Nghiên cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ ở cây thổ nhân sâm (talinum paniculatum luận án tiến sĩ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
–––––––––––––––––––––––

VŨ THỊ NHƢ TRANG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN
TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ
Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM)

LUẬN N TIẾN S SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2019


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
––––––––––––––––––––

VŨ THỊ NHƢ TRANG

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN GmCHI LIÊN QUAN ĐẾN
TỔNG HỢP FLAVONOID VÀ CẢM ỨNG TẠO RỄ TƠ
Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM (TALINUM PANICULATUM)
Ngành: Di truyền học
Mã số: 9420121

LUẬN N TIẾN S SINH HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu

THÁI NGUYÊN - 2019


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng dẫn của
GS.TS Chu Hoàng Mậu. Các kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần
đã đƣợc công bố trong các Tạp chí khoa học chuyên ngành với sự đồng ý và cho
phép của các đồng tác giả; phần còn lại chƣa ai công bố trong bất kỳ công trình nào
khác. Mọi trích dẫn đều ghi rõ nguồn gốc.
Tôi xin chịu trách nhiệm hoàn toàn về nội dung và các số liệu đã trình bày
trong luận án.
Thái Nguyên, ngày 12 tháng 3 năm 2019
TÁC GIẢ

Vũ Thị Nhƣ Trang


ii

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới GS.TS Chu Hoàng Mậu đã trực
tiếp hƣớng dẫn và thƣờng xuyên chia sẻ, động viên khích lệ để tôi có đƣợc sự tự tin
và lòng đam mê khoa học giúp tôi hoàn thành bản luận án này.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Văn Sơn và các cán bộ, nghiên cứu
viên Phòng Công nghệ ADN ứng dụng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất để tôi có thể
hoàn thành một số thí nghiệm nghiên cứu thuộc đề tài luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của thầy cô và cán bộ Bộ môn Sinh học

hiện đại & Giáo dục Sinh học, Khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học
Thái Nguyên. Đƣợc học tập và sinh hoạt chuyên môn tại tập thể khoa học nghiêm
túc, tôi đã nhận đƣợc nhiều góp ý quý báu, đƣợc trang bị thêm những phƣơng pháp
nghiên cứu và có những hiểu biết sâu sắc hơn về các vấn đề của Sinh học hiện đại.
Tôi xin cảm ơn các thầy cô và cán bộ Khoa Sinh học, các thầy cô và cán bộ
phòng Đào tạo, Trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khoá học này.
Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng tri ân đối với những ngƣời thầy, những đồng nghiệp,
gia đình và bạn bè là những điểm tựa tinh thần vững chắc, đã giúp đỡ, động viên,
khích lệ, chia sẻ những khó khăn và luôn đồng hành cùng tôi trong quá trình học tập
của mình.
Thái Nguyên, ngày 12 tháng 3 năm 2019
TÁC GIẢ

Vũ Thị Nhƣ Trang


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ....................................................................................................... i
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................ ii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iii
DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT ...........................................v
DANH MỤC CÁC BẢNG...................................................................................... viii
DANH MỤC CÁC HÌNH ......................................................................................... ix
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1. Đặt vấn đề ............................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ................................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................................... 3

4. Những đóng góp mới của luận án ........................................................................... 3
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án ................................................... 4
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................5
1.1. NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM .................. 5
1.1.1. Cây Thổ nhân sâm ...................................................................................... 5
1.1.2. Nghiên cứu định danh cây Thổ nhân sâm ................................................... 7
1.1.3. Tái sinh in vitro ở cây Thổ nhân sâm ......................................................... 9
1.1.4. Nuôi cấy rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm .......................................................... 15
1.2. FLAVONOID VÀ CON ĐƢỜNG TỔNG HỢP FLAVONOID Ở THỰC VẬT ... 22
1.2.1. Flavonoid .................................................................................................. 22
1.2.2. Con đƣờng tổng hợp flavonoid ở thực vật ................................................ 28
1.3. ENZYME CHI VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHI ..................................... 33
1.3.1. Enzyme CHI .............................................................................................. 33
1.3.2. Gen CHI .................................................................................................... 37
1.3.3. Nghiên cứu biểu hiện gen CHI ................................................................. 39
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................42
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ............................................................................... 42
2.1.1. Vật liệu thực vật ........................................................................................ 42
2.1.2. Chủng vi khuẩn và các loại vector ............................................................ 43


iv

2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU ................................ 43
2.2.1. Hóa chất, thiết bị nghiên cứu .................................................................... 43
2.2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................. 45
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 45
2.3.1. Phƣơng pháp định danh mẫu cây Thổ nhân sâm ...................................... 46
2.3.2. Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro ........................................................... 47
2.3.3. Phƣơng pháp chuyển gen GmCHI ở cây Thổ nhân sâm ........................... 51

2.3.4. Phƣơng pháp phân tích cây chuyển gen ................................................... 53
2.3.5. Các phƣơng pháp phân tích, xử lý số liệu................................................. 57
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................58
3.1. KẾT QUẢ ĐỊNH DANH CÁC MẪU THỔ NHÂN SÂM ................................ 58
3.1.1. Đặc điểm hình thái các mẫu Thổ nhân sâm thu ở một số địa phƣơng ...... 58
3.1.2. Đặc điểm trình tự nucleotide của vùng ITS và đoạn gen matK ................ 60
3.1.3. Thảo luận kết quả định danh mẫu Thổ nhân sâm trong tự nhiên ............. 66
3.2. TẠO DÕNG THỔ NHÂN SÂM CHUYỂN GEN GmCHI ............................... 67
3.2.1. Nghiên cứu hệ thống tái sinh in vitro phục vụ chuyển gen ở cây Thổ nhân sâm.. 67
3.2.2. Kết quả chuyển gen GmCHI và tạo cây Thổ nhân sâm chuyển gen......... 76
3.2.3. Kết quả phân tích cây Thổ nhân sâm chuyển gen..................................... 80
3.2.4. Thảo luận kết quả tạo dòng Thổ nhân sâm chuyển gen GmCHI .............. 86
3.3. TẠO DÕNG RỄ TƠ TỪ CÂY THỔ NHÂN SÂM ........................................... 89
3.3.1. Kết quả tạo dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm ............................................ 89
3.3.2. Thảo luận kết quả tạo dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm ............................ 97
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................................99
1. Kết luận ................................................................................................................. 99
2. Đề nghị ................................................................................................................ 100
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................104
PHỤ LỤC ...............................................................................................................118


v

DANH MỤC KÍ HIỆU, CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu, viết tắt

Tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

AS

Acetosyringone

BAP

Benzylaminopurine

bp

base pairs

Cặp bazơ nitơ

CCM

Co-cultivation medium

Môi trƣờng đồng nuôi cấy

cDNA

Complementary

DNA bổ sung

CHI

Chalcone isomerase

C4H

Cinnamate 4-hydroxylase

CHS

Chalcone synthase

4CL

4-Coumarate CoA ligase
Cộng sự

cs
CTAB

Cetyltrimethyl

ammonium

bromide
2,4 D

2,4-Dichlorophenoxyacetic
acid

DFR

Dihydroxyflavonol 4reductase

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxynucleoside
triphosphate

FAP

Fatty-acid-binding proteins

F3H

Flavanone-3-hydroxylase

ELISA

Enzyme-linked

Xét nghiệm ELISA

immunosorbentassay
FLS

Flavonol synthase

FNS II

Flavone synthase II

GA3

Gibberellic acid

Axit gibberellic

GM

Germination medium

Môi trƣờng nảy mầm

GmCHI

Glycine max chalcone


vi

Kí hiệu, viết tắt

Tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

isomerase
IAA

Idole acetic acid

Axit idole acetic

IBA

Idolbutylic acid

Axit idolbutylic

IFS

Isoflavone synthase

ITS

Internal transcribed spacers

Kb

Kilo base

kDa

Kilo Dalton

LB

Luria Bertani

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ
bản nuôi cấy vi khuẩn

LDOX

Leucoanthocyanidin
oxygenase

L-Tyr

L-tyrosine

Axit amin L-tyrosine

mRNA

Messenger ribonucleic acid

RNA thông tin

MS

Murashige và Skoog, 1962

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ
bản nuôi cấy mô thực vật

NAA

Naphthaleneacetic acid

Axit naphthaleneacetic

OD

Optical density

Mật độ quang

Ori

Origin

Điểm khởi đầu sao chép

PAL

Phenylalanine ammonia- lyase

PCR

Polymerase chain reaction

Ri-plasmid

Root inducing- plasmid

RM

Rooting medium

Môi trƣờng tạo rễ

RNA

Ribonucleic acid

Axit ribonucleic

Rol

Root locus

Gen rol

rpm

Revolutions per minute

Số vòng/ phút

scFv

Single-chain variable

Phản ứng chuỗi trùng hợp

fragment
SDS

Sodium dodecyl sulfate

SEM

Shoot elongation medium

Môi trƣờng kéo dài chồi

SIM

Shoot induction medium

Môi trƣờng cảm ứng tạo chồi

Taq DNA

Thermus aquaticus DNA


vii

Kí hiệu, viết tắt

Tiếng Anh

polymerase

polymerase

T-DNA

Transfer DNA

Nghĩa tiếng Việt

Đoạn DNA đƣợc chuyển
vào thực vật

TDZ

Thidiazuron

Ti-plasmid

Tumor inducing - plasmid

Plasmid gây khối u

T0, T1

Các thế hệ cây chuyển gen

T0

Cây chuyển gen tái sinh từ
chồi trong ống nghiệm
Hạt của cây chuyển gen T0

T1

nảy mầm thành cây T1
TL-DNA

Transfer left -DNA

Vùng biên trái đoạn DNA
đƣợc chuyển vào thực vật

TR-DNA

Transfer right -DNA

Vùng biên phải đoạn DNA
đƣợc chuyển vào thực vật

UV

Ultraviolet

Tia cực tím

Vir

Virus interferon resistance

Gen vir

vvm

Volume volume minute

Thể tích khí/thể tích chất
lỏng/ phút

WPM

Woody plant medium

Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ
bản nuôi cấy cây thân gỗ

WT

Wild type

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indolylβ-D-galacto-pyranoside

ZT

Zeatin

Cây không chuyển gen


viii

DANH MỤC C C BẢNG

Bảng 2.1. Thống kê các trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu............................. 444
Bảng 3.1. Sự sai khác về trình tự nucleotide của vùng ITS phân lập từ 5 mẫu Thổ
nhân sâm so với T. paniculatum, mã số EU410357 ................................. 622
Bảng 3.2. Sự sai khác về trình tự nucleotide của đoạn gen matK phân lập từ 5
mẫu Thổ nhân sâm so với T. paniculatum, mã số AY015274 ................... 644
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của javel 60 % và HgCl2 0,1 % đến t lệ nảy mầm của hạt 688
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trƣởng chồi từ lá mầm .... 70
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của BAP đến sự phát sinh và sinh trƣởng chồi từ đoạn thân
mang mắt chồi bên ..................................................................................... 711
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của tổ hợp 2 mg/l BAP và IBA đến sự phát sinh, sinh
trƣởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ........................................... 733
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của IAA đến khả năng ra rễ của cây Thổ nhân sâm ............ 744
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của NAA đến khả năng ra rễ của cây Thổ nhân sâm .......... 755
Bảng 3.9. Hiệu quả tạo đa chồi từ lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên sau
khi lây nhiễm A. tumefaciens ..................................................................... 777
Bảng 3.10. Kết quả biến nạp cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm...... 799
Bảng 3.11. Hàm lƣợng flavonoid tổng số của hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen
T1- 2.2; T1- 10 và cây đối chứng không chuyển gen ................................ 866
Bảng 3.12. Kết quả khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm ......... 90
Bảng 3.13. Ảnh hƣởng của mật độ vi khuẩn A. rhizogenes, nồng độ AS, thời gian
nhiễm khuẩn, thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả chuyển gen tạo rễ tơ
từ mô lá Thổ nhân sâm.............................................................................. 922
Bảng 3.14. Xác định ngƣỡng diệt khuẩn của cefotaxime sau 4 tuần ...................... 933
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sự tăng trƣởng rễ tơ Thổ nhân sâm 955


ix

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Khung cơ bản của flavonoid ..................................................................... 26

Hình 1.2. Khung cơ bản của hợp chất chalcone........................................................ 27
Hình 1.3. Các dạng dị vòng C của major flavonoid, isoflavonoid, neoflavonoid ................ 27
Hình 1.4. Cấu trúc chung của nhóm major flavonoid ............................................. 278
Hình 1.5. Cấu trúc chung của nhóm aurone .............................................................. 28
Hình 1.6. Con đƣờng phenylpropanoid ..................................................................... 31
Hình 1.7. Cấu trúc và các vị trí amino acid hoạt động của enzyme CHI .................. 34
Hình 1.8. Sự gắn kết của 2S - naringenin với các vị trí hoạt động của CHI ........... 356
Hình 1.9. Mạng lƣới liên kết hydro của phức hợp CHI - naringenin...................... 367
Hình 1.10. Hình ảnh phân tử nƣớc nằm giữa (2S)-naringenin và Tyr 106 trong
phức hợp CHI-naringenin ...................................................................... 377
Hình 1.11. Vị trí các gen GmCHI trong bản đồ gen ............................................... 389
Hình 2.1. Mẫu cây Thổ nhân sâm thu tại thành phố Thái Nguyên ......................... 422
Hình 2.2. Sơ đồ cấu trúc vector chuyển gen pCB301-GmCHI ............................... 433
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm tổng quát ..................................................................... 455
Hình 2.4. Sơ đồ thí nghiệm chuyển gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm qua nách lá mầm533
Hình 3.1. Cây Thổ nhân sâm ................................................................................... 599
Hình 3.2. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân vùng ITS ........................ 60
Hình 3.3. Sơ đồ vùng ITS ở mẫu Thổ nhân sâm ....................................................... 61
Hình 3.4. Sơ đồ hình cây thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của vùng ITS .......... 62
Hình 3.5. Hình ảnh điện di sản kiểm tra phẩm PCR nhân đoạn gen matK ............. 633
Hình 3.6. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu nghiên cứu
đƣợc thiết lập dựa trên trình tự nucleotide của đoạn gen matK ............. 655
Hình 3.7. Hạt nảy mầm sau 10 ngày nuôi cấy ........................................................ 677
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của BAP, sự kết hợp BAP và IBA đến sự phát sinh, sinh
trƣởng chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên ........................................ 722


x

Hình 3.9. Hiệu quả tạo đa chồi từ lá mầm và đoạn thân mang mắt chồi bên sau khi

lây nhiễm A. tumefaciens ........................................................................ 777
Hình 3.10. Hình ảnh biếp nạp và tái sinh cây Thổ nhân sâm chuyển gen .............. 788
Hình 3.11. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân gen GmCHI từ các cây
Thổ nhân sâm đƣợc chuyển gen ở thế hệ T0 bằng cặp mồi CHI-NcoIF/CHI- NotI-R ........................................................................................... 81
Hình 3.12. Kết quả phân tích cây Thổ nhân sâm chuyển gen bằng lai Southern ở các
cây đƣợc chuyển gen dƣơng tính với PCR với đoạn dò GmCHI đƣợc đánh
dấu bằng biotin ........................................................................................ 822
Hình 3.13. Kết quả phân tích Western blot từ 4 dòng Thổ nhân sâm chuyển gen
thế hệ T1 và cây đối chứng không chuyển gen ..................................... 833
Hình 3.14. Kết quả phân tích ELISA xác định hàm lƣợng protein tái tổ hợp
GmCHI của hai dòng Thổ nhân sâm chuyển gen và cây đối chứng
không chuyển gen .................................................................................. 844
Hình 3.15. Hình ảnh các dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen ở thế hệ T 1 và cây
đối chứng không chuyển gen trồng trong vƣờn thực nghiệm ............... 855
Hình 3.16. Khảo sát vật liệu thích hợp để tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm sau 4 tuần
biến nạp .................................................................................................... 90
Hình 3.17. Hình ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gen rolC và đoạn
gen virD2 ............................................................................................... 955
Hình 3.18. Hình ảnh cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ Thổ nhân sâm.............................. 966


1

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum) là loại cây thân thảo đƣợc biết đến với
giá trị dƣợc liệu cao. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Thổ nhân sâm
cho thấy, trong lá và rễ có rất nhiều các hợp chất có hoạt tính dƣợc học khác nhau
nhƣ: alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, phytosterol, phytol; trong đó các phytol
chiếm t lệ cao (69,32 %). Từ lâu, Thổ nhân sâm đã đƣợc sử dụng trong y học cổ

truyền, đặc biệt là trong điều trị bệnh tiểu đƣờng type 2, viêm da, rối loạn tiêu hóa,
yếu sinh lý và rối loạn sinh sản. Galactogue trong lá có tác dụng chống viêm, kích
thích tăng tiết sữa ở phụ nữ cho con bú và có khả năng chữa bệnh viêm loét. Rễ của
cây Thổ nhân sâm đƣợc sử dụng để thúc đẩy khả năng sinh sản và chữa các bệnh
phụ khoa nhƣ bất thƣờng trong chu kỳ kinh nguyệt... Steroid saponin trong rễ cây
Thổ nhân sâm có tác dụng phòng và chữa bệnh xơ vỡ động mạch, đồng thời còn là
nguyên liệu để tổng hợp nên hormone sinh dục.
Flavonoid là một hợp chất có vai trò quan trọng đối với con ngƣời nhƣ có tác
dụng chống oxy hóa, bảo vệ gan, kháng khuẩn, chống viêm, chống ung thƣ… Tuy
nhiên, chƣa thấy nghiên cứu về thu nhận flavonoid ở cây Thổ nhân sâm vì hàm
lƣợng flavonoid ở các loài thuộc chi Talinum, trong đó có cây Thổ nhân sâm rất
thấp. Vấn đề đặt ra là làm thế nào để nâng cao hàm lƣợng flavonoid ở các loài thuộc
chi Talinum nói chung và cây Thổ nhân sâm (T. paniculatum) nói riêng để có thể sử
dụng trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng.
Cho đến nay, đã có một số cách tiếp cận chủ yếu đƣợc áp dụng đối với cây
dƣợc liệu để làm tăng hàm lƣợng flavonoid. Đó là sử dụng phƣơng pháp chọn lọc từ
quần thể hoặc lai hữu tính hay đột biến thực nghiệm, từ đó chọn lọc các dòng cây có
hàm lƣợng flavonoid cao. Tuy nhiên, đối với cây Thổ nhân sâm chƣa thấy công bố
nào về ứng dụng phƣơng pháp này để nâng cao hàm lƣợng flavonoid; nhƣng việc
ứng dụng công nghệ sinh học thực vật nhƣ chuyển gen và nuôi cấy mô tế bào thực
vật ở cây dƣợc liệu đã đƣợc quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong thu nhận các
dƣợc chất, trong đó có flavonoid.


2

Ở thực vật, flavonoid đƣợc tổng hợp qua đƣờng phenylpropanoid, chuyển
phenylalanine thành 4-coumaroyl-CoA và sau đó 4-coumaroyl-CoA sẽ đi vào quá
trình tổng hợp flavonoid. Có rất nhiều các enzyme tham gia vào con đƣờng tổng
hợp flavonoid nhƣ phenylalanine ammonia-lyase, cinnamate 4-hydroxylase, 4Coumarate CoA ligase, chalcone synthase, chalcone isomerase… Trong đó,

chalcone isomerase (CHI) là enzyme chìa khóa cho sinh tổng hợp flavonoid bằng
việc xúc tác cho phân tử naringenin chalcone mạch hở đƣợc đóng vòng để hình
thành các naringenin. Sau đó, hợp chất này sẽ đƣợc chuyển hóa thành nhiều loại
flavonoid chính nhƣ flavanone, flavonol và anthocyanin. Do vậy, biểu hiện mạnh
gen mã hóa enzyme CHI sẽ làm tăng hoạt độ của enzyme chìa khóa CHI và hàm
lƣợng các loại flavonoid trong cây chuyển gen sẽ đƣợc cải thiện.
Ngoài ra, Thổ nhân sâm là loài cây có rễ củ, nhiều hợp chất thứ cấp đƣợc tập
trung ở rễ, trong đó có flavonoid. Do vậy, để tăng thu nhận flavonoid ở cây Thổ
nhân sâm, cách tiếp cận ứng dụng k thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật bằng
phƣơng pháp cảm ứng tạo rễ tơ nhằm tăng sinh khối cũng đƣợc quan tâm nghiên
cứu. Khi mô thực vật (lá, đoạn thân, lá mầm...) bị lây nhiễm Agrobacterium
rhizogenes thì T-DNA trong cấu trúc Ri-plasmid mang các gen rol và các gen mã
hóa sinh tổng hợp auxin loại IAA sẽ đƣợc chuyển vào mô thực vật. Sự biểu hiện
đồng thời của các gen rol và các gen tổng hợp auxin sẽ tạo nên kiểu hình rễ tơ ở mô
tế bào thực vật đƣợc lây nhiễm A. rhizogenes.
Xuất phát từ những cơ sở trên chúng tôi đã chọn và tiến hành đề tài: “Nghiên
cứu biểu hiện gen GmCHI liên quan đến tổng hợp flavonoid và cảm ứng tạo rễ tơ
ở cây Thổ nhân sâm (Talinum paniculatum)”.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tạo đƣợc dòng cây chuyển gen GmCHI có hàm lƣợng flavonoid cao hơn cây
đối chứng không chuyển gen và xác định đƣợc điều kiện thích hợp trong cảm ứng
tạo rễ tơ in vitro ở cây Thổ nhân sâm.


3

3. Nội dung nghiên cứu
(i) Nghiên cứu định danh các mẫu Thổ nhân sâm thu tại một số địa phƣơng bằng
phƣơng pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA.
Đặc điểm hình thái của các mẫu Thổ nhân sâm thu từ các địa phƣơng đƣợc

quan sát trực tiếp và mô tả đặc điểm rễ, thân, lá, hoa, quả, hạt. Sử dụng mã vạch
DNA (trình tự vùng ITS; đoạn gen matK, rpoB, rpoC1) để định danh các mẫu Thổ
nhân sâm thu thập đƣợc.
(ii) Nghiên cứu chuyển gen GmCHI và tạo dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen.
Nghiên cứu điều kiện thích hợp trong khử trùng hạt ở cây Thổ nhân sâm.
Khảo sát ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng đến sự tái sinh đa chồi, ra rễ
in vitro ở cây Thổ nhân sâm;
Nghiên cứu chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm thông
qua nách lá mầm và tạo các dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen. Phân tích sự hợp
nhất và sự biểu hiện của gen chuyển GmCHI ở cây Thổ nhân sâm chuyển gen;
Phân tích, so sánh hàm lƣợng flavonoid tổng số trong các dòng cây Thổ nhân
sâm chuyển gen và cây không chuyển gen.
(iii) Nghiên cứu cảm ứng tạo rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm nhờ A. rhizogenes.
Khảo sát vật liệu thích hợp tạo rễ tơ ở cây Thổ nhân sâm. Khảo sát ảnh hƣởng
của mật độ A. rhizogenes, nồng độ AS, thời gian lây nhiễm khuẩn, thời gian đồng
nuôi cấy đến hiệu quả tạo rễ tơ từ mô lá Thổ nhân sâm. Nghiên cứu xác định
ngƣỡng diệt khuẩn của cefotaxime đối với A. rhizogenes;
Phân tích dòng rễ tơ mang gen rolC bằng kĩ thuật PCR. Nghiên cứu ảnh
hƣởng của trạng thái môi trƣờng đến sự tăng trƣởng rễ tơ Thổ nhân sâm.
4. Những đóng góp mới của luận án
Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống, từ định danh các mẫu Thổ nhân
sâm thu thập ở một số địa phƣơng tạo nguồn vật liệu ban đầu để nuôi cấy in vitro
đến chuyển cấu trúc mang gen GmCHI vào cây Thổ nhân sâm và phân tích sự biểu
hiện của gen GmCHI có nguồn gốc từ đậu tƣơng ở cây Thổ nhân sâm chuyển gen.


4

Cụ thể là:
1) Năm mẫu Thổ nhân sâm thu tại các địa phƣơng ở Việt Nam thuộc một loài T.

paniculatum, chi Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae) đƣợc định danh bằng sự kết
hợp giữa phƣơng pháp hình thái so sánh và mã vạch DNA.
2) Lần đầu tiên biểu hiện thành công gen GmCHI có nguồn gốc từ cây đậu tƣơng ở
cây Thổ nhân sâm và tạo đƣợc 2 dòng Thổ nhân sâm chuyển gen có hàm lƣợng
flavonoid cao hơn các cây đối chứng không chuyển gen.
3) Tạo đƣợc 5 dòng rễ tơ từ cây Thổ nhân sâm làm vật liệu phục vụ chọn dòng rễ tơ
có hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học cao.
5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài luận án
Kết quả đạt đƣợc của luận án có giá trị khoa học và thực tiễn trong cách
tiếp cận cải thiện hàm lƣợng flavonoid bằng k thuật chuyển gen mã hóa enzyme
chìa khóa của quá trình tổng hợp flavonoid và tạo dòng rễ tơ in vitro ở cây Thổ
nhân sâm.
Về mặt khoa học
Kết quả nghiên cứu của luận án sẽ là cơ sở ứng dụng k thuật tạo dòng rễ tơ
và chuyển gen vào việc nâng cao hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học ở
cây Thổ nhân sâm và một số loại cây dƣợc liệu khác. Kết quả nghiên cứu tạo cơ sở
khoa học cho giải pháp nâng cao hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học
trong thực vật.
Các bài báo đăng tải trên các tạp chí khoa học, công nghệ quốc tế và quốc gia
cùng với các trình tự gen công bố trên Ngân hàng Gen là những tƣ liệu có giá trị
tham khảo trong nghiên cứu và giảng dạy.
Về mặt thực tiễn
Các dòng rễ tơ và dòng cây Thổ nhân sâm chuyển gen làm vật liệu cho chọn
giống Thổ nhân sâm có hàm lƣợng flavonoid cao. Kết quả của nghiên cứu đã mở ra
triển vọng ứng dụng k thuật tạo dòng rễ tơ và k thuật biểu hiện gen vào việc nâng
cao hàm lƣợng các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây dƣợc liệu.


5

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY IN VITRO Ở CÂY THỔ NHÂN SÂM
1.1.1. Cây Thổ nhân sâm
1.1.1.1. Phân loại và đặc điểm sinh học của cây Thổ nhân sâm
Theo Đỗ Tất Lợi (2004), cây Thổ nhân sâm (T. paniculatum) thuộc chi
Talinum, họ Rau sam (Portulacaceae), bộ Cẩm chƣớng (Caryophyllales), phân lớp
Cẩm chƣớng (Caryophyllidae), lớp hai lá mầm (Magnoliopsida) [3 . Thổ nhân
sâm là loại cây cỏ mọc hằng năm, thân màu xanh, mọc thẳng, có thể cao tới 0,6 m,
phía dƣới chia cành. Lá mọc so le, hình trứng ngƣợc, hoặc hình thìa, phiến lá dày,
hơi thẫm, hai mặt đều bóng, đầu lá nhọn hoặc tù, phía cuống hẹp lại, cuống rất
ngắn, lá dài 5-7 cm, rộng 2,5-3,5 cm. Vào mùa hạ ở đầu cành xuất hiện cụm hoa
hình chùm nhiều hoa nhỏ, đƣờng kính 6 mm, 5 cánh hoa màu tím nhạt, hơn 10 nhị
dài 2 mm. Bầu hoa hình cầu. Quả nhỏ, khi chín có màu xám tro, đƣờng kính ƣớc
3mm. Hạt rất nhỏ, màu đen nhánh hơi dẹt, trên mặt hơi có vân nổi. Mùa ra hoa
vào tháng 6-7-8, mùa quả vào tháng 9-10-11. Rễ củ hình trụ mang nhiều rễ con, bề
ngoài màu nâu đen. Lúc mới đƣợc thu hoạch, bên trong củ màu trắng, phơi khô sẽ
chuyển thành màu đen, hình dáng củ gần giống với củ Nhân sâm. Cây Thổ nhân
sâm mọc hoang và đƣợc trồng nhiều nơi trong nƣớc ta vì nhiều ngƣời nhầm là cây
Nhân sâm. Tuy nhiên, giữa cây Thổ nhân sâm và cây Nhân sâm khác nhau về hình
thái cũng nhƣ về họ thực vật. Ở một số tỉnh của Trung Quốc nhƣ Triết Giang,
Giang Tô, An Huy..., cây Thổ nhân sâm cũng mọc hoang và đƣợc trồng làm cảnh,
ngƣời ta gọi cây này với những tên Cao ly sâm, Thổ cao ly sâm… và cũng dùng
nó làm thuốc bổ thay sâm [3]. Cây mọc rất khỏe, có thể trồng bằng hạt hoặc bằng
một mẩu thân rễ. Cây phát triển nhanh, sau một năm có thể thu hoạch, để lâu năm
thân rễ sẽ to hơn. Thông thƣờng, dân địa phƣơng trồng để lấy lá nấu canh [1], [3].


6

1.1.1.2. Thành phần hóa học cây Thổ nhân sâm

Cây Thổ nhân sâm chứa rất nhiều các thành phần hợp chất có hoạt tính sinh học
đƣợc quan tâm sử dụng. Trong lá có galactogue, tannin [127] và 12 thành phần hợp
chất: (1) hiodrocarbon hentriacontane; (2) dotriacontane; (3) tritriacontane; (4)
pentatriacontane; (5) heneicosanoic acid; (6) ester nonacosyl nonacosanoate; (7) urea;
(8) 3-O-β-Dglucosyl-β-sitosterol; (9) β-sitosterol; (10) stigmasterol; (11) pentaciclyc
triterpene 3-O-acethyl-aleuritolic acid; (12) kali nitrat [33]. Ngoài ra, theo Catthareeya
và cs (2013) trong lá cây có 4 loại phytosterol đó là: β-sitosterol (10,6 %), stigmastanol
(2,76 %), stigmasterol (0,85 %) và campesterol (0,8 %) và các hợp chất khác nhƣ
phytol (69,32 %), α-tocopherol (0,99 %), acid béo (0,43-3,41 %) [15].
Theo Yosephine và cs (2012), rễ của cây Thổ nhân sâm giàu các hợp chất saponin
steroid và có thể đƣợc sử dụng với nhiều mục đích khác nhau trong y học [123]. Các
chiết xuất từ rễ của Thổ nhân sâm có thể cải thiện khả năng sinh sản của chuột có
lƣợng testosterone thấp tốt hơn nhiều so với chiết xuất từ rễ Nhân sâm Hàn Quốc.
Các phân tích về thành phần hóa học chính trong rễ của cây Thổ nhân sâm tƣơng tự
với Nhân sâm Trung Quốc và Hàn Quốc, do đó Thổ nhân sâm đã đƣợc sử dụng thay
thế cho Nhân sâm [127]. Phân tích GC/MS của dịch chiết xuất từ rễ cho thấy sự
xuất hiện của 5 phytosterol đó là β-sitosterol (17,37 %), stigmasterol (4,23 %),
stigmastan-3-ol (4,10 %), stigmast-22-en-3-ol (1,84 %) và campesterol (1,56 %); có
12 hợp chất là acid béo (0,50 % -11,32 %) và 2 hợp chất không rõ tên đã xác định
đƣợc hàm lƣợng. Ngoài ra, trong lá và rễ còn có các hợp chất nhƣ: alkaloid
(berberine, coptisine, piperine, palmatine, tetrahydropalmatine), flavonoid (chrysin,
quercetin, rutin, kaempferol, cyadinin, genistein, diadzien), saponin (ginsenoside,
vinaginsenoside-R5

và

vinaginsenoside-R6),

tannin

(totarol,

ellagitannin,

gallotamine, gallic acid, hexahydroxydiphenic acid [15 . Hiện nay, chƣa có công
trình nghiên cứu công bố hàm lƣợng flavonoid trong cây Thổ nhân sâm. Tuy nhiên,
ở loài Talinum triangulare (cùng chi Talinum với cây Thổ nhân sâm) đã đƣợc xác
định có hàm lƣợng flavonoid rất thấp (khoảng 0,897 mg/g lá tƣơi) [8].


7

1.1.2. Nghiên cứu định danh cây Thổ nhân sâm
Thổ nhân sâm là loại cây thảo dƣợc mọc tự nhiên khắp nơi trên thế giới, nhƣ
Thái Lan, Nigeria, Mexico, Trung Quốc... [15], [32], [82]. Ở Việt Nam, Thổ nhân
sâm vừa mọc tự nhiên, vừa là cây trồng để làm thuốc. Cây gặp nhiều ở các tỉnh nhƣ
Hà Giang, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Hòa Bình, Bắc Giang, Lạng
Sơn, Cao Bằng…[3]. Trƣớc đây, để xác định đƣợc loại thảo dƣợc đang sử dụng là
cây Thổ nhân sâm thì chủ yếu dựa vào phƣơng pháp hình thái so sánh. Phƣơng pháp
phân loại này dựa vào sự khác biệt về hình thái của các cơ quan trong cơ thể thực
vật, đặc biệt là cơ quan sinh sản [82], dựa vào đặc điểm của phấn hoa [83] hay dựa
vào cấu trúc của hoa [114]... để nhận diện các loài trong chi Talinum. Tuy nhiên,
phƣơng pháp này gặp rất nhiều khó khăn khi cần xác định những mẫu Thổ nhân
sâm đang trong giai đoạn phát triển (chƣa ra hoa), hoặc khó nhận biết đƣợc mẫu vật
do có nhiều điểm tƣơng đồng với loài cùng chi (T. triangulare) [111], hoặc mẫu vật
đã đƣợc chế biến một phần hay ở dạng bột [53]. Từ giữa những năm 1990, với sự
phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, phân loại học phân tử là phƣơng pháp mới
đang đƣợc ứng dụng rộng rãi và hiệu quả trong lĩnh vực phân loại học. Phƣơng
pháp này dùng để định danh loài dựa trên các dữ liệu thông tin về hệ gen nhân hoặc
ngoài nhân hay các sản phẩm của chúng, cho mức độ chính xác cao và đặc biệt hữu

dụng với các loài gần gũi mà những quan sát hình thái, sinh trƣởng và phát triển
chƣa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài [60].
Việc lựa chọn các gen hoặc các đoạn DNA để định danh loài phụ thuộc vào
mục đích hoặc đối tƣợng nghiên cứu và là những vùng DNA bảo thủ, ít bị đột biến
[42]. Căn cứ vào mức độ đột biến có thể xác định đƣợc mối quan hệ gần hay xa
giữa các đối tƣợng nghiên cứu. Một chỉ thị DNA lý tƣởng dùng để định danh loài
cần có những yêu cầu sau: (i) Đoạn DNA chỉ thị phải đủ độ biến thiên để phân biệt
giữa các loài nhƣng cũng phải không khác nhau quá mức giữa các cá thể trong cùng
loài; (ii) Hệ thống định danh bằng DNA phải đƣợc chuẩn hóa, với cùng một vùng
DNA có thể đƣợc sử dụng cho các nhóm phân loại khác nhau; (iii) Đoạn DNA chỉ
thị cần chứa đủ thông tin phát sinh loài để có thể dễ dàng định danh loài vào các


8

nhóm phân loại (chi, họ,…); (iv) Có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị
trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và
đọc trình tự DNA, điều này đặc biệt quan trọng khi DNA tách chiết từ mẫu phân
tích là một hỗn hợp DNA của nhiều loài cần nhận dạng trong cùng một thời điểm;
(v) Đoạn DNA chỉ thị cần có chiều dài vừa phải (400-800 bp) để có thể đƣợc
khuếch đại từ DNA khuôn là các DNA bị đứt gãy [54 . Theo đó, một số mã vạch
DNA đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng trong việc nhận dạng cây dƣợc liệu nhƣ ITS,
matK, rpoC1, rpoB... ITS là trình tự không mã hóa nằm ở hai bên của trình tự mã
hóa ribosome 5,8S bao gồm có ITS1, ITS2 [119 . Để đánh giá đƣợc đa dạng di
truyền trong các giống lúa mạch và giữa các giống lúa mạch với loài lúa mạch
hoang dại Sharma và cs (2002) đã sử dụng trình tự vùng ITS [102]. Rowena và cs
(2012) đã phân biệt đƣợc các loài trong cùng một chi và 96 % các giống trong cùng
loài từ 78 loài khác nhau nhờ việc sử dụng mã vạch ITS [96]. Trong số các gen lục
lạp, matK là một trong những gen tiến hoá nhanh nhất, có kích thƣớc khoảng 1550
bp và mã hóa cho maturase liên quan đến quá trình loại bỏ các intron sau phiên mã.

Do matK tiến hoá nhanh và có mặt hầu hết trong thực vật nên đã đƣợc sử dụng nhƣ
một chỉ thị trong nghiên cứu mối quan hệ giữa các loài và phát sinh loài ở thực vật.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng gen matK để định danh một số loài
nhƣ Cỏ biển [40], Bạch tật lê (Tribulus terrestris), Aerva javanica, Haplophyllum
robustum, Tribulus pentandrus, Tamarix aucherana... [30]. Gen rpoB, rpoC1 mã
hóa hai trong 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp. Khi nghiên cứu họ
Dipterocarpaceae, Tsumura và cs (1996) đã nhận thấy gen rpoB là thích hợp để
nghiên cứu phát sinh loài. Hiện nay, gen rpoB đƣợc sử dụng nhiều trong nghiên cứu
phát sinh loài và xác định các loài vi khuẩn, đặc biệt nghiên cứu các chủng có quan
hệ gần gũi. Cùng với gen 16S rRNA, rpoB đƣợc sử dụng trong nhiều nghiên cứu để
xác định loài vi khuẩn mới, do vậy gen này đƣợc đề xuất là chỉ thị barcode độc lập
hoặc kết hợp với một số gen khác [116]. Madesis và cs (2012) khi nghiên cứu phân
loại 25 giống cây họ Đậu ở Địa Trung Hải bằng việc sử dụng gen rpoC1 và một số


9

gen khác đã có nhận xét rằng, khi sử dụng kết quả phân tích gen rpoC1 có khả năng
xác định đƣợc 72 % trong tổng số giống cây họ Đậu nghiên cứu [69].
Trên thế giới, đã có một số công trình nghiên cứu sử dụng mã vạch DNA để
định danh mẫu Thổ nhân sâm. Chen và cs (2010) đã so sánh hiệu quả sử dụng 7 mã
vạch DNA (psbA-trnH, matK, rbcL, rpoC1, ycf5, ITS2 và ITS) để nhận diện một số
loài cây dƣợc liệu, trong đó có cây Thổ nhân sâm. Kết quả cho thấy, vùng ITS2 có
thể sử dụng nhƣ một mã vạch DNA chuẩn với t lệ thành công là 92,7 % [18]. Liu
và cs (2018) đã công bố kết quả giải trình tự toàn bộ hệ gen lục lạp của cây Thổ
nhân sâm với kích thƣớc là 156929 bp, trong đó có gen matK, rpoC1 và rpoB. Kết
quả này làm cơ sở thiết lập mã vạch DNA để định danh mẫu Thổ nhân sâm [67 . Ở
Việt Nam, hiện chƣa có công trình nghiên cứu về ứng dụng mã vạch DNA để định
danh các mẫu Thổ nhân sâm trong tự nhiên. Chính vì vậy, chúng tôi kết hợp cả
phƣơng pháp hình thái so sánh và phƣơng pháp phân loại học phân tử để nhận diện

mẫu Thổ nhân sâm thu thập tại một số địa phƣơng.
1.1.3. Tái sinh in vitro ở cây Thổ nhân sâm
Tái sinh in vitro ở cây dược liệu
Nhân giống in vitro là k thuật tạo ra các cây hoàn chỉnh thông qua nuôi cấy
mô tế bào trong môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo và vô trùng. Cơ sở của kĩ thuật
nuôi cấy in vitro là tính toàn năng của tế bào. Theo đó, mỗi tế bào riêng rẽ khi gặp
điều kiện thuận lợi đều có thể phát triển thành một cá thể. Nhân giống in vitro có
một số ƣu điểm nổi trội, đó là cho phép sản xuất một số lƣợng lớn các cây giống hệt
nhau từ những mẫu vật có kích thƣớc nhỏ trong một khoảng thời gian tƣơng đối
ngắn; có thể kiểm soát hoặc thay đổi điều kiện môi trƣờng nuôi cấy cho phù hợp
từng loại thực vật; nguồn mẫu vật nuôi cấy có quanh năm; có thể thu nhận đƣợc các
chất chuyển hóa thứ cấp… [98]. Mô chọn để nuôi cấy thƣờng là mô có khả năng tái
sinh cao trong môi trƣờng nuôi cấy sạch bệnh, giữ đƣợc các đặc tính sinh học quý
của cây mẹ, ít nguy cơ biến dị. Các loại mẫu vật khác nhau đều có thể sử dụng cho
việc nuôi cấy in vitro, nhƣng phổ biến và cho hiệu quả cao đó là nuôi cấy đỉnh sinh
trƣởng. Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng bao gồm các kiểu nuôi cấy mô phân sinh đỉnh,


10

nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng và nuôi cấy đỉnh chồi. Yêu cầu quan trọng nhất trong
nhân giống in vitro là khả năng phân chia mạnh của mô phân sinh, do đó nuôi cấy
đỉnh sinh trƣởng là kĩ thuật đƣợc ứng dụng nhiều nhất trong nông nghiệp [90].
Trong các kiểu nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng thì đoạn thân mang mắt chồi bên là loại
mẫu vật đƣợc thăm dò nhiều nhất, cho hiệu quả đa chồi cao ở phần lớn các loài thực
vật, trong đó có cây dƣợc liệu.
Hiệu quả đa chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên phụ thuộc vào nhiều yếu tố
nhƣ môi trƣờng cơ bản, nồng độ các chất kích thích tăng trƣởng, nồng độ khoáng,
kích thƣớc của đoạn thân… Phần lớn các nghiên cứu cho thấy môi trƣờng MS cơ
bản có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau cho hiệu quả tái sinh đa chồi cao

phù hợp với từng loài cây dƣợc liệu. Có những loài cây dƣợc liệu chỉ cần bổ sung
BAP với nồng độ thấp đã cho hiệu quả đa chồi cao. Nghiên cứu của Mukundan và
cs (2002) cho thấy môi trƣờng MS cơ bản chỉ bổ sung BAP gây cảm ứng tạo đa
chồi từ mẫu cấy là đoạn thân mang mắt chồi bên ở cây thuốc Hen (Tylophora
asthmatica) và ở cây Đuôi chồn màu (Uraria picta). Số lƣợng chồi đƣợc hình thành
lớn nhất trên môi trƣờng MS có chứa 1,5 và 1,0 mg/l BAP tƣơng ứng với cây thuốc
Hen và cây Đuôi chồn màu [79]. Cây Tràm trà (Melaleuca alternifolia Cheel.) đƣợc
trồng để sản xuất tinh dầu trong các ngành công nghiệp m phẩm và dƣợc phẩm.
Khi nghiên cứu nhân giống in vitro ở loài cây này, Oliveria và cs (2010) đã sử dụng
đoạn thân mang mắt chồi bên cấy trên môi trƣờng MS cơ bản và môi trƣờng WPM
cả rắn và lỏng có bổ sung 0,55 µM; 1,11 µM; 2,22 µM; 3,33 µM và 4,44 µM BAP.
Kết quả tạo đa chồi tốt nhất đó là môi trƣờng MS lỏng có bổ sung 1,11 μM BAP
cho 11,8 chồi/mẫu [86]. Nghiên cứu tái sinh đa chồi ở cây Cà dại quả đỏ (Solanum
surattense Bum.) từ đỉnh sinh trƣởng chồi ngọn, đoạn thân mang mắt chồi bên,
Rahman và cs (2011) đã cung cấp thông tin về môi trƣờng tái sinh đa chồi hiệu quả
nhất là môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung thêm 0,5 mg/l BAP cho số chồi ở mỗi
mẫu cấy là 58,2 chồi/mẫu, số chồi ra rễ đạt t lệ 100 % ở môi trƣờng ½ MS bổ sung
0,05 mg/l NAA. Khi chuyển cây trong ống nghiệm ra ngoài vƣờn ƣơm, t lệ sống
sót là 90 % [92]…


11

Tuy nhiên, ở một số loài cây dƣợc liệu phải bổ sung BAP với nồng độ cao thì
cho hiệu quả đa chồi cao. Lee và cs (2004) nghiên cứu nhân giống in vitro ở cây
Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) bằng cách sử dụng đoạn thân mang mắt
chồi bên. Số lƣợng chồi tái sinh cao nhất (6,1 chồi/mẫu trong khoảng thời gian 4
tuần) thu đƣợc từ các mẫu cấy trên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 6,7 μM BAP.
Tách riêng các chồi và nuôi cấy trong bình lớn hơn thúc đẩy đáng kể sự phát triển
và hình thành của cây con. Tất cả các cây con in vitro đều sống sót khi chuyển

sang vƣờn ƣơm và không có sự khác biệt đáng kể về hình thái với các cây trong
tự nhiên [61]. Benniamin và cs (2004) nghiên cứu nhân nhanh cây Ngƣ mộc
(Crataeva magna Lour.) trong ống nghiệm từ đoạn thân mang mắt chồi bên cho
thấy, môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 8,8 μM BAP đã gây cảm ứng đa chồi với 4,4
chồi/ mẫu, chiều dài chồi lớn nhất là 63,2 mm. Các chồi đƣợc tách ra và cấy chuyển
sang môi trƣờng ra rễ là ½ MS có bổ sung 9,84 μM IBA và 0,54 μM NAA [13]. Ở
cây Điền thanh hoa vàng (Sesbania drummondii) các chồi phát sinh nhiều trên môi
trƣờng MS cơ bản bổ sung BAP với nồng độ cao 22,2 μM. Khi cấy đoạn thân mang
mắt chồi bên trong môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 8,8 μM và 11,1 μM BAP cho số
chồi ít [17]…
Trong một số nghiên cứu, hiệu quả tái sinh đa chồi đạt đƣợc khi kết hợp BAP
với một số các chất kích thích sinh trƣởng khác. Govindaraju và cs (2003) đã
nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở Sâm Ấn Độ (Withania
somnifera) từ đoạn thân mang mắt chồi bên, lá, rễ, cuống lá. Các nguồn vật liệu
đƣợc cấy trên MS cơ bản và B5 có bổ sung 0,5-2,5 mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l
IAA hoặc 0,5-3,0 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5-3,0 mg/l NAA hoặc cùng với 0,5-1,0
mg/l kinetin. Tất cả mô sẹo của các mẫu cấy đều có khả năng tái sinh đa chồi trên
môi trƣờng MS có bổ sung 0,5-2,5 mg/l BAP hoặc kết hợp với 0,5 mg/l IAA trừ
mẫu cấy là rễ. Khả năng tạo đa chồi khác nhau từ lá, đoạn thân mang mắt chồi bên
và chồi đỉnh xuất hiện trong vòng hai tuần trên môi trƣờng MS có bổ sung 0,5-3,0
mg/l BAP kết hợp với 0,5 mg/l IAA. Sự khác nhau về số lƣợng và chiều cao của
chồi ở mỗi mẫu cấy là do sự khác nhau nồng độ của BAP kết hợp với IAA ở nồng


12

độ thấp [39]. Cây Húng quế (Ocimum basilicum L.) đã đƣợc nghiên cứu sản xuất
hạt giống nhân tạo bằng cách bọc các đoạn thân mang mắt chồi bên của cây húng
quế trong gel alginate 3 % và 75 mM CaCl2.2H2O. Các hạt giống tổng hợp khi
nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS có bổ sung với 5,0 µM BAP và 0,5 µM IAA cho

hiệu quả sản xuất đa chồi (7,9 chồi/mẫu) vƣợt trội hơn khi cấy từ chồi đỉnh
[107]. Autade và cs (2014) đã nghiên cứu nhân giống in vitro loài Cỏ ngọt (Stevia
rebaudiana Bert.) từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Mẫu đƣợc cấy trên môi trƣờng
MS cơ bản có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau kết hợp với kinetin. Sau 5
tuần cấy mẫu, hiệu quả đa chồi tốt nhất (5,16 chồi/mẫu) là môi trƣờng MS cơ bản
có bổ sung 1,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l kinetin. Chiều dài chồi tốt nhất (7,0 cm) đƣợc
quan sát thấy trên môi trƣờng MS cơ bản có chứa 0,5 mg/l BAP + 0,5 mg/l kinetin.
Các chồi đơn đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng ra rễ là ½ MS cơ bản bổ sung IBA.
Phản ứng tạo rễ hiệu quả nhất với chiều dài 1,68 cm và số rễ (3,6 rễ/mẫu) đƣợc
quan sát thấy ở môi trƣờng ½ MS cơ bản có bổ sung 1,0 mg/l IBA. Các cây con
đƣợc chuyển sang vƣờn ƣơm với t lệ sống là 90 % [11]…
Tuy nhiên, BAP không mang lại hiệu quả đa chồi với một số loài cây dƣợc
liệu. Catapan và cs (2002) đã nghiên cứu tái sinh đa chồi ở cây Chó đẻ răng cƣa
(Phyllanthus urinaria) từ đoạn thân mang mắt chồi bên. Kết quả nghiên cứu cho
thấy môi trƣờng MS có bổ sung 5,0 μM kinetin cho hiệu quả đa chồi tối ƣu với 1620 chồi/mẫu cấy [14]. Jahan và cs (2009) đã xây dựng hệ thống tái sinh đa chồi ở
cây Tam phỏng (xoan leo-Cardiospermum halicacabum L.) từ đoạn thân mang mắt
chồi bên trên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung BAP, kinetin, TDZ và 2isopentenyladenine. Kết quả cho thấy, chồi xuất hiện nhiều nhất (14,83 chồi/mẫu)
trên môi trƣờng MS cơ bản có bổ sung 0,3 μM TDZ. Môi trƣờng ra rễ tối ƣu của
các chồi là môi trƣờng 1/3 MS cơ bản có bổ sung 0,5 μM IAA [44].
Ngoài ra, hiệu quả tái sinh đa chồi từ đoạn thân mang mắt chồi bên còn phụ
thuộc vào loại môi trƣờng nhƣ ở cây Bạch tật lê (Tribulus terrestris Linn.) môi
trƣờng WPM có bổ sung 4 mg/l BAP cho hiệu quả đa chồi tốt nhất (7 chồi/mẫu) sau
4 tuần [91]; phụ thuộc vào kích thƣớc của đoạn thân nhƣ ở cây Điều nhuộm (Bixa


13

oreliana L.) với kích thƣớc đoạn thân là 0,5 cm cho số lƣợng đa chồi lớn nhất trên
môi trƣờng B5 có bổ sung 4,9 µM 2-isopentenyl adenine [70 …
Nhƣ vậy, việc sử dụng mẫu là đoạn thân mang mắt chồi bên mang lại hiệu quả

đa chồi cao ở rất nhiều các loài cây dƣợc liệu, tuy nhiên trong một số trƣờng hợp,
hiệu quả đa chồi cao lại đạt đƣợc từ lá mầm và mẫu lá. Ở cây Chiêu liêu
(Terminalia chebula) hiệu quả đa chồi đạt đƣợc khi sử dụng lá mầm cấy trên môi
trƣờng MS có bổ sung GA3. Số chồi lớn nhất đạt đƣợc là 6,4 chồi/mẫu cấy ở môi
trƣờng ½ MS có bổ sung 0,3 mg/l GA3+1 mg/l IBA +10 mg/l BAP sau 4 tuần nuôi
cấy. Sau 8-9 tuần số chồi đạt đƣợc là 19,2 chồi/mẫu. Các chồi ra rễ tốt nhất (5,5
rễ/chồi) ở môi trƣờng ½ MS +1,0 mg/l IBA + 1 % mannitol + 1,5 % sucrose [105].
Anis và cs (2005) đã xây dựng hệ thống tái sinh đa chồi in vitro ở cây Giáng hƣơng
(Pterocarpus marsupium Roxb.) khi sử dụng lá mầm cấy trên môi trƣờng MS bổ
sung BAP và IAA, hiệu quả đa chồi đạt đƣợc 4,16 chồi/mẫu ở môi trƣờng MS bổ
sung 5 µM BAP + 0,25 µM IAA sau 5-6 tuần nuôi cấy [10]. Nghiên cứu ảnh hƣởng
của TDZ lên sự tái sinh đa chồi từ lá mầm 15 ngày tuổi ở loài Ớt (Capsicum
annuum L.), Siddique và cs (2006) đã thu đƣợc kết quả 11,16 chồi/mẫu ở môi
trƣờng MS bổ sung 1,0 µM TDZ [106]. Hệ thống tái sinh đa chồi ở cây Bầu nâu
(Aegle marmelos L.) đã đƣợc xây dựng thành công khi sử dụng lá mầm sau khi gieo
hạt một tháng trên môi trƣờng MS bổ sung BAP, kinetin và IAA. Số chồi cao nhất
đạt đƣợc là 48,75 chồi/mẫu trên môi trƣờng MS cơ bản bổ sung 6,6 μM BA+1,14
μM IAA sau 7 tuần nuôi cấy [80]…
Sử dụng mẫu lá để tạo đa chồi cũng đã đƣợc nghiên cứu ở một số loài cây
dƣợc liệu. Ayyadurai và cs (2016) đã nghiên cứu tái sinh đa chồi ở cây Cà hôi
(Solanum pubescens) từ mẫu lá cấy trên môi trƣờng MS cơ bản bổ sung chất kích
thích sinh trƣởng BAP, NAA, GA3. Số chồi lớn nhất đạt đƣợc là 3,5 chồi/mẫu ở
nồng độ 3,0 mg/l BAP + 1,0 mg/l GA3 [12]. Khi so sánh hiệu quả tái sinh đa chồi
từ đoạn thân và từ lá ở cây Tầm bóp (Physalis peruviana L.), Ramar và cs (2014) đã