Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng resveratrol trong cốt khí củ, trong rượu vang nho và trong một số thực phẩm chức năng

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI
HỌC
DƯỢC
HÀ N<«
•
•
•
-C Ỉ3 # R >

NGUYỄN THỊ THú Y HẰNG

NGHIÊN CỨU XÂY Dự NG PHƯƠNG PHÁP
ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL TRONG
Cố T KHÍ CỦ, TRONG RƯỢU VANG NHO VÀ
TRONG MỘT s ố THựC PHẨM CHỨC NĂNG

LUẬN
VĂN THẠC
SỸ
•
•

Dược
HỌC
•
•

CHUYÊN NGHÀNH: KIỂM NGHIỆM THUỐC &

Đ ộc CHẤT

MÃ SỐ: 607315

Người hướng dẫn khoa học: TS. Trần Việt Hùng
PGS.TS. Vũ Đình
TRƯỜNG ĐH ĐỮÍ

THƯVỊ

HÀ NỘI 2010

N gày . X . . . tháng ...£

So ĐKCB .QỊrt.ÕC


LỜI CẢM ƠN
Với lòng kỉnh trọnọ, và biêt ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cám ơn TS. Trần
Việt Hùng - Trưởng Khoa Vật lý đo lường, Viện Kiêm nghiệm thuôc Trung ương và
PGS. TS. Vũ Đình H oàng - Phó tnrởng Phòng Quản lý Khoa học, Trường Đại học
Bách khoa Hà Nội, những người thầy đã tận tình chỉ báo, hướng dẫn cho tôi trong
suốt quá trình thực hiện và hoàn thành luận văn.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới: PGS. TS. Thái Duy Thìn- Trường Đại
học Dược Hà Nội, D S D ương Minh Tân- Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiêm nghiệm
thuốc Trung ương, đã quan tâm, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn.
Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi cũng nhận được sự giúp đỡ quí
báu của phòng quán lý sau Đại học, các thầy cô giáo Trường Đ ại học Dược Hà
Nội, các bạn đồng nghiệp của Khoa Vật lý đo lường- Viện Kiểm nghiệm thuốc
Trung ương đã tạo điều kiện thuận lợi, động viên, giúp đỡ và góp ỷ kiến cho tôi
hoàn thành luận văn.

Đê tài luận văn được hoàn thành với sự trợ giúp của Đe tài K H C N cấp Nhà
nước, thuộc chương trình Hóa dược - mã sổ CNH D .D D T021/10-1 l,tô i xin trân
trọng cảm ơn chủ nhiệm âề tài và nhóm thực hiện đề tài.
Cuối cũng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã động viên,
khích lệ tôi trong suốt quả trình học tập- nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

DS. N G U YỄN THỊ THỦY HẰNG


MỤC LỤC

Trang bìa phụ
Lòi cảm 0’n
Mục lục
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Trang
ĐẬT VẤN Đ È ...............................................................................................................I
PHẦN 1. TỎNG Q U A N ........................................................................................... 3
1.1. TỐNG QUAN VÈ R ESV ERATRO L........................................................... 3
1.1.1. Công t h ứ c .......................................................................................................... 3
1.1.2. Tính ch ất............................................................................................................ 3
1.1.3. ứ n g dụng của resveratrol trong y h ọ c......................................................4
1.2. CÁC THẢO DƯỢC VÀ SẢN PHẨM CHỨA R E SV E R A T R O L........9
1.3. MỘT SÓ HƯỚNG CẢI THIỆN HÀM LƯỢNG
RESVERATROL TRONG CÁC NGUYÊN L IỆ U ......................................... 12
1.4. MỘT SÓ PHƯƠNG PHÁP S Ủ D Ụ N G TRONG PHÂN TÍCH
R ESV ER A TR O L........................................................................................................14
1.5. TÓNG QUAN VÈ PHƯƠNG PHÁP

18

1.5.1. Phương pháp xử lý m ẫu ................................................................................18
1.5.2. Phương pháp phân tích resveratrol bằng sắc ký lỏng
hiệu năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng khối phổ (LC - M S)..............................18
1.5.2.1. Sắc ký long hiệu năng c a o ............................................................................. 18
1.5.2.2. Sắc kỷ lỏng khối p h ổ ........................................................................................ 22

PHẦN 2: ĐỚI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u ..................... 27


2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ THIÉT BỊ NGHIÊN c ứ u .............................. 27
2.2. ĐÓI TƯ Ợ NG , NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u

28

2.2.1. Đối tưọ'ng..............................................................................................................28
2.2.2. Nội dung và phưong pháp nghiên cứu........................................................ 29
2.2.2.1. X ử lý m ẫ u .......................................................................................................... 29
2.2.2.2. Xây dựng chương trình sắc kỹ HPLC- PDA và LC - M S ....................32
2.2.23. Thầm định phương plìáp phân tích đã xây d ự n g ...................................33
2.2.2.4. Định tính và định lư ợ n g................................................................................ 35
2.2.2.5. Tính toán kết quả và x ử lý số liệ u ............................................................... 35
PHẢN 3: KÉT QUẢ TH ỤC N G H IỆ M ................................................................. 37
3.1. ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL BẦNG
SÁC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG C A O ......................................................................37
3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc k ý ................................................................................37
3.1.1.1. Lựa chọn cột sắc kỷ H PLC - P D A .............................................................37
3.1.1.2. Lựa chọn ph a độn g ......................................................................................... 37

3.1.1.3. Lựa chọn bước s ó n g ..................................................................................... 38
3.1.2. Thấm định chương trình sắc ký đã xây d ự n g .......................................... 43
3.1.2.1. Đánh giá tính ph ù hợp của hệ thống......................................................... 43
3.1.2.2. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp .......................................................45
3.1.2.3. Khảo sát độ đ ú n g ............................................................................................ 46
3.1.2.4. Giới hạn định lượng (LOQ) và giới liạn ph át hiện (L O D ).................. 46
3.1.3.

Định lượng resveratrol trong các đối tuọng nghiên c ứ u .................. 48

3.2. ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL BẦNG
SẤC KÝ LỒNG KHỚI P H Ố .................................................................................... 49
3.2.1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký lỏng khối p h ổ .........................................49
3.2.1.1. Điều kiện sắc k ỷ .............................................................................................. 49
3.2.1.2. Xác định điều kiện khối p h ổ ........................................................................50
3.2.2. Thiết lập chương trình LC - M S .................................................................51
3.2.3. Thẩm định phương p h á p ................................................................................57


3.2.4. Định luọng resveratrol trong rượu vang n h o ............................................ 59
PHẦN 4: BÀN L U Ậ N ...................................................................................................62

4.1. ĐÓI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u .......................................................................62
4.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ử u ................................................................ 62
4.2.1. Qui trình xử lý m ẫ u .......................................................................................... 62
4.2.2. Phương pháp HPLC - P D A ............................................................................63
4.2.3. Phương pháp LC - M S ....................................................................................63

4.3. KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u ............................................................................63
KÉT LUẬN VÀ KIÉN N G H Ị....................................................................................65

KÉT L U Ậ N .....................................................................................................................65
KIÉN N G H Ị....................................................................................................................67
TÀI LIỆU THAM K H Ả O .......................................................................................... 68
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIET TẤT
Atmospheric pressure chemical ionization

APCI

Ion hóa hóa học ở áp suất thường
ESI

:

Electrospray Ionization
Kỹ thuật phun điện tử

DAD(PDA)

:

Diode array detector/ Photodiode array
Detector mảng diode

HPLC

:

High Performance Liquid Chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao

LC - MS

:

Liquid Chromatography - Mass Spectrometry
Sac ký lỏng khối phố

LOD

:

Limit of detection
Giới hạn phát hiện

LOQ

:

Limit of quantitation
Giới hạn định lượng

MAE

:

Microwave-assisted extraction
Chiết xuất dưới sự trợ giúp của vi sóng

PGE2

:

Prostaglandin E2

PSE

:

Pressurised solvent extraction
Chiết xuất bằng dung môi chiết áp

RSD

:

Relative Standard Deviation
Độ lệch chuẩn tương đối

SD

Standard Deviation
Độ lệch chuẩn

SIM

:

Selected Ion Monitoring
Chọn lọc ion

SKĐ

:

Sắc ký đồ

SRM

:

Selected Reaction Monitoring
Chọn lọc ion sau phản ứng

TFA

:

Acid trifloroacetic

UV-VIS

:

Ultraviolet - Visible
Phổ tử ngoại- Khả kiến

DANH MỤC CÁC BẢNG

BẢNG

NỘI DUNG

Trang

1.1

Hàm lượng resveratrol trong một số đồ uống

10

1.2

Hàm lượng resveratrol trong sản phẩm từ đậu phộng

10

2.1

Cách pha các dung dịch chuẩn

30

3.1

Khảo sát tỷ lệ pha động

37

3.2

Ket quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

44

3.3

Ket quả khảo sát độ tuyến tính của resveratrol

44

3.4

Khảo sát độ lặp lại của phương pháp

45

3.5

Khảo sát độ đúng của phương pháp HPLC

46

3.6

Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD)

46

3.7

Giới hạn phát hiện và định lượng của resveratrol trong các đối

47

tượne nghiên cứu
3.8

Kêt quả định lượng resveratrol trong nguyên liệu chiết xuất

48

vang nho và viên Thiên Bảo Vang Không Độ
3.9

Ket quả định lưcmg resveratrol trong cao chiết từ c ố t khí củ

48

3.10

Ket quả định lượng resveratrol trong rượu vang nho

49

3.11

Các thông số của khối phổ dùng để xác định resveratrol

52

3.12

Kết quả khảo sát độ lặp lại của hệ thống

57

3.13

Kết quả khảo sát độ tuyến tính của resveratrol

57

3.14

Kết quả định lượng resveratrol trong rượu vang nho

61


DANH MỤC CÁC HÌNH

HÌNH

NỘI DUNG

Trang

1.1

Sơ đồ mô tả hoạt động của gen SIRT-1

6

1.2

Nho M uscadine & rumi chế biến từ loại nho Muscadine

10

1.3

Sơ đồ hệ thống HPLC

21

1.4

Thiết bị LC-M S và nguyên lý của kỹ thuật phân tích ESI-MS

24

2*1

Thiết bị HPLC và LC - MS sử dụng trong nghiên cứu

27

2*2

Mầu viên Thiên Bảo Vang Khône Độ (NC 01)

28

2-3

Mầu rượu vana nho và mầu chiết xuất vang nho W SP0,5

29

3*1

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C2, tỷ lệ pha động (50:50)

37

3.2

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C2, tỷ lệ pha động (60:40)

38

3.3

Phố tử ngoại 3D của resveratrol trong methanol

39

3.4

Phố tử ngoại 2D của resveratrol trong methanol

39

3.5

Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn C2 (10 |ig/m l), tỷ lệ pha động

40

(50:50)
3.6

Sắc ký đồ của mẫu cao CX1, tỷ lệ pha động (50:50)

40

3 .7

Sắc ký đồ của mẫu thử Thiên Bảo Vang Không Độ

41

3.8

Sắc ký đồ của mẫu nguyên liệu chiết xuất vang

nho

41

Resveratrol-WSP0,5
3.9

Sắc ký đồ của mẫu rượu vang nho. Tỷ lệ pha động (50:50)

42

3.10

Sắc ký đồ của mẫu rượu vang nho. Tỷ lệ pha động (60:40)

42

3.11

Sắc ký đồ minh họa tính toán độ cân xứng của píc

43

3.12

Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc

45

của resverartrol

3.13

Sắc ký đồ của duns dịch chuẩn resveratrol 0,06 |ig/ml

3.14

Sắc ký đồ của mẫu rượu vang nho. Pha động MeOH
acetic 0,5% (60:40)

47
- A.

50


3.15

Khảo sát phổ khối của resveratrol ở chế độ + ESI

50

3.16

Khảo sát phổ khối của resveratrol ở chế độ - ESI

51

3.17

SKĐ mẫu C ’2 (1 Ịig/ml) phân tích LC - MS chế độ + ESI SIM

53

229 và SRM 107

3.18

SKĐ mẫu C ’2 (1 M-g/ml) phân tích LC - MS chế độ - ESI SIM

54

227 v àS R M 143

3.19

SKĐ mẫu C ’2 (1 |ag/ml) phân tích LC - MS chế độ + ESI SIM

55

229 và SRM 107, tương ứng với SKĐ hình 3.17
3.20

SKĐ mẫu C ’2 (1 M-g/ml) phân tích LC - MS chế độ - ESI SIM

56

227 và SRM 143 tương ứng với SKĐ hình 3.18
3.21

Đồ thị biếu diễn sự tương quan hồi quy tuyến tính giữa nồng

58

độ và diện tích píc
3.22

Kiểm tra LOD - LOQ bằng dung dịch chuẩn

58

3.23

Sắc ký đồ LC - M S2 của mẫu thử chạy chế độ + ESI (SRM

59

107); SKĐ chưa tích phân và xử lý
3.24

Sắc ký đồ LC - M S2 của mẫu thử chạy chế độ - ESI (SRM
143); SKĐ sau khi đã tích phân và xử lý

60


ĐẶT VÁN ĐÈ

Ngày nay cùng với sự phát triển đi lên của đời sống xã hội, con người ngày
càng quan tâm nhiều hơn đến vấn đề sức khỏe. Vì thế các thực phẩm chức năng bổ
dưỡng và hữu ích càng có cơ hội phát triển. Bên cạnh các sản phẩm có nguồn gốc từ

con đường tống hợp hóa học, sinh học; các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên cũng
thu hút được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu và phát triển ngày càng
mạnh mẽ. Đi kèm với quá trình phát triển chung đó rất cần có sự quan tâm, kiểm
soát về hiệu quả và chất lượng để các thực phấm chức năng thực sự hữu ích đối với
sức khỏe con người. Resveratrol - một hợp chất được biết từ lâu với nhiều đặc tính
ưu việt như phòng ngừa ung thư, bảo vệ tim mạch, giảm các bệnh liên quan đến tuổi
tác như tiểu đường, béo phì, chống oxy hóa, kéo dài tuổi thọ... Từ trước đến nay đã
có rất nhiều công trình nghiên cứu và ứng dụng về resveratrol kể cả ở Việt Nam và
nước ngoài. Đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà nước (CNHD.ĐT 021/10-11) do
PGS.TS Vũ Đình Hoàng chủ trì với nhiệm vụ nghiên cứu công nghệ chiết tách
Resveratrol từ nguồn thực vật Việt Nam đang được tiến hành (2010 - 2011).
Hiện nay trên thị trường có một số chế phấm chứa resveratrol từ c ổ t khí củ
(viên nang mềm M adosna- Tập đoàn dược phẩm Viễn Đông) hoặc từ chiết xuất
vang nho (viên nang cứng Thiên Bảo Vang Không Độ- Công ty Dược phẩm Đông
Á). Tiêu chuấn chất lượng của các sản phẩm này công bố có resveratrol nhưng các
công ty này lại không có phương pháp kiểm tra chất lượng chúng. Do đó việc xây

1


dựng phương pháp định tính, định lượng hoạt chất resveratrol trong các sản phẩm
trên phục vụ công tác quản lý chất lượng là hết sức cần thiết.
Nhàm góp phần thực hiện đề tài cấp Nhà nước nói trên đồng thời đánh giá chất
lượng một số sản pham có chứa resveratrol đã nêu, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu:
"NGHIÊN

CỨU

XÂY

DỤNG
•

PHƯƠNG

PHÁP

ĐỊNH
•

LƯỢNG
•

RESVERATROL TRONG CÓT KHÍ c ủ , TRONG RƯỢU VANG NHO VÀ
TRONG MỘT SÓ TH Ụ C PHẨM CHỨC NĂNG
Đe tài gồm 2 mục tiêu cụ thể như sau:
1. Xây dựng phương pháp định tính, định lượng resveratrol bàng sắc ký lỏng hiệu
năng cao (HPLC) và sắc ký lỏng khối phổ (LC - MS).
2. Tiến hành định tính, định lượng resveratrol trong c ố t khí củ, trong rượu vang nho
và trong một sô thực phẩm chức năng.

2


PHẦN 1: TỎNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VÈ RESVERATRO L
1.1.1. Công thức
- Tên khoa học: trans 3, 5, 4'- Trihydroxystilbene, hay 3, 4', 5-Stilbenetriol;
hay trans- resveratrol; hay (E)-5-(p- Hydroxystyryl) resorcinol.
- Công thức hóa /iợc|39|’[531

- Công thức phân tử: Ci4H 120 3
- Phân tử lượng: 228,25
1.1.2. Tính chất
+ Resveratrol là một chất không màu, tan trong benzen, tan trong ethanol
50mg/ml, tan tốt trong một số dung môi như dimethylsulfoxid, acetonitril.
+ Tan rất ít trong nước: ~ 0,03 mg/ml.

+ Nhiệt độ nóng chảy: 124°c.
+ Thông thường resveratrol thường tồn tại dưới hai dạng cis và trans, resveratrol
ở dạng trans khi gặp nhiệt, hoặc tia tử ngoại thì biến thành dạng cis. Resveratroỉ là
một stilben có nối đôi dễ bị không khí và ánh sáng phân huỷ. Phần lớn resveratrol
trong thực vật tồn tại dưới dạng glucoside - với tên gọi là piceid, thường gấp 4-5
lần resveratrol dạng tự do (xem hình dưới)[39] [53].

3


-O H

0H

Piceid

1.1.3. ứ n g dụng của resveratrol trong y học
Resveratrol là một polyphenolic được tìm thấy trong một số lượng lớn các loài thực
vật (ít nhất 72 loài) mà một lượng lớn trong số chúng là hợp phần trong chế độ ăn
của con người bao gồm: cốt khí củ, dâu tằm, lạc, nho và rượu vang đỏ .... c ấ u trúc
hóa học của resveratrol được xác định là trans 3,5,4 trihydroxystilbene. Từ nhiều
năm nay resveratrol đã được nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Resveratrol được giả

định như là một nhân tố quan trọng trong việc ngăn neừa các quá trình bệnh lý như
là quá trình viêm, chứng vữa xơ động mạch, stress oxy hóa, chất sinh ung thư. Kết
quả khảo sát trên súc vật thí nghiệm cho thấy nó có nhiều tác dụna, trên nhiều loại
bệnh tật nguy hiểm, bảo vệ hệ tim mạch, phòng bệnh thần kinh (Alzheimer,
Parkinson), phòng và điều trị được nhiều dạng ung thư, kể cả một số ung thư đã di
căn, chống virus, chống nấm, chống viêm, chống oxy hóa, chống béo phì, tăng
cường thê lực và kéo dài tuổi thọ. Nhiều nhà khoa học còn cho rằng: Resveratrol là
hy
tu y ế n

vọng

sống

của

người

bệnh

tiểu

đường,

ung

thư

tiền

liệt

['3ni9],[22M24],[26],[50],[51|

Resveratrol và bệnh ung thư
Các nghiên cứu trong phòng thí nghiệm gần đây chỉ ra rằng resveratrol có tác dụng
điều trị khả quan nhiều loại ung thư khác nhau như ung thư vú, ung thư tiền liệt
tuyến, ung thư dạ dày, ung thư tuyến giáp, các khối u ác tính và u nguyên bào thần
kinh...C ác tác dụng ức chế tăng trưởng của resveratrol được thực hiện gián tiếp
thông qua việc ngăn chặn sự hoạt hóa của một vài yếu tố sao chép, bao gồm NFkappaB, A P -l,E g r-l (loại hoạt chất có nhiệm vụ bảo vệ các tế bào ung thư chống lại
các liệu pháp tiêu diệt chúng); ức chế các men protein kinaza[l5][l9]'[22| [3ll [361'[45].


Resveratroỉ và bệnh Alzheimer
Hợp chất resveratrol chứa trong rượu vang đỏ có tác dụng chống độc thần kinh do
beta-amyloid. Beta-Am yloid peptide (Abeta) là một chất gây độc thần kinh, đã được
xác định gây chết tế bào ở mức độ cao trong suốt thời gian bị bệnh Alzheimer.
Resveratrol, một polyphenol tự nhiên, được tim thấy chủ yếu trong rượu vang đỏ,
có tác dụng bảo vệ tim. Một lượng vừa phải rượu vang tương quan với việc giảm
nguy cơ mắc bệnh Alzheim er nên một hiệu quả bảo vệ thần kinh bổ sung được xem
như là của resveratrol. Nó duy trì sự sống của tế bào và có hoạt tính chống oxy hoá
bằng cách tăng cường glutathion làm sạch các gốc tự do nội bào|5]'[131’[20] |48].
Chống lão hóa

về khả năng

chống lão hóa, resveratrol tác động lên enzym bảo vệ sự sống của

tế

bào, mà enzym này có tác dụng kéo dài thời gian các tế bào cần phải có để sửa chữa
ADN bị hỏng. Resveratrol cũng được xác định trên việc kéo dài tuổi thọ của chuột.
Việc ảnh hưởng của các chất bố sung resveratrol đến quá trình lão hóa ở người chưa
được xác định.
Resveratrol

kéo

dài

tuổi thọ

của nhiều

loài

khác

nhau

như

nấm

men

(Saccharomyces cerevisiae), giun tròn (Caenorhabditis elegans) và ruồi giấm
(Drosophila m elanogaster). Đối với các sinh vật này, tuổi thọ kéo dài phụ thuộc vào
Sir 1, đây là một enzym deacetyl được bảo tồn nhằm tăng cường các tác dụng có lợi
của quá trình hạn chế calo. Resveratrol tạo ra các thay đổi liên quan đến khả năng

kéo dài tuổi thọ, bao gồm tăng sự nhạy cảm với insulin, các mức độ yếu tố -1 tăng
trưởng giống insulin (IGF-1) bị suy giảm, tăng hoạt tính của men protein kinaza
hoạt hoá AMP (AM PK) và chất đồng kích hoạt gamm a thụ thể hoạt hoá sản sinh tế
bào peroxisome 1 alpha (PGC-1 alpha), số lượng các ty thể tăng và chức năng vận
động được tăng cườngíl3ỉ'f201'15211531.

5


Exercise, low n u trie n t condition

I
NAP

\

/N A D B

Resveratrol

R e s v e r a t r o l i n h i bi t s a c e t y l a t i o n a n d
i n c r e a s e s t he p e r c e n t a g e of
activated type P G C - l g .

Ac e ty Ia ti o ry^ S iR T I^ ^ r —

^

PGC- I t t

Activated type

Inativated ty p e

Gene Expression;
Metabolism activation, increase in insulin sensitivity, or
decrease ỉn serum lipid feve!
Fig. 3 Exam ple of Actions o f the SlRT* 1 Gene

Hình 1.1: Sơ đồ mô tả hoạt động của gen SIRT-1|S2]
Kháng nấm
Resveratrol có tác dụng chống nấm mạnh, chống lại các loại nấm gây bệnh ở người
trong khoảng nồng độ 10-20 |ig/ml. Sự tiêu diệt các tế bào nấm C.albicans

bởi

resveratrol đã được xác định bằng phương pháp quét kính hiển vi điện tử. Các kết
quả này đưa ra giả thuyết rằng resveratrol có thể được sử dụng như là chất điều trị
nhiễm nấm ở người^35^ 51^.
Ngăn chặn tái tạo virus cúm
Trong các thí nshiệm nuôi cấy tế bào, resveratrol đã ngăn chặn quá trình tái tạo
virus cúm, đạt hiệu quả lớn nhất 3 giờ sau khi phơi nhiễm cúm. Resveratrol đạt hiệu
quả nhỏ hơn nhưng vẫn đáng kể khi điều trị được tiến hành bắt đầu 6 giờ sau khi
nhiễm, tuy nhiên tại thời điểm 9 giờ sau khi bị nhiễm, resveratrol không có tác
dụng[40].

6


Giảm sụ oxy hóa và tăng trưỏìig các tế bào biếu mô sắc tố võng mạc người

Nghiên cứu chỉ ra răng: Quá trình trên tác độne thông qua ức chế men kinaza điều
chỉnh tín hiệu ngoại bào[l61'|2ll'[341.
Hiệu quả kháng viêm của Resveratrol đối với các tế bào biểu mô phối
Nghiên cứu chỉ ra rằng: cả resveratrol và quercetin đã ức chế quá trình sao chép phụ
thuộc

NF-kappaB-,

AP-1-

và

CREB

đến

một

mức

lớn

hơn

so

với

glucocorticosteroid, dexam ethasone12’1.
Abeer H. Harb và cộng sự đã thử nghiệm hiệu quả chống viêm của resveratrol trên

chuột và nhận thấy: quá trình giảm viêm phụ thuộc liều; sự ức chế này có ý nghĩa
thống kê sau 3h và lh với liều 13,40 mg/kg tương ứng. Hiệu quả chống viêm của
resveratrol đươc tìm thấy một cách độc lập ở tuyến thượng thận nhưng có thể liên
quan tới việc ức chế các nhân tố gây viêm và gốc tự do. Một vài ý kiến khác cho
rằng hiệu quả chổng viêm của resveratrol là do ức chế hoạt tính cyclooxygenase,
làm giảm tạo prostagladin E2 (PGE2); đồng thời ức chế con đường phát sinh NO,
làm giảm quá trình tổng hợp NO trên các đại thực bào và các tế bào nuôi cấy có
hoạt tính.
Đi kèm với hiệu quả chống viêm, resveratrol còn được đánh giá ở quá trình giảm
đau trong đó resveratrol được cho rằng làm giảm số lượng các cơn đau có phụ thuộc
liều. Khi các mô, tế bào tổn thương bị kích thích, chúna, giải phóng ra các thành
phần như H+, PG E2 hay 5-hydroxytryptamine (5-HT) và gây đau tại chỗ. Bản thân
acid acetic có thể gây đau, cùng lúc đó, nó kích thích mô giải phóng PGE2 gây đau
hơn. Resveratrol tạo ra chống lại quá trình tiếp nhận cảm giác đau thông qua ức chế
có chọn lọc cyclooxygenase-1 và cyclooxygenase-2 (COX1 và COX2). Thêm vào
đó, resveratrol còn được báo cáo về khả năng ức chế sản xuất prostaglandin E2 và
dọn sạch gốc tự do ở các tế bào vi thần kinh đệm có hoạt tính. Một khả năng khác,
việc mở kênh Ca2+- K + bởi resveratrol có thể làm giảm thêm sự khử cực dẫn đến
chống lại quá trình nhận cảm đau[l2].
Chống lại các rối loạn tim mạch do oxy hóa

7


Sự sản sinh mạnh mẽ các chất chống oxy hóa tế bào và các enzym giai đoạn 2 bằng
resveratrol trong các tế bào cơ tim: bảo vệ chống lại tổn thương do oxy hóa và ái
điện tử. Đe nghiên cứu các tác dụng bảo vệ tế bào với các tốn thương này, các tế
bào H9C2 được ủ bằng resveratrol. sau đó cho tiếp xúc với men oxy hóa xanthin
(XO)/xanthin, 4-hyđroxy-2-nonennal hoặc doxorubicin. Thêm vào đó, điều trị dự
phòng bằng resveratrol đã dần tới việc giảm đáng kể sự tích tụ các gốc tự do nội bào

ROS gây ra bởi X O /xanthin1' 2^ 13) [241.
Ngoài những tác dụng nói trên, resveratrol còn được nghiên cứu với nhiều hiệu quả
tiềm tàng khác như các tác dụng trên cơ trơn và trên huyết ápll2],[13].
Hiệu quả chống co thắt
Nghiên cứu này chỉ ra rằng, sự giãn của ruột hồi theo chiều dọc và cơ vòng bàng
quang phụ thuộc vào nồng độ của resveratrol. Kết quả này cũng phù hợp với những
nghiên cứu về hiệu quả giãn cơ của resveratrol trên các cơ trơn riêng biệt. Cơ chế sự
nới lỏng của resveratrol không được chỉ ra từ những thử nghiệm này nhưng được
quan sát từ những trường hợp tương tự. M ột vài nghiên cứu khác chỉ ra rằng nitric
oxide nới lỏng ruột hồi và bàng quang thông qua việc làm tăng tổng hợp cGMP.
Mặt khác, resveratrol kích thích sự giãn mạch thông qua kích thích NO/cGM P ở
chuột và nghiên cứu còn chỉ ra ràng resveratrol không kiểm soát hệ thống
GC/cGMP ở cơ trơn mạch vành và gây ra một đáp ứng giãn m ạch1'21.
Hiệu quả của resveratrol trên huyết áp
Trong nghiên cứu này, resveratrol làm giảm huyết áp động mạch ở những chuột
được gây tê có huyết áp bình thường khi tiêm tĩnh mạch. Mặc dù một hợp phần có
hiệu quả của resveratrol trên cả huyết áp tâm thu và huyết áp tâm trương là tạm thời
nhưng nói chung, không trở về được mức cơ bản ban đầu. Hiệu quả hạ áp của
resveratrol trong nghiên cứu này do tăng tạo NO từ màng trong hệ mạch. Thêm vào
đó, resveratrol giúp khôi phục hoạt tính eNOS trên động mạch chủ của chuột và
bình thường hóa huyết áp. Sự phát sinh NO trên những tế bào màng trong bởi eNOS
có vai trò lớn trong việc kiểm soát huyết áp.

8


Tóm lại, những kết quả này chứng minh rằng trans-reveratrol có hiệu quả chống co
thắt, hạ áp, chống viêm, giảm đau khi thử nghiệm trên chuột và thành phần này có
thể phát triển thành m ột liệu pháp điều trị từ thực vật hữu ích trong việc kiểm soát
huyết áp động mạch, viêm, đau. c ầ n tiến hành thêm các thử nghiệm để làm sáng tỏ

cơ chế hoạt tính của hợp phần này1121'1131'1491.
Tác dụng phụ của Resveratrol
Một vấn đề đặt ra là: với nhiều tác dụng hữu ích như thế, resveratrol có các tác dụng
phụ không? Tuy nhiên, các nghiên cứu về resveratrol trên người rất ít nên chúng tôi
không biết được đầy đủ các phản ứng phụ hay các lợi ích của resveratrol tại thời
điếm này. Tính đến hết tháng 11 năm 2003, không có các phản ứng phụ của
resveratrol được đề cập tới trong các tài liệu y học.
1.2. CẢC THẢO DƯỢC VÀ SẢN PHẨM CHỨA RESVERATROL
Resveratrol được tìm thấy ở nhiều cây trong thiên nhiên mà những tính chất dễ thấy
nhất của các loài này là chống nấm. Một số loài thực vật chứa hàm lượng đáng kể
resveratrol như là: nho, nhất là nho xạ, cốt khí củ, cây lạc, cây việt quất. Ngoài ra
resveratrol còn tìm thấy trong một vài loại thông như Scots pines và eastern white
p i n e [6],[33].[44],[52]_

Resveratrol có nhiều trong các loại nho, tập trung nhiều nhất ở vỏ và hột. Loại nho
có tên là muscadine (Vitis rotiindifolia) hay nho xạ, có nguồn gốc ở miền đông nam
Hoa Kỳ, từ Delaware tới vịnh Mexico; vỏ và hột của chúng cho một hàm lượng
resveratrol cao gấp nhiều lần. Hàm lượng resveratrol trong nho thay đổi tùy theo
giốns nho, thố nhưỡng nơi trồng và khả năng kháng nấm của chúng. Giống nho nếu
ít bị nấm thì hàm lượng resveratrol cao hơn loại bị nấm [6]'[29]'[53].

9


Hình 1.2 : Nho Muscadine & rượu chế biến tò loại nho Muscadine
Hàm lượng resveratrol trong một số đồ uống được trình bày ở bảng dưới đây:
Bảng 1.1: Hàm lượng resveratrol trong một số đồ uống
í
Đô uông

Resveratrol (mg/1)

Rượu vang làm tò loại nho Muscadine (Mỹ)

1 4 ,1 -4 0

Rượu Vang đỏ (Tây Ban Nha)

1,14-8,69

Nước ép nho (Tây Ban Nha)

0,43 - 3,52

Rượu Vang trăng (Tây Ban Nha)

1,98-7,13

Resveratrol còn được tìm thấy trong đậu phộng với hàm lượng được trình bày ở
bảng 1.2 dưới đây:
Bảng 1.2: Hàm lượng resveratrol trong các sản phẩm từ đậu phộng
Sản phâm

Resveratrol (mg/100g)

Đậu phộng tươi

0,069-0,178

Đậu phộng đã nâu chín

0,178-0,711

Bơ đậu phộng

0,015-0,050

Resveratrol được sản xuất từ nhiều loài thực vật trong thiên nhiên như: Nho, lạc,
thông, vỏ bạch dương, cốt khí củ.. Mỗi nguyên liệu có một ưu thế riêng, trong đó,
Cốt khí củ (Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc, họ rau răm, Polygonaceaeyl được
ưa chuộng vì đây là loài thực vật dễ trồng, hàm lượng dược chất cao, đã có tò lâu

10


trong đông y không có độc tính. Resveratrol cũng được tống hợp hóa học, sản phẩm
tổng hợp chủ yếu dùng để sản xuất mỹ phẩm. Quá trình tổng hợp cần các hóa chất
đắt tiền, phức tạp nhưng hiệu quả kinh tế không cao nên ít dùng. Vì vậy, từ các
■

nguyên liệu thiên nhiên, resveratrol được sản xuất bằng chiết xuất dung môi, một số
tài liệu còn kết hợp với enzym hoặc siêu âm. Hiện nay trên thị trường có nhiều loại
chế phẩm có hàm lượng resveratrol khác nhau16^ 29^.
Rễ Cốt khí khô là thuốc nổi tiếng ở Trung Quốc cũng như ở Nhật Bản. Nó được sử
dụng rộng rãi trong điều trị nhiễm trùne da, bệnh lậu, chốc đầu chân và bệnh tăng
lipid máu. Các thành phần hóa học đa dạng được phân lập từ loài thực vật này bao
gồm: anthraquinone, stilbene, flavonoid và các phenol khác (đáng quan tâm nhất là
resveratrol và piceid). Các thành phần này được làm sáng tở dựa trên những bằng
chứng về hóa học và kỹ thuật quang phổ bao gồm những phương pháp như cộng
hưởng từ hạt nhân hai chiều[l8).

Liu Y và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng chịu nhiệt và cơ chế phản ứng chuyển
dạng đồng phân của trans-resveratrol bằng phương pháp HPLC và LC-ESI/MS. Cột
sắc ký pha đảo Hypersil-ODS được sử dụng cùng với hệ dung môi pha động chứa
methanol - nước (60:40) thêm 0,05% trifluoroacetic cho HPLC; 0,1% acid formic
và 5 mmol/1 ammonium formate cho LC-ESI/MS. Detector mảng diode thiết lập tại
bước sóng 300 nm. Khối phổ ion âm được tiến hành. Kết quả cho thấy: sau khi bảo
quản trong thời gian 600 giờ, nồng độ trans-resveratrol giảm nhẹ ở điều kiện dưới

4°c, giảm 5% và 10% khi báo quản ở nhiệt độ thấp hơn 20°c, 40°c. Thêm vào đó,
phản ứng chuyên dạng đông phân trans và cis- resveratrol với bước sóng kích thích
254 nm và 365 nm được thử nghiệm bởi phương pháp LC-ESI/M S cho thấy sự
đồng phân hóa dựa trên trạng thái p và một số phản ứng thứ cấp xẩy ra triệt đ ế 37'.
Ớ một nghiên cứu khác, Fulvio Mattivi và cộng sự đã phân lập từ rượu vang đỏ và
mô tả đặc tính của trans- resveratrol, cis- resveratrol, trans-resveratrol Í3-Dglucopyranoside và cis-resveratrol B-D-glucopyranoside. Chiết xuất từ vỏ nho và
tính chất hóa học thay đổi của bốn thành phần trong quá trình làm rượu vang thông
thường đã được kiểm soát cho thấy mối quan hệ gần gũi về tính chất giữa các thành

11


phần. Các nhân tố ảnh hưởng của mô hình, như là nồng độ ethanol, sự thủy phân
chia tách một nửa phân tử glucose trong glucoside và dạng đồng phân trans/cis
được thảo luận dựa trên các số liệu thí nghiệm.
Resveratrol (3,5,4 - trihydroxystilbene) và các sản phẩm trùng họfp của nó là các
thành phần tự nhiên, tìm thấy trong đa dạng các họ thực vật. Nho và các sản phẩm
liên quan có thể là loại thực phẩm quan trọng nhất chứa những thành phần này.
Hydroxy hóa stilbene đã được thử nghiệm cả ở vai trò sinh học chống lại các nguồn
bệnh và cả ở những đặc tính dược lý của chúng. Họ Vitis được mô tả bởi sự có mặt
một lượng lớn các thành phần tương tự trong hột, lá và rễ. Gần đây, Siemann và
Creasy giả thuyết về một mối liên quan giữa sự giảm lắng đọng lipid trong gan

chuột bởi trans-resveratrol và các nghiên cứu lâm sàng về mức giảm lipid trong
huyết thanh trên những người uống rượu vang. M ột trong những cơ chế dược lý
dựa trên việc chứng minh sự ức chế quá trình oxy hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp
bởi các phenolic. Lợi ích có thể có của rượu vang trên sức khỏe con người do sự có
mặt của resveratrol còn nhiều tranh cãi, bởi vì, trong nhiều trường hợp, nồng độ ước
định rất thấp, vì thế không thể có một lượng đủ theo nguyên tắc hoạt động với một
mức sử dụng rượu vang thông thường[241'[25],[47].
Các nguyên liệu dùng đế chiết xuất thường có hàm lượng resveratrol thấp. Thông
thường hiệu suất chiết resveratrol từ c ố t khí củ đạt 0,0378% - 0,115%; trong bột
chiết từ phế thải nho đạt hàm lượng 0,81%. Vì hàm lượng resveratrol trong các
nguyên liệu trên rất thấp nên để định lượng chúng cần sử dụng các phương pháp có
độ chính xác và độ nhạy cao như phương pháp HPLC, LC - MS đồng thời phải ứng
dụng các phương pháp chiết xuất tối ưu để tạo ra hàm lượng resveratrol ở mức cao
n h ấ t [6].[8].[28|

1.3.

MỘT SÓ

HƯỚNG

CẢI THIỆN

HÀM

LƯỢNG

RESVERATROL

TRONG CÁC NGUYÊN LIỆU

Resveratrol được sử dụng rộng rãi trong y học, thực phẩm và mỹ phẩm bởi những
đặc tính dược lý của chúng. Tuy nhiên, resveratrol có mặt trong thực vật với lượng
ít hơn rất nhiều so với dạng glucoside piceid (có thể lên tới 14,5 m g/l)[27] của nó -

12


dạng có sinh khả dụng thấp hơn nhiều. Theo truyền thống, aglycone được tạo ra từ
quá trình thủy phân bằng acid hay enzym từ dạng glucoside của nó; nhưng điều kiện
khắc nghiệt, ô nhiễm acid trong phản ứng thuỷ phân và chi phí enzym cao làm hạn
chế trong phát triền công nghiệp của phương pháp này. Trong nghiên cứu này, H.
Wang và cộng sự đã tiến hành lên men thành công p. cuspidatum bởi nấm A.
oryzae; trong suốt quá trình đó, piceid được chuyển thành resveratrol với lượng cao
nhất 1,35% trans-resveratrol, cao gấp 3,6 lần so với lượng thu được từ thảo dược
thô chiết xuất dưới sự trợ giúp của vi sóng. Lượng trans-resveratrol tạo ra cao gấp
3,1 lần sau thời gian ủ 24h. Do đó, chuyển hóa sinh học là phương pháp tốt hơn để
làm tăng lượng resveratrol bởi lượng tạo ra cao hơn và điều kiện dễ dàng hơn.
Nguyên liệu thô sau khi được thủy phân bằng dung dịch H 2S 0 4 (1% w/w) hoặc
enzym cenllulase được

ủ

trong bình rung

ở 25°c, 150 vòng/phút.

Dịch thu được

đem ly tâm và pha loãng trong methanol, tiến hành phân tích bàng HPLC sử dụng
cột pha tĩnh Kromasil c

18

(5 |im, 4.6

X

250 nm); pha động là nước (A) và acetonitril

(B). Trans-piceid và trans-resveratrol được tách theo chương trình thời gian sau: 0-7
phút: 31% B; 7-15 phút: 31-60% B, nhiệt độ phòng, tốc độ dòng 0,7 ml/phút. Quá
trình này được thực hiện ở bước sóng 306 nm, cả trans-piceid và trans-resveratrol
đều hấp thụ tối đa127'. Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến lượng trans-resveratrol tạo
ra như nhiệt độ, thời gian ủ, hoạt tính enzym ... Vì thế, cần phải kiểm soát tất cả các
yếu tố này và tối ưu hóa các quá trình sinh học để làm tăng lượng trans-resveratrol.
Chiết xuất 2 pha tan trong nước dưới sự hỗ trợ của vi sóng được thử nghiệm để phát
hiện các thành phần có hoạt tính, bao gồm piceid, resveratrol và emodin trong c ố t
khí củ. Hệ thống hai pha tan trong nước chứa 25% (w/w) ethanol, 21% (w/w)
(NH4)2S 0 4 với lượng cân bằng piceid và một lượng gấp 1,1; 1,9 lần resveratrol và
emodin tương ứng, so với hiệu quả của chiết xuất dưới sự hồ trợ của vi sóng và
chiết xuất nhiệt ngược dòng. Ba tiến trinh riêng biệt; chiết xuất, lọc, cô đặc do đó
tạo ra một lượng resveratrol lớn hơn với chi phí thấp hơn. Đây là một phương pháp
hữu ích tiềm năng để tách và tinh chế các sản phẩm mục tiêu. Chiết xuất cổ điển 3
thành phần trên là chiết xuất nhiệt ngược dòne bàng ethanol. Tuy nhiên, chúng cần

13


một lượng ethanol lớn hơn, đồng thời cũng tốn thời gian hon. Thêm vào đó, quá
trình lọc và cô đặc là cần thiết trước khi tinh chế bằng sắc ký cột. Kết quả lượng sản

phẩm tạo ra ít hơn với chi phí cao hơn. Chiết xuất dưới sự hỗ trợ của vi sóng (MAE)
là một phương pháp lựa chọn thay thế cho chiết xuất các thành phần từ thảo dược
bởi những lợi ích của nó như thời gian chiết xuất ngắn, sử dụng ít dung môi và đem
lại hiệu quả cao.
Chiết xuất 2 pha tan trong nước (ATPE) sử dụng hệ thống dây chuyền alcol/muối
được áp dụng đế tinh chế các hợp phần tự nhiên với chi phí thấp, dễ thu hồi alcohol
bằng cách bay h ơ i... Hệ EtOH / (NH4)2S 0 4 được lựa chọn để tách riêng resveratrol
từ chiết xuất của Cốt khí củ và tinh chế resveratrol đạt mức đỉnh 34,29%.
Trong nghiên cứu này, dịch chiết pha loãng được phân tích bằng HPLC, pha tĩnh là
cột C Ị8 Kromasil (5 |im, 4,6

X

250 nm); pha động chứa nước (A) và acetonitril (B).

Trans-piceid, trans-resveratrol và emodin được tách theo chương trình sau: 0-15
phút: 31-50% B; 15-20 phút: 50-98% B; 20-25 phút: 98% B tại nhiệt độ phòng, tốc
độ 0,7ml/phút. Quá trình tách rửa được ghi lại theo chương trình: 0-18 phút tại 306
nm, khi cả trans-piceid và trans-resveratrol hấp thụ cực đại, 18-30 phút tại 254 nm
với sự hấp thụ cực đại của em odin[28'.
Trong hơn mười năm qua, ngày càng có sự quan tâm nhiều hơn đến việc sử dụng
các kỹ thuật chiết xuất dưới sự trợ giúp của vi sóng (MAE) và dung môi chiết áp
(PSE) trong các phòng thí nghiệm phân tích. Một số thử nghiệm chứng minh rằng
cả hai kỹ thuật trên cho phép giảm dung môi tiêu thụ và rút ngắn thời gian chiết
xuất, trong khi lượng tạo ra trong chiết xuất của những phép phân tích này là ngang
bằng hoặc thậm chí nhiều hơn so với các phương pháp thông thường.
MAE và PSE nổi bật lên như là các phương pháp hấp dẫn so với các phương pháp
chiết xuất thông thường như Soxhlet, chiết ngâm, sắc, chiết xuất ngược dòng, siêu
âm và một số trường hợp chưng cất nh iệt... *17].
1.4.

MỘT

SỐ

PHƯƠNG

PHÁP

sử

RESVERATROL

14

DỤNG

TRONG

PHÂN

TÍCH


Có 2 phương pháp chính được sử dụng trong phân tích định lượng resveratrol:
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao và phương pháp sắc ký lỏng khối phổ. Một
số nghiên cứu đã công bố cả ở Việt Nam và trên thế giới đều tập trung vào 2
phương pháp này.
Tao Yi, Hao Zhang và Zongwei Cai đã ứng dụng phương pháp HPLC với bộ phận
phát hiện photodiode mảng và ESI/MS được phát triển để phân tích định tính và

định lượng các thành phần hóa học chính trong thân rễ khô c ố t khí củ. Dựa trên sắc

ký đồ riêng rẽ trên cột Altima c 18 sử dụng pha động acid acetic và acetonitril, 9
thành phần, bao gồm stilbene, stilbene glucoside, anthraquinone, anthraquinon
glucoside, được xác định bằng phân tích ESI/MS trực tuyến và 7 thành phần được
xác định bằng HPLC - PAD. Các giá trị đầy đủ của phương pháp bao gồm độ nhạy,
độ tuyến tính, độ lặp lại và độ tìm lại đã được kiểm soát. Khoảng tuyến tính của
nồng độ từ 1-200 mg/L với R2 > 0,9999; trong khi giới hạn phát hiện trong khoảng
0,51 đến 1,57 ng. Độ lặp lại được xác định và giá trị RSD trong khoảng 1,79 %. Độ
thu hồi khoảng 96,0-100,1% với giá trị RSD < 2,2%. Năm mầu c ố t khí củ từ những
vùng khác nhau được nghiên cứu đế phát triển phương pháp. Các thành phần chính
piceid, resveratrol, emodin-8-O-B-D- glucoside và emodin được lựa chọn để cung
cấp các chỉ số cho việc xác định chất lượng các thuốc thảo dược.
Phân tích HPLC - PAD tiến hành trên máy Agilent (Palo Alto, CA.USA) tại bước
sóng 29Ơ nm, cột Altim a c

18

(250x4,6 mm, 5|im). Pha động chứa 0,5% acid acetic

trong nước (A) và acetonitril (B) theo chương trình: 10-40% B trong 0-35 phút, 40100% B trong 35-60 phút với tốc độ dòng 1 ml/phút tại nhiệt độ 30°c. Phân tích
HPLC - ESI/MS sử dụng cả 2 chế độ ion dương và ion âm, tốc độ 7 L/phút[42].
Phương pháp HPLC cũng được sử dụng để định lượng trans-resveratrol và chất
chuyển hóa của nó trong nước tiểu và trong huyết tương người. Nghiên cứu mô tả
phương pháp HPLC pha đảo, bước sóng phát hiện 325 nm để xác định mức
resveratrol và 6 chất chuyến hóa chính trong huyết tương và trong nước tiểu người
tình nguyện sau khi uống một liều lg. Sử dụng pha tĩnh cột Atlantis Ci8,3^m; đệm
ammonium acetate và methanol, chứa 2% propan-2-ol. Khoảng phát hiện từ 5

15

ng/mL đến 500 ng/mL trong huyết tương, (5-1000 ng/mL) trong nước tiểu. Độ thu
hồi trung bình của resveratrol là 58 ± 3%. Những kết quả trên cho thấy, đây là một
phương pháp nhanh, nhạy và chính xác để phân tích resveratrol và các chất chuyển
hóa của chúng trong nước tiểu và huyết tương người cho các nghiên cứu dược động

Ngoài ra, Phương pháp HPLC - ƯV/DAD cũns được ứng dụng trong phân tích
thường qui rượu vang đỏ, vỏ nho và các sản phẩm phụ làm rượu vang để xác định
trans-resveratrol và quercetin trong chúng. Đặc biệt, hàm lượng cao quercetin được
tìm thấy trong bã rượu vang, vì thế có thể sử dụng các sản phẩm phụ này như một
nguồn phenolic hữu ích cho việc thúc đẩy sức khỏe con người1231.
Những nghiên cứu gần đây về resveratrol tập trung hướng các nhà khoa học ở khía
cạnh hiệu quả bảo vệ tim mạch và chống ung thư của nó. Các thử nghiệm khoa học
minh chứng một cách rõ ràng rằng resveratrol giúp ngăn ngừa các bệnh về tim mạch
và ung thư. Tuy nhiên, có rất ít nghiên cứu công bổ về khả năng hấp thu và thải trừ
của resveratrol, xác định sản phẩm chuyến hóa và hiệu quả của chúng trên gan.
Nghiên cứu của Yoxing được thiết lập để thử nghiệm in vitro về chất chuyển hóa
của resveratrol trên microsome gan chuột ở 37°c. Phương pháp sắc ký lỏng kết nối
khối phổ và sắc ký lỏng đa kênh điện hóa (LC - MS và LC - EC) được ứng dụng để
xác định chất chuyển hóa chính của nó. Kết quả cho thấy: với chế độ MS ion âm,
bên cạnh đỉnh resveratrol tại m/z 227, còn quan sát thấy đỉnh của chất chuyển hóa
tại m/z 243 tương ứng với sản phẩm chuyển hóa piceatannol. MS 2 lần xuất hiện
thêm một số mảnh ion tại m/z 225, 201. 175 và 159 tương ứng với các mảnh được
quan sát trên sắc đồ của piceatannol chuẩn và dung dịch chuyển hóa. Nghiên cứu sử
dụng điện cực Ag/AgCl với nguồn năng lượng từ +400 đến 700 mV, cột Supecol
Discovery C8, pha động chứa acid acetic 0,5 % - acetonitrile (85:15, v/v), tốc độ
dòng 0,4 ml/phút cho cả hai hệ thống sắc ký lỏng với detector điện hóa và khối phổ.
Như vậy, đây là 2 phương pháp hiệu quả trong nahiên cứu chất chuyển hóa in vivo
của resveratrolf4ỏl.

16