Nghiên cứu tính đa dạng sinh học, thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây hàm ếch ( saururus chinensis lour bail, họ lá giấp saururaceae)

Lời cảm ơn
Trong quá trình học tập và thực hiện khóa luận, em đã nhận được sự
hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ tận tình của các thầy cô giáo, các kỹ thuật viên,
các bạn đồng môn và gia đình em.
Hoàn thành khóa luận này, trước hết, em xin bày tỏ lòng kính trọng và
biết ơn sâu sắc tới TS Trần Văn Ơn đã chỉ bảo tận tình và trực tiếp hướng dẫn
em trong suốt thời gian qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới các thầy cô
giáo và các kỹ thuật viên Bộ môn Thực vật – Trường Đại học Dược Hà Nội, đặc
biệt là DS. Phạm Hà Thanh Tùng và DS. Nghiêm Đức Trọng đã luôn giúp đỡ,
hướng dẫn, chia sẻ kinh nghiệm và tạo điều kiện cho em trong suốt quá trình em
thực hiện khóa luận. Đồng thời em xin gửi lời cảm ơn tới BS. Lê Thị Hồng Hạnh
- Trung tâm Sinh y dược học – Học viện quân y, DS Nguyễn Thị Thu Huế Phòng Dược lý – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương, TS. Thu – Bộ môn Vi sinh
– Trường ĐH Dược Hà Nội đã hướng dẫn và chỉ bảo tận tình cho em cho em
trong suốt quá trình em làm thực nghiệm tại cơ sở
Em cũng xin cảm ơn các bạn đồng môn đã luôn giúp đỡ và trao đổi với
em để em có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận dễ dàng hơn.
Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban Giám đốc công ty
Dược Hoa Linh, gia đình em, đặc biệt là chồng và con trai đã luôn bên cạnh
động viên, tạo mọi điều kiện để em có thể hoàn thành tốt khóa học.
Hà Nội, ngày 20 tháng 12 năm 2010
Học viên
Lưu Thị Gấm
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ LO I H M ẾCH
1.1.1. Đặc điểm thực vật

1.1.2. Công dụng
1.1.3. Thành phần hoá học
1.1.4. Tác dụng sinh học
1. . TỔNG QUAN VỀ B NH VI M DA D NG
1.2.1.Khái niệm về bệnh viêm da dị ứng
1.2.2. Nguyên nhân gây bệnh
1.2.3. Biểu hiện
1.2.4. Phƣơng pháp điều trị
1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA
V O CHỈ TH PHÂN TỬ

1

Trang

1
3
3
3
4
5
7
12
12
12
12
13
15

1.3.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
1.3.2. Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN)
trong nghiên cứu đa dạng sinh học
1.4. TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ
1.4.1. Sắc ký khí
1.4.2. Một số đặc trƣng của detector sắc kí khí
1.4.3. Detector chọn lọc khối phổ
1.4.4. Phƣơng pháp phân tích định tính
Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG V PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U
.1. NGU N V T LI U THIẾT B
2.1.1. Nguyên vật liệu
2.1.2. Thiết bị h a ch t
2.1.3. Động vật thí nghiệm
. . PHƢƠNG PHÁP NGHI N C U
2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu tính đa dạng sinh học
2.2.1.1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật
2.2.1.2. Nghiên cứu dựa trên chỉ thị phân tử bằng kỹ thuật RAPD
– PCR
2.2.2. Phƣơng pháp định tính các thành phần hoá học định lƣợng
cắn toàn phần và định lƣợng phân tích tinh dầu trong cây
Hàm ếch.
2.2.2.1. Định tính sơ bộ các nh m ch t h u cơ c mặt trong dƣợc
liệu bằng các phản ứng hoá học đặc trƣng
2.2.2.2. Định lƣợng cắn toàn phần
2.2.2.3. Định lƣợng tinh dầu
2.2.2.4. Phân tích thành phần trong tinh dầu
2.2.3. Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học
2.4.3.1. Thử tác dụng kháng khuẩn kháng n m
2.4.3.2. Thử độ kích ứng da
2.4.3.3. Thử tác dụng chống viêm đƣ ng ngoài da bằng mô h nh

gây phù bàn chân chuột bằng carrageenin
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ THỰC NGHI M
3.1. KẾT QUẢ THỰC NGHI M
3.1.1. Kết quả nghiên cứu đa dạng sinh học
3.1.1.1. Đặc điểm h nh thái thực vật của loài Hàm ếch thu hái tại
5 địa điểm khác nhau
3.1.1.2. Đặc điểm giải phẫu các cơ quan sinh dƣỡng của HEHS
3.1.1.3.. Kết quả phân tích AND
3.1.2. Kết quả nghiên cứu thành phần h a học hàm lƣợng cắn toàn
phần của phần trên mặt đ t của mẫu HEHS
3.1.2.1. Kết quả định tính sơ bộ thành phần hoá học phần trên
mặt đ t của mẫu HEHS

2

15
17
19
19
20
20
21
23
23
23
24
25
25
25
25

26
28

28
29
29
30
30
30
34
35
38
38
38
38
41
48
50
51


3.1.2.2. Kết qủa định lƣợng cắn toàn phần của phần trên mặt đ t
của mẫu HEHS
3.1.2.3. Kết qủa định lƣợng tinh dầu và phân tích tinh dầu của
phần trên mặt đ t của mẫu HEHS
3.1.3. Kết quả thử tác dụng sinh học của phần trên mặt đ t của

52
53
56

mẫu HEHS
3.1.3.1. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn, kháng n m

56

3.1.3.2. Kết quả thử độ kích ứng da

59

3.1.3.3. Kết quả thử tác dụng chống viêm đƣ ng ngoài da
60
64
CHƢƠNG 4. B N LU N
4.1. VỀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
64
4.1.1. Phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng sinh học
64
4.1.2. Phƣơng pháp nghiên cứu h a học
64
4.1.4. Phƣơng pháp thử tác dụng sinh học
65
4.2. VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
66
4.2.1. Về nghiên cứu đa dạng sinh học
66
4.2.2. Về nghiên cứu thành phần h a học
67
4.2.3. Về nghiên cứu tác dụng sinh học
69

71
KẾT LU N V ĐỀ XUẤT
71
KẾT LU N
72
ĐỀ XUẤT
T I LI U THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 3.1: Bảng phân tích tinh dầu Hàm ếch và hình ảnh phổ của các chất
đƣợc phân tích từ tinh dần Hàm ếch

3


DANH MỤC CÁC KÝ HI U CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Ý nghĩa
AND
Acid deoxyribonucleic
ALT
Alanin amino transferase
AST
Aspartat amino transferase
BT-20
Dòng tế bào ung thƣ vú
Cao HE2
Cao l ng 3:1 phần trên mặt đ t cây Hàm ếch thu hái tại Hƣơng
Sơn chiết trong cồn 70%
COX
Cyclooxygenase

dATP
2’-deoxyadenosin triphosphat
dCTP
2’-deoxycytidin-5’-triphosphat
dGTP
2’-deoxyguanosin triphosphat
(dP/dt)max
Tỷ lệ tối đa của sự thay đổi áp su t tâm th t trái
dTTP
2’-deoxythymin triphosphat
DU – 145
Dòng tế bào ung thƣ biểu mô tuyến tiền liệt ở ngƣ i
ERK
Kinase liên quan tới tín hiệu ngoại bào
GATA – 3
Yếu tố vận chuyển acid aminobutyric gama
GPT
Glutamic pyruvic transaminase
GS/MS
Gas chromatography and mass spectrometry
HA
Hyaluronic acid
hACAT
Acyl CoA cholesterol acyltransferase ở ngƣ i
HEHS
Mẫu cây Hàm ếch thu hái tại Hƣơng Sơn- Mỹ Đức- Hà Nội
HepG2
Dòng tế bào ung thƣ gan
HIV
Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣ i

HL – 60
Dòng tế bào ung thƣ bạch cầu ở ngƣ i
IC100, IC50
Nồng độ ức chế sự tăng trƣởng 100% (50%) tế bào ung thƣ
IL
Interleukin
iNOS
Men tổng hợp NO cảm ứng
LDL
Lipoprotein tỉ trọng th p
LPS
Lipopolysaccarid
m – ARN
Acid ribonucleic thông tin
MAPK
Kinase hoạt h a mitogen
MDA
Malonyl dialdehyd
MSH
Hormon kích thích tế bào biểu b tạo sắc tố
NC/Nga
Phía bắc Carolina
NF - kappaB Yếu tố nhân kappaB
NSAIDs
Thuốc chống viêm giảm đau không steroid
NXB
Nhà xu t bản
PC3
Dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền liệt
PCR

Polymerase Chain Reaction
RANKL
Yếu tố hoạt h a receptor của phối tử yếu tố nhân kappa B
RAPD
Random Amplified Polymorphic AND

4


RAW 264.7
SK – Hep – 1
SK-BR-3
SK-MEL-28
SOD
SREBP
T-47D
T98G
Th1, Th2
TLCT CCT
TLTK
TNF
UV

Dòng tế bào đại thực bào đơn nhân trong bệnh bạch cầu ở chuột
Dòng tế bào ung thƣ gan
Dòng tế bào ung thƣ vú
Dòng tế bào ung thƣ da
Superoxid dismutase
Protein gắn yếu tố điều chỉnh sterol
Dòng tế bào ung thƣ vú

Dòng tế bào ung thƣ u nguyên bào đệm
Tế bào T sản xu t cytokine
Trọng lƣợng cơ thể chuột cống trắng
Tài liệu tham khảo
Yếu tố hoại tử khối u
Ánh sáng tử ngoại

5


DANH MỤC CÁC BẢNG
Số bảng
Bảng 1.1
Bảng 1.2
Bảng 2.1

Tên bảng
So sánh đặc điểm h nh thái thực vật của cây Hàm ếch đƣợc
mô tả trong các tài liệu
Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm
ếch (Saururus chinensis (Lour.) Baill)
Địa điểm, th i gian thu hái và mã số tiêu bản của mẫu

Trang
3
8
23

Hàm ếch
Bảng 2.2

Bảng 2.3
Bảng 2.4

Các thành phần cơ bản và điều kiện của phản ứng PCR
Các phản ứng hoá học dùng để định tính các nh m ch t
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đ phù

26
28
35

nề
Bảng 2.5
Bảng 3.1
Bảng 3.2
Bảng 3.3
Bảng 3.4
Bảng 3.5
Bảng 3.6
Bảng 3.7
Bảng 3.8
Bảng 3.9

Đánh giá khả năng gây kích ứng trên da th
T m lƣợc về đặc điểm h nh thái của các loài Hàm ếch thu
hái tại các địa điểm khác nhau
Ma trận các vết ảnh điện di của 5 mẫu hàm ếch trên các
mồi khác nhau
Hệ số di truyền của các mẫu thu hái tại các địa điểm khác
nhau

Kết quả định tính các nh m ch t chính
trong phần trên mặt đ t của Hàm ếch
Kết quả định lƣợng cắn toàn phần của 3 phân đoạn chiết
xu t Hàm ếch
Kết quả định lƣợng tinh dầu trong dƣợc liệu
Kết quả thực nghiệm thử tác dụng kháng khuẩn kháng
n m của 3 mẫu Hàm Ếch
Kết quả thử kích ứng da của cao hàm ếch 3:1 chiết xu t
trong cồn 96%
Kết quả thử kích ứng da của cao Hàm ếch 3:1 chiết xu t

35
39
48
49
50
51
52
56
58
58

trong cồn 70%
Bảng 3.10
Bảng 3.11

Kết quả thử kích ứng da của cao hàm ếch 3:1 chiết xu t
trong nƣớc
Tỷ lệ % tăng thể tích bàn chân chuột sau khi gây viêm
trong thử nghiệm tác dụng kháng viêm đƣ ng ngoài da của

cao l ng HE2 tỷ lệ 3:1 trong cồn 70%

6

59
60


7


DANH MỤC CÁC HÌNH V
Số hình
Hình 1.1.

H nh 3.2.

Tên hình
Công thức c u tạo một số lignan phân lập đƣợc từ
Hàm ếch
Công thức c u tạo một số flavonoid phân lập đƣợc từ
Hàm ếch
Công thức c u tạo 1 alcaloid phân lập đƣợc từ Hàm
ếch
H nh thái thực vật mẫu hàm ếch thu hái tại Hƣơng Sơn
– Mỹ Đức
Vi phẫu rễ HEHS

H nh 3.3.

Vi phẫu thân rễ HEHS

42

H nh 3.4.

Vi phẫu thân HEHS

43

H nh 3.5.

Vi phẫu cuống lá HEHS

44

H nh 3.6.

Vi phẫu lá HEHS

45

H nh 3.7.

Đặc điểm giải phẫu bột lá HEHS

46

H nh 3.8.

Đặc điểm giải phẫu bột thân HEHS

46

Hình 3.9

Hình ảnh vết AND của 5 mẫu Hàm ếch trên 7 mồi

48

Hình 1.2.
Hình 1.3.
H nh 3.1.

Trang
6
7
7
40
42

khác nhau
Hình 3.10

Sơ đồ cây phả hệ của 5 mẫu hàm ếch

49

Hình 3.11

Phổ phân tích và công thức c u tạo của Myristicin

54

Hình 3.12

H nh ảnh phổ và công thức c u tạo của safrole

55

Hình 3.13

H nh ảnh các vòng vô khuẩn của mẫu thử kháng sinh

57

trên VSV
Hình 3.14

H nh biểu hiện mức độ ức chế phù viêm bàn chân
chuột ở các lô tại các th i điểm đo trong thí nghiệm
thử tác dụng kháng viêm đƣ ng ngòai da của HE2

8

61


ĐẶT VẤN ĐỀ
Viêm da dị ứng là một bệnh ngoài da phổ biến trên thế giới ở Việt Nam

bệnh chiếm tỷ lệ khoảng 20-25% so với các bệnh da khác. Hiện nay bệnh đang
c xu hƣớng gia tăng do các yếu tố từ ngoài tác động lên cơ thể ngày càng nhiều
nhƣ: h a ch t ô nhiễm các yếu tố thuận lợi thuộc về cơ địa nhƣ rối loạn chức
năng nội tạng nội tiết… Bệnh hay tái phát và thƣ ng kèm với bội nhiễm. Tuy
không ảnh hƣởng trực tiếp tới tính mạng nhƣng gây ra sự kh chịu r t lớn cho
bệnh nhân trong sinh hoạt hàng ngày đồng th i c thể gây ra nhiều biến chứng
nếu không đƣợc điều trị kịp th i. Nguyên nhân gây ra bệnh thƣ ng phức tạp và
nhiều khi không rõ. V vậy phác đồ điều trị bệnh Viêm da dị ứng hiện nay mới
chỉ giảm các triệu chứng. Thuốc c thành phần Corticoid đang đƣợc sử dụng nhƣ
thuốc đầu tay trong điều trị thuốc đáp ứng mạnh nh ng yêu cầu trong điều trị
nhƣ chống viêm giảm ngứa giảm dị ứng… [1], [8], [13], [23]. Tuy nhiên việc
lạm dụng thuốc này gây ra nhiều tác dụng phụ: kh liền sẹo c thể h p thu qua
da và gây loãng xƣơng loét dạ dày – tá tràng [23]. Hƣớng tới sự an toàn trong
điều trị bệnh viêm da dị ứng xu hƣớng trên thế giới hiện nay là t m kiếm các
loại thuốc từ cây c để thay thế dần các thuốc c nguồn gốc từ Corticoid tổng
hợp.
Cây Hàm Ếch hay còn gọi là cây Tam Bạch Bảo (Saururus chinensis
Baill họ Lá gi p Saururaceae) phân bố tập chung ở các tỉnh vùng núi th p trung
du và đồng bằng phía Bắc là cây thuốc đã đƣợc sử dụng lâu đ i và phổ biến
trong cộng đồng ở nhiều nƣớc phƣơng Đông nhƣ: Trung Quốc 84], Việt Nam
[7], [21], v.v… để ch a nhiều chứng bệnh khác nhau nổi bật là các bệnh ngoài
da nhƣ: nhọt viêm mủ da eczema lở loét 21], v.v… Trên thế giới cho tới nay
đã c nhiều nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng dƣợc lý của Hàm ếch,
trong đ đã phân lập đƣợc nhiều hoạt ch t sinh học và chứng minh Hàm ếch
c ng nhƣ các hoạt ch t phân lập đƣợc c các tác dụng sinh học nhƣ: chống viêm
[47], [51], bảo vệ gan 47

72 chống hen 56 v.v… Nhiều nghiên cứu đã

9

chứng minh tác dụng chống viêm c ng nhƣ cơ chế chống viêm của Hàm ếch và
các hoạt ch t phân lập đƣợc từ Hàm ếch. Ở Việt Nam cho tới nay mới chỉ c một
nghiên cứu sơ bộ về đặc điểm thực vật thành phần h a học và tác dụng chống
viêm của cây Hàm ếch. Tuy nhiên nh ng nghiên cứu sâu về tính đa dạng sinh
học dƣới loài thành phần h a học c ng nhƣ tác dụng dƣợc lý cần thiết cho một
loài thực vật c tiềm năng làm thuốc ch a bệnh viêm da dị ứng th chƣa c .
Để g p phần nâng cao giá trị sử dụng của dƣợc liệu c ng nhƣ c nh ng
đ ng g p nh trong quá tr nh nghiên cứu thuốc điều trị bệnh Viêm da dị ứng tôi
tiến hành thực hiện đề tài:
“Nghiên cứu tính đa dạng sinh học thành phần hóa học và một số tác
dụng sinh học của loài Hàm ếch” với mục tiêu sau:
- Xác định tính đa dạng sinh học của loài Hàm ếch.
- Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Hàm ếch.
- Nghiên cứu độ kích ứng da, tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn của cây
Hàm ếch.

10


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ LO I H M ẾCH
1.1.1. Đặc điểm thực vật
1.1.1.1. Vị trí phân loại
Loài Hàm ếch (Saururus chinensis (Lour.) Baill) thuộc Chi Hàm ếch
(Saururus) Họ Lá gi p (Saururaceae) Bộ Hồ Tiêu (Piperales) Phân lớp Ngọc
Lan (Magnoliidae)

Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)

Ngành Ngọc Lan

(Magnoliophyta) [7].
1.1.1.2. Đặc điểm h nh th i
Trong các tài liệu chuyên ngành thực vât: Từ điển thực vật thông dụng
[7], Cây thuốc và vị thuốc Việt Nam 21], Cây c Việt Nam 15 Thực vật chí
Trung Quốc bản điện tử 84 h nh thái thực vật của Hàm ếch đƣợc mô tả với
nh ng đặc điểm tƣơng đồng nhƣ sau:
Cây thảo c thân rễ ngầm. Thân mọc đứng phần thân c đốt c g dọc
xung quanh. Lá mọc so le h nh bầu dục gốc h nh tim đầu thuôn nhọn; gân 5
xu t phát từ gốc; lá ở ngọn thƣ ng c màu trắng; cuống lá dài khoảng 2cm c
bẹ.
Cụm hoa mọc ở kẽ lá thành bông thõng xuống màu trắng; lá bắc h nh
thìa; không có bao hoa; hoa lƣỡng tính; nhị 6 chẵn; baoph n thuôn; lá noãn 4
dính nhau mỗi lá noãn mang 2 noãn.
Quả nang; hạt h nh cầu hoặc h nh trứng nhọn.
Mùa hoa quả: tháng 4 – 6.
So sánh các tài liệu trên th y c sự khác nhau trong mô tả một số đặc
điểm về h nh thái thực vật. Sự khác nhau này chủ yếu ở kích thƣớc các bộ phận
điều này c thể do mức độ trƣởng thành của cây ở các mẫu mà mỗi tài liệu quan
sát là khác nhau. Tuy nhiên cần chú ý tới đặc điểm về bẹ lá lá kèm lông và các
đặc điểm của hoa là các đặc điểm quan trọng giúp xác định loài (bảng 1.1).

11


Bảng 1.1. So sánh đặc điểm hình thái thực vật của cây Hàm ếch được mô tả
trong các tài liệu
Tài liệu

Từ điển

Cây thuốc

thực vật

và vị thuốc

thông dụng [7]

Việt Nam [21]

30 – 80 cm

30 – 70 cm

Cây c
Việt Nam [15]

Thực vật chí
Trung Quốc
bản điện tử [84]

Đặc điểm
Chiều cao
Kích thƣớc lá
Gân lá
Bẹ lá ở gốc

Dài 8-12 cm

Dài 5-12cm

rộng 4-5 cm

rộng 2-6cm

> 100 cm

> 100 cm

Không mô tả

Dài 10-20cm
rộng 5-10cm

5

5

5

5–7

C

Không mô tả

C

Không mô tả

cuống
Các

bộ

phận Không mô tả

Không mô tả

của hoa

Nhị 6 bầu 3-4 Cuống

hoa

ô dính nhau ở nhiều lông tơ.
đáy
ngắn.

vòi nhu

Lá

bắc

h nh

th a bề mặt c
lông trừ phần
đỉnh không lông
hoặc c lông tơ.

Cây Hàm ếch phân bố ở Trung Quốc Lào Thái Lan và Việt Nam [21]. Ở
Việt Nam vùng phân bố của Hàm ếch tập chung chủ yếu ở các tỉnh vùng núi
th p trung du và đồng bằng phía Bắc. Cây thƣ ng mọc trên đ t ẩm hoặc trên
vùng bị ngập nƣớc không thƣ ng xuyên dọc theo b các khe suối mƣơng nƣớc
ruộng hay xung quanh các vùng lầy trong thung l ng. Cây ra hoa quả hàng năm;
hạt thƣ ng phát tán theo dòng nƣớc. Cây c thân rễ phát triển mạnh phân nhánh
nhiều theo chiều ngang. Trồng đƣợc bằng nhánh con hay từng đoạn thân rễ [21].
1.1.2. Công dụng

12


Cây Hàm ếch đƣợc sử dụng ở nhiều nƣớc phƣơng Đông nhƣ: Trung Quốc
84 Việt Nam 7

15

21 v.v… chủ yếu trong y học dân gian ch a nhiều

chứng bệnh khác nhau:
 Các bệnh về da nhƣ: nhọt viêm mủ da, eczema [15 lở loét 15], [21
viêm da dị ứng 34];
 Các bệnh phụ n nhƣ: bạch đới quá nhiều 7

86 viêm vú 15];

 Các bệnh về thận – tiết niệu nhƣ: viêm thận phù th ng 7

86 tiểu

tiện kh khăn 15], [21], [85];
 Các bệnh về khớp nhƣ: th p khớp, tạng khớp 7

86 cƣớc khí (chân

sƣng đau khớp xƣơng nhức thở g p v.v…) [21];
 Một số bệnh khác nhƣ: sốt cao 76 viêm amygdale sởi 7 rắn cắn
[15 viêm hạch bạch huyết ung thƣ gan 7
vàng da lậu 59

86], beri – beri tăng huyết áp 59

76].

Bộ phận dùng là toàn cây hoặc rễ.
Liều dùng hàng ngày là 10 – 20 g [21 hoặc c thể là 15 – 30 g [86].
1.1.3. Thành phần hoá học
Trên thế giới đã c nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành về thành phần hoá
học của Hàm ếch. Các nghiên cứu đã phân lập và xác định c u trúc của nhiều
hợp ch t c trong Hàm ếch thuộc các nh m ch t hoá học là: flavonoid alcaloid
sterol lignan tanin và tinh dầu.
 Nhóm hợp chất lignan:
Các hợp ch t đƣợc phân lập từ Hàm ếch tập trung chủ yếu vào nh m
lignan-1 phân nh m của polyphenol. Các lignan phân lập đƣợc trong Hàm ếch
bao gồm:

- Sauchinone (1) (hình1.1), Sauchinone B [67

1’ – Epi – sauchinone

[72];
- Acid dihydroguaiaretic [24], Acid meso – dihydroguaiaretic từ phần trên
mặt đ t 48 và rễ 44

57];

13


- Manassantin A (2) (hình 1.1) từ phần trên mặt đ t 34 và rễ 49

54

[67], Erythro, erythro – manassantin A, Threo, erythro – manassantin A [34
Manassantin B từ rễ 39], 4 - O – Demethylmanassantin A, 4 – O –
Demethylmanassantin B [74];
- Saucerneol A Saucerneol B Saucerneol C từ phần trên mặt đ t 71],
Saucerneol D, Saucerneol F, Saucerneol G, Saucerneol H, Saucerneol I từ rễ
[54], (-) – Saucerneol methyl ether từ rễ 39];
- Saururin A từ phần dƣới mặt đ t 32 Saururin B từ rễ 49 ( ) –
Saururinone [67];
- Saucernetin – 7, Saucernetin – 8 từ phần dƣới mặt đ t 60], (+) –
Saucernetin [39];
- Machilin D từ rễ 67], Machilin D – 4 – methyl ether từ rễ 71];
- Licarin A, Licarin B [32], Acid ellagic, Galbacin [63
methyltetrahydrofuriguaiacin B từ phần dƣới mặt đ t

Di – O –

71], Erythro –

austrobailignan – 6, Nectandrin B, Sarisan, Rel – (8R 8R’) – dimethyl – (7S,
7’R) – bis (3, 4 - methylenedioxyphenyl) tetrahydro – furan từ rễ 58].

Hình 1.1. Công thức cấu tạo một số lignan phân lập được từ Hàm ếch
 Nhóm hợp chất flavonoid:
- Hyperoside (4) [55], [79], [86], Hyperin [21], [77];
- Quercetin (3) [32], [79], [86], Quercetin – 3 – O – beta – D –
glucopyranosyl (1 → 4) – alpha – L – rhamnoside [32];
- Quercitrin (5) [32], [55], [85], Isoquercitrin [32], [55], Rutin [32], [78],
[86].

14


Quercetin: R1=H, R2=H (3)
Hyperoside: R1=H, R2=Galactosyl (4)
Quercitrin: R1=H, R2=Rhamnosyl (5)

Hình 1.2. Công thức cấu tạo một số flavonoid phân lập được từ Hàm ếch
 Nhóm hợp chất alcaloid:
- Các nh m ch t phân lập thuộc nh m alcaloid gồm: aurolactam [44],
[51], Aristolactam A II (6) (hình 1.3) [24], [45], Aristolactam B II [44],
Sauristolactam [32].

Hình 1.3. Công thức cấu tạo 1 alcaloid phân lập được từ Hàm ếch

 Các nhóm hợp chất khác:
- Một sterol phân lập đƣợc từ Hàm ếch là daucosterol 55].
- Một tanin đƣợc phân lập từ phần trên mặt đ t là corilagin 55].
- Toàn cây c tinh dầu c mùi thơm đặc trƣng trong tinh dầu c thành
phần chính là: methyl – n – nonylcetone [21], [86], myristicin [86].
1.1.4. Tác dụng sinh học
Trên thế giới đã c nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành về các tác dụng sinh
học của Hàm ếch c ng nhƣ của các hợp ch t phân lập đƣợc từ Hàm ếch. Các
nghiên cứu in vivo và in vitro đã chứng minh dƣợc liệu Hàm ếch c tác dụng:
chống viêm bảo vệ gan chống ung thƣ giảm lipid chống oxy h a v.v… [34],
[42]. Các hợp ch t phân lập từ Hàm ếch đƣợc quan tâm nghiên cứu về tác dụng

15


dƣợc lý là Sauchinone Manassantin A và B Saucernetin – 7 và 8, Saucerneol A
và B (bảng 1.2).
Bảng 1.2. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch
(Saururus chinensis (Lour.) Baill)
Nguyên liệu

TDSH

Cơ chế

Chống

Dịch chiết

Ngăn chặn sự h nh thành NO iNOS và

viêm

Ethanol phần trên

COX – 2 trong đại thực bào RAW 264.7

mặt đ t

kích thích bởi LPS.

Dịch chiết MeOH

Ức chế sự h nh thành NO thông qua điều

phần trên mặt đ t

hoà giảm sự biểu hiện iNOS và NF –

TLTK
[80]

[42]

kappaB.
Dịch chiết lá

Ức chế sự phát triển các tổn thƣơng da ở

[34]

chuột NC Nga c thể thông qua cơ chế
điều chỉnh sự m t cân bằng Th1 Th2
bằng cách tăng đáp ứng tế bào Th1.
Sauchinone

Ức chế hoạt tính NF – kappaB p65 in

[56]

vitro giảm viêm đƣ ng hô h p do dị ứng
thông qua ngăn chặn hoạt tính GATA – 3
cần cho sự tăng trƣởng tế bào Th2.
Ức chế sự biểu hiện iNOS TNF – alpha

[47]

COX – 2 gây ra bởi LPS.
Saucernetin –7,

Ức chế sự h nh thành NO và sự biểu hiện

saucernetin – 8

của iNOS và COX – 2 gây ra bởi LPS.

Manassantin A và

Ức chế sự biểu hiện NOS và sự sản xu t

B

NO gây ra bởi LPS.

Saucerneol D

Ức chế sự biểu hiện iNOS gây ra bởi LPS

[60]

[50]

[57]

bằng cách ngăn chặn sự hoạt hoá NF –
kappaB và MAPK.
Bảo vệ gan Dịch chiết liều 70
mg/kg

Giảm hiệu quả các chỉ số gan: ALT
AST HA huyết thanh và MDA gan giảm
hoạt tính SOD gan trong chuột cho dùng

16

[76]


Bảng 1.2. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch
(Saururus chinensis (Lour.) Baill)

Nguyên liệu

TDSH

Cơ chế

TLTK

CCl4.
Sauchinone

Bảo vệ gan trong chứng gan nhiễm mỡ

[45]

phụ thuộc SREBP.
Tăng khả năng kháng cự của tế bào

[41]

HepG2 với tổn thƣơng oxy hoá gây ra bởi
T – butyl hydroperoxide.
Ở nồng độ 50 M giảm rõ rệt sự giải

[73]

ph ng GPT vào môi trƣ ng nuôi c y tế
bào gan chuột bị phá huỷ bởi CCl4.
Chống ung Saucernetin–7,

Độc tế bào đối với tế bào HL – 60 theo

thƣ

saucernetin – 8

cơ chế gây chết tế bào theo chƣơng tr nh.

Manassantin A và

Ức chế sự kết tập tế bào HL – 60.

[62]

B

Ức chế sự biểu hiện NOS và sự sản xu t

[50]

[65]

NO gây ra bởi LPS.
Erythro –

Ức chế sinh trƣởng rõ rệt tế bào PC – 3

manassantin A

thông qua 2 cơ chế: cơ chế gây chết tế

[70]

bào ở nồng độ cao và già hoá ở nồng độ
th p.
Manassantin A,

Chống lại các dòng tế bào SK-Hep-1, PC-

Erythro, erythro–

3, DU-145 BT-20 SK-BR-3 T-47D

manassantin A,

Hela T98G và SK-MEL-28 với IC50

Threo, erythro–

trong khoảng dao động lần lƣợt là 0 018 -

manassantin A

0.423; 1,175-7,922 và 0,131- >50

[37]

µg/mL.
Giảm lipid

Dịch chiết

Giảm mức cholesterol huyết thanh lƣợng

Ethanol

lipid mô và sự tích luỹ cholesterol ở

[81]

chuột.
Dịch chiết nƣớc

Giảm lipid trong gan và huyết tƣơng đặc

17

[82]


Bảng 1.2. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch
(Saururus chinensis (Lour.) Baill)
Nguyên liệu

TDSH

n ng

Cơ chế

TLTK

biệt là triglyceride ở chuột ăn giàu ch t
béo.

Saucerneol B,

Ức chế hACAT – 1 và hACAT – 2 giảm

manassantin A,

mạnh cholesterol ở chuột c chế độ ăn

manassantin B

giàu cholesterol.

Tác

dụng Dịch chiết

trên

tim Ethanol rễ

mạch

Giãn động mạch chủ chuột cô lập với

[53]

[63]

EC50 là 9 1 g ml.

Saucerneol và

Giảm rõ rệt huyết áp th t trái

dP dt

saucerneol D

(max) và nhịp tim ở tim chuột cô lập.

Manassantin A và

Ngăn cản sự gắn bạch cầu đơn nhân vào

B

tế bào mặt trong t nh mạch rốn c thể

[59]

[46]

ứng dụng trong ngăn ngừa xơ v a động
mạch.
Tác

dụng Dịch chiết

trên

hệ Ethanol

miễn dịch

Ức chế sự h nh thành eicosanoid quá

[48]

tr nh m t hạt nh của bạch cầu điều hoà
sự biểu hiện của IL – 4 và m – ARN
eotaxin do đ c khả năng chống hen.

Manassantin A,

Ức chế miễn dịch: manassantin A >

manassantin B,

manassantin B > saucerneol > saucerneol

saucerneol,

C > sauchinone.

[61]

saucerneol C,
sauchinone
Manassantin B

Ức chế sự biểu hiện của IL – 1 beta trong

[68]

tế bào bằng cách ức chế hoạt động của cả
NF – kappaB và NF – IL6.
Chống oxy Dịch chiết MeOH

Tăng cƣ ng hệ thống bảo vệ chống oxy

hoá

phần trên mặt đ t

hoá.

Acid 2’–hydroxyl

Chống oxy hoá LDL với IC50 lần lƣợt là:

18

[42]

[32]

Bảng 1.2. Các nghiên cứu trên thế giới về tác dụng sinh học của Hàm ếch
(Saururus chinensis (Lour.) Baill)
Nguyên liệu

TDSH

Cơ chế

dihydroguaiaretic, 3 3 M đối với acid 2’ – hydroxyl
machilin D,

dihydroguaiaretic 3 8 M đối với

saururin

machilin D 8 5 M đối với saururin và

TLTK
[52]

2.9 M đối với machilin D.
Ức chế sản Manassantin A,

Ức chế phụ thuộc liều sự sản xu t

xu t

melanin trong tế bào B16 melanoma đƣợc

manassantin B

[66]

hoạt hoá bởi alpha – MSH với IC50 là 13

melanin

nM và 8 nM.
Bảo

vệ Sauchinone

xƣơng

[38]

gây ra bởi RANKL.
(-) –Saucerneol

Bảo

Ức chế sự h nh thành tế bào huỷ xƣơng

vệ Sauchinone

thần kinh

Ức chế sự biệt hoá tế bào huỷ xƣơng.

[43]

Bảo vệ các tế bào u thần kinh đệm C6

[69]

kh i cơ chế gây chết tế bào theo chƣơng
tr nh gây ra bởi Staurosporine.

Chống

Manassantin A B

Ức chế tác dụng gây bệnh tế bào tạo ra

HIV

và saucerneol B

bởi HIV – 1 trên dòng tế bào

[49]

lymphoblastoid T ở ngƣ i với IC100 là
1 0 1 0 và 0 2 M.

Trên cả thế giới và Việt Nam hiện chƣa có nghiên cứu nào đề cập tới tác
dụng kháng khuẩn, độ kích ứng da của cây Hàm (Đây là hai tiêu chí quan trọng
đối với một chế phẩm chống viêm dùng ngoài da).

1. . B NH VI M DA D

NG

1. .1. Khái niệm
Viêm da dị ứng là biểu hiện tổn thƣơng da của một dạng dị ứng. Bệnh c
đặc trƣng bởi bệnh sử gia đ nh bị hen viêm da ở trên 70% trƣ ng hợp. Tỷ lệ mắc
bệnh viêm da dị ứng đang tăng lên trên khắp thế giới chẳng hạn tỷ lệ mắc bệnh
ở học sinh Na Uy lên đến 23% 8 , [28].

19


1.2.2. Nguyên nhân
C nhiều nguyên nhân gây viêm da dị ứng nhƣ: Di truyền khi cả cha và
mẹ đều bị viêm da dị ứng th trên 80% các con đều c biểu hiện bệnh; nếu chỉ c
cha hoặc mẹ bị bệnh th tỷ lệ mắc bệnh của các con là hơn 50%. Một số gen
trong đ c gen mã h a IgE là thụ thể IgE ái lực cao men trytase dƣỡng bào và
interleukin (IL) 4 đƣợc xem là c liên quan đến bệnh viêm da dị ứng [1], [13].
Bệnh nhân c thể c biểu hiện b t thƣ ng về điều hòa miễn dịch gồm c
tăng tổng hợp IgE tăng IgE đặc hiệu với các yếu tố nhƣ: thức ăn dị ứng nguyên
không khí vi khuẩn…; tăng biểu hiện thụ thể IgE ái lực th p trên bạch cầu đơn
nhân to và tế bào B; suy giảm phản ứng quá mẫn cảm kiểu chậm; tăng đáp ứng
cytokin loại II và giảm đáp ứng cytokin loại I [28].
Viêm da dị ứng còn hay gặp ở các thể bệnh: Viêm da dị ứng viêm da tiếp
xúc dị ứng viêm da tiếp xúc kích thích bệnh tổ đỉa chàm h nh đồng xu lichen
đơn mạn tính chàm không tiết nh n viêm da tiết bã nh n [28].
1.2.3. Biểu hiện
Các tổn thƣơng gồm c nốt sần vết giống ban đ và mụn nƣớc mụn nƣớc
c thể kết tụ lại tạo thành mảng; nhiều tổn thƣơng do nhiễm khuẩn và trầy da

thể hiện thành rỉ nƣớc và đ ng vảy [1]. Trên 50% bệnh nhân viêm da dị ứng có
biểu hiện trong vòng một năm đầu sau khi sinh và 80% c biểu hiện bệnh cho
đến 5 tuổi; trong đ khoảng 80% số bệnh nhân về sau c biểu hiện mắc thêm các
bệnh viêm m i dị ứng hoặc hen. Ở trẻ sơ sinh c thể bệnh đặc trƣng là vết đốm
viêm rỉ nƣớc và màng đ ng vảy xu t hiện trên mặt cổ và bẹn. Trong khi ở trẻ
em và thiếu niên thể bệnh lại hay gặp là viêm da nếp g p nh t là ở các hố trƣớc
xƣơng trụ và hố khoe. Bệnh viêm da dị ứng c thể tự nhiên ở ngƣ i lớn nhƣng ở
trẻ em bị viêm da trên 50% c thể kéo dài đến tuổi trƣởng thành. Ngƣ i lớn mắc
viêm da dị ứng thƣ ng c tổn thƣơng khu trú biểu hiện dƣới dạng chàm bàn tay
hoặc lichen đơn mạn tính [1], [13].
Ngứa là một triệu chứng nổi bật của viêm da dị ứng và do gãi gây ra nhiều
tổn thƣơng thứ phát khác trên vùng da bị bệnh. Các d u hiệu khác của viêm da dị

20


ứng là: xanh tím quanh miệng xu t hiện thêm một nếp g p n a dƣới mí mắt
dƣới (đƣ ng Dennie) tăng số chỉ tay tăng nguy cơ bị nhiễm khuẩn da nh t là
khi bị nhiễm Staphylococcus aureus. Bệnh nhân bị viêm da dị ứng thƣ ng c da
khô và ngứa một số trƣ ng hợp tăng IgE huyết thanh [28].
Bệnh lý miễn dịch cho th y tế bào T trợ giúp trí nhớ hoạt h a biểu hiện
của kháng nguyên tế bào lympho da là phối tử của phân tử bám dính tế bào nội
mô chịu cảm ứng E-selectin. Trong viêm da dị ứng tổn thƣơng da cho th y c tế
bào Langerhans CD 1a dƣơng tính mang IgE. Ngƣ i ta cho rằng nh ng tế bào
này c liên quan với bệnh sinh viêm da dị ứng qua khả năng điều tiết đáp ứng
quá mẫn cảm với các dị ứng nguyên của môi trƣ ng sống [28].
Để chẩn đoán bệnh thƣ ng dựa vào các tiêu chí nhƣ sau: ngứa và gãi;
bệnh tiến triển nặng rồi thuyên giảm; tổn thƣơng c đặc trƣng của viêm da dạng
chàm; bệnh sử c dị ứng cá nhân hoặc gia đ nh nhƣ hen viêm m i dị ứng dị ứng
thức ăn hoặc chàm; diễn biến bệnh kéo dài hơn 6 tuần [1], [13], [28].

1.2.4. Phƣơng pháp chữa trị
Nguyên tắc điều trị bệnh viêm da dị ứng là tránh các kích thích da sử
dụng hợp lý đúng chỉ định các ch t glucocorticoid tại chỗ c tác dụng th p hoặc
tác dụng vừa và điều trị nhanh ch ng tổn thƣơng da nhiễm khuẩn thứ phát [1],
[8], [28].


Các thuốc có nguồn gốc Corticoid

Các loại thuốc nguồn gốc Corticoid sử dụng trong điều trị Viêm da dị ứng
c 2 dạng: Thuốc bôi dùng tại chỗ và thuốc uống dùng toàn thân.
Các loại thuốc bôi Corticoid c tác dụng chống viêm làm co mạch chống
tăng sinh tế bào chống ngứa đƣợc sử dụng trong điều trị Viêm da dị ứng nhƣ
sau:
- Kem (dạng nh dịch c nƣớc) áp dụng trong trƣ ng hợp viêm da không
chảy nƣớc c p hoặc bán c p.
- Thuốc mỡ dùng trong viêm da mạn tính khi da khô ráp da dày c vảy.
- Dung dịch cồn và nƣớc dùng trong viêm da mạn tính khu trú ở da đầu.

21


Các loại Corticoid toàn thân sử dụng trong các trƣ ng hợp bệnh nặng lan
rộng đ da toàn thân thứ phát 28].
Nh ng điểm cần chú ý khi sử dụng thuốc bôi tại chỗ Corticoid:
- Trẻ em thƣ ng hay gặp phản ứng toàn thân do bôi Corticoid v diện tích
da so với cân nặng tƣơng đối lớn hơn so với ngƣ i lớn và c u tạo biểu b chƣa
phát triển đầy đủ. Loại thuốc bôi Corticoid c tác dụng mạnh chỉ dùng cho trẻ
em khi chắc chắn loại thuốc c tác dụng nhẹ và vừa ít tác dụng phụ.
- Để đề phòng bệnh tái phát nặng khi dùng thuốc Corticoid loại mạnh và

cực mạnh không đƣợc ngừng thuốc đột ngột phải ngừng thuốc từng bƣớc sau
khi đã lành bệnh và dùng thuốc bảo vệ da tiếp theo một th i gian n a 28].


Các loại thuốc kháng Histamin:

Các loại thuốc kháng Histamin c tác dụng đối với tiết dịch và làm giảm
ngứa. C

thể tiêm dƣới da loại thuốc gồm c

Gama globulin histamin

(histaglobine) nh t là đối với trƣ ng hợp chàm thể tạng 1


21 .

Kháng sinh:

Kháng sinh dùng đƣ ng toàn thân và kháng sinh bôi tại chỗ đƣợc sử dụng
trong trƣ ng hợp nhiễm trùng thứ phát. Các loại vi khuẩn thƣ ng gặp trong các
trƣ ng hợp này là liên cầu và tụ cầu v vậy cần chọn các loại kháng sinh phù
hợp để điều trị 1

8

13], [28].

Các loại kháng sinh bôi tại chỗ thƣ ng dùng là:

- Tetracyclin và dẫn ch t: Oxytetracyclin Tetracyclin
- Các kháng sinh khác: Cloramphenicol, Neomycin, Bacitracin,
Gentamycin, Amikacin.
1.3. ĐẠI CƢƠNG VỀ PHƢƠNG PHÁP PHÂN LOẠI DỰA V O
CHỈ TH PHÂN TỬ [14] [25].
Phân tử AND chứa thông tin di truyền tự sao chép một cách chính xác
thông tin di truyền cho thế hệ sau và c khả năng biến đổi đƣợc. Tính đa dạng
của sinh giới c thể n i là hệ quả của sự đa dạng trong tr nh tự AND. Nhƣ vậy

22


muốn nghiên cứu và phân loại các sinh vật khác nhau bên cạnh con đƣ ng
truyền thống là dựa vào các đặc tính về h nh thái ta nên đi vào chỉ thị phân tử.
1.3.1. Phản ứng chuỗi trùng hợp PCR
Kỹ thuật PCR hay còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase
Chain Reaction) cho phép nhân một tr nh tự AND b t kỳ lên một số lƣợng bản
sao gần nhƣ vô hạn tạo nguồn vật liệu AND cho các quá tr nh nghiên cứu tiếp
theo.
PCR là quá tr nh khuếch đại của một tr nh tự AND đặc hiệu in vitro do sự
xúc tác của enzyme AND polymerase. Sự khuếch đại này n i chung đƣợc thực
hiện nh các quy tr nh lặp lại gồm 3 giai đoạn: Biến tính gắn mồi kéo dài chuỗi.
Trong dung dịch c các primer (đoạn mồi) mỗi loại sẽ bắt cặp bổ xung với đầu
mạch đơn tƣơng ứng: nh

vậy 1 mạch kép AND sau phản ứng do AND

polymerase thực hiện sẽ thành 2 mạch AND kép và c thể thực hiện chu kỳ mới
tạo thành số AND mới theo c p số nhân 2n sau n chu kỳ [14], [25].
C c thành phần cơ bản của phản ứng [14] [25]:

1. AND khuôn dùng trong PCR: thƣ ng không đòi h i c độ tinh khiết
cao lƣợng AND khuôn thay đổi trong khoảng rộng tùy theo phản ứng; AND c
thể biết trƣớc hoặc không biết trƣớc tr nh tự hai đầu.
2. Enzyme AND polymerase bền nhiệt hoạt động tối ƣu ở 72 0C có tác
dụng tháo xoắn phân tách phá b liên kết hydro gi a hai sợi đơn tổng hợp sợi
mới theo quy tắc bổ xung.
3. Mồi: c chiều dài khoảng 4-10 nucleotide đƣợc thiết kế để c thể gắn
vào một số chỗ trên AND nhằm cung c p đầu 3’-OH cho hoạt động của enzyme
polymerase. Nồng độ mồi c giới hạn bởi nếu nồng độ mồi quá cao sẽ làm tăng
gắn mồi nhầm nếu th p quá sẽ gây thiếu mồi cho phản ứng.
4. Đệm PCR: c chức năng cân bằng pH của môi trƣ ng phản ứng trong
suốt chu kỳ nhiệt.
5. dNTP: là tiền ch t tổng hợp AND gồm: dGTP dATP dCTP dTTP.
Nồng hộ dNTP tốt nh t vào khoảng 200-250µMol.

23


6. Nồng độ MgCl2: Cần thiết cho hoạt động của AND polymerase.
7. Một số thành phần khác nhƣ: Gelatin Albumin huyết thanh bò c tác
dụng làm tăng độ ổn định của enzyme.
C c bước tiến hành: Mỗi chu kỳ tiến hành theo 3 bƣớc cơ bản:
8. Bƣớc 1: Biến tính AND khuôn
Là giai đoạn làm tách hai mạch của AND tạo điều kiện cho mồi gắn vào
vị trí bổ xung. Nhiệt độ biến tính từ 920C đến 950C th i gian biến tính phụ thuộc
AND khuôn thƣ ng từ 30s đến vài phút.
9. Bƣớc 2: Lai hay bắt gặp mồi
Trong giai đoạn này nhiệt độ thƣ ng hạ xuống khoảng 36 0C (đối với các
mồi dùng trong RAPD-AND) trong 30s để cho mồi bắt cặp với các sợi đơn tại
tr nh tự bổ xung. Nhiệt độ và th i gian cần thiết cho gắn mồi phụ thuộc vào

thành phần base chiều dài và nồng độ mồi. Nếu nhiệt độ gắn mồi cao làm giảm
gắn mồi nhầm và kéo dài nhầm ở đầu 3’ do đ làm tăng tính đặc hiệu của phản
ứng
10. Bƣớc 3: Kéo dài chuỗi
Đến giai đoạn 3 tăng nhiệt độ lên 720C trong 30s là nhiệt độ thích hợp
nh t cho hoạt động của enzyme AND polymerase bền nhiệt để tổng hợp sợi mới
theo nguyên tắc bổ xung. Tốc độ tổng hợp vào khoảng 35-100 nucleotide một
giây. Th i gian tổng hợp tùy thuộc kích thƣớc AND sản phẩm.
Dựa vào phƣơng pháp PCR ngƣ i ta đã tạo ra nhiều phƣơng pháp phân
tích

AND

mới

nhƣ:

RAPD,

RFLP

(Restriction

Fragment

Length

Polymorphism)…
1.3. . Kỹ thuật RAPD (Random amplified Polimorphism ADN) trong
nghiên cứu đa dạng sinh học [ 5].

Nguyên lý: Dựa trên phản ứng PCR sử dụng một hay nhiều đoạn mồi c
tr nh tự tùy ý gồm 6-10 nucleotide để nhân một đoạn AND giãn xoắn nào đ và
đoạn AND đƣợc nhân lên này c thể phân tách và điện di trên gel đƣợc.

24


Đặc điểm: Kỹ thuật RAPD chỉ sử dụng một mồi đơn – mồi này đ ng vai
trò vừa là mồi xuôi vừa là mồi ngƣợc. Mồi ngẫu nhiên thƣ ng là nh ng đoạn
Oligonucleotide c kích thƣớc nh (5-12 nucleotide) với AND thực vật th đoạn
mồi gồm khoảng 10 nucleotide với yêu cầu tỷ lệ số nucleotide loại G C từ 7080%.
Chọn cặp mồi cần lƣu ý sao cho các mồi chỉ bắt cặp và bám vào hai đầu
đoạn khuôn để đoạn AND gi a các mồi c thể đƣợc nhân lên. Mồi càng ngắn th
khả năng bắt cặp càng cao và càng dễ thực hiện phản ứng PCR mồi càng dài th
kết quả nhân gen càng chính xác. Mồi phải đƣợc thiết kế để c thể nhân bản
ngẫu nhiên các đoạn AND ở nhiều sinh vật khác nhau. Vì vậy sản phẩm nhân
bản ngẫu nhiên thƣ ng c tính đa dạng cao nên đƣợc sử dụng làm dầu chuẩn
AND trong các nghiên cứu c u trúc di truyền đa dạng sinh học… của nhiều đối
tƣợng sinh vật khác nhau.
Tiến hành:
1. Tách chiết AND tổng số nhân AND bằng máy PCR
2. Điện di trên gel agarose hoặc gel polyarylamid.
3. Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng
(NTSYSpc UPGMA Cluster Gelcompar…) lập ma trận các vết.
Các số liệu thu đƣợc cho th y sự gần g i hoặc cách biệt di truyền của các
mẫu nghiên cứu. Hệ số đồng dạng đƣợc tính theo công thức của M. Nei& Li
(1979): Si j = 2Ni j/(Ni + Nj) trong đ :
- Si j: Hệ số đồng dạng
- Ni: Vạch của giống i
- Nj: Vạch của giống j

- Ni j: Vạch của 2 giống i và j
Sản phẩm RAPD của các sinh vật khác nhau trên cùng một mồi là các
đoạn AND c kích thƣớc tr nh tự khác nhau và các đoạn AND c kích thƣớc và
tr nh tự giống nhau. Các đoạn AND giống nhau c tốc độ di chuyển trên gel
agarose bằng nhau nên băng c kích thƣớc bằng nhau và ngƣợc lại. Các cây

25