(Luận văn thạc sĩ) Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây đông hầu vàng (Turnera Ulmifolia)

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHAN THỊ THÚY

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

PHAN THỊ THÚY

XÂY DỰNG QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG IN VITRO
CÂY ĐÔNG HẦU VÀNG (TURNERA ULMIFOLIA)

Ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ THANH NHÀN

THÁI NGUYÊN, NĂM 2018

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận văn: “Xây dựng quy trình nhân giống in vitro
cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)” là công trình nghiên cứu của riêng
tôi. Mọi kết quả thu được là trung thực, không sao chép từ kết quả nghiên cứu
khác. Tất cả những tham khảo và kế thừa đều được trích dẫn đầy đủ.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả luận văn

Phan Thị Thúy

iii


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm giúp
đỡ tận tình của nhiều cá nhân, cơ quan đơn vị.
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Phạm Thị Thanh Nhàn,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện, giúp đỡ tôi trong
quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin được cảm ơn các thầy giáo, cô giáo thuộc khoa Sinh học, bộ phận
Sau đại học của Phòng Đào tạo, Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên
đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới cô Trần Thị Hồng, cán bộ phòng
thí nghiệm Công nghệ tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm – Đại học
Thái Nguyên đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi tiến hành luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thân trong
gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã tạo điều kiện, giúp đỡ và động viên tôi
trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên, tháng 11 năm 2018
Tác giả luận văn

Phan Thị Thúy

iv


MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN ...............................................................................................iii
LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................... iv
MỤC LỤC ........................................................................................................... v
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................. v
DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................. vi
MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1
1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................ 2
3. Nội dung nghiên cứu ....................................................................................... 2
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Đông hầu vàng ...................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học ....................................................... 3
1.1.2. Giá trị cây Đông hầu vàng ................................................................................ 5
1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Đông hầu vàng trên thế giới và ở Việt Nam ........ 7
1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng ....................................... 8
1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật......................... 9
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro .................................................... 9
1.2.3. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro ............................................... 12
1.3. Thành tựu của nhân giống in vitro ............................................................. 15
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................... 17
2.1. Vật liệu, hóa chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu .................................... 17

2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................................................................... 17
2.1.2. Hóa chất nghiên cứu ....................................................................................... 17
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu ......................................................................................... 17
2.1.4. Địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................ 17
2.2.1. Phương pháp pha môi trường ......................................................................... 17
v


2.2.2. Phương pháp nuôi cấy in vitro ....................................................................... 17
2.2.3. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu........................................................... 22
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................... 23
3.1. Nghiên cứu công thức vô trùng mẫu .......................................................... 23
3.2. Nghiên cứu môi trường kích thích hạt Đông hầu vàng nảy mầm .............. 24
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây
Đông hầu vàng ................................................................................................... 25
3.4. Nghiên cứu tạo đa chồi cây Đông hầu vàng ............................................... 28
3.4.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông
hầu vàng ..................................................................................................................... 28
3.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng phát sinh chồi cây
Đông hầu vàng ........................................................................................................... 30
3.4.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát
sinh chồi cây Đông hầu vàng .................................................................................... 32
3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh
chồi cây Đông hầu vàng ............................................................................................ 34
3.4.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng phát sinh chồi cây
Đông hầu vàng ........................................................................................................... 36
3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông
hầu vàng ............................................................................................................. 39
3.5.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng .. 39

3.5.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng.... 40
3.6. Nghiên cứu giá thể thích hợp đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên .. 42
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................... 45
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ ĐƯỢC CÔNG
BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .............................................................. 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................... 47

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Tên tiếng Anh

Nghĩa tiếng Việt

MS

Murashige and Skoog

Môi trường MS

KT

Khử trùng

CT

Công thức

BAP

6- Benzylamino purine

Kinetin

6- Fururolamino purine

GA3

Gibberellic acid 3

NAA

α- Naphthaleneacetic acid

IBA

3- Indolebutyric acid

2,4- D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

NXB

Nhà xuất bản

cs

Cộng sự

iv


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Công thức khử trùng hạt cây Đông hầu vàng ................................... 18
Bảng 2.2. Công thức giá thể ra cây Đông hầu vàng .......................................... 22
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt cây Đông hầu vàng ....................................... 23
Bảng 3.2. Tỷ lệ nảy mầm của hạt Đông hầu vàng ở các môi trường ................ 25
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây Đông
hầu vàng .......................................................................................... 26
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng phát sinh chồi cây Đông hầu vàng . 29
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng.... 31
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và NAA đến khả năng phát sinh chồi
cây Đông hầu vàng .......................................................................... 33
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA đến khả năng phát sinh chồi
cây Đông hầu vàng .......................................................................... 35
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của 2,4- D đến khả năng tạo mô sẹo ở lá Đông hầu vàng.... 37
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo cây
Đông hầu vàng ................................................................................. 38
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ...... 40
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ cây Đông hầu vàng ....... 41
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của giá thể đến cây trồng trong bầu sau 8 tuần ............ 43

v


DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Đông hầu vàng ............................................................................. 3
Hình 1.2. Hoa và hạt cây Đông hầu vàng ............................................................ 4
Hình 3.1. Hạt Đông hầu vàng sau khử trùng ..................................................... 24
Hình 3.2. Ảnh hưởng của nước dừa 100 ml/l và than hoạt tính 1,5 g/l đến sự
sinh trưởng của cây Đông hầu vàng .................................................. 27
Hình 3.3. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 sau 4 tuần......... 30
Hình 3.4. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3 .......................... 30
Hình 3.5. Hình ảnh cây Đông hầu vàng trên môi trường CT2 .......................... 34
Hình 3.6. Hình ảnh mô sẹo và chồi tái sinh từ mô sẹo sau 4 tuần .................... 38
Hình 3.7. Kết quả tạo rễ cây Đông hầu vàng trên môi trường CT3 .................. 42
Hình 3.8. Cây Đông hầu vàng sau khi lấy ra khỏi bình .................................... 43
Hình 3.9. Cây Đông hầu vàng in vitro trong vườn ươm ................................... 43
Hình 3.10. Sơ đồ quy trình nuôi cấy in vitro cây Đông hầu vàng ..................... 44

vi


MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Dược liệu có vai trò rất quan trọng trong đời sống con người. Từ xưa,
ông cha ta đã biết sử dụng, chế biến dược liệu để chăm sóc và bảo vệ sức khỏe.
Ngày nay, nhu cầu sử dụng dược liệu của người dân ngày càng gia tăng bởi ít
tác dụng phụ và phù hợp với quy luật sinh lý của cơ thể. Theo Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO), khoảng 80% dân số hiện nay trên thế giới vẫn dựa vào thuốc
có nguồn gốc tự nhiên trong chăm sóc sức khỏe cộng đồng [43]. Theo số liệu
thống kê của ngành Y tế, mỗi năm ở Việt Nam tiêu thụ từ 30-50 tấn các loại
dược liệu khác nhau để sử dụng trong y học cổ truyền làm nguyên liệu cho
công nghiệp Dược và xuất khẩu. Trong đó, trên 2/3 khối lượng này được khai
thác từ nguồn cây thuốc mọc tự nhiên và trồng trọt trong nước. Riêng từ nguồn
cây thuốc tự nhiên đã cung cấp tới trên 20.000 tấn mỗi năm [1]. Do không có

chính sách quản lí chặt chẽ nên nhiều loài cây dược liệu tự nhiên bị khai thác ồ
ạt, không chú ý tới bảo vệ, tái sinh làm cho nguồn tài nguyên dược liệu giảm
sút nghiêm trọng, nhiều loài đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Yêu cầu đặt
ra là cần phải bảo tồn nguồn gen, nhân nhanh các loài cây dược liệu quý hiếm
và tìm ra những loài cây dược liệu thay thế.
Hiện nay, nhu cầu làm đẹp của phái nữ ngày một gia tăng mạnh mẽ. Tuy
nhiên, các mỹ phẩm tổng hợp và pha chế được bán trên thị trường thường gây
hại cho da sau một thời gian sử dụng. Vì vậy, các công ty dược- mỹ phẩm phải
tìm đến những hợp chất được chiết xuất từ những cây cỏ tự nhiên. Ở Việt Nam
có rất nhiều cây thuốc quý được sử dụng để cải thiện sắc đẹp như: trinh nữ
hoàng cung, ngưu tất, hà thủ ô, cây rau sam, diệp hạ châu, cây lá bỏng, lá dâu
tằm, lá trầu không,…[47]. Cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) là loài cây
có nhiều công dụng đối với cơ thể, đặc biệt có tác dụng làm đẹp cho phụ nữ
như làm trắng da, kéo dài tuổi thanh xuân. Tuy nhiên, ở nước ta hiện nay, cây

1


Đông hầu vàng là cây nhập nội với số lượng hạn chế, cần được nhân nhanh để
tạo nguồn giống.
Nuôi cấy mô tế bào là một kỹ thuật rất quan trọng của công nghệ sinh
học thực vật. Những thành tựu mà nuôi cấy mô tế bào đạt được đã chứng tỏ
khả năng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là nhân nhanh và bảo tồn
những loài quý hiếm.
Từ các lý do trên, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: “Xây dựng quy trình
nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia)” nhằm phát triển
cây Đông hầu vàng làm thuốc ở Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu
Xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cây Đông hầu vàng (Turnera
ulmifolia).

3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu công thức khử trùng hạt Đông hầu vàng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất phụ gia đến sự sinh trưởng của cây
Đông hầu vàng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm cytokinin, tổ hợp nhóm cytokinin và
auxin, 2,4- D đến khả năng tạo đa chồi cây Đông hầu vàng.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nhóm auxin đến khả năng tạo rễ cây Đông
hầu vàng.
- Nghiên cứu giá thể thích hợp để đưa cây Đông hầu vàng ra ngoài tự nhiên.

2


Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về cây Đông hầu vàng
1.1.1. Đặc điểm phân loại và đặc điểm sinh học
Cây Đông hầu vàng có tên tiếng Anh là Yellow Turnera, Yellow Alder,
Yellow Elder, West Indian Holly hay Sage Rose. Tên tiếng Việt là Đông hầu
vàng, Kim ngân, Dừa thái vàng hay Dừa vàng. Tên khoa học là Turnera
ulmifolia, là một loài thực vật thuộc chi Đông hầu (Turnera), phân họ Hoa thời
chung hay phân họ Đông hầu (Turneroideae), họ Lạc tiên (Passifloraceae)
(trước đây chi này được đặt trong họ Đông hầu (Turneraceae), bộ Sơ ri
(Malpighiales) [2], [6]. Cây Đông hầu vàng có nguồn gốc từ Châu Mỹ. Ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt đới, nhất là châu Mỹ và châu Phi có 20 họ và 120 loài.
Một số loài thuộc chi Đông hầu như Turnera arcuata, Turnera
angustifolia Mill., Turnera aurelii, Turnera caerulea, Turnera candida, Turnera
chamaedryfolia, Turnera difusa Willd. Ex Schult., Turnera ulmifolia L., Turnera
velutina, Turnera weddelliana…[44].

Hình 1.1. Cây Đông hầu vàng

Các cây thuộc họ Đông hầu từ lâu đã được biết đến như một loại thảo
dược nổi tiếng ở châu Mỹ với công dụng tăng cường sức khỏe sinh sản, được
người Maya cổ và người Mexico sử dụng rộng rãi. Y học hiện đại thì coi đây
như một loại trà kích thích khả năng sinh lý. Lá Đông hầu còn có lợi ích tốt cho
phụ nữ trong thời kỳ kinh nguyệt, giảm chuột rút, mệt mỏi, lo lắng và đau đầu

3


do khả năng điều tiết và cân bằng nội tiết tố nữ [40]. Đại diện duy nhất của họ
này tại Việt Nam là cây Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) có nguồn gốc ở
Mexico và Tây Ấn [42].
Cây Đông hầu vàng là một loại cây có phân bố địa lý rộng. Cây được
nhập cư rộng rãi ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Cây thích nghi với
nhiều loại đất, điều kiện môi trường và có khả năng sinh sản cao nên định cư
được ở các môi trường sống mới. Sự phân tán hạt trong loài này là do khả năng
thu hút kiến làm cho những con kiến vận chuyển hạt giống trong khoảng cách
tương đối ngắn tạo thuận lợi cho việc hình thành quần thể dày đặc và tăng khả
năng tạo ra hạt [16], [18], [45].
Cây Đông hầu vàng là cây bụi nhỏ, cao khoảng 1m, phân nhiều cành. Lá
đơn, mọc so le, hình trái xoan hẹp, dài khoảng 5-6cm, rộng 2,5cm, hai đầu nhọn,
mép khía răng cưa nhọn, gân lá hình lông chim, nổi rõ, gốc phiến lá có 2 tuyến
nhỏ, cuống ngắn có lông mềm, vò lá có mùi hăng nhẹ [6].
Hoa cây Đông hầu vàng là hoa đơn, thường nở vào buổi sáng, tàn vào
buổi trưa, hoa mẫu năm, đường kính hoa 5-6cm, cuống ngắn, mọc ra từ cuống
lá, 2 lá bắc hẹp dài, 5 lá đài hình mũi mác nhọn, do các lá đài và cánh hoa họp
lại tạo thành, các thùy của tràng xếp vặn, nhị 5 xen kẽ với cánh hoa và không có
vành phụ, vòi nhụy rời và xẻ nhiều ở đỉnh (mỗi vòi có dạng bút lông), 5 cánh
hoa hình bầu dục, màu vàng, mặt trong gốc cánh hoa màu vàng nâu, có 5 nhị rời
và bầu nhẵn. Ra hoa quanh năm, rộ nhất vào mùa hè [6].

Hình 1.2. Hoa và hạt cây Đông hầu vàng
4


Quả Đông hầu vàng có hình cầu, nhiều hạt, quả bế, khi già nở tung tạo
điều kiện cho hạt phát tán ở khảng cách ngắn [41]. Hạt Đông hầu vàng nhỏ,
màu nâu sẫm, nảy mầm vào mùa xuân, được bảo quản ở nhiệt độ thường.
1.1.2. Giá trị cây Đông hầu vàng
Cây Đông hầu vàng có hương thơm nồng, vị hơi đắng. Lá được dùng
làm hương liệu cho mùi rượu. Ở Mexico, người ta dùng để thay thế cho cây trà.
Tác dụng của cây là bồi bổ, xổ nhẹ và lợi tiểu, chống suy nhược, làm thuốc kéo
dài tuổi thanh xuân cho cả nam và nữ [41], [46].
Thành phần chính của cây Đông hầu vàng gồm: Flavonoid (22 hợp chất
khác nhau), arbutin (chiếm 7%), tinh dầu (khoảng 0,5%), deltacadinee (10%),
thymol (4%), cyanogenic glycosides (tetraphyllin, 7 hợp chất khác nhau), maltol
glucoside, phenolics, monoterpenoids, sesquiterpenoid, triterpenoid, polyterpene
ficaprenol-11, axit béo, caffeine, ethanol, nhựa thông, chất nhựa, alkaloid [34],
[38], [46].
Flavonoid có tác dụng chống đông máu, phòng ngừa viêm loét niêm mạc
dạ dày và tá tràng, giảm thương tổn dạ dày do sự kết hợp của indomethacin và
bethanechol, giảm chứng loét dạ dày do stress gây ra [24].
Khả năng kích thích tình dục có thể do một loại alkaloid trong cây thuốc
có tác dụng như hormone sinh dục testosterone ở nam [48].
Dịch chiết Đông hầu vàng có khả năng bảo vệ gan, chống lại tổn thương
gan gây bởi carbon tetrachloride [46].
Arbutin trong cây Đông hầu vàng có tác dụng làm trắng da nhờ khả năng
ức chế enzyme sản sinh melanin mà không có tác dụng phụ, chống lão hóa và
ngăn các gốc tự do. Tinh dầu giúp tinh thần sảng khoái, giảm đau bụng kinh,
kinh nguyệt không đều, chống nhiễm trùng, làm căng da, mịn da [41].

Cây Đông hầu vàng chứa chất thymol có tác dụng kích thích lên cơ thể
và giúp hồi phục hệ thần kinh. Chất này được dùng cho các bệnh nhân bị bệnh
suy nhược hay suy nhược thần kinh ở mức độ nhẹ cho đến vừa phải [41].

5


Cây Đông hầu vàng có khả năng cải thiện sức khỏe sinh sản, giúp trị
xuất tinh sớm và bất lực ở nam, điều hòa nội tiết và kinh nguyệt ở nữ [41].
Cây Đông hầu vàng có đặc tính lợi tiểu và khử trùng nước tiểu, do đó nó
được dùng để trị các bệnh nhiễm trùng các cơ quan tiết niệu như bệnh viêm
bàng quang, viêm ống dẫn nước tiểu. Bên cạnh đó, chất nhựa trong cây có tác
dụng như dịch vị dạ dày giúp tiêu hóa tốt, do đó, cây cũng được dùng để trị
bệnh táo bón do cơ ruột co bóp kém [24], [46].
Chiết xuất của Đông hầu vàng (Turnera ulmifolia) cùng với Parkia
platycephala Benth và Dimorphandra Gardneriana được sử dụng trong chống
nhiễm trùng giun sán ở các loại gia súc nhai lại nhỏ như ở dê [31].
Chiết xuất từ Đông hầu vàng và Mentha arvensis L. khi kết hợp với thuốc
chống nấm Metronidazole làm cho khả năng kháng nấm Candida tropicalis
được tăng cường [36].
Cao Đông hầu được cô đặc từ hơn 7 loại cây thuốc quý hiếm như Đông
hầu vàng, Thành ngạnh, Dây cóc,… có tác dụng làm căng da, mờ nhăn, kích
thích quá trình tăng sinh collagen gấp 8 lần so với bình thường, phục hồi da,
làm trẻ hóa da và chống lão hóa, làm se khít lỗ chân lông, cân bằng độ ẩm và
trị mụn hiệu quả cao [49].
Ngoài ra, các loài trong chi Đông hầu còn được sử dụng để điều trị các
bệnh như thiếu máu, viêm phế quản, ho, tiểu đường, giảm đau, phổi và các
bệnh đường hô hấp, rối loạn da [46].
Cây thuốc, vị thuốc Đông hầu vàng có thể có những dạng bào chế như
thuốc viên, bột, cao, trà, rượu thuốc. Cây thuốc này thường được dùng kết hợp

với các thuốc khác để tăng cường tác dụng của thuốc. Liều dùng khác nhau đối
với từng bệnh nhân, lứa tuổi và tình trạng sức khỏe. Thuốc không được dùng
cho trẻ em, phụ nữ mang thai hoặc đang cho con bú, những người bị bệnh gan,
tiểu đường hoặc quá mẫn cảm với các thành phần trong cây [48].

6


1.1.3. Tình hình nghiên cứu cây Đông hầu vàng trên thế giới và ở Việt Nam
Công trình nghiên cứu đầu tiên về đặc tính viagra của cây Damiana
(thuộc họ Đông hầu) (1999) cho thấy rằng sức khỏe sinh sản của chuột được
cải thiện khi được uống chất chiết từ cây này[41].
Năm 2002, theo các nhà khoa học Brazil, hoạt chất chủ yếu của cây Đông
hầu vàng (ở thân và lá) là các hợp chất flavonoid, có tác dụng chống oxy hóa
và chống các vết loét. Thử trên chuột, cho thấy hoạt chất của cây này có tác
dụng phòng chống viêm loét dạ dày và hành tá tràng. Trong bệnh viêm loét dạ
dày do stress, chất chiết trong môi trường nước của cây này cũng có tác dụng
làm giảm từ 50-58% với liều 0,5-1 g/kg thể trọng. Các kết quả nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm phù hợp với kinh nghiệm dân gian ở Brazil là dùng trà
Đông hầu vàng để chữa các bệnh chủ yếu liên quan đến viêm loét dạ dày và
hành tá [24].
Năm 2006, các nhà khoa học thuộc Khoa Phân tích lâm sàng và Chất
sinh học Brazil đã nghiên cứu sơ bộ về hoạt động chống oxi hóa của Turnera
ulmifolia. Nghiên cứu sử dụng chiết xuất hydroethanol 50% được đánh giá
bằng hệ thống oxy hóa kết hợp axit beta-carotene/linoleic để ức chế quá trình
oxy hóa và ức chế peroxidation lipid ở chuột đồng, có sử dụng các chất phản
ứng thiobarbituric acid và chemiluminescence. Kết quả cho thấy chiết xuất này
có hoạt tính chống oxy hoá (77,4 ± 10%) cao hơn alpha-tocopherol (vitamin E)
(58,4 ± 3,7%) [30].
Cũng trong năm 2006, các nhà khoa học thuộc Khoa Dược, Đại học

Granada, Tây Ban Nha đã nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm đường ruột của
thân, lá Đông hầu vàng. Nghiên cứu được thử nghiệm trong mô hình viêm đại
tràng chuột do axit trinitrobenzenesulphonic (TNBS) gây ra. Kết quả thu được
cho thấy việc sử dụng chiết xuất Turnera ulmifolia đối với chuột cống ở 250 và
500 mg/kg, làm giảm đáng kể tổn thương đại tràng gây ra bởi TNBS. Tác dụng
có lợi này có liên quan đến sự cải thiện tình trạng oxy hóa đại tràng, hiệu quả

7


phòng ngừa do truyền tĩnh mạch của Turnera ulmifolia trong mô hình TNBS
của bệnh viêm đại tràng ở chuột có lẽ liên quan đến tính chất chống oxy hoá do
hàm lượng flavonoid có trong cây [23].
Năm 2009, hai nghiên cứu về khả năng kháng sinh trên các chủng vi
khuẩn đã kháng thuốc kháng sinh nhóm aminoglycosides. Dựa trên các kết quả
thực nghiệm đã chứng minh, dịch chiết từ cây Đông hầu vàng có khả năng
diệt các chủng Escherichia coli và Staphylococcus aureus đã kháng kháng sinh
nhóm aminoglycosides và có tác dụng hiệp đồng khi dùng kết hợp cùng với các
loại thuốc kháng sinh như kanamycin, gentamicin, neomycin, tobramycin và
amikacin [20], [21].
Năm 2012, Brito và cs (Đại học Liên bang Rio Grande do Norte, Brazil)
đã nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa (chống carbon tetrachloride gây oxy
hóa) và tác dụng bảo vệ của Đông hầu vàng ở chuột. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, các chất glutathione và hoạt động của enzyme chống oxy hóa (glutathione
peroxidase, superoxide dismutase và catalase) đã được tăng cường đáng kể
trong chuột do uống thuốc được chiết từ lá Đông hầu vàng và có sự hiện diện
của chất flavonoid, là chất trung gian ảnh hưởng của stress oxy hóa [19].
Ở Việt Nam, nghiên cứu của các bác sĩ và giáo sư tại Viện nghiên cứu Y
học Bản địa Việt Nam (Thái Nguyên và Hà Giang) đã tạo ra sản phẩm cao
Đông hầu với nhiều tác dụng tốt cho da [49].

1.2. Kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong những kỹ thuật quan
trọng của công nghệ sinh học, là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công
nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Trải qua hơn 100 năm
phát triển và đã đạt được những thành tựu nhất định trong lĩnh vực nhân giống,
bảo quản nguồn gen cây trồng.

8


1.2.1. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật đó là tính
toàn năng của tế bào do Haberlandt nêu ra vào năm 1902. Theo quan điểm của
sinh học hiện đại thì tính toàn năng của tế bào là mỗi tế bào riêng rẽ đó phân
hóa, sẽ mang toàn bộ thông tin di truyền cần thiết và đầy đủ của cơ thể sinh
vật. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể phát triển thành một cơ
thể hoàn chỉnh. Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy mô và tế bào thực
vật là kết quả của quá trình phân hóa và phản phân hóa tế bào. Như vậy, kĩ
thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình
thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô
trùng) một cách định hướng. Đây là một điểm rất quan trọng bởi vì trên cơ sở
đơn vị mô, tế bào, các nhà sinh vật học thực hiện những kĩ thuật tiên tiến cho
việc lựa chọn, cải thiện và lai tạo giống cây trồng [5].
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy in vitro
Mẫu nuôi cấy
Các nhân tố khi chọn lọc mẫu cấy bao gồm kiểu gen, cơ quan được chọn,
tuổi sinh lý, mùa vụ, giai đoạn sinh trưởng, độ khỏe của mẫu và nguồn mẫu [5].
Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng phát
triển của mẫu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là

từ 20-27oC. Điều kiện ánh sáng từ 1000-3000lux. Độ pH là 5,7-5,8 [5].
Chất kích thích sinh trưởng thực vật
Các chất kích thích sinh trưởng có vai trò rất quan trọng trong kĩ thuật
nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bằng cách cung cấp các chất kích thích ở một
mức hợp lý thì chúng ta có thể điều khiển được quá trình phát sinh hình thái
của mẫu nuôi cấy.
Auxin và cytokinin là hai nhóm chất kích thích sinh trưởng được sử
dụng phổ biến nhất hiện nay. Cytokinin là hormone phân bào ảnh hưởng đến

9


sự phân chia tế bào, sự thay đổi ưu thế ngọn và phân hóa chồi trong nuôi cấy
mô tế bào thực vật. Các cytokinin được sử dụng thường xuyên nhất là: BAP,
kinetin và zeatin. Hàm lượng sử dụng các loại cytokinin dao động từ 0,5-2
mg/l. Ở nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình
thành chồi bất định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Hoạt
lực của BAP cao hơn và bền vững hơn zeatin dưới tác dụng của nhiệt độ cao.
BAP có khả năng làm tăng hình thành các sản phẩm thứ cấp và tăng kích thước
của tế bào ở các lá mầm, kích thích sự nảy mầm của hạt và quá trình trao đổi
chất [5], [7], [37]. GA (Gibberellic acid) là loại gibberellin được sử dụng thường
xuyên nhất, muốn sử dụng GA ta thường phải lọc qua màng lọc vô trùng, sau đó
đưa vào môi trường nuôi cấy. Trong số hơn 20 chất thuộc nhóm gibberellin,
GA3 là chất được sử dụng nhiều nhất trong thực tiễn. GA3 kích thích kéo dài
chồi và nảy mầm của phôi vô tính, kéo dài thân và đòng lúa, kéo dài đốt thân
(với các cây lùn), phá ngủ hạt giống hoặc củ giống (phá ngủ khoai tây sau khi
thu hoạch) [5], [7], [28].
Agar
Agar có vai trò rất cần thiết đối với mẫu nuôi cấy, làm đặc môi trường,
giúp mô không bị chìm. Agar thường được sử dụng ở nồng độ 0,6 đến 1% [5].

Chất phụ gia
Nước dừa chứa hàm lượng dinh dưỡng cao, được sử dụng để cung cấp
dinh dưỡng cho mẫu nuôi cấy mô tế bào thực vật. Nước dừa được sử dụng để
kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ở nhiều loài cây. Nước dừa thường
được lấy từ quả để sử dụng tươi hoặc sau bảo quản. Nước dừa được một số
công ty hóa chất bán dưới dạng đóng chai sau chế biến và bảo quản. Thông
thường nước dừa được xử lý để loại trừ các protein, sau đó được lọc qua màng
lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh. Tồn dư protein trong nước dừa
không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng có

10


thể dẫn tới kết tủa dung dịch khi bảo quản lạnh. Chất cặn có thể được lọc bỏ
hoặc để lắng dưới đáy bình rồi gạn bỏ phần cặn [5].
Ngoài nước dừa, chuối xanh, khoai tây và cà chua cũng là những chất tự
nhiên giàu dinh dưỡng được sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật. Ngày
nay, nhiều nghiên cứu để giảm thiểu chi phí cần thiết cho công nghệ nuôi cấy
mô được tiến hành, trong đó có nghiên cứu của Daud và cs. Mục đích của
nghiên cứu này là khảo sát ảnh hưởng các chất phụ gia (nước dừa già, nước
dừa non, dịch chiết đu đủ, dịch chiết chuối và dịch chiết cà chua) ở 4 nồng độ
(20; 30; 50 và 70 ml/l) đến khả năng tạo đa chồi của cây Celosia sp. (chi Mào
gà) trong 8 tuần nuôi cấy. Trong số các dịch chiết được sử dụng, nước dừa non
với nồng độ 70 ml/l tạo ra tỷ lệ phát sinh chồi cao nhất (14,21 ± 8,26
chồi/mẫu), tiếp theo là nước dừa già với nồng độ 50 ml/l cho tỷ lệ phát sinh
chồi là 13,14 ± 10,33 chồi/mẫu. Dịch chiết chuối và dịch chiết cà chua ở nồng
độ 50 ml/l cho tỷ lệ chồi thấp (9,57 ± 4,68 và 9,28 ± 5,82 chồi/mẫu). Trong khi
nồng độ thấp nhất của nước đu đủ (20 ml/l) cho thấy tỷ lệ phát sinh chồi là
10,50 ± 3,45 chồi/mẫu [22].
Than hoạt tính cũng là một chất phụ gia có nhiều tác dụng tích cực trong

nuôi cấy mô, có tác dụng hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản
phẩm trao đổi thứ cấp, kích thích sự hình thành và sinh trưởng của rễ (Vũ Văn
Vụ, 2006). Trong thí nghiệm ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng tạo rễ
của Lan kim tuyến, các tác giả Nguyễn Thị Nhật Linh và cs đã sử dụng than
hoạt tính với các nồng độ khác nhau bổ sung vào môi trường Knud + sucrose
20 g/l và agar 7g/l. Kết quả xử lý thống kê hàm Anova một nhân tố cho thấy,
nồng độ than hoạt tính khác nhau rõ ràng có ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo rễ, chiều
dài rễ và số lượng rễ của lan Kim tuyến nuôi cấy mô theo hướng tích cực. Ở tất
cả các môi trường bổ sung than hoạt tính đều cho tỷ lệ tạo rễ là 100%. Bổ sung
than hoạt tính ở nồng độ 5% cho số lượng rễ nhiều nhất (4,22 rễ/mẫu) và chiều
dài rễ là 3,5cm, rễ mập và rất khỏe [8].

11


1.2.3. Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro
Phương pháp nhân giống in vitro đã bổ sung cho các kĩ thuật nhân giống
vô tính cổ điển như giâm cành, chiết cành, ghép cành... Nhân giống in vitro là
một trong bốn lĩnh vực của công nghệ tế bào thực vật (làm sạch virus, nhân
nhanh các giống cây quý, sản xuất và chuyển hóa sinh học các hợp chất tự nhiên
và cải biến về mặt di truyền các giống cây trồng) và mang lại hiệu quả kinh tế
lớn [5]. Có ba phương thức tạo cây in vitro:
a. Hoạt hóa chồi nách
Hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi
cấy các đỉnh chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự
hoạt hóa của chồi nách diễn ra theo hai cách:
Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi
nuôi cấy loài cây hai lá mầm như cây thuốc lá, hoa cúc, ...)
Cách 2: Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách (xảy ra khi nuôi cấy
cây một lá mầm như lúa, mía...)

Các chồi được tách và nuôi cấy trên môi trường dinh dưỡng có bổ sung
cytokinin với nồng độ cao. Vai trò của cytokinin lúc này là ức chế ưu thế ngọn
để chồi bên phát triển. Các chồi này tiếp tục được chuyển sang môi trường mới
có bổ sung cytokinin thì các chồi mới tiếp tục được tạo ra. Sau đó, các chồi này
được chuyển sang môi trường tạo rễ và được đưa ra vườn ươm khi đã có rễ
hoàn chỉnh [5].
Những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự hình thành đa chồi: (1) Nhu
cầu về loại và nồng độ cytokinin khác nhau. Nồng độ cytokinin thay đổi tùy theo
giai đoạn nuôi cấy, thông thường trong quá trình tạo chồi người ta sử dụng auxin
với nồng độ thấp, phối hợp cùng với cytokinin ở nồng độ cao. Không nên cảm
ứng tạo mô sẹo với nồng độ cytokinin quá cao vì có thể tạo ra chồi bất định
mang các đột biến. (2) Trong trường hợp chồi bên không tăng trưởng được thì
cần phải cắt bỏ chồi ngọn hoặc làm chết chồi ngọn thì chồi bên mới có thể hoạt
động. (3) Khi cấy chuyển nhiều lần tốc độ sinh khối bị thay đổi [5].
12


Hiện nay nhân nhanh bằng phương pháp nhân chồi bên được áp dụng
rộng rãi ở nhiều loài thực vật, quá trình nhân chồi thường được thực hiện theo
các bước sau:
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trước khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận cây mẹ.
Các cây này cần phải sạch bệnh, đặc biệt là sạch virut và ở giai đoạn sinh
trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với
chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu nuôi cấy sẽ
làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu.
Bước 2: Nuôi cấy khởi động
Là giai đoạn khử trùng và đưa mẫu cấy in vitro. Các giai đoạn này cần
đảm bảo các yêu cầu sau: Tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, các mô tồn tại và
sinh trưởng tốt. Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển

của cây. Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi
hoa, cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Bước 3: Nhân nhanh
Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số
lượng thông qua các con đường hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phôi vô tính. Chúng ta cần phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại
cảnh thích hợp để có hiệu quả cao nhất. Theo nguyên tắc chung môi trường có
nhiều cytokinin sẽ kích thích tạo chồi. Nhiệt độ nuôi cấy thường là 25-27 oC,
thời gian chiếu sáng 16h/ngày với cường độ ánh sáng 2000-4000lux. Tuy
nhiên, đối với mỗi loại đối tượng nuôi cấy đòi hỏi có chế độ ánh sáng nuôi cấy
khác nhau.
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Để tạo rễ cho chồi người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang
môi trường tạo rễ. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi
trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất kích thích
sinh trưởng.
13


Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh
trưởng tốt cần đảm bảo những yêu cầu sau: Cây trong ống nghiệm đã đạt những
tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây). Có giá thể tiếp nhận
cây in vitro thích hợp. Giá thể phải sạch đủ dinh dưỡng và độ ẩm, tơi xốp, thoát
nước [5], [12].
b. Tạo chồi bất định
Chồi bất định là chồi mọc ra từ các cơ quan, bộ phận khác của cây,
không phải là phôi, ví dụ chồi hình thành từ callus (mô sẹo). Để tạo chồi bất
định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá, giẻ hành...
Trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình phân

hóa để tế bào soma hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát
triển mô sẹo [5], [12].
c. Tạo phôi vô tính
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, phôi có thể hình thành từ các tế bào
soma gọi là phôi vô tính. Các phôi vô tính có thể tái sinh thành cây hoàn
chỉnh hoặc có thể sử dụng làm nguyên liệu để sản xuất hạt giống nhân tạo.
Tương tự như tạo chồi bất định, để tạo phôi vô tính cần thực hiện hai quá
trình phản phân hóa và quá trình phân hóa để tách các tế bào soma hình thành
phôi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn mô sẹo. Sự hình thành phôi
trải qua hai bước chính:
Bước 1: Sự phân hóa các tế bào có khả năng phát sinh phôi. Trong quá
trình này cần môi trường giàu auxin, vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các
tế bào phôi, đồng thời nó còn giúp kích thích cho quá trình phát triển số lượng
tế bào thông qua việc liên tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát
sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều hạch nhân, không có không bào, tế
bào chất đậm đặc, giàu protein và ARN thông tin.

14


Bước 2: Sự phát triển của phôi mới hình thành. Môi trường nuôi cấy của
giai đoạn này phải nghèo hoặc không có auxin, với nồng độ auxin cao kích
thích sự tạo thành phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển
tiếp theo của phôi này. Như vậy, với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý
là rất quan trọng để có các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc
cho phản ứng, nếu nồng độ quá cao sẽ gây ức chế hoặc gây độc [5], [12].
1.3. Thành tựu của nhân giống in vitro
Ngày nay nhiều nguồn gen thực vật có nguy cơ tuyệt chủng, nhiều giống
cây trồng bị thoái hóa không giữ được đặc điểm nguyên sơ ban đầu như chất
lượng hay khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi, việc sử dụng kỹ thuật

nhân giống in vitro để nhân nhanh và bảo tồn nguồn gen là hết sức cần thiết.
Một số thành tựu nhân giống in vitro đạt được là:
Năm 2003, Bedir và cs đã vi nhân giống thành công giống Hydrastis
Canadensis, một loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở miền Bắc nước Mỹ [17].
Cũng năm 2003, Part và cs đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo
tồn cây thuốc Anemopaegma arvense trong ống nghiệm trên môi trường MS có
chứa 4% đường sorbitol, kết quả sau 6 tháng mới phải cấy chuyển một lần [33].
Năm 2008, Balaraju và cs đã nhân giống và tái sinh in vitro thành công
cây thuốc Vitex agnus castus bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào từ mô phân sinh
trên môi trường MS có bổ sung IBA 0,1 mg/l [15].
Gần đây đạt được thành tựu trong việc hoàn thiện quy trình nuôi cấy in
vitro các cây thuốc đang có nguy cơ bị tuyệt chủng như Gynura procumbens,
Crotalaria verrucosa, Momordica tuberosa. Năm 2009, bằng kỹ thuật nhân giống
in vitro các nhà khoa học đã thành công trong việc nhân nhanh nhiều cây thuốc
quý hiếm như Phyllanthus urinaria hay Givotia rottleriformis [26], [35]. Park và
cs (2009) tái sinh thành công loài Rehmannia glutinosa quý hiếm đang bị khai
thác quá mức [32].

15


Ở Việt Nam việc áp dụng kỹ thuật này để bảo tồn các loài thực vật nhiệt
đới quý hiếm, có giá trị kinh tế cũng được các nhà nghiên cứu quan tâm, bắt
đầu từ cây Thông (Taxus sps.) là một loài có chứa các hoạt chất chữa ung thư
hiệu quả như taxoid [13].
Cây Màng tang (Litsea verticillata) là loại cây thân gỗ có chứa một số
hợp chất có khả năng kháng HIV và một số chất kháng sinh. Năm 2004, Lê
Xuân Đắc và cs đã thành công trong việc nhân nhanh và bảo tồn cây Màng
tang của vườn quốc gia Cúc Phương [5], [25], [39].
Cây Trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.) được biết là một vị

thuốc quý trong việc chữa một số bệnh ung thư. Năm 2005, Lưu Trường Sinh
và cs đã tạo ra cây Trinh nữ hoàng cung bằng phương pháp in vitro có chất
lượng tương đương với cây trồng theo phương pháp truyền thống [11].
Nguyễn Thanh Danh và cs (2005) đã nghiên cứu thành công bước đầu của
quy trình nhân nhanh in vitro cây Vù hương (Cinamomum balansae Lecomte.), sử
dụng phôi hạt của quả Vù hương xanh thu hái trước khi chín 30 ngày đã nhân
giống được cây Vù hương bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt xanh [3].
Năm 2010, Lê Ánh Nguyệt và cs đã ứng dụng kĩ thuật nuôi cấy mô và tế
bào thực vật để nhân nhanh và bảo tồn cây Mắt châu (Micromelum hisutum Oliv.)
của vườn quốc gia Cúc Phương [10].

16