báo cáo thí nghiệm vi sinh thực phẩm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC VÀ THỰC PHẨM



BÁO CÁO THỰC HÀNH
THÍ NGHIỆM VI SINH THỰC PHẨM

GVHD: Ts. Trịnh Khánh Sơn
NHÓM 1
SVTH:

MSSV

Trần Thị Như Hảo

16116126

Hà Thị Trinh

16116187

Trương Thị Thu

16116176

Trần Thị Sao Mai

16116148

Nguyễn Thị Yến

16116200

Hoàng Ngọc Thương

16116179

Lớp thứ 3,5,7 – tiết 15

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2018


MỤC LỤC
Bài 1: TIÊU BẢN GIỌT TREO VÀ TIÊU BẢN GIỌT ÉP..................................................3
Bài 2: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN..............................................................................6
BÀI 3: NHUỘM GRAM...........................................................................................................8
Bài 4: NHUỘM BÀO TỬ.......................................................................................................13
Bài 5: KĨ THUẬT PHÒNG ẨM (QUAN SÁT NẤM SỢI)..................................................16
Bài 6: KỸ THUẬT CẤY RIA.................................................................................................19
Bài 7: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN..............................23
Bài 8: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ NẤM MEN, NẤM MỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC................................................................................................................27
Bài 9: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VI KHUẨN HIẾU KHI BẰNG PHƯƠNG PHÁP
ĐẾM KHUẨN LẠC................................................................................................................31

1


DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1: Tiêu bản giọt ép của nước dưa cải chua ở độ phóng đại ×1000................................3

Hình 1. 2: Vi khuẩn hình que trong nước dưa cải muối chua nhuộm bằng crystal violet
được quan sát ở độ phóng đại ×1000........................................................................................................ 6
Hình 1. 3: Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm (phải)......10
Hình 1. 4: Kết quả nhuộm bào tử............................................................................................................. 13
Hình 1. 5: Nấm sợi.......................................................................................................................................... 16
Hình 1. 6: Hệ sợi của nấm........................................................................................................................... 17
Hình 1. 7: Kết quả sau khi cấy men bánh mỳ ( bên trái), Yakult (bên phải) lên môi trường.
............................................................................................................................................................................... 19
Hình 1. 8: Thạch đứng sau khi nuôi cấy bằng mẫu Yakult..............................................................19
Hình 1. 9 a-b: Thạch đứng sau khi nuôi cấy bằng nấm men.........................................................20
Hình 1. 10: Thạch nghiêng sau khi nuôi cấy bằng nấm men.........................................................21
Hình 1. 11: Ống nghiệm dương tính....................................................................................................... 23
Hình 1. 12: So sánh ống nghiệm dương tính và ống nghiệm không dương tính...................24
Hình 1. 13: Ống nghiệm dương tính........................................................................................................ 25
Hình 1. 14: Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch với độ pha loãng mẫu ..............................................27
Hình 1. 15: Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch có độ pha loãng mẫu lần lượt là .........................28

2


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. 1: Kết quả so sánh vi khuẩn lactic nhuộm Gram và nhuộm đơn bằng crystal violet
và safranin O..............................................................................................................................9
Bảng 1. 2: Tỉ lệ các thành phần có trong cấu trúc của thành tế bào vi khuẩn Gram dương
và Gram âm (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)...............................................................11
Bảng 1. 3:Số ống dương tính..................................................................................................24
Bảng 1. 4: Số ống dương tính ở các nồng độ...........................................................................25
Bảng 1. 5: Số ống dương tính ở các nồng độ...........................................................................25
Bảng 1. 6: Số khuẩn lạc đếm được ở các độ pha loãng.......................................................29
Bảng 1. 7: Bảng kết quả...........................................................................................................32

3


Bài 1: TIÊU BẢN GIỌT TREO VÀ TIÊU BẢN GIỌT ÉP
1. Mục đích
Quan sát được hình dạng, kích thước và cách sắp x ếp c ủa tế bào vi sinh v ật s ống
trong môi trường lỏng.
Quan sát khả năng di động của vi sinh vật trong môi tr ường l ỏng, t ừ đó phân
biệt được chuyển động tự thân và chuyển động Brown.
2. Kết quả thí nghiệm
Kết quả làm tiêu bản thu được hình ảnh của hệ vi sinh vật trong n ước d ưa c ải
muối chua bằng việc sử dụng kính hiển vi quang học nền sáng. Trong đó, có nhi ều nh ất
là những vi khuẩn hình que có độ dài ngắn khác nhau, trong suốt (đ ộ t ương ph ản v ới
nền sáng thấp). Các vi khuẩn này đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi.
Các vi khuẩn này không di động, có sự dịch chuy ển hỗn loạn so với v ị trí ban đ ầu
do sự chuyển động của các phân tử nước kéo theo.

Hình 1. 1: Tiêu bản giọt ép của nước dưa cải chua ở độ phóng đại ×1000
Kết quả quan sát sự chuyển động của vi khuẩn trong mẫu nước dưa cải chua:
/>3. Nhận xét và giải thích
Muối dưa là một hình thức lên men quen thuộc nhờ hoạt động c ủa vi khu ẩn
lactic acid (*). Vi khuẩn lactic và vi khuẩn gây thối ban đ ầu có th ể cùng phát tri ển, sau
một thời gian lượng acid lactic được tích lũy làm ức chế sự phát tri ển c ủa nhóm vi
khuẩn gây thối (Nguyễn Lân Dũng, 2003). Sự hiện diện của axetic acid và pH th ấp c ủa
môi trường có lợi cho sự phát triển của vi khuẩn lactic acid.

4

(*) Các vi khuẩn lactic acid được xếp chung vào họ Lactobacteriaece. Các vi
khuẩn lactic không đồng nhất về mặt hình thái (vi khu ẩn d ạng que ng ắn, que dài l ẫn
các vi khuẩn hình cầu), Gram dương, không tạo thành bào tử và hầu hết không di động.
Vì thế, hình ảnh thu được trên tiêu bản giọt treo và tiêu bản gi ọt ép là c ủa vi
khuẩn lactic acid. Các vi khuẩn này có chuy ển động Brown, h ầu nh ư không di đ ộng. Các
vi khuẩn này chỉ dịch chuyển hỗn loạn gần vị trí ban đầu là do s ự chuy ển đ ộng c ủa các
phân tử nước kéo theo.
Tiêu bản giọt treo và tiêu bản giọt ép cho phép quan sát vi sinh v ật s ống trong
môi trường lỏng nên ta có thể thu được hình dạng và s ự di động c ủa vi sinh v ật m ột
cách chân thực nhất.
4. Bàn luận
Tiêu bản giọt treo và tiêu bản giọt ép cho ta thấy d ễ dàng cách di chuy ển c ủa vi
sinh vật sống trong môi trường chất lỏng. Đây là phương pháp đ ơn gi ản và ti ện l ợi
nhất để tìm hiểu về hình dạng và sự chuyển động của vi sinh vật. Tuy nhiên, do kích
thước vi khuẩn quá bé và hầu như trong suốt nên để thu được hình thái chính xác c ủa
vi khuẩn ta cần có các phương pháp khác.
Để phân biệt chuyển động Brown và chuyển động tự thân của vi sinh vật trong
tiêu bản giọt treo và tiêu bản giọt ép, ta cần quan sát xác định:



Quãng đường vi khuẩn di chuyển trong một khoảng thời gian.
Hướng di chuyển của vi khuẩn so với hướng dịch chuy ển của các phân t ử ch ất
lỏng.
Có thể so sánh chuyển động Brown của vi khuẩn lactic trong n ước d ưa c ải mu ối

chua với chuyển động tự thân của vi khuẩn trong nước thịt thối được quan sát b ằng
tiêu bản giọt treo để phân biệt sự khác nhau giữa hai loại di chuyển của vi sinh vật.
Chuyển động của vi khuẩn có trong nước thịt thối:
/>Khi vi sinh vật quan sát được có di chuy ển tự thân, cần có các ph ương pháp khác đ ể xác

định cơ chế di chuyển của vi khuẩn. Những vi khuẩn di chuy ển thật s ự có th ể di
chuyển nhờ tiên mao (flagellar motion), di chuy ển theo ki ểu xoắn ốc (corkscrew-type
motion) hoặc uốn khúc (bending-type motion) hoặc tr ượt nh ẹ nhàng (gliding motion).

5


Ngoài ra, trong mẫu tiêu bản còn có những vật chất có hình d ạng và cách di chuy ển
khác với vi khuẩn lactic. Tuy nhiên những vật chất này không ph ải đ ối t ượng quan sát
và không đủ cơ sở để đưa ra những kết luận về chúng.
Để thực hiện tiêu bản gọt treo ta cần lưu ý một số điều sau:
 Đặt vị trí quan sát tại phía rìa giọt nước vì vi khuẩn tập trung nhi ều ở khu vực
này.

 Tiêu bản giọt treo quan sát được sự chuyển động của vi sinh vật d ễ dàng h ơn

và quan sát được các tế bào vi khuẩn có kích thước lớn.
 Nhờ có một lớp gờ Vaseline giữ ẩm, tiêu bản gi ọt treo có th ể quan sát và gi ữ
mẫu vi sinh vật được lâu hơn.
Trong khi đó, tiêu bản giọt ép có một số ưu điểm và hạn chế như:
 Dụng cụ dễ kiếm, thao tác đơn giản, chuẩn bị mẫu nhanh.
 Quan sát được hệ vi sinh vật có trong mẫu tự nhiên.
 Tiêu bản dễ bị khô do chịu ảnh hưởng của nhiệt độ và đèn chi ếu sáng nên
không giữ được lâu.
Đồng thời, khi sử dụng kính hiển vi quang học nền sáng cho tiêu bản gi ọt treo và
tiêu bản giọt ép, cần điều chỉnh nguồn sáng ở cường độ yếu để những vi sinh v ật trong
suốt có sự tương phản với nền sáng để dễ quan sát.
5. Tài liệu tham khảo
Lê Văn Việt Mẫn (2006). Thí nghiệm Vi sinh vật Thực phẩm, NXB. ĐH Quốc gia TP
Hồ Chí Minh.

Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003). Vi sinh vật học.
NXB Giáo dục.
Webleyd, D. M. (1953). A Simple Method for Producing Microcultures in Hanging
Drops with special reference to Organisms Utilizing Oils.Macaulay Institute for Soil
Research, Craigiebuckler, Aberdeen 66-71
Anthony W. Thomas (2011). Making a wet mount microscope slide. Microbehunter
Microscopy Magazine, 1: 5-6.

6


Bài 2: TẠO VẾT BÔI VÀ NHUỘM ĐƠN
1. Mục đích
Tạo vết bôi giúp cố định vi sinh vật lên phiến kính, vi khuẩn bắt màu thuốc nhuộm tốt
hơn để dễ dàng quan sát hình thái và đặc điểm cấu trúc của vi sinh vật.
Nhuộm vi sinh vật bằng phẩm nhuộm có thể xác định được chính xác hình thái, sự sắp
xếp, kích thước của vi khuẩn không màu, cũng như xác định được đặc điểm cấu tạo của tế bào
vi khuẩn dựa trên những thuốc nhuộm chuyên biệt.
2. Kết quả thí nghiệm
Quá trình tạo vết bôi và nhuộm đơn được tiến hành trên nước dưa cải muối chua chứa
vi khuẩn lactic acid.

Hình 1. 2: Vi khuẩn hình que trong nước dưa cải muối chua nhuộm bằng crystal
violet được quan sát ở độ phóng đại ×1000
Tạo vết bôi và nhuộm đơn trên nước dưa cải muối chua cho thấy hình ảnh của các vi
khuẩn hình que có độ dài ngắn khác nhau, bắt màu tím đen của thuốc nhuộm crystal violet.
Các vi khuẩn đứng riêng lẻ (A) hoặc xếp thành chuỗi (B), ngoài ra còn có trong hình
ảnh trường hợp vi khuẩn xếp thành một cụm các tế bào hình que song song.
3. Nhận xét và giải thích
Mẫu nước dưa cải muối chua chứa nhiều vi khuẩn lactic acid. Những vi khuẩn này có

hình que, đứng riêng lẻ hoặc tạo thành chuỗi. Căn cứ vào hình dạng, những vi khuẩn quan sát
được được gọi là bacillus (số nhiều là bacilli), khi chúng đứng thành một chuỗi được gọi là
streptobacilli.

7


Trường hợp quan sát được vi khuẩn xếp thành cụm các tế bào hình que song song do
các vi khuẩn bước vào quá trình nhân đôi và phân chia. Khi đó, kích thước của vi khuẩn sẽ
nhỏ hơn vi khuẩn trong giai đoạn sinh trưởng nên hình ảnh thu được các vi khuẩn hình que có
kích thước khác nhau.
Trong quá trình tạo vết bôi và nhuộm đơn, vết bôi dày sẽ làm vi khuẩn xếp chồng lên
nhau dẫn đến khó quan sát chính xác hình dạng, kích thước và cách sắp xếp của vi khuẩn.
4. Bàn luận
Các thành phần trên tế bào vi sinh vật rất nhạy cảm với thuốc nhuộm. Phẩm nhuộm
được sử dụng để nhuộm vi khuẩn có những ion tự do có khả năng kết hợp kết hợp với các
thành phần của tế bào để tạo thành muối có khả năng bắt màu và giữ màu phẩm nhuộm rất
tốt.
Những lỗi thường gặp trong quá trình tạo vết bôi và nhuộm đơn:
 Tạo vết bôi dày, lượng mẫu vi sinh vật nhi ều sẽ làm vi sinh v ật x ếp ch ồng lên
nhau



5.

Thời gian nhuộm quá ngắn hoặc qúa dài đối với từng loại thuốc nhuộm
Lượng thuốc nhuộm dư không được rửa trôi toàn bộ.
Hơ quá nóng làm phá vỡ cấu trúc tế bào vi khuẩn
Tài liệu tham khảo

Lê Văn Việt Mẫn (2006). Thí nghiệm Vi sinh vật Thực phẩm, NXB. ĐH Quốc gia TP
Hồ Chí Minh
M.R.Adams and M.O.Moss.(2000). Food Microbiology. Second Edition. The Royal
Sociaty of Chemistry.
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty.(2003), Vi sinh vật học, NXB
Giáo dục.
TS Trịnh Khánh Sơn (2018). Các kĩ thuật cơ bản trong thực nghiệm vi sinh vật học.
NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
Michael J. Leboffe and Burton E. Pierce. 2010. Microbiology Laboratory Theory &
Application.Third Edition. Morton Publishing Company
Churchman, J.W. (1912). The selective bactericidal action of gentian violet, Journal
of Experimental Medicine, 16 (2): 221–247, plates 21–31

8


BÀI 3: NHUỘM GRAM
1. Mục đích
Phân biệt các loài vi khuẩn thành hai nhóm Gram d ương và Gram âm. T ừ đó phân
biệt sự khác nhau về thành phần hóa sinh trên thành tế bào.
2. Kết quả thí nghiệm
Thuốc nhuộm
Kết quả
Crystal violet ( nhuộm
đơn)
(thuốc nhuộm thứ nhất):
vi khuẩn có màu tím đen

Safranin O (nhuộm đơn)

(thuốc nhuộm thứ hai) vi
khuẩn có màu hồng

Crystal violet + safranin O
(nhuộm Gram): vi khuẩn
giữ được màu tím đen (B)
và màu hồng (A)

Bảng 1. 1: Kết quả so sánh vi khuẩn lactic nhuộm Gram và nhuộm đơn bằng crystal violet
và safranin O
Trong quy trình nhuộm Gram, crystal violet đóng vai trò là thuốc nhu ộm th ứ
nhất, Safranin O đóng vai trò là thuốc nhuộm thứ hai.

9


Mẫu vi sinh vật là nước dưa cải muối chua chứa chủ y ếu là vi khu ẩn lactic acid. K ết
quả sau khi nhuộm Gram cho thấy vi khuẩn lactic có khả năng bắt màu và gi ữ màu c ả
hai loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản.
3. Nhận xét
Vi khuẩn lactic acid là những vi khuẩn Gram dương. Tuy nhiên, k ết qu ả thí nghi ệm
thu được cho thấy vừa có vi khuẩn Gram dương và Gram âm trong mẫu vi khu ẩn lactic.
Những vi khuẩn Gram dương bắt màu tím đen của Crystal violet, vi khu ẩn Gram âm b ắt
màu hồng của dung dịch Safranin O.
Do cấu tạo của thành tế bào vi khuẩn Gram âm và Gram d ương khác nhau nên có
khả năng bắt màu và giữ màu phẩm nhuộm khác nhau. Thành t ế bào vi khu ẩn Gram
dương có lớp Peptidoglycan dày (chiếm 50% khối lượng khô) được gắn ch ặt v ới nhau
và có nhiều acid teichoic. Peptidoglycan là một loại polyme x ốp, không tan, khá c ứng và
bền vững, bao quanh tế bào như một mạng lưới. Thành phần của Peptidoglycan gồm Nacetylglucosamine (NAG), N-acetylmuramic acid (NAM) và tetrapeptide g ồm c ả lo ại D và
L acid amine. Tetrapeptide trên các chuỗi peptidoglycan sẽ liên k ết v ới nhau t ạo c ấu

trúc chắc chắn. Trong khi đó, vi khuẩn Gram âm có cấu trúc thành t ế bào khá ph ức t ạp:
trong cùng là một lớp peptidoglycan mỏng, một không gian chu ch ất và l ớp màng ngoài
có chứa phospholipid và lipopolysaccharides dễ bị hòa tan trong chất t ẩy màu.

(phải)

Hình 1. 3: Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn Gram dương (trái) và Gram âm

10


Bảng 1. 2: Tỉ lệ các thành phần có trong cấu trúc của thành tế bào vi khuẩn Gram dương
và Gram âm (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2003)
Thành phần
Peptidoglycan
Acid teichoic
Lipoit
Protein

Tỉ lệ % đối với khối lượng khô của thành tế bào vi khuẩn
Gram dương
Gram âm
30-95
5-20
Cao
0
Hầu như không có

20

Không có hoặc ít

cao

Trong quá trình nhuộm Gram, cả vi khuẩn Gram âm và Gram d ương đều có kh ả
năng bắt màu thuốc nhuộm thứ nhất crystal violet. Dung dịch ch ất c ẩn màu iodine có
khả năng tạo phức không tan crystal violet- iodine. Khi b ị r ửa b ằng c ồn, thành t ế bào vi
khuẩn Gram dương bị hydrate hóa làm giảm khoảng cách của các phân t ử trong màng.
Đồng thời lớp peptidoglycan dày và nhiều t ầng xếp chồng giúp các ph ức crystal violet –
iodine không bị rửa trôi và giữ được màu thuốc nhuộm ban đầu. Trong khi đó, các vi
khuẩn Gram âm không có khả năng giữ lại phức này do lớp lipid ngoài thành t ế bào d ễ
bị hòa tan trong chất tẩy, làm trôi thuốc tẩy thứ nhất. L ớp peptidoglycan m ỏng lúc này
bị lộ ra ngoài nhưng không có khả giữ được phức crystal violet – iodine. Lúc này, thuốc
nhuộm bổ sung (Safranin O) được sử dụng để nhuộm màu vi khuẩn Gram âm.
Trên các tế bào vi khuẩn Gram dương “già”, thành tế bào vi khuẩn bị thoái hóa và
khả năng vận chuyển các ion dương của acid teichoic kém nên ph ẩm nhu ộm th ứ nh ất
có khả năng bị rửa trôi cùng với thuốc tẩy và bắt màu ph ẩm nhu ộm th ứ hai. Vì v ậy, khi
quan sát mẫu nhuộm Gram vi khuẩn lactic trong nước dưa cải chua, ngoài nh ững vi
khuẩn nhuộm màu tím đen còn có một số vi khuẩn có màu tím.
Ngoài ra, do thời gian khử màu bằng chất tẩy màu quá lâu ho ặc trong quá trình t ạo
vết bôi làm biến dạng thành tế bào vi khuẩn nên vi khu ẩn Gram d ương còn có th ể xu ất
hiện dưới dạng Gram âm.
4. Bàn luận
Trong kĩ thuật nhuộm Gram, các tế bào vi khuẩn Gram d ương có th ể xu ất hi ện d ưới
dạng Gram âm, nhưng các tế bào Gram âm thì không bao gi ờ xuất hi ện d ưới d ạng Gram
dương.

11

Khi quan sát tiêu bản nhuộm Gram, ngoài phân bi ệt thành ph ần hóa sinh và c ấu t ạo
của thành tế bào còn có thể xác định được hình dạng, kích th ước và s ự s ắp x ếp c ảu các
tế bào vi khuẩn. Đây là công cụ hữu dụng nhất và được sử dụng th ường xuyên trong thí
nghiệm vi sinh.
Thành tế bào vi khuẩn có chức năng chủ yếu:
 Duy trì ngoại hình của tế bào.
 Hỗ trợ sự chuyển động của tiên mao.
 Giúp tế bào thích nghi với các điều kiện môi trường ( nhi ệt độ, áp su ất th ẩm
thấu,…).
 Cần thiết cho quá trình phân cắt của tế bào, cản trở sự xâm nhập của các
chất độc hại vào tế bào.
 Liên quan đến khả năng sinh độc tố và gây hại của tế bào vi khuẩn.
Vì thế, việc xác định vi khuẩn thuộc Gram dương hoặc Gram âm cho th ấy cái nhìn
tổng quát về cấu trúc, hình thái, một số đặc điểm và khả năng gây bệnh của vi khu ẩn.
Trong kĩ thuật nhuộm Gram, cần lưu ý một số điểm sau:
 Sử dụng hai loại thuốc nhuộm khác màu, thông thường là crystal violet và một
loại phẩm nhuộm khác dễ phân biệt với màu tím đen.
 Luôn sử dụng giống vi khuẩn “trẻ” được nuôi cấy trong vòng 24 gi ờ để cho
kết quả tốt nhất,
 Lưu ý thời gian nhuộm màu và thời gian tẩy màu, loại thuốc tẩy sử dụng,
 Tạo vết bôi vi khuẩn đúng cách.
5. Tài liệu tham khảo
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003). Vi sinh vật học.
NXB Giáo dục. 27-30.
TS Trịnh Khánh Sơn (2018). Các kĩ thuật cơ bản trong thực nghiệm vi sinh vật
học. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh
Lê Văn Việt Mẫn. 2006. Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm. Nhà xuất bản ĐH
Quốc gia TP.HCM.
M.R.Adams and M.O.Moss.2000. Food Microbiology. Second Edition. The Royal
Sociaty of Chemistry.

12


Bài 4: NHUỘM BÀO TỬ
1. Mục đích
Nhuộm bào tử nhằm giúp chúng ta quan sát được hình d ạng và vị trí c ủa bào t ử
trong tế bào sinh dưỡng.
2. Kết quả thí nghiệm

Bào tử nằm ở tâm tế bào
sinh dưỡng

Hình 1. 4: Kết quả nhuộm bào tử
3. Nhận xét
Sau khi nhuộm với malachite green thì các thành phần khác c ủa tế bào vi khu ẩn
sẽ bị tẩy màu và sẽ được nhuộm bổ sung với chất nhuộm bổ sung safranin, còn n ội bào
tử dưới tác nhân nhiệt sẽ được nhuộm và có màu xanh.
Kết thúc quá trình nhuộm, ta thấy được hình ảnh của bào t ử có màu xanh n ằm ở
bên trong, còn tế bào sinh dưỡng ở ngoài có màu hồng.

13


Về hình thái của nội bào tử quan sát dưới kính hiển vi: bào t ử n ằm ở tâm c ủa t ế
bào thuộc kiểu vi khuẩn Bacillus. Đây là kiểu vi khuẩn gram dương, hình que.
4. Bàn luận
Do tính không thẩm thấu của áo bào tử nên với những ph ương pháp nhu ộm
thông thường không làm cho bào tử bắt màu. Bào t ử có đặc điểm là khó b ắt màu h ơn t ế
bào dinh dưỡng, xong khi bắt màu rồi thì lại rất khó bị t ẩy màu, trong khi đó t ế bào

dinh dưỡng bị tẩy màu nhanh chóng.
Chính vì vậy, để bào tử có thể bắt màu thuốc nhuộm, ta c ần hoạt hóa nó b ằng
tác nhân nhiệt độ cao hay kết hợp acid với nhiệt. Việc hoạt hóa sẽ kích thích bào t ử n ảy
mầm và khi bào tử ở trạng thái nảy mầm thì thuốc nhuộm sẽ dễ dàng xâm nh ập vào
bên trong lõi dẫn đến bào tử bắt màu.
Điều này được giải thích bằng cơ chế: khi hoạt hóa bằng nhi ệt thì nhi ệt đ ộ sẽ
làm cho protein của áo bào tử bị biến tính dẫn đến cấu trúc áo tr ở nên x ốp h ơn, tính
thấm tăng và đồng thời cũng xúc tiến hoạt động thủy phân c ủa enzyme protease t ại
đây. Kết quả là lượng protein giảm, cấu trúc áo trở nên lỏng lẻo tạo đi ều ki ện cho n ước
và thuốc nhuộm thấm vào vỏ bào tử, làm cho vỏ bào tử trương phồng. Sự trương phồng
sẽ làm cho lớp peptidoglycan bị vỡ cấu trúc t ạo đi ều ki ện cho n ước và thu ốc nhuộm
thấm vào trong lõi làm cho bào tử có màu xanh.
Những lưu ý có khả năng ảnh hưởng đến quá trình nhuộm :
 Vết bôi vừa phải, không quá dày nếu không thì các l ớp vi khu ẩn sẽ ch ồng lên
nhau khó nhuộm và gây khó quan sát.
 Mẫu giấy đặt trên hình chữ nhật có kính thước vừa, phù h ợp v ới phi ến kính
chữ nhật, vì nếu to quá sẽ làm thuốc nhuộm chảy xuống phía dưới.
 Mẫu giấy trên phiến kính hình chữ nhật phải luôn luôn phải được làm ẩm bởi
malachite green. Vì nếu khô giấy sẽ bị dính chặt vào vết bôi và chúng ta không th ể r ửa
trôi với nước.
Trong quá trình cố định vi sinh vật, nếu hơ nóng quá có th ể gây v ỡ thành t ế bào
gây khó quan sát được bào tử.
5. Tài liệu tham khảo
Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2003). Vi sinh vật học.
NXB Giáo dục. 27-30.

14


TS Trịnh Khánh Sơn (2018). Các kĩ thuật cơ bản trong thực nghiệm vi sinh vật

học. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

15


Bài 5: KĨ THUẬT PHÒNG ẨM (QUAN SÁT NẤM SỢI)
1. Mục đích
Nhờ vào kĩ thuật phòng ẩm mà ta có thể quan sát được hình d ạng, cấu t ạo cũng nh ư
giống loài của loại nấm sợi mà ta cấy vào môi trường.
2. Kết quả thí nghiệm

Hình 1. 5: Nấm sợi

16


a) Hệ sợi

b) Vách ngăn của sợi nấm
Hình 1. 6: Hệ sợi của nấm

3. Nhận xét
Nấm sinh trưởng và phát triển với thân trong suốt, thân không phân nhánh và
đầu sợi nấm có mang bào tử.
Hệ sợi (khuẩn ty) của nấm mọc trong suốt với nhiều nhánh. Đặc bi ệt, trên m ỗi
sợi đều có những vách ngăn rõ rệt.
Qua những hình ảnh quan sát được dưới kính hiển vi thì ta th ấy nó có hình d ạng
và đặc điểm giống sợi nấm Aspergillus thuộc lớp nấm bất toàn Deuteromycetes. Gi ống
nấm này phần lớn không có hình thức sinh sản hữu tính mà là kiểu sinh sản vô tính.
4. Bàn luận

Môi trường sử dụng trong bài này còn được bổ sung thêm chloramphenicol có
tác dụng kìm hãm sự phát triển của các loại vi khuẩn, giúp cho t ế bào n ấm s ợi có đ ủ
sinh dưỡng để sinh trưởng và quan sát dễ dàng hơn.

Những lưu ý trong bài quan sát nấm sợi:

17


 Quá trình thực hiện kĩ thuật phòng ẩm (cấy nấm) luôn thực hi ện trong đi ều
kiện vô trùng nếu không thì sẽ bị tạp nhiễm, tế bào nấm sinh tr ưởng không nh ư ý
muốn.

 Lượng sinh khối ta cấy vào môi trường không quá nhi ều n ếu không sẽ m ọc

chồng chất gây khó khăn trong việc quan sát.
5. Tài liệu tham khảo
Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương (2010). Nhà xuất bản đại học Qu ốc gia Tp H ồ
Chí Minh.Thí nghiệm vi sinh học thực phẩm.53-55.

Bài 6: KỸ THUẬT CẤY RIA
1. Mục đích

18


Cấy ria là kỹ thuật dùng để phân lập vi sinh vật t ừ quần thể ban đ ầu sau đó nuôi
cấy trong môi trường dinh dưỡng thích hợp để tạo ra các khuẩn lạc giống thuần khiết.
2. Kết quả thí nghiệm

Hình 1. 7: Kết quả sau khi cấy men bánh mỳ ( bên trái), Yakult (bên phải) lên môi trường .
Khuẩn lạc của men bánh mì phát triển rất nhanh ( sau 24 gi ờ ).
Khuẩn lạc của Yakult phát triển rất chậm ( sau hơn 48 giờ ).

Hình 1. 8: Thạch đứng sau khi nuôi cấy bằng mẫu Yakult.

19


Bọt khí
Thạch đứng
tách ra làm
2 phần

Hình 4a

Hình 4b

Hình 1. 9 a-b: Thạch đứng sau khi nuôi cấy bằng nấm men

20


Hình 1. 10: Thạch nghiêng sau khi nuôi cấy bằng nấm men
Nhận thấy: xuất hiện bọt khí trong quá trình nuôi cấy.
3. Nhận xét
Mật độ khuẩn lạc ở hai mẫu có độ khác nhau rõ rệt và thời gian phát tri ển cũng
chênh lệch tương đối đáng kể, khuẩn lạc ở men bánh mì dày đặc trong khi ở Yakult mọc
lên một cách thưa thớt.
Khuẩn lạc ở mẫu men bánh mì được phân lập gần như ở nh ững đ ường c ấy cu ối

cùng, bên cạnh đó khuẩn lạc của Yakult được phân lập ngay ở những đ ường cấy đ ầu
tiên.
4. Bàn luận
Trong kĩ thuật cấy ria mật độ vi sinh vật gi ảm dần để hình thành các khu ẩn l ạc
riêng rẽ do: số lượng khuẩn lạc được lấy với một số lượng lớn trên đầu que cấy vòng
sau đó được ria trên bề mặt môi trường thạch, chúng sẽ bám dính lên môi tr ường và
giảm dần theo các đường cấy. Tại một số vị trí trên đường cấy các tế bào riêng l ẻ sẽ r ời
khỏi đường cấy và phát triển thành các khuẩn lạc riêng rẽ do v ậy không ph ải m ỗi
khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch sau quá trình cấy ria đ ều đ ược hình thành t ừ m ột
tế bào ban đầu.
Môi trường được sử dụng để đổ đĩa là M1 (môi trường giá đậu đường) được bổ
sung các chất dinh dưỡng thích hợp giúp các khuẩn lạc phát tri ển bên c ạnh đó còn

21


được chứa một lượng Agar là một loại polysaccharide được tách từ m ột loại rong bi ển.
Đây là một loại phức hợp polysaccharide mà thành phần chính là agarose và
agaropectin nó rất khó để vi sinh vật có thể tiêu thụ và t ạo đi ều ki ện cho khu ẩn l ạc có
thể bám dính. (Hoàng Kim Anh.2006)
Ở kỹ thuật cấy thạch đứng, trong quá trình phát triển của vi sinh v ật có sinh ra
bọt khí, nếu vi sinh vật phát triển quá mạnh và bọt khí quá nhi ều nh ưng không th ể n ổi
lên bề mặt có thể xảy ra hiện tượng nứt thạch agar ở gi ữa và mi ếng th ạch b ị khí sinh
ra đẩy đi lên.
Sự khác nhau giữa kỹ thuật thạch đứng và thạch nghiêng: trong kỹ thuật th ạch
nghiêng vi khuẩn phát triển ngay trên bề mặt của môi trường (trong đi ều ki ện hi ếu
khí) vì vậy chúng phân giải Glucose thành CO 2 và nước sinh năng lượng, sau khi hết
Glucose chúng tiếp tục dị hóa Pepton để tiếp tục sinh năng lượng. Pepton có 3 thành
phần chính: các peptide, protein, axit amin t ự do. Sự phân gi ải các acid amin trong
pepton sẽ tạo ra NH3 làm bề mặt có môi trường kiềm. Ngược lại trong kỹ thuật thạch

đứng vi khuẩn phát triển trong điều kiện yếm khí do vậy Glucose sẽ lên men t ạo ra các
sản phẩm acid hữu cơ làm PH của môi trường giảm xuống (Linde. 1999)
Các yếu tố và một số lưu ý trong kĩ thuật cấy ria:
 Số lượng mẫu lấy vào ở đầu que cấy vừa phải, không quá nhi ều vì nh ư th ế sẽ
khó để tách thành các tế bào riêng rẽ.
 Cần bảo quản (bọc kín) một cách cẩn thận để tránh sự phát tri ển c ủa nấm
mốc lên môi trường dẫn tới hư mẫu.
 Kỹ thuật cấy không đạt có thể dẫn đến các đường cấy bị đè lên nhau, l ượng
mẫu quá dày trên môi trường thạch.
5. Tài liệu tham khảo
Hoàng Kim Anh.2006.Hidrocacbon.In hóa học thực phẩm.Nhà xuất bản khoa học
và kỹ thuật. 224-226
J.j.M.Ter Linder, H. Liang, R.W. Davis, H.Y.Steensma, J.P.Van Dijken, J.T Pronk.1999.
Genome-Wide Transcriptional Analysis of Aerobic and Anaerobic Chemostat Cultures of
Saccharomyces cerevisiae. Journal of bacteriology. 7409-713.
TS Trịnh Khánh Sơn (2018). Các kĩ thuật cơ bản trong thực nghiệm vi sinh vật
học. NXB Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.

22


Bài 7: ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN
1. Mục đích
Đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất hiện diện lớn
nhất trên một đơn vị thể tích mẫu.
Định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt các ống nghiệm được lặp lại
ở một số độ pha loãng khác nhau .
2. Kết quả thí nghiệm
a. Sau khi cho mẫu vào môi trường LSB.
Bảng 1. 3:Số ống dương tính

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

3

3

1

0

0

0

Sinh bọt khí

Hình 1. 11: Ống nghiệm dương tính

23

Ống nghiệm đổi màu

Hình 1. 12: So sánh ống nghiệm dương tính và ống nghiệm không dương tính.
Từ kết quả thí nghiệm được lựa chọn tiến hành tra bảng MPN ta thu được kết
quả như sau:
Bảng 1. 4: Số ống dương tính ở các nồng độ
10-2

10-3

10-4

Tra bảng MPN

MPN/ml

3

1

0

43

43×102

b. Sau khi cho mẫu vào môi trường BGBL
Bảng 1. 5: Số ống dương tính ở các nồng độ
Nồng độ

10-1

10-2

10-3

Số ống dương tính

2

3

0

24