(Luận văn thạc sĩ) Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải theo thời gian nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ QUANG HỌC

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ PHÂN GIẢI THEO THỜI
GIAN NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TRUYỀN NĂNG LƯỢNG
CỘNG HƯỞNG

PHẠM THỊ HẰNG
LỚP CAO HỌC LÝ K10.B1

THÁI NGUYÊN, 2018


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới
Thầy giáo hướng dẫn PGS.TS. Nguyễn Thanh Bình. Thầy đã giao đề tài và tận tình
hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn.
Em xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Vũ Thị Bích và Th.S Nguyễn Đình
Công ở Viện Vật Lý Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, PGS. TS. Chu
Việt Hà trường Đại học Sư Phạm – Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện
để em hoàn thành tốt luận văn.
Em xin gửi lời cảm ơn của mình tới toàn thể Thầy Cô giáo trong khoa Vật lý
trường Đại Học Khoa Học - Đại học Thái Nguyên đã giảng dạy và giúp đỡ em trong
suốt quá trình học tập tại khoa, và các anh chị, các bạn học viện lớp K10B1 – lớp Cao
học Vật lý đã trao đổi và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình tôi, bạn bè đồng
nghiệp của tôi – những người đã luôn bên cạnh động viên và giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian học tập và thực hiện luận văn này.
Luận văn được hoàn thành với sự hỗ trợ từ đề tài KHCN cấp Viện Hàn lâm

Khoa học và Công nghệ Việt Nam thuộc Chương trình phát triển Vật lý tới 2020 cấp:
“Ứng dụng phương pháp huỳnh quang phân giải thời gian và hiệu ứng truyền năng
lượng cộng hưởng FRET thử nghiệm phát hiện độc tố kháng sinh trong thực
phẩm”
Tác giả luận văn

PHẠM THỊ HẰNG

i


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................i
MỤC LỤC ..................................................................................................................... ii
MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................ iii
DANH MỤC CÁC BẢNG............................................................................................iv
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................................v
MỞ ĐẦU .........................................................................................................................1
Chương 1: Tổng quan ...................................................................................................3
1.1.Vật liệu nano và ứng dụng .........................................................................................3
1.2. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) ..........................5
1.2.1. Khái niệm. .............................................................................................................5
1.2.2. Lịch sử phát triển FRET [11] ...................................................................................7
1.2.3. Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor ............................ 14
Chương 2. Kỹ thuật thực nghiệm ..............................................................................17
2.1. Kỹ thuật đo hấp thụ .............................................................................................. 17
2.2. Kỹ thuật đo huỳnh quang .......................................................................................19
2.3. Kỹ thuật đo huỳnh quang phân giải thời gian ........................................................20
2.3.1. Quang phổ phân giải thời gian và thời gian sống phát quang ............................. 20
2.3.2. Hệ đo huỳnh quang phân giải thời gian - TCSPC ...............................................23

Chương 3: Kết quả và thảo luận ................................................................................27
3.1. Quá trình truyền năng lượng giữa AuNPs với phân tử Rh6G ................................ 27
3.2. Quá trình truyền năng lượng giữa Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS ....33
KẾT LUẬN ..................................................................................................................38
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................39

ii


MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

FRET
EM

Fluorescence Resonance Energy Transfer
Sóng điện từ

BRET

truyền năng lượng cộng hưởng phát quang sinh
học

TCSPC

time-correlated single photon counting

SPR
AuNPs

Surface Plasmon Resonance

hạt nanô vàng

A

Acceptor

D

Donor

QDs

Quantum dots

DNA

Deoxyribonucleic acid

PL
Rh6G-CdSe/ZnS
AuNPs/Rh6G

Phổ huỳnh quang
Chấm lượng tử CdSe/ZnS-Rhodamin 6G
hạt nano vàng-Rhodamin 6G

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1: Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rh6G (Donor) và AuNPs (Acceptor) ........... 29
Bảng 3.2. Kết quả tính thời gian sống từ fitting đường cong suy giảm huỳnh quang theo hàm
stretch exponent. ....................................................................................................................... 33
Bảng 3.3. Các mẫu nghiên cứu FRET giữa cặp Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS . 34
Bảng 3. 4. Giá trị của tích phân vùng phổ chồng chồng lên nhau, (J ()), hiệu suất truyền
năng lượng Förster, (E%), và khoảng cách cặp donor-acceptor (r).......................................... 36

iv


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Mô hình hiệu ứng FRET............................................................................................. 6
Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET ................................................................. 10
Hình 1.3: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và Acceptor .................. 11
Hình 1.4: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng cách cặp donoracceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền băng 50% ............................... 12
Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch hỗn hợp của donor và
acceptor..................................................................................................................................... 13
Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b) .............................. 15
Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động........................ 16
Hình 2.1: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600 .................................................................... 18
Hình 2.2: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR .................................. 18
Hình 2. 3: Sơ đồ nguyên lý của máy phổ kế huỳnh quang Cary Eclipse ................................. 20
Hình 2.4: (a) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền thời gian;
(b) Phép đo thời gian sống theo phương pháp miền tần số ...................................................... 22
Hình 2.5: Nguyên lý tổng quát của kỹ thuật TCSPC: một photon tín hiệu được ghi nhận tại
mỗi chu kỳ xung kích thích, nhớ vào các cột thời gian (bin time), dựng lại biểu đồ tín hiệu
theo thời gian (histogram) sẽ cho profile cường độ [17] ............................................................ 24
Hình 2.6: Sơ đồ tổng quát của hệ TCSPC ................................................................................ 25
Hình 3.1: Ảnh HRTEM của AuNPs ......................................................................................... 28

Hình 3.2: Phổ hấp thụ của hạt AuNPs trong ............................................................................ 28
Hình 3.3: Phổ PL của các mẫu AuNPs/Rh6G, kích thích = 488nm. .......................................... 30
Hình 3.4. Hiệu suất FRET phụ thuộc vào tỉ lệ N giữa Acceptor và Donor (tam giác đỏ), so
sánh với lý thuyết Förster tại tỉ lệ R/Ro = 0.92 (Đường màu xanh dương).............................. 30
Hình 3.5: Đường cong suy giảm huỳnh quang của Rh6G ........................................................ 32
Hình 3.6: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ khác nhau
.................................................................................................................................................. 34
Hình 3.7: Phổ huỳnh quang phân giải thời gian của các mẫu Rh6G:CdSe/ZnS với tỉ lệ thành
phần khác nhau đo tại đỉnh phát xạ 563 nm với bước sóng kích thích 405 nm ....................... 35

v


MỞ ĐẦU
Truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang hay truyền năng lượng cộng
hưởng Förster được đặt tên của nhà khoa học Theodor Förster - người đã tìm ra hiệu
ứng truyền năng lượng giữa hai chất màu hữu cơ, chất huỳnh quang [1]. Trong một thời
gian dài, mục tiêu chính của phương pháp dựa vào FRET là xác định khoảng cách giữa
các phân tử tương tác bằng cách xác định sự thay đổi cường độ huỳnh quang của chất
cho (donor) hoặc chất nhận (acceptor), từ đó xác định hàm lượng thành phần của
donor-acceptor

[2,5]

. Sau này với sự phát triển của khoa học kỹ thuật đặc biệt là kỹ

thuật đo thời gian sống huỳnh quang, ảnh thời gian sống huỳnh quang, FRET trở thành
công cụ nghiên cứu cấu trúc, tương tác giữa các phân tử trong tế bào. FRET là nguyên
nhân gây ra sự dập tắt huỳnh quang của donor nhưng phần lớn năng lượng phát xạ bởi
acceptor. FRET có các thuộc tính của truyền năng lượng và dập tắt cơ học [4]. Khi hiệu

ứng FRET xảy ra, acceptor với một tập hợp các mức năng lượng quỹ đạo gần hoặc
thấp hơn mức kích thích của donor, có nghĩa là phổ phát xạ của donor phải chồng chập
lên phổ hấp thụ của acceptor, quá trình truyền năng lượng có thể đo được thông qua
thời gian sống huỳnh quang. Xác định FRET qua thời gian sống huỳnh quang có một
số ưu điểm so với phương pháp xác định cường độ phổ đồng thời tránh được trường
hợp không phải FRET (quá trình tái hấp thụ). Trong nghiên cứu này, chúng tôi trình
bày kết qủa nghiên cứu truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang là cặp donoracceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng; Rhodamin 6G và chấm lượng
tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước.
Luận văn với tiêu đề: “Ứng dụng phương pháp quang phổ phân giải thời gian
nghiên cứu quá trình truyền năng lượng cộng hưởng”. Ngoài phần mở đầu, kết luận
được chia làm 3 chương:
− Chương 1: Tổng quan tìm hiểu tài liệu về FRET, ứng dụng FRET: trình bày
lich sử phát triển nghiên cứu FRET, lý thuyết FRET và một số ứng dụng của
nó.

1


− Chương 2: Kỹ thuật thực nghiệm: Chuẩn bị mẫu đo, các phương pháp thực
nghiệm được sử dụng trong luận văn như đo phổ hấp thụ, phổ huỳnh quang,
thời gian sống huỳnh quang
− Chương 3. Trình bày các kết quả truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh
quang của 2 cặp donor-acceptor là: chất màu Rhodamin 6G và hạt nano vàng;
Rhodamin 6G và chấm lượng tử CdSe/ZnS trong môi trường dung môi nước.

2


Chương 1

TỔNG QUAN
1.1.Vật liệu nano và ứng dụng
Vật liệu nano là loại vật liệu được đặc biệt chú ý nghiên cứu trên thế giới và tại
Việt Nam trong hơn mười năm trở lại đây. Hiện nay công nghệ nano đã và đang dần đi
vào cuộc sống, nhiều ngành, nhiều lĩnh vực sử dụng công nghệ nano tạo ra ứng dụng
có tính đột biến lớn. Công nghệ và Vật liệu nano cũng là hướng nghiêu cứu ưu tiên
trong định hướng phát triển khoa học công nghệ của Đảng và Nhà Nước ta trong thời
gian tới. Về bản chất vật liệu nano là loại vật liệu làm việc ở cấp độ nguyên tử phân tử
nên nó có nhiều tính chất khác biệt so với vật liệu ở dạng khối. Vật liệu nano cho thấy
khả năng ứng dụng rất phong phú và đa dạng, vật liệu nano có thể thay thế các loại vật
liệu truyền thống hoặc sử dụng tính chất mới của vật liệu nano để tạo ra ứng dụng mới.
Với ưu điểm là kích thước rất bé (1-100nm) vật liệu nano có thể dễ dàng xâm
nhập vào các tế bào sống. Đây chính là chìa khoá để mở ra khả năng ứng dụng to lớn
trong lĩnh vực y-sinh học. Vật liệu nano có thể kết hợp với các chất hợp sinh để đưa
vào trong cơ thể, tế bào sống mà không bị đào thải và bám vào tế bào đích. Đây chính
là nguyên lý ứng dụng hạt nano đánh dấu nhận biết các tế bào bị bệnh nhằm chẩn đoán
và điều trị, nhằm giảm thiểu các hiệu ứng phụ so với những phương pháp truyền
thống. Cũng với tính chất này, vật liệu nano còn được sử dụng để dẫn truyền thuốc tới
tận các tế bào bệnh, ức chế hoặc tiêu diệt các tế bào. Nhiều phương pháp điều trị bệnh
được xây dựng trên cơ sở sử dụng vật liệu nano như liệu pháp hoá trị (chemotherapy):
chế tạo các hệ thống mang thuốc nano hướng đích làm tăng hiệu quả của thuốc và
giảm các tác dụng phụ; liệu pháp nhiệt trị (thermal therapy): sử dụng nguyên tắc đốt
nội với các nguồn nhiệt là các hạt từ, hạt kim loại kích thước bé hơn tế bào để bóc tách
hoặc diệt tế bào ung thư; liệu pháp thực khuẩn thể (phage therapy) là phương pháp sử
dụng các thực khuẩn thể đặc hiệu gắn với các hạt mang thuốc… Ngoài ra, tính chất
quang của các hạt nano như chấm lượng tử, hạt nano vàng, các hạt nano silica chứa
tâm màu hữu cơ và các hạt nano đất hiếm được sử dụng để đánh dấu, làm tăng độ
tương phản ảnh, tăng độ nhạy cũng như độ chính xác của phép chuẩn đoán hình ảnh.
3

Tại Việt Nam nghiên cứu về vật liệu nano đã được thực hiện gần hai chục năm qua,
hàng ngàn dự án, đề tài khoa học các cấp đã được thực hiện, chúng ta đã thu được
nhiều kết quả khoa học đáng khích lệ, nhiều công trình khoa học đã được công bố,
nhiều kết quả đã được đưa vào ứng dụng trong thực tế …bên cạnh những tính chất,
thông số, đặc trưng vật lý của đơn hạt nano ở trạng thái dừng (steady state) của vật liệu
nano được tập trung nghiên cứu thời gian gần đây, một tính chất khác của vật liệu
nano là tính chất động học – tính chất của vật liệu khi có tương tác với môi trường bên
ngoài ít được chú ý vì ở Việt Nam chúng ta chưa có đầy đủ phương tiện, máy móc để
thực hiện các nghiên cứu này. Gần đây tại viện Vật lý Viện Hàn lâm Khoa Học Công
Nghệ Việt Nam đã phát triển được một số thiết bị cho phép xác định được một số đặc
tính động học của vật liệu nano.
Vật liệu nano có triển vọng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Chẳng hạn, ống
nano cacbon, dây nano silic đóng vai trò quan trọng trong việc chế tạo các linh kiện
điện tử, cũng như các chuyển mạch quang... Các vật liệu gốm trên cơ sở tinh thể nano
Si3N4, SiC... có độ cứng siêu cao, ít bị mài mòn, được dùng trong cơ khí để chế tạo
mũi khoan, dao cắt gọt, các ổ bi.... Vật liệu TiO2 anatase với kích thước cỡ nano mét
cho thấy chúng là một chất xúc tác quang điện hóa mạnh, mở ra một khả năng ứng
dụng làm vật liệu xúc tác, làm sạch môi trường: kính được phủ hạt tinh thể nano TiO2
sẽ không dính ướt; các loại sơn có pha hạt nano TiO2 sẽ có độ bám dính rất cao, làm
cho lớp sơn bền lâu và không bám bụi... Các hạt nano từ: Fe2O3, Fe3O4... được sử dụng
để đốt các tế bào ung thư bằng từ trường ngoài mà không ảnh hưởng đến các tế bào
bình thường.
Các hạt kim loại có cấu trúc nano cũng là một hướng tiếp cận trong các nghiên
cứu khoa học–công nghệ nano. Ở đây, tính chất hấp thụ cộng hưởng plasmon bề mặt
liên quan tới hệ điện tử tự do đặc biệt có ý nghĩa quan trọng. Gần đây, hai loại hạt
nano kim loại được quan tâm nghiên cứu nhiều là vàng (Au) và bạc (Ag). Vàng kích
thước nano (khoảng một vài chục nm) có plasmon bề mặt cộng hưởng ở khoảng 530
nm. Quá trình biến đổi photon–plasmon–photon (vùng phổ cộng hưởng ~530 nm) cho
phép tiếp cận trực tiếp lĩnh vực nano–photonics, tận dụng được các ưu thế "nhanh" của

quang tử (photonics) và "kích thước nano" của điện tử. Plasmon bề mặt trong các hạt
vàng còn được sử dụng để truyền năng lượng ánh sáng cho các tế bào, protein được
4


đánh dấu riêng, nhằm có được sự đốt nóng chọn lọc trong điều trị định vị các mô ung
thư. Các hạt nano bán dẫn (CdS, CdSe, CuInS2...) được sử dụng trong đánh dấu sinh
học, phát hiện các phân tử DNA, phát hiện ung thư, virút hay các ứng dụng trong pin
mặt trời, chiếu sáng rắn... [6]
1.2. Hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET)
1.2.1. Khái niệm.
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (Fluorescence
Resonance Energy Transfer - FRET ) là một cơ chế truyền năng lượng xảy ra ở cấp độ
nano thông qua tương tác lưỡng cực – lưỡng cực, đây là một hiện tượng vật lý quan
trọng với nhiều lĩnh vực tiềm năng trong lĩnh vực quang điện tử và rất nhiều lĩnh vực
khác. FRET được đưa ra từ thập kỷ 50 của thế kỷ trước, hiện nay đang được ứng dụng
rộng rãi trên nhiều lĩnh vực đặc biệt trong nghiên cứu y sinh học

[7,8]

. FRET là hiệu

ứng phụ thuộc vào khoảng cách truyền năng lượng từ một chất cho huỳnh quang
(donor) tới một acceptor huỳnh quang (acceptor) phù hợp, là một trong số ít các công
cụ có sẵn để đo khoảng cách nanomet và xác định những thay đổi trong khoảng cách
cả trong in vitro lẫn trong cơ thể. Do có độ nhạy với khoảng cách cao, nên hiệu ứng
FRET đã được sử dụng để nghiên cứu động học, tương tác nguyên tử. [9,10,13]
Cơ chế truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang liên quan đến các chất phát
huỳnh quang mà ở đây là điện tử ở trạng thái kích thích, một phân tử huỳnh quang có
thể truyền năng lượng kích thích của nó cho một acceptor không phát xạ gần đó thông

qua các tương tác lưỡng cực-lưỡng cực tầm xa. Lý thuyết truyền năng lượng được dựa
trên khái niệm về một chất huỳnh quang kích thích như một dao động lưỡng cực có thể
trải qua sự trao đổi năng lượng với một lưỡng cực thứ hai có tần số cộng hưởng tương
tự. Vấn đề này, truyền năng lượng cộng hưởng tương tự như sự dao động cùng tần số.
Ngược lại, năng lượng bức xạ yêu cầu phát xạ và tái hấp thụ một photon phụ thuộc vào
kích thước vật lý và tính chất quang học của mẫu vật, cũng như hình dạng của bề mặt
và quãng đường truyền sóng. Không giống như các cơ chế bức xạ, truyền năng lượng
cộng hưởng có thể mang lại một lượng đáng kể thông tin về cấu trúc liên quan đến các
acceptor.[9,10,12]

5


Một cặp phân tử tương tác với nhau thông qua hiệu ứng FRET được gọi là một
cặp donor- acceptor. Hiện tượng FRET không qua trung gian là quá trình phát xạ
photon. Ngoài ra, nó thậm chí không yêu cầu chất màu nhận được phát huỳnh quang.
Mặc dù trong hầu hết các ứng dụng, các donor và acceptor đều có khả năng phát
huỳnh quang. [13,14]
Tóm lại, FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer - FRET ) hay còn gọi
là hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang. Ở đây truyền năng lượng
cộng hưởng (RET) còn gọi là truyền năng lượng cộng hưởng điện tử (electronic
energy tranfer – EET).
Hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) là cơ chế mà
trong đó một hạt nano có thể truyền năng lượng kích thích không bức xạ của nó cho
một hạt nano độc lập khác ở một khoảng cách ngắn (khoảng cách nguyên tử).
Phát xạ

FRET

Donor

Accrptor

Hấp thụ
Huỳnh quang chất cho

Hấp thụ chấp nhận

Hình 1.1: Mô hình hiệu ứng FRET
Một cặp nguyên tử tạo ra một điện trường do sự tương tác lưỡng cực. Đầu tiên
sự hấp thụ ánh sáng xảy ra ở nguyên tử cho (donor molecule), bắt đầu bị kích thích.
Trước khi donor có thể phát huỳnh quang và quay trở lại trạng thái ban đầu, nó đang ở
trạng thái kích thích nên truyền năng lượng cho nguyên tử nhận (acceptor molecule)
gần nhất có trạng thái năng lượng kích thích thấp nhất qua sự trao đổi của một photon
ảo. Nguyên tử cho (the donor) trở về trạng thái cơ bản còn nguyên tử nhận trở lên
trạng thái kích thích.[9,15,16]
Kết quả cuối cùng là nguyên tử nhận bắt đầu chuyển lên trạng thái kích thích
nhờ vào quá trình gián tiếp nhận photon ảo, mặt khác đây cũng là hiện tượng xảy ra rất
tự nhiên

[12]

. FRET là một hiện tượng tự nhiên đầy lý thú bởi vì nó không phụ thuộc

vào sự tiếp xúc vật lý cũng như truyền điện tử.

6


1.2.2. Lịch sử phát triển FRET [11]

Mặc dù các ứng dụng thực tế của FRET chỉ diễn ra sau năm 1950 nhưng quan
sát hiện tượng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang được thực hiện từ thực
nghiệm năm 1900 và các nhà khoa học luôn tìm mọi cách để giải thích hiện tượng này.
Bắt đầu với lý thuyết về sóng điện từ (EM) và quang phổ, đồng thời với sự ra đời của
cơ học lượng tử (QM). Những lý thuyết này rất cần thiết cho quan sát và giải thích
đúng về việc truyền năng lượng không bức xạ. Khái niệm EM đưa ra chỉ vài thập kỷ
trước khi quan sát được truyền năng lượng. Lý thuyết đầu tiên cố gắng giải thích
FRET là sử dụng lý thuyết EM cổ điển này. Lý thuyết cơ học lượng tử đầu tiên của
FRET đã được phát triển đồng thời với lý thuyết mới của Heisenberg, Schrodinger và
Dirac (Heisenberg, 1925; Dirac, 1926; Schrodinger, 1926).
Thí nghiệm đầu tiên ghi lại các phép đo truyền năng lượng huỳnh quang cộng
hưởng (quan sát phát xạ của nguyên tử donor) được Carlo và Franck thực hiện trên
khoảng cách lớn hơn bán kính va chạm đã được thực hiện vào năm 1922. Carlo quan
sát phát xạ từ Tali trong một hỗn hợp hơi thủy ngân và Tali, khi hỗn hợp hơi bị kích
thích bởi bước sóng 253,6 nm, Bước sóng này chỉ có thể kích thích các nguyên tử thủy
ngân nhưng lại thu được huỳnh quang của Tali. Huỳnh quang của Tali được gọi là
“huỳnh quang cảm ứng” (sensitized fluorescence) nó quan sát được vì năng lượng từ
các nguyên tử thủy ngân bị kích thích đã truyền cho nguyên tử tali.
Các thí nghiệm tiếp theo của các tác giả khác thấy huỳnh quang cảm ứng xẩy ra
với hơi của các kim loại kiềm như: bạc, cadmium, chì, kẽm và indi với sự có mặt của
hơi thủy ngân. Tầm quan trọng của sự cộng hưởng giữa năng lượng mức giữa các mức
năng lượng của nguyên tử nhạy cảm đã được minh chứng rõ ràng bởi các thí nghiệm
sau nay của Beuler và Josephi (1927-1929), cường độ huỳnh quang tăng với sự tham
gia của hai loại nguyên tử. Điều này phù hợp với nguyên lý Franck (1922): năng lượng
điện tử của một nguyên kích thích không thể chuyển trực tiếp thành động năng của hạt
va chạm. Nếu năng lượng kích thích đã chuyển thành nội năng dập tắt thì sẽ có những
trạng thái kích thích với năng lượng được tăng cường
Cơ học lượng tử và lý thuyết truyền năng lượng [9,10]
Lý thuyết cơ học lượng tử để giải thích sự truyền năng giữa các nguyên tử ở
khoảng cách xa hơn so với bán kính va chạm đã được đề xuất bởi Kallmann và

7


London (1928). Lý thuyết này giả thiết có sự cộng hưởng giữa các mức năng lượng
của các nguyên tử tương tác. Về cơ bản đây là phép tính nhiễu loạn bậc hai để tính
toán năng lượng tương tác. Họ tìm ra rằng chuyển dời giữa các mức năng lượng là các
chuyển dời dipole, tiết diện hiệu dụng q của 2 nguyên tử tương tác tăng -2/3 ( là sự
sai khác mức năng lượng kích thích) khi →0 tiết diện hiệu dụng tiến tới giá trị lớn
hơn bán kính tán xạ. Đây là cơ sở lý thuyết FRET cơ học lượng tử sau này, tương tự
như mô tả của lực London-van der Waals.
Lực London - Van Der Waals) và tương tác Debye-Keesom
Ý tưởng lưỡng cực-lưỡng cực (Dipole-Dipole) tương tác ở khoảng cách giữa
các nguyên tử và phân tử đang được London áp dụng giải thích tương tác phân tử
Vander Waals và truyền năng lượng. Trước đó tương tác này cũng đã được Keesom
(1912); Debye (1920-1921) sử dụng giải thích các tương tác giữa các phân tử có mối
liên hệ giữa phân tử của London và FRET. Sự khác nhau chính ở đây là năng lượng
tương tác của lực Vander Waals và tốc độ thay đổi năng lượng của FRET. Trong
tương tác Vander Waals cả hai phân tử tương tác ở trạng thái cơ bản còn trong FRET
một trong hai phân tử tương tác ở trạng thái kích thích. Biểu thức lực London tương
tác giữa hai nguyên tử liên quan đến cường độ dao động UV-Vis của chuyển dời
quang học tương ứng, giống như FRET (Förster, 1951). Biểu thức đầy đủ cho tương
tác London tổng của các chuyển dời quang học của hai nguyên tử tương tác. Nếu cả
hai nguyên tử đều ở trạng thái cơ bản, lực London luôn là lực hút, hơn nữa, nếu các
nguyên tử tương tác không phải là hình cầu đối xứng có phân cực đẳng hướng, định
hướng tương đối của chúng sẽ ảnh hưởng đến sự tương tác (giống như sự phụ thuộc
định hướng của FRET). Tương tác van der Waals đơn giản (không tính đến thế năng
liên quan đến hiệu ứng Casmir theo lý thuyết của London giảm theo R6, trong đó R là
khoảng cách giữa các nguyên tử; điều này cũng giống nhau khoảng cách phụ thuộc
như FRET giữa hai phân tử huỳnh quang.
Lý thuyết của J. Perrin và F. Perrin

Mô hình J. Perrin (1925): Ông giả thuyết rằng việc truyền năng lượng kích
thích có thể nhảy từ một phân tử tới một phân tử khác thông qua tương tác giữa các
dao động lưỡng cực của các phân tử gần nhau. Theo lý thuyết cổ điển một phân tử kích
thích sẽ dao động ở tần số  tương ứng với cường độ của năng lượng kích thích
8


Eexit= h, là sự sai khác giữa hai mức năng lượng. Các phân tử tương tác như trường
dipole điện Hertzian (1888);
Dipole Hertzian dao động như là một dipole tĩnh. Perrin giả định rằng nếu các
phân tử được phân cách bởi khoảng cách đủ nhỏ, năng lượng có thể được chuyển cho
phân tử acceptor không phát xạ. Ông gọi đây là ''transfert d'activation''.
Mô hình F. Perrin
F. Perrin (con trai của J. Perrin) là một trong những người tiên phong về huỳnh
quang (1929), Ông mở rộng J. Perrin lý thuyết truyền giao năng lượng bằng cách phát
triển một mô hình cơ học lượng tử (Perrin, 1932; Perrin, 1933). Tuy nhiên, ông kết
luận, cũng như J. Perrin, rằng tốc độ truyền tỷ lệ thuận với 1/R3; điều này dẫn đến việc
truyền năng lượng ở khoảng cách dài hơn đã được tìm thấy bằng thực nghiệm. F.
Perrin cũng xem xét tới va chạm giữa các phân tử huỳnh quang và các phân tử dung
môi, cũng như hiệu ứng Doppler (Perrin, 1932; Perrin, 1933). Những va chạm này mở
rộng phổ sự hấp thụ và phát xạ của các phân tử, vốn J. Perrin giả thiết là hẹp để đảm
bảo hiệu suất tương tác. Các hiệu ứng va chạm và Doppler như vậy là chủ đề của
nhiều nghiên cứu quang phổ trong hai thập kỷ đầu của thế kỷ 19 và cũng đã được
Kallmann và London nghiên cứu ở pha hơi. Các mở rộng quang phổ là quan trọng vì
lý do sau đây. Năng lượng bị mất bởi donor chính xác bằng năng lượng thu được của
acceptor. Mỗi phân tử chỉ có một xác suất va chạm nhất định. Điều này làm giảm khả
năng cộng hưởng, bởi vì phải có hai lưỡng cực tương tác để có quá trình truyền năng
lượng. F. Perrin đã sử dụng lý thuyết phổ va chạm mở rộng cho truyền năng lượng ở
khoảng cách mới giảm xuống còn khoảng [(/ 2) (t/)]1/6 trong đó t là thời gian giữ
hai lần va chạm;  là thời gian sống huỳnh quang

Lý thuyết của Förster's.
Trên cở sở các công trình của các nhà khoa học tiền bối Theodor Förster đã
phát triển lý thuyết truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang xuất bản và công bố
qua hàng loạt công bố từ 1946-1951.
1.2.3. Cơ sở lý thuyết của hiệu ứng FRET.[9,12]
Sự kích thích trên một ion có thể lan truyền sang một ion cùng loại khác sang một
trạng thái cơ bản là một kết quả của sự truyền năng lượng cộng hưởng (FRET) khi
chúng được định xứ gần nhau. Khoảng cách giữa các ion mà tại đó xác suất của quá
9


trình huỳnh quang và năng lượng trở nên cạnh tranh nhau là cỡ vài Angstrom. Sơ đồ
của quá trình truyền năng lượnđg cộng hưởng mô tả như hình dưới:

Hình 1.2: Giản đồ Jablonski mô tả hiệu ứng FRET
Trong quá trình truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang, phân tử huỳnh
quang donor hấp thụ năng lượng tưng ánh sáng tới chuyển lên trạng thái kích thích.[9]
Năng lượng kích thích này truyền cho phân tử huỳnh quang acceptor lân cận. Quá
trình truyền năng lượng này tự nó sẽ làm giảm huỳnh quang của donor (dập tắt) và
tăng cường độ huỳnh quang acceptor đồng thời giảm thời gian sống huỳnh quang
donor
D + h → D*+
D* + A → D +A*
A* →A + h’
D: donor; A: acceptor; dấu “*” kí hiệu trạng thái kích thích
Một số điều kiện cần phải được thỏa mãn để cho FRET xảy ra đó là:
(i)

Phổ phát xạ huỳnh quang của các phân tử donor phải chồng lên phổ hấp

thụ hoặc kích thích của chất màu nhận. Mức độ chồng chập lên nhau được gọi là phổ
chồng lên nhau tích hợp (J).
(ii)

Donor phải có cường độ huỳnh quang mạnh.

(iii)

Hai chất này (donor và acceptor) phải ở khoảng cách gần nhau (thường 1

đến 10 nanomet).
10


(iv)

Các lượng cực điện (dipole) của các donor và acceptor phải gần như

song song với nhau.
(v)

Thời gian sống huỳnh quang của các phân tử các donor phải có khoảng

Cường độ

thời gian đủ để cho hiệu ứng FRET xảy ra.

Bước sóng (nanomet)

Hình 1.3: Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và

Acceptor
Hình 1.3. Phổ hấp thụ và phổ huỳnh quang của một cặp chất Donor và
Acceptor. Khu vực màu đậm là sự chồng quang phổ gữa quang phổ huỳnh quang của
các donor và phổ hấp thụ của acceptor.[9]
Hiệu suất truyền năng lượng FRET tỉ lệ với nghịch đảo mũ 6 khoảng cách
donor-acceptor
(1.1)
Trong đó R0 là bán kính Förster – là khoảng cách mà ở đó năng lượng
truyền được 50%.

11


Hiệu suất truyền năng

Khoảng cách (Angstorm)

Hình 1.4: Hiệu suất truyền năng lượng FRET được vẽ như hàm khoảng
cách cặp donor-acceptor, khoảng cách R0 là khoảng cách mà hiệu suất truyền băng 50%
(1.2)
Bán kính Förster R0 phụ thuộc vào hiệu suất lượng tử huỳnh quang của donor
(D) khi không có mặt acceptor (fd), chiết suất của dung môi (η), góc định hướng
lưỡng cực của phân tử (K2 ) và sự chồng chập phổ của donor-acceptor (J)

(1.3)
Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua cường độ huỳnh
quang theo biểu thức:
(1.4)
Trong đó FD là cường độ huỳnh quang của donor; FDA cường độ huỳnh quang
của donor khi có mặt acceptor

Hiệu suất truyền năng lượng cũng có thể xác định thông qua thời gian sống
huỳnh quang theo biểu thức

(1.5)
12


Trong đó DA là thời gian sống huỳnh quang của donor khi có mặt acceptor; D
là thời gian sống huỳnh quang của donor khi không có mặt acceptor
Tóm lại, tỷ lệ FRET phụ thuộc vào mức độ chồng chập quang phổ giữa các cặp
cho – acceptor (hình 1.3), hiệu suất lượng tử của các chất cho, định hướng tương đối
của các donor– acceptor, những khoảng cách chuyển tiếp lưỡng cực và khoảng cách từ
các donor tới acceptor. Bất kỳ quá trình nào có ảnh hưởng đến khoảng cách giữa các
cặp chất cho- acceptor cũng sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất của FRET.
Phát hiện hiệu ứng truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET):
Việc phát hiện và định lượng hiệu ứng FRET có thể được thực hiện trong một
số cách khác nhau. Đơn giản chỉ cần hiện tượng này có thể được quan sát bởi một mẫu
vật có chứa cả các donor và các phân tử acceptor với ánh sáng phát ra ở các bước sóng
trung tâm gần với phát xạ. Bởi vì FRET có thể dẫn đến giảm cường độ huỳnh quang
của các phân tử donor cũng như tăng cường độ huỳnh quang của acceptor, nên khi xác
định tỷ lệ số liệu của hai tín hiệu có thể phát hiện được hiệu ứng FRET có xảy ra hay
không [12].
Ưu điểm của phương pháp này là một thước đo của sự tương tác có thể được
thực hiện là độc lập với nồng độ tuyệt đối của cảm biến. Bởi vì không phải tất cả các
gốc acceptor đều phát huỳnh quang, nên chúng có thể được sử dụng như một phương
tiện để dập tắt huỳnh quang. Trong trường hợp này, những tương tác mà kết quả trong
một phân tử các chất huỳnh quang cho đến gần phân tử như vậy sẽ dẫn đến một sự mất

Cường độ

mát tín hiệu.

Khoảng cách (Angstorm)

Hình 1.5: Quang phổ huỳnh quang của donor và acceptor và dung dịch
hỗn hợp của donor và acceptor
13


Trong Hình 1.5, huỳnh quang của acceptor tăng gần sáu lần khi có sự hiện diện
của chất cho. Trong trường hợp, như huỳnh quang các donor trở thành 1/3 huỳnh
quang các chất cho. Sự thay đổi cường độ huỳnh quang là bằng chứng hình ảnh rõ
ràng của FRET. Các quang phổ huỳnh quang đã được ghi nhận là sự phát huỳnh quang
của donorvà nhận. Đây là hiệu ứng FRET sử dụng các chất 3-octadecyl-2[3-octadecyl2(3H)-benzothizolidene) metyl] benzoth) metyl] benzothiazolium perchlorate (chất
cho), Octadecyl rhodamine B (acceptor).
1.2.4. Ứng dụng hiệu ứng FRET và chấm lượng tử làm nanosensor
Nanosensor là cảm biến được xây dựng ở cấp độ nano, với mục đích chủ yếu là
để thu thập số liệu về quy mô nguyên tử và chuyển nó thành dữ liệu có thể dễ dàng
phân tích. Các cảm biến này cũng có thể được định nghĩa là “Một cảm biến hóa học,
cảm biến vật lý, cảm biến sinh học sử dụng các thành phần có kích thước nano, thông
thường là từ kích thước micromet tới nanomet”. Những cảm biến này có độ nhạy cực
kỳ cao và có thể phát hiện các hạt đơn lẻ hoặc thậm chí nồng độ cực thấp dư lượng
một chất nguy hiểm tiềm tàng còn sót lại. Vì hiện nay công nghệ này đã và đang được
nghiên cứu ở rất nhiều hướng khác nhau nên rất khó để có thể cho một định nghĩa duy
nhất về những gì chính xác là một nanosensor.[12]
• Nanosensor xác định DNA
Cũng như nguyên lý của hiệu ứng FRET, các nhà khoa học đang trong giai
đoạn tạo ra loại sensor DNA nano bằng việc sử dụng Qds để xác định các DNA. Trong
kỹ thuật này, các phát minh đã sử dụng QDs là chất CdSe-ZnS được chế tạo bằng kỹ
thuật lõi-vỏ làm donor. Trên bề mặt của chấm lượng tử được biến tính hoạt hóa bằng

chất Streptavisin. Tiếp theo cho chất huỳnh quang Cy5.5 và Biotin tác dụng với chất
Oligonucleotit tạo thành hai tác nhân hoạt hóa với vai trò khác nhau: tác nhân thông
tin (Reporter probe) và tác nhân liên kết (Capture probe). Hai nhóm phân tử chức năng
này liên kết với phân tử DNA cần xác định (mục đích DNA). Cụm phân tử hai chức
năng thông tin và kết hợp có chứa DNA, liên kết với QDs đã biến tính (Steptavidin
Conjugated QDs), tạo thành biosensor DNA nano. Biosenssor DNA nano này có nhóm
biotin kết hợp với chất Steptavidin trên bề mặt QDs. Nhờ vậy hiệu ứng FRET được

14


phát huy. Bằng phương pháp này, ta có thể kiểm chứng được DNA nhanh và độ chính
xác cao[12,13,14]. Hình 1.6 là mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano.

Hình 1.6: Mô hình cơ chế hoạt động của biosensor DNA nano QDs (a,b)
và hiệu ứng kiểm tra (c).
Nhìn chung, biosensor nano hiệu ứng FRET dùng chất phát huỳnh quang QDs
có nhiều ưu điểm so với huỳnh quang hữu cơ. Vì vậy nhiều loại biosensor để xác định
ảnh invivo được nghiên cứu chế tạo.
• Sử dụng nanosensor trong nghiên cứu Enzim
Giáo sư Gae Baik Kim và Young-Pil Kim cùng các cộng sự taị đại học
Hanyang Hàn Quốc cũng nghiên cứu và phát triển phép phân tích Enzim Protease
bằng nanosensor sử dụng chấm lượng tử có hiệu ứng FRET. Nghiên cứu này cho thấy
việc phát triển hoạt động của protease dựa trên sự truyền năng lượng của các chấm
lượng tử. Bằng cách kết hợp một số loại protease vào thiết kế của dạng QDs có cấu
trúc truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang (FRET) và truyền năng lượng cộng
hưởng phát quang sinh học (BRET), hoạt động của protease dẫn đến những thay đổi
trong hiệu suất truyền năng lượng. Đặc biệt là do đặc tính vượt trội của QDs, nó có thể
15

được xem như là một tác nhân nhận biết protease với độ nhạy cao. Người ta dự đoán
rằng QDs dựa trên FRET/BRET như một đầu dò sẽ có một tiềm năng lớn trong việc
phân tích vai trò cơ bản của protease và có khả năng chế tạo loại thuốc ức chế protease
như thuốc điều trị sinh học dạng nano [12,13,14].
FRET là kỹ thuật phổ biến nhất được sử dụng trong các ứng dụng cảm biến
sinh-hóa hiện nay bởi độ nhạy cao, khả năng phục hồi trạng thái tốt, và khả năng quan
sát trong thời gian thực. Phương pháp thông thường để phát hiện để phát hiện hoạt
động protein được dựa trên phát huỳnh quang với các liên kết peptide hữu cơ. Ví dụ
cho hoạt động protease là đầu dò tự động, đầu dò mang màu kép, và đầu dò dựa trên
các photon hiệu ứng FRET, như mô tả hình 1.7.
Tuy nhiên, việc phát huỳnh quang hữu cơ thường gặp một vài vấn đề chẳng hạn
như hình ảnh bị tẩy trắng, độ nhạy ảnh hưởng bởi môi trường, khó khăn trong việc
phân tích tổ hợp donor và acceptor. Như đã nói trên, những vấn đề trong các nghiên
cứu về FRET có thể được khắc phục khi có phổ huỳnh quang thích hợp hoặc dập tắt
được sử dụng thích hợp với chấm lượng tử (QDs).(hình 1.7). Từ QDs có dải hấp thụ
rộng và phổ phát xạ hẹp cũng như sự ổn định quang cao, sẽ có thuận lợi trong việc
theo dõi lâu dại và cho phép phát hiện, QDs thường được sử dụng như các donor trong
khi các phân tử nhận năng lượng huỳnh quang (chất dập tắt) thường là một peptide
được biến tính thích hợp [12-13-14].

Hình 1.7: Sơ đồ cảm biến FRET cơ bản để phát hiện các protease hoạt động
(A) Quá trình FRET thông thường (B) FRET sử dụng QDs. D và A là chất cho và
nhận tương ứng
16


Chương 2

KỸ THUẬT THỰC NGHIỆM

2.1. Kỹ thuật đo hấp thụ
Phổ hấp thụ là một công cụ hữu ích trong việc nghiên cứu sự tương tác của vật
liệu với ánh sáng chiếu vào, qua đó, có thể biết được thông tin về các quá trình hấp thụ
xảy ra tương ứng với các chuyển dời quang học từ một số trạng thái cơ bản ni đến một
số trạng thái kích thích nj, từ đó có thể xác định được bước sóng kích thích hiệu quả
cho quá trình quang huỳnh quang (j–i) quan tâm. Môi trường vật chất hấp thụ ánh sáng
tuân theo định luật Beer–Lambert:
I (ν) = I0(ν)e – α (ν )d

(2.1)

trong đó: I0(ν) và I(ν) là cường độ ánh sáng tới và cường độ truyền qua mẫu
vật chất, d là độ dày của mẫu và α(ν) là hệ số hấp thụ vật liệu đối với photon có năng
lượng hν (hay hc/λ, với c là vận tốc ánh sáng).
Muốn xác định hệ số hấp thụ α(ν), người ta lấy in hai vế (2.1), được:
Ln [I0(ν) /(I (ν)] = α(ν)d𝛼(𝜈)𝑑

(2.2)

Phổ hấp thụ biểu diễn đồ thị hệ số hấp thụ α (hay độ hấp thụ A) theo bước sóng
hay năng lượng của photon đi qua vật chất. Như vậy, hệ số hấp thụ lớn tại một bước
sóng nào đó cho thấy photon có năng lượng tương ứng bị vật chất hấp thụ mạnh, phần
ánh sáng truyền qua có cường độ yếu. Ý nghĩa của hệ số hấp thụ bằng 1 là khi ánh
sáng truyền qua một môi trường có độ dày 1 cm, cường độ sẽ bị suy giảm đi e (~2,7)
lần. Hai đại lượng I0(ν) và I (ν) đo được bằng thực nghiệm.
Phương pháp đo phổ hấp thụ trong từng vùng phổ đòi hỏi nguồn sáng phát xạ liên
tục trong vùng phổ đó, một phổ kế hoặc là máy đơn sắc lựa chọn bước sóng hay tần số,
thiết bị thu tín hiệu để đo sự truyền qua của ánh sáng đơn sắc. Nguồn sáng thường
được sử dụng là đèn hydrogen và deuterium đối với vùng tử ngoại và đèn dây tóc
(volfram+halogen) cho vùng nhìn thấy và vùng hồng ngoại gần. Trong thí nghiệm đo

phổ hấp thụ, chúng tôi dùng đèn halogen phát xạ trong vùng nhìn thấy. Bằng cách ghi
phổ trải trong vùng năng lượng photon rộng, có thể biết được các quá trình hấp thụ xảy
ra tương ứng với các chuyển dời quang học.
17


Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Một chùm ánh sáng được phát ra từ nguồn
sáng, là đèn phát sáng trong vùng tử ngoại UV hoặc phát trong vùng nhìn thấy VIS,
được đưa qua hệ máy đơn sắc là hệ lăng kính hoặc cách tử nhiễu xạ, để được tách ra
thành các bước sóng đơn sắc. Mỗi tia sáng đơn sắc này sẽ lần lượt được chia thành hai
tia để so sánh, có cường độ như nhau nhờ một gương phản xạ bán phần. Một trong hai
tia sáng trên truyền qua một cuvet trong suốt bằng thạch anh chứa dung dịch mẫu cần
nghiên cứu, cường độ của tia sáng sau khi truyền qua mẫu là I. Tia sáng còn lại là tia
sáng so sánh truyền qua một cuvet tương tự nhưng chỉ chứa dung môi không chứa
chấm lượng tử, cường độ của nó sau khi truyền qua dung môi là Io. Cường độ của các
tia sáng sau đó được các detector ghi lại và so sánh trực tiếp trong cùng điều kiện đo.

Hình 2.8: Máy đo phổ hấp thụ Shimazu UV2600

Hình 2.9: Sơ đồ nguyên lý của hệ đo hấp thụ quang học UV-VIS-NIR
18


Nếu mẫu không hấp thụ ánh sáng ở một bước sóng đã cho thì I = Io. Tuy nhiên
nếu mẫu hấp thụ ánh sáng thì I < Io. Các phổ có thể được vẽ dưới dạng phổ truyền
qua :
T(ν) = I(ν)/Io(ν)

(2.3)

A(ν) = log10[Io(ν)/I(ν)].

(2.4)

hoặc phổ hấp thụ:

2.2. Kỹ thuật đo huỳnh quang
Hệ đo phổ huỳnh quang Cary Eclipse phân giải cao được đặt tại Viện Vật Lý,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nguyên tắc hoạt động của phổ kế
Cary Eclipse được cho trên hình 2.2.
Nguyên lý hoạt động của hệ đo: Nguồn kích thích của Cary Eclipse là đèn
Xenon flash có thể phát bước sóng từ 200 đến 1000nm, nguồn sáng từ đèn xenon đi
qua một máy đơn sắc để chọn bước sóng đơn sắc kích thích. Ánh sáng đơn sắc này
được đưa vào buồng mẫu và hội tụ lên mẫu đo. Tín hiệu huỳnh quang phát ra từ mẫu
được hội tụ lên lối vào của máy đơn sắc thứ hai và thu nhận ở lối ra bằng đầu thu
quang điện. Một phần của ánh sáng kích thích được trích ra đưa vào đầu thu quang
điện thứ hai để đồng bộ với tín hiệu thu. Xeno flash hoạt động ở chế độ xung nên Cary
Eclipse còn có thể đo thời gian sống huỳnh quang của mẫu có thời gian sống dài (lân
quang).

19