Ứng dụng kỹ thuật realtime RT PCR trong giảm sát dịch cúm AH1N1 tại một số đơn vị quân đội phía bắc việt nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THANH TÂM

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR
TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT
HÓA SINH

SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC

HÀ NỘI - 2012

HÀ NỘI - 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ THANH TÂM

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME RT-PCR

TRONG GIÁM SÁT DỊCH CÚM A/H1N1 TẠI MỘT
SỐ ĐƠN VỊ QUÂN ĐỘI PHÍA BẮC, VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƢỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: HÓA SINH
MÃ SỐ: 607325

Người hướng dẫn khoa học:
1. TS Lê Thu Hà
2. TS Nguyễn Văn Rƣ

HÀ NỘI - 2012


LỜI CẢM ƠN
Với

ng k nh trọng v

iết n s u s c t i xin ph p ư c g i ời c

n ch n th nh nhất tới:
TS. Lê Thu Hà – Chủ nhiệm Khoa Vi sinh Y học, Viện Vệ sinh
Phòng dịch Quân đội người thầy hướng dẫn trực tiếp dìu d t v giúp ỡ t i
trong suốt quá trình

ề t i.

TS. Nguyễn Văn Rƣ – Trƣởng Bộ môn Hóa Sinh, trƣờng Đại học
Dƣợc Hà Nội người ã hết

ng giúp ỡ t i trong quá trình học tập v ho n

th nh uận văn n y..
T i cũng xin c

n các anh chị ang c ng tác tại Khoa Vi sinh Y học

– Vi n v sinh Ph ng dịch Qu n ội Khoa Sinh học Ph n t B nh vi n Trung
ng Qu n ội 108 nh ng người u n tận tình gi i áp nh ng th c
hết

cv

ng giúp ỡ t i trong quá trình thực hi n ề t i.
T i xin g i ời c

n tới an ãnh ạo Trường Đại học Dư c H Nội

v các thầy c giáo trực tiếp tha

gia gi ng dạy v giúp ỡ e

trong suốt quá

trình học tập tại trường.
V cuối cùng t i xin

y tỏ

ng iết n ối với người th n

nh ng người u n sát cánh cùng t i chia s

ạn è

ộng vi n giúp t i ho n th nh

kh a học v uận văn tốt nghi p.
Đề t i ư c thực hi n tại ph ng Vi sinh Y học ph n t

Vi n V sinh ph ng

dịch Qu n ội v Khoa Sinh học ph n t B nh vi n 108.
H Nội ng y 14 tháng 11 nă
Học vi n
Nguyễn Thị Thanh T

2012


MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Tình hình dịch

nh cú

A .................................................................... 3

1.1.1. Tình hình nhiễ

cú

A/H1N1 tr n thế giới ................................... 3

1.1.2. Tình hình nhiễ

cú

A/H1N1 tại Vi t Na .................................. 4

1.1.3. Đặc iể
1.2. Đặc iể

s ng

nh cú

A/H1N1 ........................................... 6

của virus cúm A ..................................................................... 7

1.2.1. Ph n oại Virus cú ........................................................................ 7
1.2.2. Cấu trúc virus cú
1.3. Kh năng g y

nh v c chế x

1.3.1. Kh năng g y

1.3.2. C chế x

A....................................................................... 8
nhiễ ............................................ 12

nh ........................................................................ 12

nhiễ ......................................................................... 13

1.4. Các phư ng thức iến ổi kháng nguy n............................................. 14
1.4.1. Hi n tư ng « ch kháng nguy n».................................................. 14
1.4.2. Hi n tư ng «trộn kháng nguy n» .................................................. 15
1.4.3. Hi n tư ng g ycosy hoá ............................................................... 16
1.5. Các kỹ thuật s dụng trong nghi n cứu virus cú
1.5.1 Kỹ thuật rRT-PCR phát hi n cú

A/H1N1 từ

A/H1N1 ................ 17
nh phẩ

nh y

họng ......................................................................................................... 17
1.5.2. Kỹ thuật gi i trình tự gen .............................................................. 20
1.5.3. Một số phư ng pháp tạo c y chủng oại phát sinh (Phy ogenetic
tree) .......................................................................................................... 21
1.6. Một số nghi n cứu i n quan virus cú

A/H1N1 ã thực hi n ........... 22

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 24
2.1. Đối tư ng nghi n cứu........................................................................... 24


2.2. Nguyên vật i u .................................................................................... 25
2.2.1. Sinh phẩ ...................................................................................... 25
2.2.2. Trang thiết ị ................................................................................. 25
2.2.3. Vật tư ti u hao ............................................................................... 25
2.3. Thiết kế nghi n cứu .............................................................................. 26
2.4. Ứng dụng rRT-PCR phát hi n cúm A/H1N1 ....................................... 26
2.4.1. Qui trình x

nh phẩ ............................................................. 26

2.4.2. Quy trình tách chiết ARN tổng số ................................................. 27
2.4.3. Phư ng pháp rRT-PCR ................................................................. 28
2.4.4. Phư ng pháp i n di kiể

tra v tinh sạch s n phẩ

rRT-PCR .. 29

2.5. Các ước tiến h nh gi i trình tự ........................................................... 31
2.5.1. Real time PCR cho Sequencing .................................................... 32
2.5.2. Tinh sạch ại s n phẩ
2.5.3. Gi i trình tự tr n
2.6. Phư ng pháp x

PCR cho Sequencing ............................... 32

áy Sequencing CEQ 8800 .............................. 33

ý số i u .................................................................... 34

Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................ 35
3.1. Kết qu giá

sát dịch tễ cú

A/H1N1 tại

ột số

n vị qu n ội ph a

B c ............................................................................................................... 35
3.1.1. Đặc iể

tình hình dịch tễ tại các

n vị qu n ội giai oạn tháng

8-12/2009 ................................................................................................. 35
3.1.2. Kết qu giá

sát diễn iến dịch cú

tại các

3.1.3. Kết qu x t nghi

cú

A tại

ột số

3.1.4. Kết qu x t nghi

cú

A/H1N1 tại

n vị qu n ội ....... 36

n vị qu n ội ph a B c . 37
ột số

n vị qu n ội ph a

B c ........................................................................................................... 38
3.1.5. Tỉ

nhiễ

virus cú

A/H1N1 tại các

n vị qu n ội nă

2009

................................................................................................................. 40


3.1.6. Ph n ố tỉ

nhiễ

virus cú

A/H1N1 theo các tháng trong nă

2009 – 2010 ............................................................................................. 40
3.2. Kết qu thu nhận Rea ti e –PCR Gi i trình tự xác ịnh gen H1 ...... 42
3.2.1. Kết qu thực hi n rRT-PCR .......................................................... 42
3.2.2. Kết qu gi i trình tự v thu nhận chuỗi gen .................................. 44
3.3. Phân tích so sánh trình tự gen

ã h a kháng nguy n H của các

ẫu

gi i trình tự .................................................................................................. 47
3.3.1. Truy cập ng n h ng gen v ựa chọn các chủng virus cú

A/H1N1

so sánh ph n t ch với chủng thu thập ..................................................... 47
3.3.2. Kết qu ph n t ch sai khác về nuc eotid ở các chủng so sánh....... 52
3.2.3. Kết qu so sánh ph n t ch trình tự th nh phần acid a in của các
oạn gen H1 của

ẫu nghi n cứu với các chủng quốc tế ư c ựa chọn

so sánh ..................................................................................................... 56
3.3. Kết qu ph n t ch xác ịnh quan h ph h của các

ẫu virus cúm

A/H1N1 thu ư c với các chủng tr n thế giới dựa trên gen H1 ................. 58
Chƣơng 4. BÀN LUẬN ................................................................................. 65
4.1. Kết qu giá
vực

sát dịch

nh cúm A/H1N1 tại các

n vị qu n ội khu

iền B c từ 2009-2011 ........................................................................ 65

4.2. Kết qu kh o sát ặc iể
n vị qu n ội khu vực

sinh học ph n t virus cú

A/H1N1 tại các

iền B c từ 2009-2011 ....................................... 68

KẾT LUẬN .................................................................................................... 71
ĐỀ XUẤT ....................................................................................................... 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 73


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
AI

Avian Influenza - Cú

gia cầ

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool - C ng cụ tì

kiế

sự

tư ng ồng
Bp

Base pair - Cặp ase

CDC

Centers for Disease Control and prevention- Trung t
soát v ph ng chống

nh tật

cDNA

Complementary DNA

dNTPs

Deoxy ribonucleotide triphosphates

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene Diamine Tetra acetace Acid

Et-Br

Ethidium Bromide

HA

Hemagglutinin

Kb

Kilo base

M1,2

Matrix 1,2 protein

NCBI

National Centre for Biotechnology Information

NA

Neuraminidase

NP

Nucleoprotein

PA

Polymerase acidic protein

PB1

Polymerase basic protein 1

PB2

Polymerase basic protein 2

PCR

Polymerase Chain Reaction - Ph n ứng khuếch ại chuỗi

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcriptase PCR - Ph n ứng sao ch p ngư c

v/p

Vòng /phút

VSDT TW

Vi n V sinh dịch tễ trung ư ng

WHO

World Health Organization - Tổ chức Y tế Thế giới

kiể


DANH MỤC BẢNG

B ng 1.1. Các

nh RNA v chức năng của virus cú

B ng 2.1. Th nh phần v nồng ộ các chất tha

A ............................ 11

gia ph n ứng ..................... 29

B ng 2.2. Chu kì nhi t của ph n ứng .............................................................. 29
B ng 3.1. Đặc iể

dịch tễ các

n vị c nhiễ

B ng 3.2. Diễn iến tình hình dịch cú
B ng 3.3. Kết qu x t nghi
nă

cú

cú

trong vụ dịch ............. 35

trước v sau c ng ố dịch ............... 36

A ằng kĩ thuật rRT-PCR TaqMan Probe

2009........................................................................................ 37

B ng 3.4. Kết qu x t nghi

cú

A/H1N1 tại

kĩ thuật rRT-PCR TaqMan Pro e nă
B ng 3.5. Ph n ố tỉ

ột số

n vị qu n ội ằng

2009 ................................. 39

nhiễ virus cú A/H1N1 theo các tháng trong 2 nă . 41

B ng 3.6. Danh sách các chủng virus cú

A/H1N1 của Vi t Na

v thế giới

s dụng gen H1 trong ph n t ch so sánh th nh phần gen v

ối quan

h nguồn gốc ph h ....................................................................... 49
B ng 3.7. Các vị tr nuc eotid sai khác trong gen H1 gi a các chủng so sánh 55
B ng 3.8. Các vị tr acid a in sai khác trong trình tự protein H1 của các oạn
gen nghi n cứu với các nh

chủng virus A/H1N1 so sánh ........ 58


DANH MỤC HÌNH VẼ
Hình 1.1. Cấu trúc kh ng gian virus cú A ..................................................... 9
Hình 1.2. Cấu trúc virus cú A [27]............................................................... 10
Hình 1.3. C chế x nhiễ của virus cú A/H1N1 v o tế o vật chủ ...... 14
Hình 2.1. Thiết kế nghi n cứu dịch tễ học ph n t virus cú A/H1N1 ......... 26
Hình 2.2. Qui trình tinh sạch DNA ................................................................. 30
Hình 3.1. Tỷ nhiễ cú A tại các n vị qu n ội .................................... 38
Hình 3.2. X t nghi dư ng t nh với cú A/H1N1 tại các n vị qu n ội . 39
Hình 3.3. Tỷ nhiễ cú A/H1N1 tại các n vị qu n ội ......................... 40
Hình 3.4. Ph n ố tỷ nhiễ virus cú A/H1N1 theo tháng ....................... 41
Hình 3.5. Đi n di s n phẩ rRT-PCR của virus cú A/H1N1 tr n thạch
agarose 1% ......................................................................................... 43
Hình 3.6. Gi n ồ Chro atogra
ột phần trình tự gen virus cúm
A/H1N1.............................................................................................. 45
Hình 3.7. Một phần trình tự gen ã h a kháng nguy n H của virus
A/H1N1(hai ẫu số 5 v số 7) .......................................................... 46
Hình 3.8. Kết qu BLAST oạn gen gi i trình tự n NCBI ( ẫu số4) ......... 48
Hình 3.9. Kết qu so sánh th nh phần nuc eotid của gen H1 của các chủng
nghi n cứu với các iến chủng A/H1N1 ư c ựa chọn so sánh ...... 53
Hình 3.10. Kết qu so sánh th nh phần acid a in của gen H1 của các
chủng nghi n cứu với các iến chủng A/H1N1 ư c ựa chọn so

sánh .................................................................................................... 57
Hình 3.11. Mối quan h nguồn gốc ph h gi a các chủng cú A/H1N1
xác ập dựa tr n th nh phần nuc eotid gen H1 ằng chư ng trình
MEGA5.1 (phư ng pháp kết nối iền kề NJ - Neighbour Joining,
với h số kiể ịnh tin cậy ã th 1000 ootstrap)............................ 61
Hình 3.12. Mối quan h nguồn gốc ph h gi a các chủng cú A/H1N1
xác ập dựa tr n th nh phần acid a in gen H1 ằng chư ng trình
MEGA5.1 (phư ng pháp kết nối iền kề NJ - Neighbour Joining,
với h số kiể ịnh tin cậy ã th 1000 bootstrap)............................ 63


ĐẶT VẤN ĐỀ
Đầu nă

2009 tr n to n cầu xuất hi n

ột chủng virus cúm A/H1N1

ới với ầy ủ t nh chất ể c thể g y th nh ại dịch. Ng y 11/06/2009 ần
ầu ti n sau 41 nă
dịch cú

Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ã ch nh thức c ng ố ại

ầu ti n trong thế kỷ XXI với t n gọi

cú

A/H1N1/09 ại dịch.

Sáu tuần sau dịch ã an rộng ra 168 nước v vùng ãnh thổ ở c 5 ch u ục
với kho ng 162.380 ca

nh v 1153 ca t vong [3], [48].

Ng y 31/05/2009 với vi c ghi nhận ca

nh cú

ầu ti n tại th nh phố Hồ Ch Minh Vi t Na

ã trở th nh quốc gia thứ 54

tr n to n cầu th ng

áo xuất hi n dịch cú

A/H1N1/09

ầu ti n tại khu vực

ại dịch

A/H1N1/09 ại dịch

ới n y. Ca

nh cú

iền B c khởi phát ng y

08/06/2009. Đại dịch ã nhanh ch ng an ra các tỉnh th nh phố [3] [48].
Cho ến nay theo ánh giá của H thống giá

sát cú

to n cầu của Tổ

chức Y tế thế giới kĩ thuật Real time Reverse transcription-PCR (rRT-PCR)
ư c xe

ti u chuẩn v ng cho phát hi n ở

nhờ ộ nhạy v

ức ộ ph n t học virus cú

ộ ặc hi u cao của ph n ứng.

Hi n nay tại

ột số ph ng th nghi

của tuyến trung ư ng ã triển

khai kĩ thuật rRT-PCR phát hi n ư c các su type cú
thiết ị hi n ại con người c trình ộ chuy n
Tuy nhi n

y vẫn

nhưng y u cầu trang

n cao v giá th nh c n

kĩ thuật ư c ựa chọn s dụng rộng rãi nhất cho c

t.
ục

ch chẩn oán cũng như nghi n cứu vì phư ng pháp rRT-PCR cho kết qu
nhanh sớ

ch nh xác giúp cho các nh qu n ý xác ịnh sớ

ư c tác nh n

g y dịch khoanh vùng dịch v sớ

ựa chọn nh ng i n pháp ph ng

hi u qu . Trong các

ặc i t

trường
cùng

n vị qu n ội

các

n vị huấn uy n v các

o tạo do iều ki n sống v sinh hoạt tập trung
ột thời iể

n n dễ dẫn tới tình trạng nhiễ

1

nh

các

ng úc nhiều người
nh truyền nhiễ


y an qua ường h hấp trong

c virus cú

hi n nhanh ch nh xác tác nh n g y
nhi

A/H1N1 n i ri ng. Vi c phát

nh ể kịp thời ối ph dập t t dịch u n

vụ h ng ầu của ng nh dự ph ng qu n ội.

Virus cúm A/H1N1có các kháng nguy n g ycoprotein ề

ặt ặc hi u

virus c các chức năng quan trọng. Ch nh ởi tầ

quan trọng của hai kháng

nguy n n y n n vi c phân tích gi i trình tự hai gen

ã h a chúng ể c nh ng

ánh giá s u h n về

ặt di truyền học kh năng g y

thuốc rất quan trọng [9]. Nghi n cứu ặc iể
kh ng chỉ cho ph p tì
a in của virus v
nhiễ

hiểu ặc iể

ph n t của gen cúm A/H1N1,

iến ổi th nh phần nucleotid và acid

nh hưởng của nh ng virus

ến ộc ực kh năng x

tr n vật chủ cũng như tư ng quan trong áp ứng

cho ph p ph n t ch

nh v t nh kháng

iễn dịch

c n

ối quan h tiến h a xác ịnh ph n type xác ịnh tư ng

ồng kháng nguy n- iễn dịch của virus. Qua
virus cúm A/H1N1 ở

cho ph p dự áo dịch tễ học

ức ộ sinh học ph n t giúp ịnh hướng s dụng

vacxin phù h p. Xuất phát từ nh ng c sở tr n chúng t i tiến h nh ề t i:
―Ứng dụng kỹ thuật Real time RT-PCR trong giám sát dịch cúm
A/H1N1 tại một số đơn vị quân đội phía Bắc, Việt Nam” với các
- Xác ịnh tỉ

nhiễ

cú

A/H1N1 ở

ột số

ục ti u:

n vị qu n ội ph a B c

trong vụ dịch 2009-2010 ằng kỹ thuật rRT-PCR
- Xác ịnh ặc iể

kiểu gen

ã h a kháng nguyên H của chủng virus

cúm A/H1N1 ph n ập ư c.

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. Tình hình dịch bệnh cúm A
B nh cú

ã ư c Hippocrates

trước. Virus cú

ư c cho

t r nh

ã g y ra các vụ dịch tr i suốt ịch s

[48],[51]. Từ thế kỷ XVI nh ng ại dịch cú
với

ức ộ v

h ng nă
cú

n y

ạch kho ng 2.400 nă
o i người

xuất hi n 10 - 50 nă

nh hưởng khác nhau cùng với

các dịch cú

1 ần

ùa x y ra

[51]. Theo WHO, t nh tr n to n thế giới hậu qu của nh ng dịch
h ng nă

c kho ng 1 tỷ ca

c cú

3 ến 5 tri u ca

c cú

nặng v kho ng 250.000 ến 500.000 ca t vong hầu hết nh ng ca t vong ở
nh ng nước c ng nghi p phát triển

nh ng người từ 65 tuổi trở n [9],[51].

1.1.1. Tình hình nhiễm cúm A/H1N1 trên thế giới
Đại dịch cú
Dịch

ầu ti n ư c ghi nhận trong ịch s x y ra v o nă

1580.

t nguồn từ Nga an sang ch u Phi rồi v o ch u Âu. Trận dịch ã khiến

ột số th nh phố của T y Ban Nha v Ita y thi t hại nặng [9],[48].
Thế kỷ XX chứng kiến 3 ại dịch cú . Từ 1918 ến 1919
ra ại dịch cú
t vong

T y Ban Nha. Số người chết v o kho ng 20 ến 50 tri u tỷ

2 - 3% [48]. N

n sang con người

ến

ư c g y ra ởi virus H1N1 v
ùa hè nă

1918 dịch cú

Một phần a d n số thế giới ã ị nhiễ
các o i vật hoang dã
Nă
cú

cú

trung gian y an

2009 ánh dấu ại dịch cú

A/H1N1

t ầu

y an từ

ã an ra kh p thế giới.

v phần ớn

ầ

do tiếp xúc với

nh [9], [36].

ầu ti n của thế kỷ XXI do

ới g y ra. Theo WHO dịch cú

nhận tại Mexico v o ng y 18/3/2009 sau
giới

thời kỳ x y

A/H1N1

ột virus

t ầu ư c ghi

an sang Mỹ v các nước tr n thế

ột cách nhanh ch ng [9],[49]. Đến ng y 11/6/2009 WHO phát i th ng

áo tới tất c các quốc gia tr n thế giới

cú

A/H1N1 ã trở th nh ại dịch

to n cầu. T nh ến ng y 25/10/2009 tr n to n thế giới ã xác ịnh h n

3


440.000 ca

c cú

oán xác ịnh
ịnh

c

A/H1N1 sau

WHO ngừng cập nhật số ca ư c chẩn

nh do tăng quá nhanh [48],[51]. Tuy vậy số ca ư c xác

nh kh ng ph n ánh ầy ủ tác ộng của ại dịch. T nh ến ng y

25/4/2010

ã c

h n 214 quốc gia v vùng ãnh thổ xác

A/H1N1 trong

ịnh c

tr n 17.919 ca t vong [3],[49]. Hầu hết các

nhiễ

virus cú

tr e

v người tr tuổi. Tỷ

cú

nh nh n

H1N1 2009 ều diễn iến cấp t nh v tự khỏi gặp nhiều ở
c

nh thay ổi theo từng vùng tỷ

vong nhìn chung dưới 0 5% ước t nh thay
[36],[22]. Vaccin ph ng
tháng sau thời iể

ổi từ 0 0004%

t

ến 1 47%

oại virus n y ã ư c chế tạo th nh c ng chỉ 5

phát hi n nh ng ca

nh ầu ti n

vaccin ầu ti n ã

ư c tung ra thị trường hồi tháng 11/2009 [2],[49].
Kết qu các iể

giá

sát cú

(30/01-12/02/2011) trong số các
cúm A/H1N1 chiế
yếu

tỷ

tr n to n cầu trong tuần thứ 5 6/2011
ẫu x t nghi

dư ng t nh với cú

63 6%. Tại Trung Quốc virus cú

virus cúm A/H1N1 trong khi

virus cúm A/H1N1 cú

ưu h nh chủ

tại Ch u Âu ao gồ

B tại Mỹ ao gồ

virus

c hai oại

a oại virus cúm A/H1N1, cúm

A/H3N2 và cúm B [5],[36],[51]. Theo th ng áo của Tổ chức Y tế Thế giới
trong tháng 06/2011 các trường h p
với các tháng trước trong

c cú

ặc dù vẫn tiếp tục ghi nhận các trường h p

cúm A/H1N1 tuy nhi n hầu như ã kết thúc
sát cú
tỷ

c

ùa cú . Theo kết qu các iể

tr n to n cầu từ ng y 05-18/6/2011 tại 71 quốc gia v vùng

ãnh thổ ã ghi nhận 485
chiế

ạnh so

c virus cúm A/H1N1 tại khu vực B c án cầu

Châu Âu B c Á v B c Mỹ
giá

tr n to n thế giới gi

57 9% các

ẫu x t nghi

ẫu x t nghi

dư ng t nh với virus cúm A/H1N1
dư ng t nh với virus cúm [25],[29].

1.1.2. Tình hình nhiễm cúm A/H1N1 tại Việt Nam
Ở Vi t Na

Virus cú

cú

cũng

ột

nh ý rất hay gặp trong cộng ồng.

căn nguy n virus ứng h ng thứ 2 g y nhiễ

4

khuẩn h hấp cấp


t nh ở tr e
chứng cú

(sau virus h p
tại H Nội

o h hấp) [11]. Nă

535 25/100.000 d n

2001 tần suất

c hội

iền B c (trừ H Nội)

2746 47/100.000 d n c nước

2063 43/100.000 d n [11]. V hội chứng

cú

c h ng nă

hội chứng

nh c tỷ

khá ổn ịnh trong số các
nă

nh truyền nhiễ

u n chiế

vị tr cao nhất v

g y dịch tại

iền B c trong 10

1999 - 2008 với kho ng 2.100 – 3.000 trường h p tr n 100.000 d n

[11],[48]. Theo th ng áo của Vi n V sinh Dịch tễ Trung ư ng từ tháng
4/2009 ến tháng 6/2009 ở

iền B c tổng số

c ca n o t vong) cao nhất trong số các
Vi t Na
nhất

c cú

285.210 ca (kh ng

nh truyền nhiễ

cũng chịu nh hưởng của các ại dịch cú

ại dịch cú

th ng áo dịch cú

A/H1N1 2009. Tại Vi t Na
A/H1N1 tại Mexico v Mỹ

[5],[48].
tr n thế giới

ới

34 ng y sau khi WHO

ã ghi nhận trường h p cú

A/H1N1 ầu ti n v o ng y 31/5/2009 [5],[48]. Nh ng ca

nh ầu ti n ều

nh ng người i từ nh ng nước c dịch về v nh ng trường h p tiếp xúc trực
tiếp với nh ng người

. Dịch dần an rộng

ùng phát th nh các ổ dịch ở

nh ng n i tập trung

ng người như các trường học c ng sở

25/7/2009 dịch ư c xác ịnh ã chuyển sang giai oạn
ồng [5],[10]. Từ
iể

ến ng y

y an trong cộng

dịch tiếp tục an rộng ra hầu hết các tỉnh th nh

v o tháng 8 9 v gi

ỉnh

dần từ tháng 11 12 [11],[48]. T ch ũy từ ầu

vụ dịch ến 3/2010 c nước ã ghi nhận 11.305 trường h p c x t nghi
dư ng t nh với virus cú

A/H1N1 tại 63 tỉnh th nh phố trong

61 trường

h p ã t vong ph n ố ở c 4 khu vực trong c nước cụ thể: Miền Na :
41 0% T y Nguy n: 13 1%

iền Trung: 13 1%

trường h p t vong chủ yếu

ở nh

c thai tr nhỏ tiền s
nh

iền B c: 32 8% [11]. Các

nh nh n c nguy c cao như phụ n

nh ý như nhiễ

HIV

nh phổi

nh ti

ạch

áu...[48].
Hai tháng ầu nă

2011 Virus cúm A/H1N1 ã ư c ghi nhận tại 30

5


tỉnh th nh phố

a số các trường h p

c ều ở thể nhẹ. C 07 trường h p

t vong tại 06 ịa phư ng; các trường h p t vong chủ yếu c
kè

theo cụ thể: 01 trường h p c tiền s

qu giá

sát cú

ruột hoại t . Từ ầu nă

trọng iể

ạn t nh

ái tháo ường tăng huyết áp; 01

trường h p ị khối u trung thất; 01 trường h p ị
t nh v 01 trường h p vi

nh

nh phổi t c nghẽn

ạn

2011 ến nay theo kết

Quốc gia nước ta ghi nhận sự xuất hi n của 03

phân týp virus cúm A/H1N1, cúm A/H3N2 và cúm B. Virus cúm A/H1N1 ã
ư c ghi nhận tại 40 tỉnh th nh phố với 498 trường h p
dư ng t nh trong

c c x t nghi

ã c 13 trường h p t vong tại 10 ịa phư ng; các

trường h p t vong chủ yếu c

nh

ạn t nh kè

theo chiế

61 5% [9],[11].

1.1.3. Đặc điểm lâm sàng bệnh cúm A/H1N1
B nh c thể x y ra ở
sức ề kháng của

ọi ứa tuổi với các iểu hi n

s ng tùy theo

ỗi cá thể từ nhẹ ến nặng [2].

Trong vòng 7 ngày:
- Sống hoặc ến từ vùng c cú
- Tiếp xúc gần với người
xác ịnh

c cú

A/H1N1.

nh nguồn

nh: nghi ngờ c thể hoặc ã

A/H1N1.

- B nh diễn iến cấp t nh v c

ột số iểu hi n sau

y:

+ Sốt.
+ Vi

ong ường h hấp.

+ Đau họng.
+ Ho khan hoặc c

ờ .

- Các tri u chứng khác
+ Đau ầu au c
+ Nhiều trường h p c

t

ỏi n n ti u ch y.
iểu hi n vi

hấp cấp v suy a tạng.

X t nghi

chẩn oán căn nguy n [2]:

6

phổi nặng thậ

ch c suy h


- Real time RT-PCR
phẩ

x t nghi

xác ịnh virus cúm A/H1N1. B nh

dịch ngoáy họng dịch tỵ hầu dịch phế qu n ( ấy c ng sớ
- Nu i cấy virus: thực hi n ở nh ng n i c
- C ng thức

iều ki n.

áu: số ư ng ạch cầu ình thường hoặc gi

- X quang phổi: c thể c

c ng tốt).

iểu hi n của vi

nhẹ.

phổi kh ng iển hình.

1.2. Đặc điểm của virus cúm A
1.2.1. Phân loại Virus cúm
Virus cúm chủ yếu g y
Orthomyxoviridae, có gen
Orthomyxoviridae gồ

nh ường h hấp ở người v
RNA

n s i (-) gồ

ộng vật thuộc họ
8 ph n

oạn. Họ

4 chi: Influenzavirus A (virus cúm A), Influenzavirus B

(virus cúm B), Influenzavirus C (virus cúm C) và Thogotovirus. Các nhóm virus
n y khác nhau chủ yếu ở kháng nguy n ề

ặt v

tác nh n chủ yếu g y

nh

ường h hấp tr n ở người ộng vật gia cầ v chi [9],[16],[39].
Nhóm virus cúm A (Influenza A virus): Ph n type nguy hiể
c thể g y

nh cú

nhất vì n

ở ộng vật ở người v c thể ùng phát th nh nh ng vụ

dịch hoặc nh ng trận ại dịch to n cầu.
Nhóm virus cúm B (Influenza B virus): Thường chỉ phát hi n thấy ở
người v kh ng ao gồ

các ph n nh

. Virus cú

B cũng c thể g y

nặng cho người nhưng t g y th nh dịch như virus cú

A [9].

Nhóm virus cúm C (Influenza C virus): Tồn tại tr n người v
ị nhiễ

virus cú

nh

n. Người

C c thể iểu hi n các tri u chứng ở dạng nhẹ. Virus cú

C kh ng g y th nh dịch.
Ba nh

virus cú

trúc kháng nguy n ề

A B C ư c nhận di n ởi sự khác nhau trong cấu
ặt phức h p protein cũng như vai tr g y

nhau tr n ộng vật c xư ng sống. Virus cú
ặt

protein he agg utinin (HA) c n ở cú

esterase fusion).

7

nh khác

A v B c kháng nguy n ề

C

HEF (he agg utinin


Nh

Thogotovirus g y

nh cho ộng vật người v

xư ng sống ( uỗi rận iển). Kháng nguy n ề

ộng vật kh ng

ặt của Thogotovirus

GP

(glycoprotein).
Virus cú

A ư c ịnh type phụ dựa v o ph n ứng huyết thanh học của

các g ycoprotein ề

ặt HA v NA. Hi n nay người ta ã xác ịnh ư c 16

phân type HA (H1 - H16) và 9 phân type NA (N1 - N9). Từ nă

1980 vi c

xác ịnh ph n type HA ã ư c ti u chuẩn h a cho tất c các virus cú
A từ gia cầ

chi

phục hồi sau khi
c

ngựa v người. Huyết thanh từ gia cầ
c

nh v kháng thể

ặt kháng nguy n của virus cú

type

v chồn sư ng

n d ng ư c dùng ể xác ịnh sự

trong từng ph n type [18], [32], [43].

Đối với các virus ư c ph n ập tr n người

nh: Danh pháp ư c Tổ

chức Y tế thế giới (WHO) quy ịnh thống nhất danh pháp virus cú

theo thứ

tự ký hi u: Tuýp huyết thanh/n i ph n ập/số hi u chủng/thời gian ph n
ập/ oại hình ph n tuýp theo kháng nguy n HA v NA [25].
V dụ: A/Singapore/13032057/2009 (H1N1). Chủng virus ph n ập từ
người tại Singapore k hi u chủng 13032057 nă

ph n ập 2009 c kháng

nguyên HA là H1 và NA là N1 [12].
1.2.2. Cấu trúc virus cúm A
Cấu trúc của virus cú
tiếp ến
Ngo i cùng

A gồ

3 phần: Trong cùng

ớp vỏ protein ao ọc õi gen ể

õi (gen) của virus

o v gen gọi

ớp vỏ ipoprotein ao ọc xung quanh capsid gọi

(envelope).

8

vỏ capsid.
vỏ ngo i


Hình 1.1. Cấu trúc không gian virus cúm A
Virus cú
c

hình cầu ường k nh kho ng 100 – 120 n . Các hạt virus cú

cấu trúc c

n gồ

các protein capsid cùng với ARN tạo th nh

nuc eocapsid. Bao ngo i của virus cú

2 ớp ipid tr n ề

ặt 2 ớp ipid

c các kháng nguy n he agg utinin v neura inidase ký hi u

H v N. Các

kháng nguy n n y ặc hi u cho từng phân type virus v c chức năng giúp virus
x

nhập v o tế

o thúc ẩy sự p ráp v ch n

uồi của virus trong tế

o.

Hi n nay c 16 cấu trúc kháng nguy n H v 9 cấu trúc kháng nguy n N khác
nhau ký hi u kháng nguy n H1 ến H16 N1 ến N9 nhưng chỉ c H1 2, 3 và
N1 2

hay gặp ở người.Virus cú

A c 11 protein ư c

ã hoá trong ARN

ao gồ : he agg utinin (HA) neura inidase (NA) nuc eoprotein (NP) M1
M2, NS1, NS2, PA, PB1, PB1-F2 và PB2 [18], [27], [43]. (Hình 1)

9


Hình 1.2. Cấu trúc virus cúm A [27]
Genom của virus cú

A

RNA s i

oạn ri ng i t nối với nhau th nh

n

[(-) ssRNA], gồ

ột s i duy nhất

8 ph n

n trong vỏ virus

ã

h a cho 11 protein tư ng ứng của virus (HA NA, M1, M2, NS1, NS2, NP,
PA, PB1, PB1- F2, PB2) [18] (B ng 1.1).

10


Bảng 1.1. Các mảnh RNA và chức năng của virus cúm A
Mảnh
RNA
1

2

3

4

5

6

7

8

Độ dài
(bp)
L tiểu n vị th nh phần trong phức h p enzym 2341
Basic polymerase
polymerase của virus chịu trách nhi
khởi ầu
protein 2 (PB2)
phiên mã RNA virus
Mã h a tổng h p enzym PB1 - tiểu n vị xúc tác 2341
của phức h p enzy po y erase trong quá trình
tổng h p RNA virus chịu trách nhi
g n ũ
Basic polymerase
RNA.
protein 1(PB1) và
Protein (PB1-F2) ư c ã h a ởi ột khung ọc
PB1_F2
ở khác của PB1 c vai tr g y ra hi n tư ng
apoptosis (hi n tư ng tế

o chết theo chư ng
trình)
PA
ột tiểu n vị của po y erase chịu trách 2233
Acidic polymerase
nhi
k o d i sự phi n ã RNA trong quá trình
protein (PA)
tổng h p RNA của virus.
G n với thụ thể tr n
ng tế o chủ dung h p 1701
Hemagglutinin
ng tế o chủ v virus. Khởi ầu quá trình x
(HA)
nhiễ c 16 oại HA
Nucleoprotein Mã h a tổng h p nuc eoprotein (NP) - thành phần 1497
của phức h phi n ã chịu trách nhi
vận
(NP)
chuyển RNA gi a nh n v
o tư ng tế o chủ
Neuraminidase Tránh sự kết tụ virus v hỗ tr gi i ph ng phần t 1410
virus ới.
(NA)
Tư ng tác với ộ gen v các nh n tố ngoại nhân, 1027
hỗ tr
ng g i virus
Matrix protein Tạo k nh ion kiể soát pH trong Go gi của quá
trình tổng h p HA v cởi ỏ ớp vỏ virion.
(MP)

Bao ọc RNA tạo n n phức h p RNP v tha gia
v o quá trình ―nảy chồi‖ của virus
890
Non-suctrutural
Kiể soát RNA sau phi n ã trung h a interferon.
protein 1 (NS1)
Hỗ tr sự di chuyển ra ngo i nh n của RNA virus
Non-suctructural
ng g i virus. B o v h gen của virus.
protein 2 (NS2)
Chức năng

Mã hóa protein

11


1.3. Khả năng gây bệnh và cơ chế xâm nhiễm
1.3.1. Khả năng gây bệnh
Virus cú

A c t nh th ch ứng v

ường h hấp g y

y nhiễ

cao với tế

o iểu

nh chủ yếu ở ường h hấp v cũng c thể g y tổn

thư ng cho nhiều c quan khác nhau trong c thể của các ộng vật c
nhiễ

do

c n ư c gọi

virus a phủ tạng. Kh năng g y

nh của virus

cúm A phụ thuộc v o ộc ực v t nh th ch nghi vật chủ của từng chủng virus.
Virus cúm A (Influenza A virus)

ột oại virus ặc i t c

ức ộ v

iều ki n tiến h a nhanh do kh năng thay ổi h gen tạo n n ph n type v
iến chủng

ới th ng qua c chế ột iến ― ch kháng nguy n‖ (antigenic

drift) hoặc/v tái tổ h p ―trộn kháng nguy n‖ (antigenic shift). Trộn kháng
nguy n

hi n tư ng trao ổi các ph n oạn gen hay c n gọi

trao ổi (reassort ent) gi a các virus thuộc cùng
các ph n type khác nhau dẫn ến sự hình th nh
t nh g y

tái tổ h p

ột ph n type hoặc gi a
ột oại virus

ới c

ặc

nh v kháng nguy n ho n to n khác c kh năng g y ại dịch

to n cầu [27],[39], [41].
Sau khi ị nhiễ
chống ại virus ể

virus cú

A c thể vật chủ sinh ra áp ứng

o v c thể nhưng áp ứng

o v ho n to n cho c thể trong ần nhiễ

iễn dịch

iễn dịch n y c thể kh ng

sau do virus cú

A u n c sự

iến ổi kháng nguy n của n trong quá trình ưu h nh ở tự nhi n. Do
xuất hi n nh ng iến chủng virus cú
nh ng chủng virus trước
c cú

ới. Đ y

ới gi

hoặc iến

dịch ặc hi u với iến chủng

t áp ứng

nguy n nh n

nhiều ần trong nă

thường nặng nề v c thể g y n n ại dịch cú
chủng virus cú

ặc t nh kháng nguy n khác với

c thể sẽ kh ng hoặc c

o hộ th ch ứng với chủng virus
v con người thường

Ac

các

iễn dịch

cho gia cầ

t dịch cú

về sau

ới. Kh năng g y

nh của

ất khi c thể c

ư c áp ứng

v chúng trở n n th ch nghi

12

khi

y nhiễ

iễn

ở o i


vật chủ

ới [41].

1.3.2. Cơ chế xâm nhiễm
Cũng như tất c các oại virus khác virus cú
Quá trình x

A k sinh nội

o

nhiễ v nh n n của virus x y ra chủ yếu ở các tế

t uộc.

o iểu

ường h hấp ường ti u h a:
- Quá trình x

nhiễ

hi u d nh cho n tr n ề
virus v o trong
- Trong

ư c

t ầu khi HA kết h p với thụ thể ặc

ặt các tế

o tư ng của tế
o tư ng tế

oc

nhiễ

v gi i ph ng h gen của

o nhiễ .

o nhiễ

virus s dụng ộ

áy sinh học của tế

o chủ tổng h p các protein của virus v các enzym RNA po y erase phụ
thuộc RNA (RNA-dependent RNA polymerase - RdRp)

c ở tế

oại enzym không

o chủ xúc tác cho tổng h p gen RNA từ s i khu n cũng c

n chất

RNA. Phức h p protein – RNA của virus ư c vận chuyển v o trong nhân
tế

o.
- Trong nh n tế

dư ng từ khu n

o từ các RNA h gen của virus tổng h p n n các s i

s i

của h gen virus từ các s i dư ng n y chúng tổng

h p n n RNA h gen của virus

ới nhờ RNA- po y erase. Các s i n y

kh ng ư c Adenine h a ở ầu 3‘ v 5‘ chúng kết h p với nuc eoprotein
(NP) tạo th nh phức h p ri onuc eoprotein (RNP) ho n chỉnh v
chuyển ra

o tư ng tế

ư c vận

o [27], [39]. Đồng thời các RNA th ng tin của

virus cũng sao ch p nhờ h thống enzym ở từng ph n oạn gen của virus v
ư c enzym PB2 g n th
vận chuyển ra

10 - 12 nucleotid Adenin ở ầu 3‘ sau

o tư ng v dịch

ã tại ưới nội

ư c

o c hạt ể tổng h p n n

các protein của virus.
- Các ph n t NA v HA của virus sau khi tổng h p ư c vận chuyển
g n n

ặt ngo i của

ng tế

o nhiễ

nhờ ộ

áy Go gi gọi

vùng ―n y

chồi‖ của virus. Protein NP sau khi tổng h p ư c vận chuyển trở ại nh n tế

13


o ể kết h p với RNA th nh RNP của virus. Sau cùng các RNP của virus
ư c h p nhất với vùng ―n y chồi‖ tạo th nh các ―chồi‖ virus g n chặt v o
ng tế

o chủ ởi i n kết gi a gai HA với thụ thể của tế

o chứa sia ic

acid. Các NA ph n c t các i n kết n y v gi i ph ng các hạt virus trưởng
th nh ra ngo i tế

o ể tiếp tục chu trình x

nhiễ

của virus v o các tế

o

khác.
Virus cúm A
Virus xâm nhi tế
bào

Thụ thể dành cho virus trên bề mặt tế bào
Màng tế bào
Dung h p
màng, cởi áo

Virus ph ng th ch theo nối
n y chồi

Nhân tế bào
Glycoprotein HA và NA
của virus ư c chèn lên
màng tế bào

Hình 1.3. Cơ chế xâm nhiễm của virus cúm A/H1N1 vào tế bào vật chủ
1.4. Các phƣơng thức biến đổi kháng nguyên
Đặc t nh c

n của virus cú

A

h gen u n iến ổi sự thay ổi

kháng nguy n theo thời gian tồn tại giúp cho virus ưu h nh rộng rãi trong tự
nhi n ở nhiều loài vật chủ khác nhau [11], [43].

C

a phư ng thức chủ yếu

iến ổi kháng nguy n ở virus cú A.

1.4.1. Hiện tượng «lệch kháng nguyên»
«L ch kháng nguy n» (antigenic drift) thực chất
x y ra trong các ph n oạn gen/h gen của virus chủ yếu

14

các ột iến iể
ở ph n oạn 4 của


ph n oạn HA (Hình 1.6). Do virus cú

A ký sinh nội

o

t uộc kh ng c

c chế "đọc và sửa bản sao" (proof-reading) trong quá trình phiên mã và sao
ch p ở nh n tế
các enzy

o

ch cho n n sự thiếu hụt enzy

sao ch p phụ thuộc RNA sẽ c thể th

s a ch a RNA dẫn ến
nucleotid (đột biến thêm),

ất i (đột biến xoá) hoặc thay thế (đột biến điểm) [12]
kh ng ư c s a ch a trong ph n t RNA chuỗi

nucleotid

ột hay nhiều
n

ới trong

quá trình nh n n của virus [43] [39].
Tuỳ thuộc vị tr x y ra các ột iến trong ộ a
tiếp

ãh a

thay ổi các acid amin trong trình tự của protein ư c

c thể trực
ã h a iểu

hi n dẫn ến thay ổi ặc t nh sinh học của protein hoặc ư c t ch ũy trong
ph n oạn gen x y ra ột iến (đột biến điểm). Tần suất x y ra ột iến iể

(point- utation) rất cao cứ
RNA h gen của virus cú
gần như

ỗi hạt virus

ỗi 10.000 nucleotid (tư ng ứng với ộ d i của

A) thì c 1 nucleotid sai khác [18],[21]. Như vậy

ới ư c sinh ra ều chứa

ột hoặc hai ột iến iể

trong h gen của n v như vậy các ột iến n y ư c t ch ũy qua nhiều thế
h virus sẽ

xuất hi n

ột ph n type virus

ới c gen HA với nh ng ặc

t nh kháng nguy n ới c thể ị sai ch.
Sự chuyển dịch ch kháng nguy n cũng c thể x y ra với gen NA. NA c
chứa nhiều phần dư acid amin quan trọng nh ng phần dư n y khi ột iến sẽ
làm cho virus kháng ại các thuốc ức chế neura idase. Các ột iến n y
thường x y ra tại các vị tr acid amin R152K E119V H274Y R292K. Đột
iến tại vị tr H274K i n quan ến vấn ề kháng thuốc Ose ta ivir (Ta if u)
[12],[33],[42]. Lysine (K) thay thế cho arginine (R) ở vị tr 292 của NA sẽ ưa

ến sự kháng thuốc ho n to n. Đột iến R th nh K g n iền với sự trao ổi
nucleotid AGA thành AAA trong gen NA.
1.4.2. Hiện tượng «trộn kháng nguyên»
Hi n tư ng «trộn kháng nguy n» (antigenic shift) (c n gọi

15

trao đổi hay


tái tổ hợp) các gen kháng nguy n chỉ c ở virus cú
RNA g y

ột số virus

nh gia cầ khác cho ph p virus c kh năng iến chủng rất cao.

Hi n tư ng n y x y ra như sau : H gen gồ
của virus cú
ột tế

v ở rất t

A ư c hai chủng virus cú

o c thể trao ổi cho nhau

8 ph n oạn gen ri ng i t

A khác nhau khi ồng nhiễ

ể c thể x y ra sự ho trộn (reassort)

hoặc trao ổi (swap) các ph n oạn gen gi a hai chủng virus
trình kết h p ại th nh
gen ở các hạt virus

ột h gen

trong quá

ới tạo ra các dạng khác nhau của RNA h

ới sinh ra hỗn h p từ th nh phần các ph n oạn của h

gen từ nh ng virus an ầu. Kết qu
oạn gen kết h p v

trong

tạo ra thế h virus

ới c các ph n

i khi giúp cho chúng c kh năng y nhiễ ở o i vật

chủ ới hoặc gia tăng ộc ực g y

nh [33] [42] [18].

1.4.3. Hiện tượng glycosyl hoá
Th ng thường các virus cúm A nói chung và cúm A/H1N1 nói riêng có
ức ộ ột iến iể

cao

thay thế

c thể tạo n n các acid amin

ột số nucleotid tại nh ng vị tr

ở

ới c kh năng tiếp nhận car onhydrate tạo

n n hi n tư ng glycosyl hoá (glycosylation). Hay nói cách khác ở virus cú
A/H1N1, glycosyl hoá là sự g n kết của

ột chuỗi car onhydrate

(oligosaccharide) v o với acid amin asparagine (N) ở
trong chuỗi po ypeptide HA hay NA hay

ột số vị tr nhất ịnh

ột số po ypeptide khác. Th ng

thường chuỗi o igosaccharide ư c g n tại vị tr NXS hoặc NXT (trong

, N:

asparagine, X: acid amin ất kỳ trừ pro ine S: serine hoặc T: threonine).
Đ y

nh ng vị tr

ư c cho

g n kết với các kháng thể ư c c thể sinh ra

do k ch th ch của kháng nguy n nhằ

o v c thể khỏi ị nhiễ

Hi n tư ng «lệch kháng nguyên» sinh ra do ột iến iể
hình thành nên ộ

ở

virus.

ột vị tr n o

ã của asparagine tạo tiền ề cho hi n tư ng g ycosy hoá

x y ra khi tổng h p chuỗi po ypeptide HA hay NA

thay ổi iểu hi n ặc

t nh kháng nguy n của HA và NA, giúp cho virus thoát khỏi tác ộng iễn dịch

16