XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ ACID AMIN ĐẠM FORMOL AMONIAC TRONG THỰC PHẨM

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÀI TIỂU LUẬN
MÔN: PHÂN TÍCH HÓA LÝ THỰC PHẨM 1

Đề tài:

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ - ACID
AMIN - ĐẠM FORMOL - AMONIAC TRONG THỰC
PHẨM

GVHD: Nguyễn Thị Hải Hòa
Nhóm thực hiện: 09
1.Nguyễn Thị Hà......................2022150022
2. Phạm Thị Hoài Xinh.............2022150117
3. Trương Thị Tường Quyên.....2022150192

Tp. HCM, ngày 7 tháng 11, năm 2017


MỤC LỤC


LỜI MỞ ĐẦU
Protein được tạo thành chủ yếu từ các amino acid qua lien kết peptide. Cho đến
nay ta đã thu được nhiều loại protein dạng tinh khiết, có thể kết tinh được và đã xác
định được thành phần các nguyên tố hóa học, gồm các nguyên tố chính là C, H, O, N
với tỉ lệ C: 50 – 55%; H: 6,5 – 7,3%; O: 21 – 24%; N: 15 – 18% và một lượng nhỏ S:
0 – 0,24%. Ngoài ra, còn chứa một lượng nhỏ các nguyên tố khác như: P, Fe, Zn, Cu,

Mn, Ca,…
Trong thực phẩm protein tồn tại ở nhiều dạng khác nhau như đạm hữu cơ (acid
amine, peptide, polypeptide, acid nucleic,…); đạm vô cơ ( amoniac, muối amoni, muối
nitrate, nitrit,..). Chúng tồn tại trong thực phẩm với một hàm lượng nào đó quyết định
đến giá trị dinh dưỡng cũng như sự an toàn cho thực phẩm. Để xác định được chúng,
hiện nay có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng và mục đích phân tích mà lựa chọn
phương pháp phù hợp. Bài tiểu luận sau đây sẽ nêu ra được các phương pháp và cách
sử dụng của chúng.

3


I. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTIDE THÔ TRONG THỰC PHẨM
1. Ý nghĩa của chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm
Về phương diện hóa học, protide thô là những chất hữu cơ mà thành phần cấu tạo
gồm: C, H, O, N có khi còn thêm P và S.
Protide bao gồm các acid amine (amino acid) và những hợp chất (peptit, protein)
khi thủy phân cho một hoặc nhiều loại acid amine. Peptide là do một số giới hạn acid
amine kết hợp với nhau bởi liên kết peptit (-CO-NH-) (nhóm chức acid của acid amine
này kết hợp với nhóm chức amine của acid amine kia).
Protein là tên gọi để chỉ chung những protide, được chia làm 2 nhóm: holoprotein và
heterprotein. Holoprotein khi thủy phân cho các acid amine. Heterprotein khi thủy
phân ngoài acid amine còn có những chất không phải là protide (gọi là chất phi
protide) thí dụ như: lipide, acid nucleic,…
Xác định hàm lượng protide là xác định các thành phần liên quan đến chất lượng và
dịnh dưỡng của thực phẩm (xác định hàm lượng protide thô, xác định hàm lượng
protein, xác định hàm lượng acid amine, xác định hàm lượng amoniac,…).
Ở đây, với việc phân tích chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm, đặc biệt là trong nước
mắm, dùng để phân hạng nước mắm và quyết định đến giá thành của sản phẩm thì
lượng protide thô bao gồm protein và các hợp chất chứa nitơ khác như amoniac, acid

nucleic,…hay còn gọi là tổng lượng nitrogen. Đây là một trong những chỉ tiêu quan
trọng để đánh giá chất lượng của thực phẩm,
Nguyên tắc xác định: được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ toàn phần và
kết quả nhân với 6,25. Điều đó có nghĩa là protide thô luôn chứa 16%N. Ở protide thô
động vật, hàm lượng nitơ toàn phần thường cao hơn 16% (16 – 17%), nhưng ở thực
vật thì hàm lượng này lại thấp hơn 16%. Hệ số 6,25 là hệ số trung bình thô.
2. Các phương pháp phân tích chỉ tiêu protide thô trong thực phẩm
Hiện nay, có 2 phương pháp dùng khá phổ biến được dùng để phân tích tổng
nitrogen hay hàm lượng protide thô trong thực phẩm như sữa, thức ăn chăn nuôi, đó là
phương pháp Dumas và phương pháp Kjedahl. Cả hai phương pháp này đều được
quốc tế công nhận và đã được tiêu chuẩn hóa thành TCVN

4


2.1. Phương pháp Kjeldahl
Phương pháp Kjeldahl chỉ xác định được hàm lượng đạm hữu cơ (acid amine,
peptide, polypeptide, acid nucleic,…) và amoni.
2.1.1. Nguyên tắc
Khi đốt nóng mẫu thực phẩm với H2SO 4 đậm đặc, các chất hữu cơ bị oxyl hóa tạo
thành SO2, CO2, H2O. Còn nitơ sau khi được giải phóng ra dưới dạng NH 3 kết hợp với
H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.
Protein, polypeptide, peptone H2SO4 đặc, t0
và các hợp chất chứa nitơ

xúc tác

(NH4)2SO4 + SO2 + CO2 + H2O

Đẩy NH3 ra khỏi muối (NH4)2SO4 bằng một base mạnh (NaOH)

(NH4)2SO4 + 2NaOH 2NH3+2H2O + Na2SO4
Định lượng NH3 bay ra bằng acid (phương pháp trực tiếp):
2NH3 + H3BO3 (NH4)2B4O7 + 5H2O
(NH4)2B4O7 + 2HCl + 5H2O 4H3BO3 + 2NH4Cl
Hoặc có thể sử dụng H2SO4 0,1N dư, chuẩn độ lượng dư H 2SO4 bằng dung dịch
NaOH 0,1N (phương pháp gián tiếp):
2NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
2NaOH + H2SO4 dư Na2SO4 + 2H2O
2.1.2. Phạm vi áp dụng
Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm theo TCVN 8099-2:2009
2.1.3. Dụng cụ - hóa chất – thiết bị
-

Dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thí nghiệm
Bình Kjedahl dung tích 500ml
Bộ cất đạm Kjedahl
Dung dịch H2SO4 đậm đặc
Hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 = 1: 10
Dung dịch H3BO3 4%; pH = 5,5; điều chỉnh pH bằng NaOH 0,1N
Dung dịch Hcl 0,1N
Dung dịch NaOh 0,1N
Dung dịch H2SO4 0,1N
Dung dịch Phenolphthalein 1%
Dung dịch Tashiro hoặc Alirazin natri sunfonat
Giấy quỳ tím

5


2.1.4. Các bước tiến hành

- Bước 1: Vô cơ hóa mẫu
+ Cân chính xác khoảng 2-4g mẫu hoặc V(ml) dung dịch mẫu cho vào bình Kjeldahl
+
+
+
+

dung tích 500ml. Chú ý không được dính mẫu lên thành bình.
Thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4=1;10 vào bình.
Rót từ từ theo thành bình 10-20ml H2SO4 đậm đặc.
Lấy nhẹ bình để acid trộn đều vào mẫu.
Đậy bình bằng phễu thủy tinh rồi cặp vào giá đỡ và đặt nghiêng một góc 45 0 trên bếp

điện.
+ Đung nóng tủ hút cho đếnkhi dung dịch trong suốt không màu hoặc có màu xanh
trong. Trong quá trình đun thỉnh thoảng lắc nhẹ, tráng khéo sao cho không còn một vệt
+
+
+
+
+
+
+

đen nào của mẫu chưa bị phân hủy sót lại trên thành bình.
Để nguội. Chuyển toàn bộ dung dịch vào cất đạm.
Vô cơ hóa mẫu bằng bộ phá mẫu nhiều ống:
Cân chính xác khoảng 2-4g mẫu hoặc V(ml) dung dịch mẫu cho vào ống phá mẫu.
Thêm 2g hỗn hợp xúc tác CuSO4: K2SO4=1:10.
Rót từ từ theo thành bình 10ml H2SO4 đậm đặc..

Đặt ống vào trong bộ phá mẫu.
Mở máy và cài đặt nhiệt độ.
Tiến hành phá mẫu trong tủ hút cho đến khi thu được dung dịch có màu trong xanh
hoặc trong suốt.
6


- Bước 2: Tiến hành cất đạm
+ Lắp ráp bộ cất đạm và rửa sạch bộ cất đạm.
+ Cho vào bình tam giác hứng 50ml H 3BO4 4% và 5 giọt chỉ thị Tashiro, dung dịch có

màu xám bẩn.
+ Nhúng đầu ống sinh hàn của bộ cất đạm ngập hẳn trong dung dịch của bình tam giác
hứng.
+ Chuyển dung dịch đã vô cơ hóa vào bình cầu của máy cất đạm, rửa bình Kjeldahl 2 lần

với nước cất và chuyển tất cả nước rửa vào bình cầu. Trung hòa bằng NaOH 30% với
Tashirolafm chỉ thị màu (hoặc với chỉ thị Alizarin natri sulfonate), sau đó cho thêm
5ml NaOH 30%.
+ Mở nước vào ống simh hàn.
+ Tiến hành cất kéo hơi nước 15-30 phút.
+ Nâng đầu ống sinh hàn lên khỏi mặt dung dịch trong bình tam giác, dùng bình tia rửa
đầu ống sinh hàn, tiếp tục cất thêm 2 phút nữa. Kiểm tra nước chảy ra ở đầu ống sinh
hàn không làm thay đổi màu giấy quỳ là được.
- Bước 3: Chuẩn độ
+ Lấy bình hứng ra và chuẩn độ bằng dung dịch bằng dung dịch HCl 0,1N dung dịch

chuyển từ màu xanh lục sang màu tím. Ghi thể tích dung dịch HCl 0,1N tiêu tốn.
Chú ý: Rửa bộ cất đạm bằng HCl 10% và nhiều lần bằng nước cất.
- Chỉ sử dụng các loại thuốc thử loại tinh khiết phân tích. Nước được sử dụng phải

là nước cất không chứa amoni hoặc nước có độ tinh khiết tương đương.
- Đối với hàm lượng nitơ biết trước thấp, có thể sử dụng nồng độ acid ít đậm đặc
hơn để thu được độ chính xác cao hơn.
- Trong quá trình phân tích sinh khí SO2 độc
2.1.5. Tính toán và biểu thị kết quả
Hàm lượng nitơ toàn phần được tính theo công thức
Đối với mẫu rắn
Nitơ toàn phần (g/100g) =
Đối với mẫu lỏng
Nitơ toàn phần (g/l) =
Trong đó: V: thể tích HCl 0.1N (ml)
N: đương lượng dung dịch HCl
Vm: thể tích mẫu thử (ml)
m: khối lượng mẫu thử (g)
7


Nếu chuẩn độ lượng NH3 sinh ra bằng phương pháp gián tiếp như đã trình bày ở
trên
Đối với mẫu rắn:
Nitơ toàn phần (g/100g) =
Đối với mẫu lỏng:
Nitơ toàn phần (g/l) =
Trong đó: V1: thể tích dung dịch NaOH 0.1N (ml)
V2: thể tích dung H2SO4 0.1N (ml)
N: đương lượng dung dịch H2SO4 0.1N
Vm: thể tích mẫu thử (ml)
m: khối lượng mẫu thử (g)
F: hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch NaOH 0.1N
Hàm lượng protide thô được xác định bằng cách lấy kết quả nitơ toàn phần nhân với

hệ số 6.25 (hay các hệ số tương đương trong từng trường hơp cụ thể).
2.2. Phương pháp Dumas
Phương pháp Dumas xác định nitrogen ở tất cả các dạng liên kết trong thực phẩm,
cả hữu cơ và vô cơ, cả nitrate và nitrite.
Được sử dụng lần đầu tiên cách đây hơn 150 năm và được gọi là “phương pháp đốt
cháy” có tính chính xác cao và đo mẫu nhanh. Phương pháp này được thừa nhận bởi
các tổ chức quốc tế như: AOAC, AACC, ASBC, ISO, OIV.
2.2.1. Nguyên tắc
Mẫu được đốt cháy ở nhiệt độ cao, khoảng 900 0C tạo thành oxide, các hợp chất bị
đốt cháy bao gồm cả muối nitrate và nitrite để tạo thành N-oxides hoặc N 2.Với sự có
mặt của Cu (đồng), các oxide nitrogen sẽ khử thành nitrogen.Trong khi đó, CO 2; H2O
và một vài oxide khác được tách ra và loại bỏ hoàn toàn bằng cách bẫy hấp thụ và hấp
phụ. Khí nitrogen sinh ra được đo bằng đầu dò dẫn nhiệt (thermal conductivity
detector – TCD).
Một máy tính được kết nối với máy Dumas bằng phần mềm điều khiển và tính nồng
độ nitrogen có trong mẫu từ tín hiệu trên đầu dò TCD của khí nitrogen và từ khối
lượng mẫu. Hàm lượng protide thô được tính bằng cách nhân hàm lượng nitrogen với
hệ số chuyển đổi thích hợp, thực phẩm nói chung là 6,25.
8


Protide thô [%] = 6,25× N [%]
2.2.2. Phạm vi áp dụng: các loại hạt có dầu và thức ăn chăn nuôi theo TCVN 8133
– 1:2009.
2.2.3. Dung cụ - Hóa chất – Thiết bị
- Khí mang: CO2; He; O2 99,99% thể tích
- Chất hấp phụ sulfua dioxide và halogen, dùng để loại sulfua ra khỏi mẫu. Ví dụ,
chì cromat PbCrO4 hoặc búi thép.
- Chất xúc tác Platin đồng oxide (vật liệu nhồi cho ống sau đốt). Chất xúc tác Platin
5% Pt trên alumin Al2O3 được pha trộn với CuO với tỷ lệ 1:7 hoặc 1:8 theo chỉ dẫn của

nhà sản xuất.
- Bông bạc và bông đồng: cần tách rời trước khi nạp vào ống sau đốt hoặc ống khử
- Bông thạch anh hoặc bông thủy tinh
- Đồng (dây, các đoạn cắt, vụn hoặc bột) hoặc volfram dùng cho ống khử sẽ làm
tăng độ chụm của các kết quả phân tích đối với các mẫu chứa hàm lượng nitơ thấp
(khoảng 1% khối lượng).
- Diphospho pentoxide hoặc magiesium peclorat hạt Mg(ClO 4)2 hoặc chất mang
khác thích hợp để nhồi các ống làm khô
- Các hạt khoáng oxide nhôm hình cầu rỗng dùng cho ống đốt
- CuO làm vật liệu nhồi cho ống đốt
- NaOH, trên chất hỗ trợ
- Acid aspartic C4H7NO4 hoặc acid atylen diamin tetraacetid C 10H16N2O8 haợc acid
glutamic C5H9NO4 hoặc acid hippuric chuẩn C9H9NO3 hoặc các mẫu chuẩn thích hợp
khác đã biết trước có hàm lượng nitơ không để đã được xác nhận.
- Dầu nhẹ, có điểm sôi trong khỏang 30oC đến 60oC hoặc aceton hoặc ethanol.
- Cân phân tích, có thể gân chính xác đến 0,0001g
- Máy nghiền phòng thử nghiệm, thích hợp với bản chất của mẫu
- Sàng thử nghịem, có lỗ 800mm hoặc 1mm làm bằng vật liệu không chứa sắt
- Chén nung (thép không gỉ, thạch anh, gốm hoặc platin) hoặc ống thiếc, giấy lọc
không chứa nitơ, thích hợp để sử dụng cho thiết bị Dumas
- Thiết bị Dumas có lò nung có thể duy trì được nhiệt độ bằng hoặc lớn hơn 850 oC,
detector dẫn nhiệt và có thiết bị thích hợp để phân tích tín hiệu.
* Tính toán và biểu thị kết quả
9


Hàm lượng nitơ tổng số WN, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng và thông
thường có sẵn từ dữ liệu in ra từ thiết bị
Hàm lượng protide thô WP, được biểu thị bằng phần trăm khối lượng theo công
thức sau: Wp = WN×F

Trong đó, F là hệ số chuyển đổi (bằng 5,7 đối với lúa mì và các sản phẩm nghiền của
chúng, bằng 6,25 đối với các sản phẩm khác)

Hệ thống phân tích đạm Dumas
2.2.4. Cách tiến hành
•Phần thử mẫu

Cân ít nhất 0,1g mẫu thử chính xác đến 0,0001g cho vào chén nung hoặc ống thép.
Đối với các mẫu chứa hàm lượng protein thấp (<1% phần khối lượng) thì có thể cần
tăng lượng mẫu lên 3,5g, tùy thuộc vào loại thiết bị Dumas sử dụng và bản chất của
phần mẫu thử.Sấy khô mẫu trước khi phân tích, nếu độ ẩm >17%.
•Kiểm soát nhu cầu oxy

Một vài loại thiết bị Dumas đòi hỏi ước tính nhu cầu oxy của phần mẫu thử.Đối với
một số thiết bị có bộ kiểm soát tự động điều chỉnh lưu lượng oxy, thì đòi hỏi lượng
oxy còn lại từ 2 – 8%.
Thực hiện 5 phép thử trắng đối với môi trường không khí, mỗi lần sử dụng một
lượng sacaroza tương đương thay cho mẫu, với mỗi bộ xác định protein hoặc nitơ để
thay mẫu thử. Mẫu trắng sacaroza cho biết lượng nitơ do không khí đưa vào và bị giữ
lại trong vật liệu hữu cơ đã nghiền bột. Sử dụng giá trị trung bình của các lần thử trắng
10


môi trường không khí để hiệu chỉnh sai số trong phép tính xác định nitơ hoặc protein
của từng mẫu thử.
•Hiệu chuẩn

Sử dụng các hợp chất tinh khiết có hàm lượng nitơ biết trước không đổi (acid
aspartic) làm chất chuẩn để hiệu chuẩn thiết bị lâu dài. Phân tích kép ba hợp chất tinh
khiết mỗi lần sử dụng ba nồng độ khác nhau được chọn theo dải đo các mẫu thử.

Để dựng đường chuẩn, cần chọn hợp chất và lượng sử dụng để đảm bảo rằng có thể
phát hiện chính xác lượng nitơ từ 4mg đến 200mg. Muốn cho đường chuẩn tuyến tính
thì từ 1mg đến 5mg.
•Xác định

Phần mẫu thửu được đốt cháy hết trong các điều kiện đã chuẩn hóa ở nhiệt độ trong
khoảng từ 8500C đến 12000C tùy thuộc vào thiết bị và mẫu thử nghiệm.
Các sản phẩm phân hủy bay hơi (N 2,NOx, CO2, H2O) được chuyển bằng khí mang
qua thiết bị
Các nitơ oxide được khử thành N2 và lượng Oxy thừa được giữ lại bằng đồng trong
cột khử.
Loại bỏ nước bằng bộ ngưng được là bằng magiesium diphospho pentoxide.Khi
không dùng CO2 làm khí mang, thì nước được giữ lại bằng cách cho đi qua chất hấp
phụ thích hợp, ví dụ NaOH trên chất mang.
Các hợp chất gây nhiễu ( hợp chất halogen bay hơi và lưu huỳnh) phải được loại bỏ
bằng các chất hấp phụ hoặc các chất tiếp xúc ví dụ bông bạc hoặc NaOH trên chất
mang thích hợp.
Một vài loại thiết bị Dumas đòi hỏi ước tính nhu cầu oxy của phần mẫu thử.Đối với
một số thiết bị có bộ kiểm soát tự động điều chỉnh lưu lượng oxy, thì đòi hỏi lượng
oxy còn lại từ 2 – 8%.protein hoặc nitơ để thay mẫu thử. Mẫu trắng sacaroza cho biết
lượng nitơ một lượng sacaroza tương đương thay cho mẫu, với mỗi bộ xác định
Thực hiện 5 phép thử trắng đối với môi trường không khí, mỗi lần sử dụng do
không khí đưa vào và bị giữ lại trong vật liệu hữu cơ đã nghiền bột. Sử dụng giá trị
trung bình của các lần thử trắng môi trường không khí để hiệu chỉnh sai số trong phép
tính xác định nitơ hoặc protein của từng mẫu thử.ba hợp chất tinh khiết mỗi lần sử
dụng ba nồng độ khác nhau được chọn (acid aspartic) làm chất chuẩn để hiệu chuẩn
thiết bị lâu dài. Phân tích kép Sử dụng các hợp chất tinh khiết có hàm lượng nitơ biết
11

trước không đổi theo dải đo các mẫu thử.rằng có thể phát hiện chính xác lượng nitơ từ
4mg đến 200mg. Muốn cho đường chuẩn tuyến tính thì từ 1mg đến 5mg.
Để dựng đường chuẩn, cần chọn hợp chất và lượng sử dụng để đảm bảo độ trong
khoảng từ 8500C đến 12000C tùy thuộc vào thiết bị và mẫu thử Phần mẫu thửu được
đốt cháy hết trong các điều kiện đã chuẩn hóa ở nhiệt nghiệm.
Các sản phẩm phân hủy bay hơi (N2,NOx, CO2, H2O) được chuyển bằng khí mang
qua thiết bị
Các nitơ oxide được khử thành N2 và lượng Oxy thừa được giữ lại bằng đồng trong
cột khử.
Loại bỏ nước bằng bộ ngưng được là bằng magiesium diphospho pentoxide.qua
chất hấp phụ thích hợp, ví dụ NaOH trên chất mang.
Khi không dùng CO2 làm khí mang, thì nước được giữ lại bằng cách cho đi
Các hợp chất gây nhiễu ( hợp chất halogen bay hơi và lưu huỳnh) phải được loại bỏ
bằng các chất hấp phụ hoặc các chất tiếp xúc ví dụ bông bạc hoặcNaOH trên chất
mang thích hợp.
Nitơ còn lại theo khí mang đi qua detector dẫn nhiệt.
•Phát hiện

Để định lượng nitơ thì thiết bị sử dụng tế bào dẫn nhiệt nhạy, đã được tối ưu hóa về
khí mang sử dụng và có thể điều chỉnh điểm zero tự động giữa các lần đo các phần
mẫu thử. Sau khi khuếch đại và chuyển đổi tín hiệu detector thì các dữ liệu này được
xử lý bằng bộ vi xử lý ngoại biên.
2.2.5. Lưu ý
- Để tránh rò rỉ, vòng chữ O được sử dụng để làm kín phải được bôi trơn bằng dầu
chân không cao trước khi lắp đặt.
- Phải làm sạch tất cả các dụng cụ thạch anh và dụng vụ thủy tinh thật cẩn thận và
xóa hết các dấu vân tay trên ống bằng dung môi thích hợp (ví dụ như aceton) trước khi
đưa ống vào lò nung.
2.2.6.Ưu - nhược điểm của phương pháp Dumas
Phương pháp Dumas dễ sử dụng và hoàn toàn tự động hóa. Nó nhanh hơn phương

pháp Kjedahl rất nhiều, chỉ khoảng 4 – 5 phút/mẫu, trong khi đó phương pháp Kjedahl
mất 1,5 – 2 tiếng. Hơn nữa, phương pháp này không sử dụng các chất độc hại và
không làm gây ô nhiễm môi trường như phương pháp Kjedahl vì lượng SO 2 sinh ra rất
12


độc hại.
Với nguyên lý của phương pháp Dumas, phân tích lượng nitơ toàn phần bao gồm cả
hợp chất vô cơ như nitrate và nitrite thì phương pháp Kjedahl chỉ phân tích các hợp
chất nitrogen hữu cơ và amoni. Đây chính là sự khác biệt giữa hai phương pháp này.Vì
vậy, phần lớn các mẫu khi được phân tích bằng hai phương pháp này thì hàm lượng
protide thô khi phân tích bằng phương pháp Dumas luôn cao hơn hàm lượng protide
thô bằng phương pháp Kjedahl. Sự khác biệt này càng rõ ràng đối với mẫu có hàm
lượng nitrate, nitrite cao như các loại rau, lạp xưởng,…
Do vậy, phương phá Dumas không có sự chọn lọc protein. Nếu sử dụng phương
pháp Dumas, các sản phẩm có thể làm giả để tăng hàm lượng protein bằng bất cứ hợp
chất hữu cơ hoặc vô cơ nào có chứa nitrogen. Cũng giống như phương pháp Kjedahl,
không đưa ra được kết quả protein thực khi nó phân tích cả chất phi protein.Nhưng,
phương pháp Kjedahl vẫn được coi là phương pháp chuẩn để so sánh với các phương
pháp khác khi phân tích protide thô.Phương pháp Dumas được sử dụng khi sự khác
biệt giữa các mẫu là không đáng kể.

II. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ACID AMIN TRONG THỰC PHẨM
1.Ý nghĩa của chi tiêu acid amin
Như chúng ta đã biết, protein là thành phần không thể thiếu trong cơ thể sống thì
acid amin là thành phần cấu tạo nên các protein trong cơ thể.Amino acid là đơn vị cấu
trúc cơ bản của protein là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất một nhóm carboxyl và
ít nhất một nhóm amino trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid amine).
Các protein khác nhau do sự sắp xếp vị trí các acid amin trong chuỗi polypeptide và
thành phần các acid amin. Protein được mô tả như một chuỗi các hạt với nhiều hình

dạng khác nhau.Mỗi hạt là một phân tử nhỏ được gọi là acid amin. Các loại thực phẩm
giàu đạm như: thịt, cá, trứng sữa,… thì các protein sẽ được dịch vị tiêu hóa trong dạ
dày thành các acid amin hoặc các sản phẩm thực phẩm như nước mắm, nước tương,…
thì hàm lượng acid amin so với đạm tổng số quyết định đến giá trị dinh dưỡng của sản
phẩm.
Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau, do đó việc phân tích chúng để xác
định thành phần axit amin hoặc hàm lượng của các protein, peptide, và các chế phẩm
dược phẩm khác rất cần thiết.
13


2. Các phương pháp định lượng acid amin
2.1. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao năng HPLC
2.2.1.Nguyên tắc
HPLC là phương pháp sắc ký được phát triển dựa trên phương pháp ghi sắc ký
cột, các chất phân tích khi qua cột sắc ký do có ái lực khác nhau với pha động (dung
môi) và pha tĩnh (các hạt nhồi trong cột) mà chúng ra khỏi cột với thời gian khác
nhau,chất nào có ái lực với pha tĩnh lớn hơn sẽ giữ trong cột lâu hơn, còn chất có ái
lực nhỏ với pha tĩnh sẽ ra khỏi cột cùng với pha động sớm hơn .
Thay vì để dung môi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác dụng của trọng lực,
người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng 400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn.
Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích thước nhỏ trong cột hấp
phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa pha tĩnh và các phân tử chất phân tích đi qua nó.
Điều này sẽ tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn hợp.
2.1.2. Dụng cụ hóa chất
•

Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl phenol cho vào 1 ml hcl

•

Bình khí nitơ

•

Chất tạo dẫn xuất như Phenylisothiocyanate ( PITC) ,

•

Triethylamine (TEA)

•

Ethanol loại dùng cho HPLC

•

Nước cất lần 2

•

Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ cho sắc ký
2.1.3. Các bước tiến hành



Chuẩn bị xong mẫu, cho dung môi pha động vào bình chứa pha động..



Đưa mẫu vào thiết bị kim tiêm mẫu



Điều chỉnh các thông số cho máy sắc kí: nhiệt độ, vận tốc dòng, bước sóng của
đầu dò.
Khởi động máy và tiến hành chạy sắc ký, sau đó xử lý số liệu và tính toán kết



quả.
2.1.3.1. Chuẩn bị dung dịch acid amin chuẩn
Dùng pipet tự động rút 3,5,7,10 µl dung dịch axit amin chuẩn cho vào ống
14


nghiệm và làm dẫn xuất như đối với dung dịch mẫu
Chú ý Sấy khô mẫu tạo dẫn xuất để loại bỏ những vết cuối cùng của PITC
Cần chuấn bị tạo dẫn xuất ở mỗi lần phân tích
Ở nhiệt độ phòng,các mẫu đã được pha loãng chỉ cho kết quả ổn định trong
vòng 10 giờ.Còn các mẫu chưa pha loãng thì có thể giữ được trong 60 giờ,Vì vậy
không nên lưu trữ các mẫu chưa pha loãng.Những mẫu khô có thể để nhiều tuần trong
tủ đông.
2.1.2.2. Xử lý mẫu
 Thủy phân protien, peptide

Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy vào loại thực phẩm và
thành phần của protien. Thứ tự thủy phân như sau:
- Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112oC khoảng 20 -30 phút trước khi thủy phân
- Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực phẩm)

- Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có phenol để ngăn cản halogel hóa
của tyrosin )
 Tạo dẫn xuất

Tăng độ nhạy trong quá trình phân tích người ta thường tạo dẫn xuất acid amin,
trong đó có các axit amin phản ứng với một tiền chất để mang lại khả năng hấp thụ
mạnh tia UV/Vis hoặc một tạo một hợp chất huỳnh quang. Có nhiều chất để tạo dẫn
xuất với protien như:
- o-phthalaldehyde (OPA), Phenylisothiocyanate (PITC), carbamate 6aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl (AQC) ...Ứng với mỗi dẫn xuất thì chọn
detector có bước sóng khác nhau.
- Việc tạo dẫn xuất phải thực hiện qua nhiều bước.
+ Quy trình sấy khô
•
•
•

Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại
Cho vào bình định mức
Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô
+ Chuẩn bị dung dich dẫn xuất

•

Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương pháp dẫn xuất
+Tạo dẫn xuất

•

Rút 20µl hỗn hợp dung dịch tạo dẫn xuất mới pha ở trên, cho vào mỗi ống mẫu đã sấy
15

•
•
•

khô
Lắc vài giây
Để yên 20 phút ở nhiệt độ 20-25oC
Sấy khô
a.
Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

OPA
o-phthalaldehyde hoặc ortho-phthalaldehyde (OPA) là các hợp chất hóa học với công
thức C6 H4 (CHO)2.
Thường được viết tắt OPA, phân tử này là một dialdehyde bao gồm hai nhóm formyl
(CHO) gắn liền kề trên một vòng benzene.Là chất rắn màu vàng nhạt được dùng trong
việc tổng hợp các hợp chất dị vòng và là một thuốc thử trong phân tích của các acid
amin.
Ortho-phthalaldehyde (OPA) được hòa tan và ổn định trong dung dịch nước ở pH
<11,5. Nó nhạy cảm với tia cực tím và oxy không khí.
o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin trong với sự có mặt của các hợp
chất thiol, hình thành các sản phẩm huỳnh quang. Phản ứng này được sử dụng cho
việc tạo các dẫn xuất trong phân tích của các axit amin bằng sắc ký trao đổi ion.
Có 2 phương pháp tạo dẫn xuất OPA: tạo dẫn xuất tiền cột (Precolumn derivatization)
và tạo dẫn xuất sau cột (derivatization postcolumn).
Dẫn xuất tiền cột:
Nguyên tắc chung tạo Precolumn derivatization là tạo dẫn xuất của các axit amin với
o- phthalaldehyde (OPA), tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký lỏng được

trang bị một máy dò fluorometric để phát hiện các dẫn xuất acid amin. Cường độ
huỳnh quang của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước sóng kích thích 348
nm và bước sóng phát xạ450 nm.
o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid amin với sự có mặt của hợp chất thiol
để hình thành các sản phẩm huỳnh quang. N-acetyl-L-cysteine và 2 -mercaptoethanol
16


có thể được sử dụng như là các thiol.
OPA tự nó không phát huỳnh quang và do đó không ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước cùng với tốc độ phản ứng
nhanh nên có thể tạo dẫn xuất tự động và phân tích bằng cách sử dụng một máy lấy
mẫu tự động, dẫn xuất này có độ nhạy rất cao, giới hạn phát hiện tối thiểu là 50 fmol
(10 -15mol)
Tuy nhiên, vì không có khả năng phản ứng với acid amin thứ cấp nên làm hạn chế ưu
thế của phương pháp tạo dẫn xuất này.Phương pháp này không phân tích được các
acid amin thứ cấp (ví dụ như proline).
Dẫn xuất sau cột
Nguyên tắc tạo dẫn xuất sau cột là sử dụng cột trao đổi ion để tách các axit amin tự do,
tiếp theo là quá trình oxy hóa các acid amid bằng hypochlorite natri rồi thực hiện phản
ứng với OPA với sự có mặt của hợp chất thiol như N-acetyl-L-cysteine và 2mercaptoethanol
Mặc dù OPA không phản ứng với các amin thứ cấp ( proline) để tạo thành các chất
huỳnh quang, nhưng quá trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin thứ
cấp phản ứng với OPA.
Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được đo với một bước sóng kích
thích 348 nm và phát xạ bước sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu
dò huỳnh quang 348nm.
Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid
amin, tuyến tính trong phạm vi của một vài pmol đến vài chục nmol.
So với dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp hơn tuy nhiên ưu điểm là có

thể phân tích được acid amin thứ cấp.
b.

Phương pháp tạo dẫn xuất NBD – F

NBD - F
17


Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất NBD-F là phản ứng của các acid amin với 7-fluoro-4nitrobenzo-2-oxa-1.3-diazole (NBD-F), NBD-F phản ứng với các acid amin kể cả các
acid amin thứ cấp để tạo thành sản phẩm cao huỳnh quang, tiếp theo là tách HPLC pha
đảo với sử dụng đầu dò huỳnh quang bước sóng kích thích là 480 nm và bước sóng
phát xạ là 530 nm.
Các điều kiện tốt nhất cho phản ứng tạo dẫn xuất là ở nhiệt độ 60 oC và môi trường
kiềm trong 5 phút, sau đó dùng acid HCl bổ sung vào hỗn hợp để hạn chế ảnh hưởng
của chất chất nền huỳnh quang.
Ưu điểm: Độ nhạy của phương pháp này gần với phương pháp tạo dẫn xuất tiền cột
OPA nhưng có ưu điểm hơn là phản ứng được với acid amin thứ cấp.
Giới hạn phát hiện của phương pháp tạo dẫn xuất này cho mỗi acid amin là khoảng 10
fmol.
c.

Phương pháp tạo dẫn xuất PITC

Phenyl isothiocyanate (PITC) là một thuốc thử được sử dụng trong HPLC pha đảo
ngược PITC, ít nhạy cảm hơn (OPA) và không thể hoàn toàn tự động tuy nhiên PITC
có thể tạo sản phẩm ổn định với tất cả các axit amin, trong đó có acid amin thứ cấp
(proline).
PITC phản ứng với axit amin để tạo thành phenylthiocarbamyl (PTC) hấp thụ cực đại
bước sóng tử ngoại 254 nm.

Đầu tiên loại hết HCl dư và làm khô. Sau khi đã làm khô bổ sung thuốc thử tạo dẫn
xuất gồm ethanol:TEA: nước cất: PITC = 7:1:1:1, làm sạch dẫn xuất bằng cách hạ áp
suất trong 30-45 phút.
Lưu trữ mẫu dẫn xuất PITC sau khi sấy khô, tái sử dụng dẫn xuất bằng cách hòa tan lại
nó vào dung dịch đệm photphat pH= 7,4 và acetonitrile với tỉ lệ 95:5 chỉ có thể giữ
được tối đa một ngày ở nhiệt độ phòng, hay 60-70 giờ khi để trong tủ lạnh.
Phát hiện các dẫn xuất bằng cách sử dụng một máy dò tia cực tím ở 254 nm, giới hạn
phát hiện tối thiểu được khoảng 1 pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin. Tuyến
tính thu được trong khoảng 20-500 pmol.
Các thuốc thử PITC là dễ bay hơi, làm cho nó có thể loại bỏ thuốc thử dư thừa, qua đó
giảm thiểu khả năng ảnh hưởng của thuốc thử.
PITC chỉ có thể áp dụng cho trường hợp tạo dẫn xuất tiền cột vì sự chuẩn bị mẫu và
tạo dẫn xuất yêu cầu thời gian dài.
18


2.1.4. Tính toán và biểu thị kết quả
Công thức tính kết quả: Hàm lượng mỗi axit amin trong mẫu phân tích được tính bằng
số mg có trong 1g mẫu bằng công thức:

A=
Trong đó:A là nồng độ axit amin i trong mẫu, mg/g
SM là diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của mẫu
SClà diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của chuẩn
C là nồng độ axit amin chuẩn i tính theo đường chuẩn
V là tổng thể tích định mức mẫu
M là Khối lượng mẫu thực phẩm dùng để phân tích axit amin, g
2.2. Phương pháp quang phổ
2.2.1. Nguyên tắc
Dựa vào sự hấp thu tia cực tím ở bước sóng 280nm của các acid amin. Các acid amin

Tryptophan, Tyrosin và một phần là Phenylamin hấp thu tia cực tím cực đại ở bước
sóng 280nm. Sự hấp thu ở bước song 280nm của chúng cũng thay đổi tùy loại acid
amin nhưng hệ số tắc đo được cho mỗi loại acid amine cho phép tính nồng độ của
protein tinh sạch (hệ số tắt là độ hấp thu của dung dịch protein 1% với đường truyền
sóng qua 1cm).
2.2.2. Các bước tiến hành
Thiết bị: máy quang phổ UV có Cuvet thạch anh đường truyền sóng là 1cm. Quá trình
gồm các bước sau:
Bước 1:Ly tâm mẫu để loại bỏ các phân tử hoặc phức hợp khác có trong thể huyền
phù. Lấy dịch nổi để các định mật độ quang học.
Bước 2:Chỉnh máy quang phổ ở bước sóng 280nm và điều chỉnh độ hấp thu về o với
cuvet chứa đệm.
Bước 3: Đo mẫu và đọc độ hấp thu của mẫu. Nếu giá trị thu được > 2,0 thì pha loãng
mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng truyền ngắn hơn (2mm) cho đến khi đọc được
nằm trong khoảng 0,5 đến 1,5.
19


Bước 4: Lặp lại ở bước 2 và 3 ở bước sóng 260nm
Bước 5: Tính tỉ số hấp thu 260nm/280nm. Tỉ số này nên nhỏ hơn 0,6. Nếu lớn hơn 0,6
thì protein không sạch có lẫn các tạp chất khác đặc biệt với acid nucleic.
2.2.3. Tính kết quả
Nồng độ protein = độ hấp thu ở bước sóng 280nm/hệ số tắt ở 280nm
Với một hỗn hợp protein hoặc với bất kỳ một loại protein nào mà không biết hệ số tắt
thì tính như sau:
Nồng độ protein = (1,55 × độ hấp thụ ở 280nm) – (0,77 × độ hấp thu ở 260nm) (mg/l)
Có thể phỏng đoán lượng acid nucleic đưa vào (độ hấp thu ở bước sóng 280nm/độ hấp
thu ở bước sóng 260nm).
2.2.4. Độ nhạy và khả năng ứng dụng
Đây là phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch. Phương

pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein (dưới 0,05 – 0,1
mg/ml) hoặc khi có mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng vùng cực tím (ví dụ: đệm,
acid nucleic và một số chất béo) hoặc khi protein ở trong dung dịch huyền phù).
2.3. Phương pháp sử dụng phản ứng Ninhidrin
Đây là phản ứng màu đặc trưng quan trọng để định tính và định lượng axitamin.
Tất cả các α-axit amin của protein đều phản ứng với nidirin tạo thành hợp chất màu
xanh tím, riêng iminoaxit như prolin tạo thành màu vàng.Phản ứng này rất nhạy, có thể
phát hiện được đến microgram axitamin, vì vậy được dùng nhiều trong phân tích định
tính và định lượng axitamin (trong các phương pháp sắc ký và điện di).Cơ chế phản
ứng khá phức tạp và có nhiều chỗ chưa thống nhất. Có thể nêu một số phản ứng chính
như sau:
+ Dưới tác dụng của nindirin ở nhiệt độ cao, axitamin tạo thành NH 3, CO2 và aldehit
tương ứng có mạch cacbon ngắn hơn axitamin một cacbon; ninhidrin chuyển thành
diextooxyhindriden

20


+ Dixetooxyhindrinden NH3 mới được tạo thành, tiếp tục phản ứng với một phân tử
ninhidrin khác tạo thành hợp chất màu xanh tím có công thức như sau:

Để định lượng axitamin có thể dùng phương pháp so màu, đo cường độ màu phản ứng
hoặc dùng phương pháp đo thể tích khí CO 2 hoặc NH3 được tạo thành. Phương pháp
so màu được sử dụng nhiều hơn.
Ngoài axitamin, peptit, protein, muối amon, amoniac,... cũng tạo màu với thuốc thử
ninhidrin. Vì vậy muốn xác định chính xác axitamin, phải loại bỏ các chất này. Để xác
định aixtamin liên kết trong peptit hoặc protein phải thủy phân các chất này để tạo
thành axitamin tự do rồi mới thực hiện phản ứng với ninhidrin.
III. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐẠM FORMOL TRONG THỰC PHẨM
1.Ý nghĩa của việc phân tích chỉ tiêu đạm formol trong thực phẩm

Protein là một đại phân tử có đơn phân là các acid amin, vốn là thành phần vô cùng
quan trọng cho cơ thể sinh vật.
Xác định hàm lượng đạm formol là định lượng các acid amine và muối amoni có trong
thực phẩm.Tuy nhiên, đa phần thực tế, lượng muối amoni rất ít nên khi nói xácđịnh
nitơ formol thì ta hiểu rằng chỉ xác định lượng acid amine mà thôi.
2. Các phương pháp xác định hàm lượng đạm formol trong thực phẩm
2.1. Phương pháp Sorensen
2.1.1. Nguyên tắc
Trong acid amine có cả nhóm –COOH (tính acid) và –NH 2 (tính bazơ), do đó ta cho
tác dụng với formol để nhóm –NH2 tạo thành nhóm –N=CH2 làm mất tính base. Từ đó
21


ta có thể chuẩn độ trung hòa bằng NaOH và chất chỉ thị.

Phản ứng xảy ra giữa acid amine và formol
2.1.2. Dụng cụ - Hóa chất – Thiết bị
- Dụng cụ thủy tinh thông thường của phòng thí nghiệm
- Formol trung tính
- Dung dịch Ba(OH)2 bão hòa
- BaCl2 khan
- Dung dịch Na2HPO4 hoặc Alirazin natri sunfonat
- Giấy lọc
2.1.3. Cách tiến hành
Xử lý mẫu: Cân chính xác P(g) chất thử đã xay nhuyễn (hoặc V ml dung dịch thử) cho
vào bình định mức 100ml, với 50ml nước cất, lắc mạnh trong 10 phút để hòa tan. Cho
thêm 5ml dung dich PP, 2g BaCl2, từng giọt Ba(OH)2 đến khi dung dịch có màu hồng
nhạt. Sau đó thêm 5ml Ba(OH)2 để kết tủa các muối phosphate và carbonate. Cho
nước cất vừa đủ, lắc đều và lọc.
Tiến hành

Bước 1:Xác định lại nồng độ của NaOH bằng dung dịch chuẩn gốc H 2C2O4 0,1N với
chỉ thị phenolphtalein.
Bước 2: Chuẩn độ
Hút 20ml dung dịch xác định co vào bình tam giác 250ml. Thêm 20ml dung dịch
formol trung tính. Chuẩn độ bằng NaOH 0,2N cho đến màu đỏ tươi.
2.1.4. Tính toán và biểu thị kết quả
Đối với mẫu rắn:

X(g/100g) = *100
Đối với mẫu lỏng:

X(g/100g) = *100
Trong đó: 0,0028 là số (g) nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,2N
22


n: số ml NaOH 0,2N đã sử dụng
m, V: số g hay số ml mẫu thử
2.1.5. Lưu ý
− Các muối amoni, thí dụ NH 4Cl ở dung dịch trung tính, khi gặp formol cũng làm cho

dung dịch trở thành acid nên ảnh hưởng đến kết quả phân tích.
− Đây là trường hợp một acid yếu được chuẩn độ bằng kiềm mạnh nên điểm tương
đương ở pH kiềm (pH = 9 – 9,5) do đó phản ứng kết thúc khi PP chuyển màu đỏ tươi
chứ không phải màu hồng (pH = 8,3 như thông thường).
− Nếu trong chất thử có các muối phosphate hoặc carbonate, các muối này sẽ làm cho

dung dịch trở thành dung dịch đệm và pH khó tăng đến 9 – 9,5, làm ảnh hưởng đến kết
quả, do đó cần phải loại bỏ bằng cách kết tủa với BaCl2 và Ba(OH)2.
− Điểm chuyển màu rất khó nhận vì khó xác định lúc nào là chuyển sang màu đỏ tươi.

Do đó nên có dung dịch màu để so sánh. Người ta dùng 100ml dung dịch Na 2HPO4
0,1N (pH = 9,3) trộn đều với 0,5ml PP 1% để có màu đỏ tươi làm mẫu so sánh màu
của điểm tương đương.
2.2. Phương pháp hỗn hợp chỉ thị: sử dụng Phenolphathalein và Bromthymol
blue
Xử lý mẫu
Nếu sản phẩm đặc: nghiền nhuyễn, cân chính xác 3-5g (G) cho vào bình định
mức 100ml (Vo), thêm 50ml nước cất, lắc mạnh cho tan hết, thêm nước cất đến vạch
định mức, lắc đều, để yên 10 phút, lọc qua giấy lọc.
Nếu sản phẩm lỏng: dùng pipet lấy chính xác 10ml (Vm) cho vào bình định mức
100ml, cho nước cất đến vạch định mức.
Trung hòa mẫu
Dùng pipet lấy 10ml đã chuẩn bị ở trên cho vào bình tam giác 250ml, thêm 15 giọt
Bromthymol blue 0,04%. Nếu dung dịch có màu vàng thì nhỏ thêm từng giọt NaOH
đến khi xuất hiện màu xanh. Nếu dung dịch trên có màu xanh thì nhỏ từng giọt HCl
0,1N đến khi có màu vàng rồi lấy lại màu xanh bằng vài giọt NaOH 0,1N.
Chuẩn độ
Cho tiếp 5 giọt PP 0,1%, 5ml formol, rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,05N đến khi màu của
dung dịch chuyển từ xanh sang tím.
Tính toán và biểu thị kết quả
23


Đối với mẫu rắn:

X(g/100g) = *100
Đối với mẫu lỏng:

X(g/100g) = *100

Trong đó: 0,0007 là số (g) nitơ tương ứng với 1ml NaOH 0,05N
n: số ml NaOH 0,2N đã sử dụng
m, V: số g hay số ml mẫu thử

IV. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AMONIAC TRONG THỰC PHẨM
1.Ý nghĩa của phân tích chỉ tiêu amoniac trong thực phẩm
Trong nguyên liệu, thường chứa một loại nitơ dưới dạng vô cơ (muối amonium hay
những amin dễ bay hơi). Đây là dạng nitơ tạo thành do sự phân hủy của protein (bị lên
men thối hoặc trong quá trình khử carboxyl của aminoacid).
Trong sản xuất nước mắm nếu hàm lượng NH 3 đạt dưới 35% so với lượng nitơ toàn
phần thì nước mắm đạt chất lượng.Vì vậy, việc xác định hàm lượng amoniac rất quan
trọng đặc biệt trong thực phẩm.
2. Phương pháp xác định hàm lượng amoniac trong thực phẩm
Xác định hàm lượng NH3 bằng phương pháp cất kéo hơi nước.
2.1. Nguyên tắc
Đẩy amoniac ra khỏi mẫu bằng dung dịch kiềm trong bộ chưng cất đạm. Dùng hơi
nước kéo NH3 tự do ra khỏi mẫu, cho hấp thu vào dung dịch H2SO4 dư và định lượng
bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,1N với chỉ thị Tahiro, dung dịch chuyển từ màu tím
sang màu xanh (sử dụng kĩ thuật chuẩn độ ngược).
Phương trình phản ứng:
NH4+ + OH-NH3↑ + H2O
2NH + H2SO4(NH4)2SO4
H2SO4 + 2NaOH  Na2SO4 + H2O
2.2. Phạm vi áp dụng
Áp dụng cho tất cả các loại thực phẩm
24


Tài liệu trích dẫn: TCVN 3706 – 90
2.3. Yêu càu kĩ thuật

Dụng cụ, thiết bị

Hóa chất

Bộ chưng cất đạm

Dung dịch NaOH 0,2N

Dụng cụ thủy tinh thông thường của Dung dịch NaOH 0,1N
phòng thí nghiệm
Dung dịch H2SO4 0,1N

Giấy quỳ tím

Dung dịch Tahiro hoặc alirazin sodium
sunfonate 1%

2.4. Cách tiến hành

Xử lý mẫu

Chưng cất

Chuẩn độ

Xử lí mẫu: Cân khoảng 10g mẫu đã xay nhuyển vào cốc thủy tinh 100ml. Pha loãng
mẫu bằng nước cất, chuyển vào bình định mức 100ml, định mức đến vạch và lọc qua
giấy lọc. Dung dịch lọc được sử dụng cho bước tiếp theo.

25