi sinh vật

Trung Quốc

Na2HPO4.2H2O

Trung Quốc

NaOH

Pha dd đệm sodium
phosphate
Pha dung dịch chuẩn độ pH

HCl

Pha dung dịch chuẩn độ pH

Trung Quốc

Ethanol 96%

Khử trùng thiết bị

Trung Quốc

Ethanol 70%

Đức

DMF

Rửa tủa trong tách chiết
DNA tổng số
Định tính enzyme βgalactosidase
Dùng để pha X-gal

Chất cảm ứng IPTG

Kích thích sinh enzyme

Đức

Na2CO3

Pha dung dịch định lượng
enzyme
Cơ chất định lượng enzyme
β-galactosidase
Xây dựng đường chuẩn oNP

Đức

Dung dịch đệm hòa tan
sinh khối tách chiết DNA

tổng số
Dung dịch đệm hòa tan
sinh khối tách chiết DNA
tổng số
Dung dịch đệm hòa tan
sinh khối tách chiết DNA
tổng số
Dung dịch đệm hòa tan
sinh khối tách chiết DNA
tổng số
Tách chiết DNA tổng số

Đức

Tủa DNS, trong tách chiết
DNA tổng số

Đức

Chỉ thị X-gal

oNPG
oNP
Tris-HCl
EDTA
NaCl
SDS
CH3COOK
Isopropanol

Làm môi trường thạch

19

Việt Nam

Trung Quốc

Đức

Đức
Đức

Đức
Đức
Đức
Đức


Lisozyme

Tách chiết DNA tổng số

20

Đức


3.2. Nội dung nghiên cứu
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng sinh enzyme

β-galactosidase trên đĩa thạch có trang X-gal và chất cảm ứng IPTG.
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt ở nhiệt độ 60ºC, kiểm tra hoạt độ ở các
mốc thời gian 0.5 giờ, 1 giờ, 1,5 giờ, 2 giờ,…, 50 giờ.
- Tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt ở 60ºC và pH 4. Enzyme chịu nhiệt được
ủ pH 4, kiểm tra hoạt độ ở các mốc thời gian 0.5 giờ, 1 giờ, 1,5 giờ, 2
giờ,…480 giờ.
- Định danh chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt, pH 4 bằng phương pháp xác định trình
tự gen 16S rRNA.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Phương pháp hoạt hóa giống và nuôi cấy giống để thu dịch enzyme ngoại bào
Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy giống được tiến hành theo Nguyễn Lân Dũng
và (1978) và được mô tả như sau:
-

Phương pháp hoạt hóa giống
Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 5ml môi trường NB, đem hấp khử trùng ở
121oC,1atm, trong 20 phút. Dùng đầu que cấy nhọn tiệt trùng lấy khuẩn lạc và cho vào
ống nghiệm. Nút miệng ống nghiệm bằng nút bông, đánh dấu tên chủng, thời gian cấy.
Các thao tác thí nghiệm đều được thực hiện trong buồng cấy vi sinh và dưới ngọn lửa
đèn cồn. Sau đó, các ống nghiệm được chuyển vào tủ nuôi cấy, nuôi ở 37 oC, lắc 200
vòng/phút trong vòng 24 giờ.

-

Phương pháp nuôi cấy giống để thu dịch enzyme ngoại bào
Tiếp giống 1% từ ống nghiệm hoạt hóa vào bình tam giác chứa môi trường NB
có bổ sung 1% đường lactose đã hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút và nuôi cấy ở 37

o

C, lắc 200 vòng/phút trong 24h. Tiến hành li tâm 6000 vòng/ phút ở 4 oC trong 20

phút, gạn lấy phần dịch nổi bảo quản ở 4 oC để xác định khả năng sinh enzyme β –
galactosidase.

21


3.3.2. Xác định khả năng sinh β- galactosidase bằng phương pháp đĩa thạch
Khả năng sinh β-galactosidase của các chủng Bacillus được xác
định theo phương pháp của Toru Nakayama và Teruo Amachi, 1996,
được mô tả như sau:
Nguyên tắc: β-galactosidase thuỷ phân X-gal hình thành sản
phẩm kết tủa màu xanh da trời kiểu indigo. Vì vậy, vi khuẩn dương
tính với enzyme này sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh khi nuôi cấy trên
môi trường đĩa thạch bổ sung chỉ thị X-gal và chất cảm ứng IPTG
hoặc lactose.
 Cách 1: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp cấy trang
trên đĩa thạch
+ Môi trường NA được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó dùng
micropipet hút, bổ sung 60 µl X-gạl nồng độ 20 mg/ml và 10 µl IPTG
0,1 M trên mỗi đĩa, trang đều.
+ Hút 3 µl dịch khuẩn đã được hoạt hóa ở phần 3.3.1 lên các đĩa
thạch chỉ thị này, trang đều.
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37⁰C,
trong điều kiện tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.
 Cách 2: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp nhỏ dịch
nuôi cấy trên đĩa thạch

+ Môi trường NA được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó dùng
micropipet hút và bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 µl
IPTG 0,1 M trên mỗi đĩa, trang đều
+ Hút 3 µl dịch khuẩn, đã được hoạt hóa ở phần 3.3.1 nhỏ trên
bề mặt đĩa thạch chỉ thị, để khô dịch khuẩn trong 5 phút.
+ Đĩa làm xong được đưa vào tủ nuôi ở nhiệt độ 37⁰C, trong điều
kiện tối.

Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.

22


 Cách 3: Xác định khả năng sinh β-galactosidase bằng phương pháp cấy ria
trên đĩa thạch
+ Môi trường NA được hấp vô trùng và làm nguội, sau đó dùng
micropipet hút và bổ sung 60 µl X-gal nồng độ 20 mg/ml và 10 µl
IPTG 0,1 M trên mỗi đĩa, trang đều
+ Tiến hành lấy khuẩn lạc cấy ria chủng vi khuẩn trên mỗi đĩa
+ Đĩa cấy vi sinh vật được đưa vào tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 37 ⁰C,
trong điều kiện tối. Kiểm tra kết quả sau 24h, 48h và 72h.
3.3.3. Xác định hoạt độ của β-galactosidase ngoại bào
Hoạt độ của β-galactosidase được xác định theo phương pháp
của Nguyen và cs, 2006, được mô tả như sau:
Nguyên tắc: Hoạt độ β-galactosidase được xác định bằng cách
cho enzyme này phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl-β-Dgalactopyranoside (oNPG). Dưới tác dụng của β-galactosidase, oNPG
sẽ thủy phân thành galactose và o-nitrophenol.
o-nitrophenol khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu
vàng và hấp thụ (Abs) ở bước sóng cực đại 420 nm.
 Bước 1: Xây dựng đường chuẩn oNP

Các dung dịch
Vdung dịch gốc (ml)
Vdung dịch đệm (ml)
Nồng độ (mM)

1
0
5
0

2
0.1
4
0.4

3
0.2
3
0.8

4
0.3
2
1.2

5
0.4
1
1.6

6
0.5
0
2.0

Dùng 0.5ml oNP và 0.75ml Na 2CO3 đo ở bước sóng 420nm, dựa vào sự
tương quan giữa nồng độ oNP và giá trị OD ở bước sóng 420nm xác định được tốc
độ phản ứng của oNP qua đường chuẩn dựng bằng phần mềm Excel.
Bảng 3.6. Số liệu dựng đường chuẩn oNP
STT
Nồng độ
oNP
(mM)
Abs

1
0

2
0.04

3
0.08

4
0.12

5
0.16

6
0.2

0.004
5

0.1326

0.2624

0.3878

0.5078

0.6336

23


Hình 3.1 Đường chuẩn oNP
 Bước 2: Xác định hoạt tính của enzyme

+ Hút 480 µl oNPG vào ống eppendorf 1,5ml, sau đó ống
eppendorf được cho vào máy ổn nhiệt (thermomixer) ở 30oC, chờ 5
phút để nhiệt độ trong ống eppendorf đạt 30ºC trước khi đưa enzyme
vào.
+ Bắt đầu phản ứng bằng cách thêm 20 µl dung dịch
enzymengoại bào (ở phần 3.3.1).
+ Lắc đều ở 600 vòng/phút trong 10 phút.

+ Dừng phản ứng enzyme bằng cách bổ sung 750 µl Na2CO3 0.4
M vào trong ống eppendorf.
+ Đo độ hấp quang trên máy so màu ở bước sóng 420 nm.
Mẫu đối chứng được tiến hành tương tự như mẫu thí nghiệm, trong
đó 20 µl dung dịch enzyme được thay thế bằng 20 µl dung dịch đệm
phosphate pH 6.5.
Thí nghiệm lặp lại 2 lần, sai số ở 2 thí nghiệm không được vượt quá
5%.
Tính kết quả:
Hoạt tính enzyme có trong 1 ml dịch nuôi cấy theo công thức sau:

Trong đó:
U/ml:
Hoạt tính β- galactosidase
Abs420nm:
Độ hấp thụ quang của phản ứng màu đo được tại 420 nm
Blank:
Độ hấp thụ quang của mẫu đối chứng
SlopeoNPstandardcurve:
Hệ số góc của đường chuẩn oNP
treaction:
Thời gian phản ứng enzyme cơ chất (phút)
3.3.4. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân có đặc tính chịu nhiệt
Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase
chịu nhiệt được xác định theo phương pháp của Nguyen và cs, 2012.
24


Để xác định khả năng chịu nhiệt của β-galactosidase, các

enzyme này được ủ ở nhiệt độ 60ºC. Tại các thời gian ủ khác nhau,
enzyme lấy ra để xác định hoạt độ (theo phương pháp mô tả ở mục
3.3.3). Độ bền nhiệt của enzyme được xác định bằng cách so sánh %
hoạt độ còn lại của enzyme tại thời điểm đo với thời điểm bắt đầu ủ.
3.3.5. Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus sinh β-galactosidase thủy
phân, có đặc tính chịu nhiệt ở pH = 4
Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase
chịu nhiệt ở pH = 4 được xác định theo phương pháp của Nguyen và
cs, 2012.
Chủng có enzyme chịu nhiệt được xác định ở mục 3.3.4 được sử
dụng để xác định khả năng chịu axit. Để xác định độ bền pH của βgalactosidase, các enzyme này được ủ ở pH = 4, nhiệt độ 30 oC. Tại
các thời gian ủ khác nhau, enzyme được lấy ra để xác định hoạt độ
(theo phương pháp mô tả ở mục 3.3.3). Độ bền pH của enzyme được
xác định bằng cách so sánh % hoạt độ còn lại của enzyme tại thời
điểm đo với thời điểm bắt đầu ủ.
3.3.6. Định danh chủng được tuyển chọn bằng phương pháp xác định trình tự gen
16S rRNA
Chủng vi khuẩn sinh β-galactosidase chịu nhiệt, chịu PH 4 được xác
định trình tự gen và so sánh mức độ tương đồng di truyền với các
loài trên ngân hàng gen NBCI bằng công cụ BLAST theo phương pháp
của Maxam và Gibert, 1997.
3.3.6.1. Quy trình chiết DNA
Lấy 50 – 100 µl dịch khuẩn vào tube 1.5 ml
Dịch nuôi được ly tâm ở 5000 vòng trong 10 phút để thu sinh khối. Dùng pipet
hút cẩn thận dịch trong ra khỏi tube, giữ cặn.
Hòa tan sinh khối trong 0.5 ml đệm (Tris-HCl, EDTA, NaCl, SDS).
Ủ phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, siêu âm phá vỡ tế bào, 70% năng
lượng , 5 phút bật/ 5 phút tắt.
Bổ sung lysozyme 20 μg/ml, ủ ở nhiệt độ 370C trong 1h.
25