Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hóa học cây đa tử biển ( limnocitrus littoralis (miq ) sw ) , họ cam ( rutaceae) ở ninh thuận
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (5.19 MB, 77 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq.)Sw.), HỌ CAM
(RUTACEAE)
Ở NINH THUẬN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
HÀ NỘI 2012
-1-
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ THƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
CÂY ĐA TỬ BIỂN (LIMNOCITRUS LITTORALIS (Miq.)Sw.), HỌ CAM
(RUTACEAE)
Ở NINH THUẬN
LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC
CHUYÊN NGÀNH: DL - DHCT
MÃ SỐ: 607310
Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Viết Thân
HÀ NỘI 2012
-2-
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS. NGUYỄN
VIẾT THÂN và TSKH. BÀNH NHƯ CƯƠNG đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp.
Luận văn này là kết quả của quá trình học tập gần 16 tháng liên tục. Do
đó, tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể tất cả các thầy, cô trường Đại học
Dược Hà Nội, những người đã tham gia vào quá trình giảng dạy và trang bị
cho tôi những kiến thức để tôi có thể hoàn thiện luận văn tốt nghiệp này.
Tiếp đến tôi muốn gửi lời cảm ơn của mình tới các thầy cô, các em học
sinh trường Cao đẳng kỹ thuật y tế II và các anh chị trong công ty dược phẩm
Danapha đã tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng
như làm luận văn.
Cuối cùng tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới người thân,
bạn bè đặc biệt là chồng và con gái của tôi đã luôn động viên, giúp đỡ tôi.
Tôi xin chân thành cảm ơn./.
Hà Nội, ngày 09 tháng 09 năm 2012
Học viên
Nguyễn Thị Thương
-3-
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ..................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN...........................................................................3
1.1. Thực vật.................................................................................................... 3
1.1.1. Vị trí phân loại chi Limnocitrus..............................................................3
1.1.2. Đặc điểm chung họ Cam (Rutaceae).......................................................3
1.1.4. Đặc điểm thực vật chi Limnocitrus.........................................................4
1.1.3. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Limnocitrus littoralis Miq.........5
1.2. Thành phần hóa học.................................................................................6
1.3. Công dụng.................................................................................................6
1.4. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học TD họ Rutaceae..7
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.........12
2.1. Đối tượng nghiên cứu………………………………………………….12
2.2. Phương tiện nghiên cứu.........................................................................12
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất..............................................................12
2.2.2. Phương tiện và máy móc.......................................................................12
2.3. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................13
2.3.1. Về thực vật............................................................................................13
2.3.2. Về hóa học.............................................................................................14
2.3.2.1. Định tính các nhóm hoạt chất trong DL bằng phản ứng hóa học......14
2.3.2.2. Chiết xuất…………………………………………………………...14
2.3.2.3. Định tính cắn các phân đoạn.............................................................15
2.3.2.4. Phân lập và nhận dạng chất tinh khiết...............................................16
2.3.2.5. Nghiên cứu về hóa học tinh dầu.........................................................19
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM................................................22
3.1. Nghiên cứu về thực vật………………………………………………...22
3.1.1. Đặc điểm thực vật……………………………………………………..22
-4-
3.1.2. Cấu tạo giải phẫu của cành và lá……………………………………...23
3.1.2.1. Cấu tạo giải phẫu lá………………………………………………...23
3.1.2.2. Cấu tạo giải phẫu cành……………………………………………..24
3.1.3. Đặc điểm vi học………………………………………………………26
3.1.3.1. Bột thân……………………………………………………………..26
3.1.3.2. Bột lá………………………………………………………………..26
3.2. Nghiên cứu về hóa học………………………………………………...27
3.2.1. Nghiên cứu về tinh dầu……………………………………………….27
3.2.1.1. Độ ẩm trong dược liệu………………………………………………27
3.2.1.2. Chỉ số vật lý…………………………………………………………28
3.2.1.3. Hàm lượng tinh dầu…………………………………………………28
3.2.1.4. Định tính, định lượng các thành phần có trong tinh dầu lá, vỏ quả..29
3.2.2. Xác định sơ bộ thành phần hóa học trong lá và thân…………………31
3.2.2.1. Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong thân…………….31
3.2.2.2. Định tính sơ bộ các nhóm hợp chất hữu cơ trong lá……………….37
3.2.2.3. Định lượng và định tính cắn ở các phân đoạn……………………...41
3.3. Phân lập và xác định cấu trúc thành phần hóa học…………………48
3.3.1. Chiết, phân lập các chất trong thân…………………………………...48
3.3.2. Kiểm tra độ tinh khiết của chất LL1…………………………………..51
3.3.3. Chiết, phân lập các chất trong lá……………………………………...52
3.3.4. Xác định cấu trúc LL1………………………………………………..52
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN…………………………………………………56
4.1. Về phương pháp………………………………………………………56
4.2. Về thực vật……………………………………………………………..57
4.3. Về thành phần hóa học……………………………………………….57
-5-
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………….62
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
-6-
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ACN:
Acetonitrile
BuOH:
Butanol
CHCl3:
Cloroform
Dc:
Dịch chiết
Dd:
Dung dịch
MeOH:
Methanol
EtOAc:
Ethylacetat
ESI–MS:
Electrospray Ionization Mass Spectrometry
GC-MS:
Gas Chromatography–Mass Spectrometry
HPLC:
High Performance Liquid Chromatography
1
Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectrometry
H-NMR:
13
C-NMR:
Carbon (13) Nuclear Magnetic resonance
spectrometry
IUCN:
International Union for Conservation of Natural
IR:
Infrared Spectroscop
MS:
Mass Spectrum
Pư:
Phản ứng
SKLM:
Sắc ký lớp mỏng
SKC:
Sắc ký cột
Tt/kl:
Thể tích trên khối lượng
TD:
Tinh dầu
TT:
Thuốc thử
TLC:
Thin Layer Chromatography
UV:
Ultra Violete.
-7-
DANH MỤC HÌNH
TT
Tên hình
Trang
1
Hình 2.1: Sơ đồ chiết phân đoạn các nhóm chất.
18
2
Hình 3.2: Ảnh hình thái cây Đa tử biển.
23
3
Hình 3.3: Ảnh chụp vi phẫu lá cây Đa tử biển.
25
4
Hình 3.4: Ảnh chụp vi phẫu cành cây Đa tử biển.
25
5
Hình 3.5: Ảnh chụp các đặc điểm bột thân cây Đa tử biển dưới
26
kính hiển vi.
6
Hình 3.6: Ảnh chụp các đặc điểm bột lá cây Đa tử biển dưới
27
kính hiển vi.
7
Hình 3.7: Sắc ký đồ phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi
45
ethylacetat : acid acetic : acid formic : nước (10 : 1 : 1 : 2).
8
Hình 3.8: Sắc ký đồ phân đoạn cao ethylacetat với hệ dung môi
46
toluen: ethylacetat: aceton: acid formic (10 : 2 : 2 : 1).
9
Hình 3.9: Sắc ký đồ phân đoạn cắn n – Butanol.
47
10
Hình 3.10: Ảnh chất phân lập từ thân cây Đa tử biển.
49
11
Hình 3.11: Sơ đồ phân lập chất từ phân đoạn Ethylacetat trong
50
thân.
12
Hình 3.12: Sắc kí đồ HPLC mẫu LL1.
51
13
Hình 3.13: Sắc ký đồ phân đoạn MeOH, ethylacetat, n-butanol
52
và LL1.
14
Hình 3.14: Công thức cấu tạo của Scopoletin.
-8-
55
DANH MỤC BẢNG BIỂU
TT
1
Tên bảng
Bảng 1.1: Thành phần và hàm lượng tinh dầu vỏ quả giống Citrus
Trang
8
họ Cam (Rutaceae).
2
Bảng 3.2: Độ ẩm trong lá cây Đa tử biển.
27
3
Bảng 3.3: Độ ẩm trong vỏ quả cây Đa tử biển.
28
4
Bảng 3.4: Chỉ số vật lý của tinh dầu vỏ quả và lá cây Đa tử biển.
28
5
Bảng 3.5:Tỷ lệ % tinh dầu trong lá Đa tử biển.
28
6
Bảng 3.6: Tỷ lệ % tinh dầu trong vỏ quả cây Đa tử biển.
29
7
Bảng 3.7: Kết quả định tính và định lượng (%) các thành phần
29
trong tinh dầu vỏ quả cây Đa tử biển.
8
Bảng 3.8: Kết quả định tính và định lượng (%) các thành phần
30
trong tinh dầu lá cây Đa tử biển.
9
Bảng 3.9: Kết quả định tính các nhóm chất chính trong trong thân
40
và lá cây Đa tử biển bằng các phản ứng hóa học.
10
Bảng 3.10: Hàm lượng cao trong từng phân đoạn chiết thân.
42
11
Bảng 3.11: Hàm lượng cao trong từng phân đoạn chiết lá.
42
12
Bảng 3.12: Kết quả định tính cao các phân đoạn trong thân.
43
13
Bảng 3.13: Kết quả định tính cao các phân đoạn trong lá.
44
14
Bảng 3.14: Chương trình dung môi rửa giải.
51
15
Bảng 3.15: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất LL1.
53
-9-
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam, với vị trí tự nhiên hiếm có, một mặt gắn liền với lục địa, mặt
khác thông với đại dương, lại nằm trong vành đai nhiệt đới gió mùa, khí hậu
có nhiều nét độc đáo và đa dạng, thay đổi từ điều kiện khí hậu nhiệt đới điển
hình ở vùng núi thấp phía Nam, đến khí hậu mang tính chất á nhiệt đới vùng
núi cao các tỉnh phía Bắc thậm chí có những vùng nhỏ đậm sắc ôn đới như Đà
lạt, Sapa... Điều kiện tự nhiên đó thực sự là sự ưu đãi cho đất nước và con
người Việt Nam một hệ sinh thái phong phú và đa dạng, một tiềm năng to lớn
về tài nguyên cây thuốc nói riêng và tài nguyên dược liệu nói chung. Theo kết
quả điều tra khảo sát của các nhà nghiên cứu khoa học đa ngành khác nhau
cho biết, Việt Nam có khoảng 12.000 loài thực vật bậc cao có mạch, đã xác
định tên của 8.000 loài, 600 loài nấm, 800 loài rêu và hàng trăm các loài tảo
lớn [51]. Trong đó có tới gần 4.000 loài thực vật bậc cao và bậc thấp được
dùng làm thuốc, chúng được phân bố rộng khắp cả nước [51]. Nguồn thực vật
phong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá
trị, có hoạt tính sinh học cũng như ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vực khác
nhau của cuộc sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh.
Cây Đa tử biển thuộc họ Cam (Rutaceae), có ở một số nước Đông Nam
Á. Ở Việt Nam, cây mọc ở Trung bộ và Nam bộ đặc biệt là tỉnh Ninh Thuận
[16], [20]. Cây này còn được gọi là cây Cam đường, là dược liệu được sử
dụng tương đối phổ biến trong y học cổ truyền dân tộc Chăm. Nhưng do việc
khai thác sử dụng không hợp lý nên nó đã được tổ chức IUCN đưa vào sách
đỏ thực vật có nguy cơ đe dọa. Mặt khác, hiện nay Đa tử biển đã có tên trong
các tài liệu cây thuốc nhưng chưa được nghiên cứu đầy đủ về dược liệu học.
Chính vì vậy, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành
phần hóa học cây Đa tử biển (Limnocitrus littoralis (Miq.)Sw.), họ Cam
(Rutaceae) ở Ninh Thuận” với các mục tiêu như sau:
- 10 -
1. Nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Đa tử biển.
2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá và thân mẫu nghiên cứu.
3. Nghiên cứu tinh dầu có trong lá và vỏ quả mẫu nghiên cứu.
Để thực hiện mục tiêu đề ra, đề tài được tiến hành với các nội dung sau:
1. Đặc điểm thực vật: Mô tả đặc điểm hình thái, đặc điểm vi phẫu lá,
thân, đặc điểm bột lá, bột thân Đa tử biển. Kiểm định tên khoa học.
2. Thành phần hóa học của lá và thân: Định tính các nhóm chất bằng
phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng đối với cao các phân đoạn của các mẫu
nghiên cứu. Chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc của chất tinh khiết.
3. Nghiên cứu tinh dầu: Tiến hành chiết xuất và định lượng tinh dầu
bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Định tính, định lượng các thành phần có
trong tinh dầu bằng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ. Bên cạnh đó
xác định một số chỉ tiêu lý học (tỷ trọng, chỉ số khúc xạ) của tinh dầu.
- 11 -
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Thực vật:
Qua quan sát đặc điểm hình thái, Đa tử biển là một loài thuộc chi
Limnocitrus Miq., họ Cam (Rutaceae).
1.1.1. Vị trí phân loại chi Limnocitrus.
Theo khung phân loại thực vật của Takhtajan 1987, vị trí phân loại của
chi Limnocitrus như sau [15], [20], [45]:
Giới thực vật: Plantae
Ngành Ngọc lan: Magnoliophyta
Lớp Ngọc lan: Magnoliopsida
Phân lớp Hoa hồng: Rosidae
Liên bộ Cam: Rutanae
Bộ Cam: Rutales
Họ Cam: Rutaceae
Chi Đa tử biển: Limnocitrus.
1.1.2. Đặc điểm chung họ Cam (Rutaceae).
Đặc điểm thực vật
Cây gỗ, bụi, cây cỏ có túi tiết tinh dầu, nhị ngoài dĩa mật, vòng ngoài
thường đối diện với cánh hoa. Lá đơn hoặc lá kép, mọc so le hay mọc đối,
không có lá kèm. Cụm hoa là xim, hoa thường đều, lưỡng tính, mẫu 5, các
thành phần của bao hoa rời. Nhị có vòng ngoài thường đối diện với cánh hoa.
Bộ nhụy thường có 4-5 lá noãn dính liền thành bầu trên, có khi nhiều lá noãn
(15-20), số ô của bầu bằng số lá noãn, mỗi ô có 1-2 hay nhiều noãn đính trung
trụ. Quả nang hay mọng loại cam, có khi quả tụ gồm nhiều quả đại. Hạt
không có nội nhũ [6].
- 12 -
Họ này còn có nhiều tên khoa học khác: Amyridaceae Kunth (1824);
Aurantiaceae Durande; Boroniaceae J.Agardh; Cneoraceae Vest (1818);
Correaceae J.Agardh; Cusparia ceae (DC) Tratt; Dictamnaceae Vest;
Diosmaceae R.Br; Diplolaenaceae J.Agardh; Flindersiaceae (Engl);
Fraxinellaceae Ness; Pilocarpaceae J.Agardh; Ptaeroxylaceae J-F.Leroy
(1960); Pteleaceae Kunth; Zanthoxylaceae Bercht và J.pest [11], [17].
Phân loại
Họ này chia làm 4 phân họ:
+ Rutoideae: Có các lá noãn hoàn toàn tách biệt, nó chỉ liên kết với
nhau ở vòi và đầu nhụy, quả nạc, có các tông sau: Ruteae, Zanthoxyleae,
Boronieae, Diosmeae, Cusparieae [50].
+ Toddaloideae: Các lá noãn dính, quả bao gồm 2-4 quả hạch con [50].
+ Rhabdodendroideae: Các lá noãn hợp nhưng phân biệt bởi đế phình to
+ Aurantioideae: Bầu nguyên và quả lớn [50].
Limnocitrus littoralis Miq. thuộc phân họ Aurantioideae [49].
Đa dạng và sử dụng.
Họ Cam (Rutaceae) có 150/1600 phân bố rộng ở nhiệt đới, cận nhiệt
đới và ôn đới, nhất là Nam phi và Australia. Ở Việt Nam có khoảng 110 loài,
thuộc 30 chi [6], [17]: Acronychia, Aegle, Atalantia, Boenningghausenia,
Citrus, Clausena, Euodia, Feronicella, Fortunella, Glycosmis, Limnocitrus,
Limonia, Luvunga, Maclurodendron, Micromelum, Murraya, Naringi,
Paramignya, Phellodendron, Pleiospermium, Ruta, Severinia, Skimmia,
Tetradium, Thoreldora, Tolddalia, Triphasia, Zanthoxylum
1.1.3. Đặc điểm thực vật chi Limnocitrus.
Cây bụi hoặc cẫy nhỡ, cành nhẵn, có gai mập mạp. Lá đơn, mọc so le,
nhẵn, cứng, dai, phiến lá hình bầu dục hay hình trái xoan ngược mép khía
răng cưa, cuống lá ngắn. Cụm hoa ngù mọc ở đầu cành. Hoa trắng thơm, có 4-
- 13 -
5 cánh không dính liền nhau, hình trứng. Đài hình tam giác, có 4-5 lá đài dính
liền nhau. Bộ nhị có 10 nhị rời nhau, chỉ nhị nhẵn, bao phấn thuôn dài, trên
bao phấn có 15-20 rãnh dọc. Bầu nhụy gần hình cầu, chia 4-5 ô, mỗi ô có 2 lá
noãn. Quả hình cầu hoặc gần hình cầu, khá lớn đường kính 3,5-4cm, lúc non
có màu xanh khi chín chuyển thành màu da cam, vỏ quả mỏng có nhiều túi
tiết tinh dầu, thịt không nhiều, hóa nhầy. Hạt lớn, phẳng hình bầu dục, cứng,
có lớp màng màu trắng bao bọc phía ngoài và có lá mầm màu xanh [49].
Chi Limnocitrus chỉ có 1 loài duy nhất: Limnocitrus littoralis Miq.[20],
[45].
1.1.4. Đặc điểm thực vật và phân bố của loài Limnocitrus littoralis Miq.
Cây nhỡ cao 2m, cành thẳng màu nâu xám, gai to dài 1–2cm. Lá đơn,
mọc so le, nhẵn, cứng và hơi dai, hình bầu dục hay trái xoan ngược, dài 5–
7,5cm, rộng 3-4cm, gân phụ 8-11 cặp nghiêng một góc 40-600 so với gân
chính, có rất nhiều túi tiết tinh dầu. Hơi khía tai bèo ở mép lá, cuống lá hình
trụ có kích thước 3,5-7 x1-1,5mm. Cụm hoa có kích thước 3-4 x 2,5-5cm, đầu
trục cụm hoa phân thành các cống hoa nhỏ dài 2,5-3,5mm có lông trắng mịn.
Dĩa mật hình chén cao 0,5-0,6mm, rộng 1,5-1,6mm. Hoa trắng thơm, có 4-5
cánh rời nhau, nhẵn, hình trứng, dài 7,5–10mm. Đài hình tam giác, dài 23mm, nhẵn không có lông, có 4-5 lá đài màu xanh dính liền nhau. Nhị có 8-10
nhị, chỉ nhị thuôn dài, bao phấn dài và mảnh (4,5-1mm). Nhụy hoa dài 1011mm, bầu nhụy gần hình cầu cao 4,5-5mm, rộng 1,7-2mm, có lông tơ nhỏ
màu trắng ở phía dưới bầu phía trên hầu như không có, chia làm 5 ô, mỗi ô 2
lá noãn, đính noãn trung trụ; vòi nhụy dài 4mm, có các nốt màu nâu nhỏ li ti.
Quả hình cầu, đường kính 3-5cm, lúc non có màu xanh khi chín có màu vàng,
vỏ mỏng chứa nhiều túi tiết tinh dầu, thịt không nhiều và hóa nhầy, chia làm
3-5 ô, mỗi ô chứa 1–2 hạt. Hạt hình cầu, có vỏ lụa màu trắng bao bọc ở phía
ngoài [49].
- 14 -
Phân bố: Cây ưa sống ở những vùng khô và nóng. Phần lớn cây tập
trung ở bờ nam của đảo Java thuộc Indonesia. Ở Việt Nam cây mọc ở Trung
bộ và Nam bộ đặc biệt là tỉnh Ninh Thuận [16], [20], [45].
1.2. Thành phần hóa học.
Ở Việt Nam, cho đến nay, Đa tử biển là đối tượng hoàn toàn mới chưa
có bất kỳ một tài liệu về cây thuốc nào công bố thành phần hóa học.
1.3. Công dụng của Đa tử biển.
Đa tử biển có tác dụng chữa ho, long đờm, hạ sốt, chống viêm và ngăn
chặn sự lão hóa của tế bào da [9], [40]. Dịch chiết Limnocitrus littoralis Miq.
có mặt trong một số công thức mỹ phẩm như: kem làm mờ vết nhăn, kem
chống nắng, kem lót, phấn trang điểm, sữa dưỡng thể [40].
Y học dân gian tộc Chăm sử dụng dược liệu này số lượng lớn trong
nhiều bài thuốc:
• Bài 1: Bài thuốc chữa viêm phế quản [9].
Đa tử biển
20g
Dây chiều vàng
20g
Chữa trị: Ho, ho có đờm, đau cuống họng, sốt, nuốt nước miếng khó,
khò khè khó thở.
Cách dùng: Sắc uống ngày một thang.
• Bài 2: Bài thuốc chữa ho [9].
Đa tử biển
20g
Vỏ sung
20g
Chữa trị: Ngứa cổ, ho, ho khan, ho có đờm, nhiều lúc ho thở khò khè,
chảy nước mũi.
Cách dùng: Ngày sắc 2 thang, mỗi thang sắc 1 lần. Đổ 3 chén nước, sắc
còn 8 phân uống (sắc lửa nhỏ).
- 15 -
• Bài 3: Bài thuốc chữa đau thần kinh tọa [9]
Đa tử biển
20g
Thằn lằn dây
16g
Cỏ chông
16g
Sung rừng
16g
Ma dương
16g
Chanh rừng
16g
Chữa trị: Đau ngang thắt lưng, đau lan xuống mông, xuống đùi, xuống
mặt sau cẳng chân, cúi ngửa không được, đi lại hạn chế.
Cách dùng: Sắc uống ngày một thang.
• Bài 4: Bài thuốc chữa ho [9]
Đa tử biển
30g
Hương nhu rừng
20g
Bình vôi
20g
Lá cam thảo dây
10g
Chữa trị: Đau đầu sổ mũi, ho khan, ho có đờm, ho đau tức ngực, đau rát
cuống họng không ngủ được.
Cách dùng: Ngày uống 1 thang, 1 thang sắc 2 lần. Đổ 3 chén nước, sắc
còn 5 phần.
1.4. Những kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học tinh dầu họ Cam
(Rutaceae).
Trên thế giới, thành phần hóa học tinh dầu vỏ quả Citrus đã được
nghiên cứu từ lâu và rộng rãi. Nhiều công trình đã đi sâu phân tích thành phần
hóa học tinh dầu vỏ quả chi Citrus. Theo các công trình nghiên cứu đã công
bố, trong tinh dầu vỏ quả Citrus có chứa hydrocarbon nhóm monoterpen và
- 16 -
sesquiterpen, hợp chất chứa oxy. Trong đó terpen hydrocarbon chiếm khoảng
95%, nhóm hợp chất chứa oxy chỉ có khoảng 5%.
Ở Việt Nam, Phạm Minh Hoàng và Trịnh Hoàng Hiếu khảo sát tinh
dầu vỏ quả giống Citrus họ Rutaceae bằng GC–MS kết quả thu được trong
các mẫu tinh dầu của Bưởi (Citrus decumana), Cam (Citrus aurantium),
Chanh (Citrus medica), Quất (Citrus japonica) lần lượt có 23, 18, 37, 11
thành phần [18], [19]. Trong đó thành phần chính ở các mẫu nghiên cứu trên
chủ yếu là Limonen.
Trịnh Hoàng Hiếu cũng đã tiến hành khảo sát thành phần hóa học tinh
dầu lá Quất bằng phương pháp GC-MS thấy có 6 thành phần gồm: Elemol
(18%); β-Eudesmol (16%); Epibiciclosesquiphelandren (16%); Limonen
(1,45%); Elemol (17,72%); Guaien (6,65%) [19].
Kỹ sư Nông Ích Thượng nghiên cứu về thành phần hóa học của vỏ quả
và lá Mắc mật (Clausena indica) thấy: hàm lượng tinh dầu trong vỏ quả là
5,55%, có 9 thành phần trong đó chủ yếu là β-Myrcen (70%); lá chứa 2,71%
tinh dầu, gồm có 11 thành phần, trong đó Myristicin (40,37-56,04%) và pcymen-8-ol (18,58-22,45%) là hai thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất [29]. Hàm
lượng tinh dầu trong lá Chanh Việt Nam chỉ ở mức 0,09–0,11%, có chứa
Citral a (24,7%); Citral b (6%); Borneol (5%); Linalylacetat (2,5%);
Benzaldehyd (6%) [4].
Bảng 1.1. Thành phần và hàm lượng tinh dầu vỏ quả giống Citrus họ
Cam (Rutaceae)
TT
Tên cấu phần
Hàm lượng (%)
Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]
1
α-Pinen
0,67
4,36
2,67
3,67
2
β-Pinen
0,47
3,67
6,94
17,14
3
Biciclosesquiphelandren
-
0,28
-
0,13
- 17 -
TT
Tên cấu phần
Hàm lượng (%)
Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]
4
β-Mircen
-
1,40
-
-
5
α-Thujen
-
9,61
-
-
6
Limonen
92,62
52,86
84,86
26,36
7
3-Caren
-
1,60
-
-
8
Terpinen
+
18,39
-
6,39
9
Terpinolen
-
3,26
-
1,00
10
Linalool
+
0,88
0,54
1,04
11
trans-Pinocarveol
-
-
-
0,10
12
β-Citronellal
-
-
-
0,14
13
Terpinen-4-ol
-
0,45
-
-
14
γ-Isopulegol
-
-
0,13
-
15
Carvomenthen
+
0,10
-
-
16
α-Terpineol
+
1,39
0,36
2,07
17
Nerol
-
0,24
-
0,14
18
α-Citral
-
0,16
-
3,37
19
β-Citral
-
0,12
-
2,97
20
Geraniol
-
-
-
1,89
21
Geraniol acetat
-
0,14
-
0,51
22
Caryophylen
-
0,30
-
4,27
23
Decanal
-
-
0,52
0,94
24
β-Citronellol
-
-
0,20
-
25
Perilal
-
-
0,18
-
26
β-Cubeben
-
2,10
3,00
-
27
cis-Caran
-
-
0,20
-
- 18 -
TT
Tên cấu phần
Hàm lượng (%)
Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]
28
γ-Elemen
-
0,40
-
2,02
29
Piperitone
-
-
-
0,12
30
Undecanal
-
-
-
0,09
31
Eremophilen
-
0,18
-
0,13
32
γ-Muurolen
-
0,23
-
0,11
33
Sabinen
-
-
0,08
-
34
β-Cadinen
-
0,11
-
-
35
Copaen
-
-
0,32
-
36
Menthal-1,8-dien-9-ol
-
-
0,41
-
37
α-Bergamoten
+
-
0,19
3,81
38
α-Farnesen
-
-
0,97
7,02
39
Elemen
-
-
-
1,68
40
Nerol acetat
-
-
-
0,21
41
β- Elemen
-
-
-
1,37
42
α-Humulen
-
-
-
0,74
43
β-Santalen
-
-
-
0,34
44
Germacrene D
-
-
-
1,33
45
Isocaryophylen
-
-
-
0,49
46
Cadinen
-
-
0,31
-
47
Elixen
-
-
0,20
-
48
β-cis-Ocimen
-
-
-
1,15
49
α-Selenen
-
-
-
0,54
50
α-Himachalen
-
-
-
0,24
51
Epiglobulol
-
-
-
0,17
- 19 -
TT
Tên cấu phần
Hàm lượng (%)
Quất[19] Bưởi[18] Cam[18] Chanh[18]
52
Tetradecanal
-
-
-
0,24
53
α-Bisabolol
-
-
-
0,56
54
Elemol
0,12
-
-
-
55
β-Eudesmol
0,24
-
-
-
Ghi chú:
(-): Không có.
(+): Có nhưng chưa xác định được hàm lượng.
- 20 -
CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu:
Mẫu nghiên cứu được thu hái tháng 07/2011 tại Ninh Phước, Ninh
Thuận gồm:
- Cây tươi mang hoa để giám định tên khoa học và làm tiêu bản mẫu
khô.
- Cây tươi mang hoa, lá để làm tiêu bản vi học cấu tạo giải phẫu.
- Lá, thân phơi khô, làm nhỏ, bảo quản trong túi nilon kín, để nơi khô
ráo, thoáng mát làm mẫu nghiên cứu thành phần hóa học.
Lá cắt nhỏ để cất tinh dầu thu hái tháng 10/2011 tại Ninh Phước, Ninh
Thuận.
Vỏ quả cắt nhỏ để cất tinh dầu thu hái tháng 05/2012 tại Ninh Phước,
Ninh Thuận.
2.2. Phương tiện nghiên cứu:
2.2.1. Thuốc thử, dung môi, hoá chất:
Các thuốc thử, dung môi, hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu
chuẩn theo Dược điển Việt Nam III, IV.
- Các dung môi: Methanol, Ethanol, Cloroform, Ethylacetat, n–Hexan...
- SKLM: Dùng bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 F254 (Merck).
- Sắc ký cột: Chất nhồi cột là Silicagel pha thường, cỡ hạt 60-200µm
(Merck).
- Các thuốc thử: Dragendorff, Bouchardat…
2.2.2. Phương tiện và máy móc:
- Kính hiển vi Leica Wetzlar GmbH.
- Kính soi nổi Krussoptroni.
- Cân kỹ thuật Precisa.
- 21 -
- Tủ sấy Shellab.
- Máy xác định độ ẩm Satorius.
- Máy cắt vi phẫu cầm tay.
- Máy ảnh kỹ thuật số Cannon.
- Máy sắc ký khí GC/MS–QP 2010 Shimadzu
- Bộ dụng cụ cất tinh dầu.
- Máy chấm mẫu Linomat 5 của Camag (Thụy sỹ).
- Máy đốt bản mỏng (Camag–Thụy sỹ).
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) (Máy: Shimadzu, Nhật).
- SKLM: Bản mỏng tráng sẵn Silica gel GF254 của hãng MERCK (Đức).
- Sắc ký cột: chất hấp phụ là Silicagel GF254 (MERCK).
- Nhiệt độ nóng chảy được đo trên máy đo nhiệt độ nóng chảy
Gallenkamp, Sanyo, Nhật Bản (tại Viện Dược liệu).
- Phổ tử ngoại (UV) được đo trên máy đo quang phổ UV-VIS 1800
Shimadu, Nhật Bản (tại Viện Dược liệu).
- Phổ hồng ngoại (IR) được đo bằng máy đo FT–IR Spectrophotometer
1650–Perkin Elmer (tại Viện hóa học, VAST).
- Phổ khối (ISI) được đo trên máy LC/MS/MS-Waters-API-ISI (Viện
Hóa học, VAST).
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H- và 13C-NMR) được đo trên máy đo
Bruker 500 MHz (Viện Hóa học, VAST).
2.3. Phương pháp nghiên cứu:
2.3.1. Về thực vật.
• Phân tích hình thái thực vật.
- Mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp ghi trong tài liệu phân loại
thực vật [5].
- Phân tích hoa trên kính lúp soi nổi và chụp ảnh bằng máy ảnh kĩ thuật số.
- 22 -
• Nghiên cứu đặc điểm vi học theo các tài liệu [5], [6].
• Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu [5].
- Sử dụng khóa phân loại tới họ, chi và loài trong tài liệu.
- Đối chiếu với mô tả trong các tài liệu chuyên sâu về thực vật [5].
- So sánh đối chiếu với mẫu tiêu bản trong phòng tiêu bản HNIP (Bộ môn
Thực vật–Trường Đại học Dược Hà Nội), HNU (Khoa Sinh–Trường Đại học
khoa học tự nhiên–Đại học Quốc gia Hà Nội) và HN (Viện Sinh thái và Tài
nguyên Sinh vật–Trung tâm khoa học Tài nguyên và công nghệ Quốc gia).
2.3.2. Về hóa học.
2.3.2.1. Định tính các nhóm hoạt chất hữu cơ trong dược liệu bằng phản ứng
hóa học.
Lá và thân cây tươi tách riêng, sấy khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C.
Đem tán nhỏ riêng lá, thân bằng thuyền tán thành bột thô, bảo quản trong túi
nilon kín, để ở chỗ thoáng mát, khô ráo để làm các phản ứng hóa học định
tính riêng đối với từng loại bột dược liệu theo tài liệu [1].
2.3.2.2. Chiết xuất.
* Xác định độ ẩm của dược liệu:
Lấy 5g bột dược liệu để xác định độ ẩm. Bật máy đo độ ẩm, điều chỉnh
nhiệt độ 110°C. Để dược liệu lên đĩa cân và trải đều trên mặt đĩa, đậy đĩa cân
và cho máy tự hoạt động, sau khoảng 10 phút máy sẽ tự động hiện kết quả.
Tiến hành 3 lần, lấy kết quả trung bình.
* Định lượng các cao:
Cân chính xác khoảng 100g dược liệu cành và 100g dược liệu lá Đa tử
biển đã xác định độ ẩm. Ngâm lạnh bằng MeOH trong bình chiết. Thu hồi
dung môi dưới áp suất giảm, thu được cao MeOH toàn phần. Hòa tan cao
MeOH toàn phần vào một lượng vừa đủ nước nóng, thu được dịch chiết nước.
Đem dịch chiết nước lắc lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần
- 23 -
n-hexan, cloroform, ethylacetat, và n-butanol với mỗi loại dung môi lắc kỹ
đến khi nào dung môi trong suốt thu được 4 phân đoạn dịch chiết. Các dịch
chiết được cất thu hồi dung môi ở 60oC, thu được các cao tương ứng. Chiết
theo sơ đồ hình 2.1.
Cao các phân đoạn thu được đem sấy ở nhiệt độ 400C tới khối lượng
không đổi. Quá trình chiết xuất được lặp lại 3 lần. Hàm lượng cao là kết quả
trung bình của 3 lần thực nghiệm. Xác định hàm lượng cao trong từng phân
đoạn bằng phương pháp cân. Hàm lượng cao các phân đoạn được tính theo
công thức.
F=
a
×100
M × (1 − x)
Trong đó:
F:
Hàm lượng chất (%).
a:
Khối lượng cắn (g).
M:
Khối lượng dược liệu đã sấy khô (g).
x:
Độ ẩm của dược liệu.
2.3.2.3. Định tính cắn các phân đoạn.
* Định tính các cao bằng phản ứng hóa học:
Cao ở các phân đoạn lần lượt được tiến hành định tính các nhóm chất
bằng các phản ứng hóa học theo tài liệu [1], [13].
* Định tính các cắn bằng SKLM:
- Tiến hành nghiên cứu sắc ký lớp mỏng đối với các cao của mẫu
nghiên cứu (lá và thân) theo tài liệu [1], [13].
- Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng Silicagel 60 F254 của hãng Merck. Trước
khi chấm, bản mỏng được hoạt hóa 1100 C trong 1 giờ.
- Pha động: Lựa chọn hệ dung môi thích hợp để các chất được tách tốt
nhất.
- 24 -
- Dung môi chấm sắc ký: MeOH.
- Bình sắc ký rửa sạch, sấy khô, lót một lớp giấy lọc cao gần miệng và
kín 3 mặt thành trong của bình.
- Bão hòa dung môi: rót dung môi đã pha ở trên từ từ theo thành bình,
để yên cho dung môi bão hòa.
- Chấm sắc ký:
+ Lấy một lượng mẫu thích hợp vào xilanh, đưa xilanh vào hệ thống
bơm mẫu tự động. Lập file cho mỗi mẫu phân tích. Nhập các thông số cần
thiết: độ rộng vết, số lượng vết, thể tích mẫu chấm.
+ Song song với quá trình bơm mẫu là quá trình làm khô tự động dịch
chiết trên bản mỏng bằng khí nén.
- Triển khai sắc ký:
+ Đặt thẳng bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa dung môi, đậy kín,
để yên, quan sát quá trình tách đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng
khoảng 2cm thì lấy bản mỏng ra, đánh dấu đường dung môi và để khô tự
nhiên trong tủ hốt.
+ Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng trắng và ánh
sáng tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm và sau khi phun thuốc thử hiện
màu.
2.3.2.4. Phân lập và nhận dạng chất tinh khiết.
Sử dụng phương pháp sắc ký cột thông dụng để phân lập các chất trong
phân đoạn ethylacetat. Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng.
Sử dụng các phổ IR, UV, NMR, MS để xác định cấu trúc chất tinh
khiết.
Cột sắc ký được tiến hành trên cột Silicagel pha thường, có kích thước
hạt 60-200µm .
- 25 -
