NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO BẠC CỦA VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHIM CÚT

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP NANO

BẠC CỦA VI KHUẨN BACILLUS LICHENIFORMIS
PHÂN LẬP TỪ PHÂN CHIM CÚT

KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

1


2


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Abs

Absorbance

CT

Công thức

LB

Luria – Bertani

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction

PTN

Phòng thí nghiệm

UV – Vis

Ultraviolet – Visible

TEM

Transmission Electron Microscopy

XRD

X-ray diffraction

3


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Kí hiệu
bảng
2.1
3.1
3.2

Tên bảng

Trang

Bố trí các lô thí nghiệm
Vị trí đỉnh hấp thu và cường độ hấp thu của dung dịch

25
36

nano bạc tổng hợp từ CT2
Đường kính vòng kháng khuẩn gây ra bởi nano bạc tổng

38

hợp ở nồng độ 1mM AgNO3 theo CT2 và đối chứng (Đơn
3.3

vị: mm)
Đường kính vòng kháng khuẩn gây ra bởi nano bạc tổng
hợp ở nồng độ 2mM AgNO3 theo CT2 và đối chứng (Đơn
vị: mm)

4

40


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số
hiệu

1.1
1.2
1.3

Tên hình ảnh

Trang

Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc
Phổ UV – Vis của dung dịch nano bạc
Phổ XRD của nano bạc (Nguồn: Công ty TNHH nghiên cứu

11
17
18

1.4
2.1
3.1
3.2
3.3
3.4
3.5
3.6

khoa học và phát triển công nghệ HELEN)
Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn Bacillus licheniformis
Sơ đồ sinh tổng hợp nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
Khuẩn lạc của chủng vi sinh vật phân lập từ phân chim cút ủ thô
Tế bào chủng TT01 khi nhuộm Gram

Kết quả tra cứu trên BLAST NCBI
Kết quả chạy cây phát sinh loài
Màu sắc của dung dịch sinh tổng hợp nano bạc sau 6 ngày ủ
Phổ UV – Vis sau 6 ngày khảo sát sinh tổng hợp nano bạc từ

20
24
29
30
30
31
32
33

CT1 tổng hợp ở nồng độ 1mM AgNO3 (a), ở ngồng độ 2mM
3.7

AgNO3 (b)
Phổ UV – Vis sau 6 ngày khảo sát sinh tổng hợp nano bạc từ

34

CT3 tổng hợp ở nồng độ 1mM AgNO3 (a), ở ngồng độ 2mM
3.8

AgNO3 (b)
Phổ UV – Vis sau 6 ngày khảo sát sinh tổng hợp nano bạc từ

35

3.9

CT2 (tổng hợp ở nồng độ 1mM AgNO3)
Phổ UV – Vis sau 6 ngày khảo sát sinh tổng hợp nano bạc từ

35

3.10

CT2 (tổng hợp ở nồng độ 2mM AgNO3)
Dịch nano bạc tổng hợp (a) và dịch ngoại bào (b) tạo vòng

37

3.11

kháng khuẩn ức chế E.coli
Dịch nano bạc tổng hợp (c) và dịch ngoại bào (d) tạo vòng

38

3.12

kháng khuẩn ức chế Bacillus cereus
Dịch nano bạc tổng hợp (e) và dịch ngoại bào (f) tạo vòng ức

38

3.13

chế Ralstonia solanacearum
Dịch nano bạc tổng hợp và dịch nổi (h) tạo vòng kháng khuẩn ức

39

3.14

chế B.cereus
Dịch nano bạc tổng hợp và dịch nổi (h) tạo vòng kháng khuẩn ức

39

3.15

chế Ralstonia solanacearum
Dịch nano bạc tổng hợp (nồng độ 2mM AgNO3) từ CT2 (i) và

40

dịch nổi (k) tạo vòng kháng khuẩn trên vi sinh vật kiểm định

5


3.16
3.17
3.18

E.coli
Kết quả phân tích XRD

Kết quả phân tích ảnh TEM
Biểu đồ tần suất và kích thước hạt của nano bạc

6

41
42
43


MỞ ĐẦU
1.

Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, khoa học và công nghệ nano đang phát triển mạnh

mẽ, đó là một trong những công nghệ tiên tiến hiện nay với rất nhiều lĩnh vực được
ứng dụng trong y học, điện tử, nông nghiệp, xử lý môi trường,...Với kích thước nano
mét các loại vật liệu nano có thể can thiệp đến từng phân tử - nguyên tử, điều này đặc
biệt quan trọng trong nghiên cứu ứng dụng công nghệ nano trong Y – Sinh học.
Bạc là một trong những kim loại có tính sát khuẩn mạnh, từ lâu con người đã
biết ứng dụng nó, và hiện nay thì công nghệ nano bạc đóng vai trò khá quan trọng
trong các nghiên cứu về vật liệu nano. Nghiên cứu chỉ ra rằng khi ở kích thước nano
(từ 1 đến 100 nm), hoạt tính sát khuẩn của bạc tăng lên khoảng 50000 lần so với bạc
dạng khối, như vậy 1 gam bạc nano có thể sát khuẩn cho hàng trăm mét vuông chất
nền [4]. Điều này sẽ làm cho khối lượng bạc sử dụng trong các sản phẩm sẽ giảm
mạnh, nên tỷ trọng của bạc trong giá thành trở nên không đáng kể. Nano bạc có tính
kháng khuẩn mạnh, vô hiệu hóa hầu như tất cả các enzyme cần thiết cho sự trao đổi
oxy của vi khuẩn và tiêu diệt chúng trong vài phút, ngoài ra các hạt bạc với kích thước
nhỏ chui vào trong tế bào, kết hợp với các enzyme hay DNA có chứa nhóm sunfua

hoặc photphate gây bất hoạt enzyme hay DNA dẫn đến gây chết tế bào. Nano bạc
không gây tác dụng phụ, không gây độc cho con người và vật nuôi khi nhiễm lượng
bạc bằng nồng độ diệt khuẩn (khoảng nồng độ nhỏ hơn 100ppm), không gây ô nhiễm
môi trường. Vì vậy nano bạc đang được ứng dụng rộng rãi. Trong nông nghiệp, ứng
dụng công nghệ nano bạc đang được nhiều quốc gia xem là một hướng để phát triển
một nên nông nghiệp hiệu quả, kinh tế và an toàn hơn, phòng trị các bệnh do vi khuẩn,
vi rút, nấm, gây ra trên cây trồng, vật nuôi, bảo quản nông sản. Trong ngành may mặc,
nano bạc có thể ứng dụng để tạo ra các loại quần áo có khả năng diệt khuẩn, vi khuẩn
gây mùi hôi, mốc... Đặc biệt, nghiên cứu tổng hợp nano bạc để phục vụ cho các ứng
dụng trong y học, nhất là hiện tượng vi khuẩn kháng kháng sinh ngày càng phổ biến
như hiện nay.
Có nhiều phương pháp để tổng hợp nano bạc, trong đó các phương pháp hóa
học, vật lý, hóa lý kết hợp thường gây nhiều tác động xấu đến môi trường, chi phí đầu

7


tư tốn kém, giá thành cao lại khó sản xuất rộng rãi. Vì vậy, tổng hợp nano bạc bằng
con đường sinh học đang là một xu hướng mang tính tất yếu. Phương pháp tổng hợp
này tạo ra các hạt nano bạc tiêu chuẩn về kích thước và phân bố tốt hơn so với các
phương pháp khác đồng thời mở ra triển vọng sản xuất với qui mô lớn. Các hạt nano
cũng có thể được ổn định ngay trong quá trình sản xuất bởi các polymer sinh học. Ở
Phương pháp sinh học thì tác nhân chính sinh tổng hợp nano bạc chính là các vi nấm,
vi khuẩn. Với thời gian sinh trưởng ngắn, quá trình sinh tổng hợp tạo ra kích thước hạt
nhỏ và đồng đều, không tốn dung môi hóa học và không gây ảnh hưởng môi trường
nên các loài vi nấm hay vi khuẩn là đối tượng đang được nghiên cứu. Trong đó,
Bacillus licheniformis là vi khuẩn có khả năng sinh trưởng ở phổ nhiệt cao và môi
trường nuôi cấy thông thường, nó là vi khuẩn được ứng dụng trong công nghiệp khi
sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào chịu nhiệt như protease, amylase, lipase...v.v.
Nhằm tiếp cận với phương pháp và xuất phát từ những lý luận, thực tiễn nêu

trên, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc
của vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút”.
2. Mục tiêu đề tài
Đánh giá được khả năng sinh tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus
licheniformis phân lập từ phân chim cút.
3. Ý nghĩa của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả của nghiên cứu sẽ cung cấp dẫn liệu khoa học có giá trị tham khảo cho
sinh viên, kĩ thuật viên về khả năng tổng hợp nano bạc từ chủng Bacillus licheniformis
TT01.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Thành công của khóa luận sẽ xác định được một số điều kiện sinh tổng hợp
nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis có ý nghĩa trong việc ứng dụng tạo nên
các vật liệu, sản phẩm nano bạc phục vụ trong các ngành y học, nông nghiệp, điện tử,
môi trường,...v.v.

8


CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan về công nghệ nano và nano bạc
1.1.1. Vật liệu nano
Khoa học nano là khoa học nghiên cứu vật chất ở kích thước cực kì nhỏ bé –
kích thước nanomet (nm), một nanomet bằng một phần tỉ của mét (m) hay bằng một
phần triệu của milimet (mm). Công nghệ nano là các công nghệ liên quan đến việc
thiết kế, phân tích, chế tạo, ứng dụng các cấu trúc, thiết bị và hệ thống bằng việc điều
khiển hình dáng, kích thước ở quy mô nanomet (từ 1 – 100nm). Vật liệu nano là đối
tượng của hai lĩnh vực khoa học nano và công nghệ nano.
Năm 1959, khái niệm về công nghệ nano được nhà vật lý người Mỹ Richard
Feynman nhắc đến khi ông đề cập đến khả năng chế tạo vật chất ở kích thước siêu nhỏ

đi từ quá trình tập hợp các nguyên tử, phân tử. Những năm 1980, nhờ sự ra đời của
hàng loạt các thiết bị phân tích, trong đó có kính hiển vi đầu dò quét (SEM hay TEM)
có khả năng quan sát đến kích thước vài nguyên tử hay phân tử, con người có thể quan
sát và hiểu rõ hơn về lĩnh vực nano.
Phân loại vật liệu nano
Vật liệu nano không chiều (cả ba chiều đều có kích thước nano), ví dụ đám
nano, hạt nano.
Vật kiệu nano một chiều là vật liệu trong đó có một chiều tự do, hai chiều có
kích thước nano, ví dụ dây nano, ống nano.
Vật liệu nano hai chiều là vật liệu trong đó hai chiều tự do, một chiều có kích
thước nano, ví dụ màng mỏng (có chiều dày kích thước nano).
Ngoài ra còn có vật liệu có cấu trúc nano hay nanocomposite trong đó chỉ có
một phần của vật liệu có kích thước nm, hoặc cấu trúc của nó có nano không chiều,
một chiều, hai chiều đan xen lẫn nhau.
Hạt nano kim loại
Hạt nano kim loại là một khái niệm để chỉ các hạt có kích thước nano được tạo
thành từ các kim loại. Khi nghiên cứu, các nhà khoa học đã thiết lập các phương pháp

9


chế tạo và hiểu được các tính chất thú vị của hạt nano. Một trong những tính chất đó là
màu sắc của hạt nano phụ thuộc rất nhiều vào kích thước và hình dạng của chúng [3].
Ví dụ, ánh sáng phản xạ lên bề mặt vàng ở dạng khối có màu vàng. Tuy nhiên,
ánh sáng truyền qua lại có màu xanh nước biển hoặc chuyển sâng màu da cam khi kích
thước hạt thay đổi. Hiện tượng thay đổi màu sắc như vậy là do một hiệu ứng gọi là
cộng hưởng plasmon bề mặt. Chỉ có các hạt nano kim loại, trong đó các điện tử tự do
mới có hấp thụ ở vùng ánh sáng khả kiến làm cho chúng có hiện tượng quang học trên
[26].
1.1.2. Hạt nano bạc

Bạc nano là những hạt bạc có kích thước nằm trong khoảng 0,1 đến 100nm.
Bạc nano thường ở dưới dạng các dung dịch keo với các chất bảo vệ là các polymer
(polyvinylalcol PVA, polyethylenglycol PEG, polyvinyl pyrolidone PVP) để các hạt
nano bạc không bị kết tụ. Bạc ở kích thước nano có những đặc trưng rất khác so với
bạc bình thường. Đó là một kháng sinh tự nhiên và rất mạnh, có khả năng phòng ngừa
nhiều bệnh truyền nhiễm. Tính chất kháng khuẩn của dung dịch keo nano bạc đã được
tìm hiểu một cách khoa học vào đầu thế kỉ 20, Nhưng sự phát minh ra thuốc kháng
sinh đã ngăn cản những nghiên cứu sâu trong lĩnh vực này. Những năm gần đây, do
công nghệ nano phát triển và do các kháng sinh càng ngày càng bị lờn với vi khuẩn,
nên việc nghiên cứu ứng dụng nano bạc trrong lĩnh vực Y sinh học được quan tâm
nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ [26].
Nhìn chung, nano bạc có những đặc điểm đáng quan tâm sau đây:
Diệt trên 650 loại vi khuẩn
Hiệu quả cao
Tác dụng nhanh
Không độc
Không kích thích
Không gây dị ứng
Tính kháng khuẩn của nano bạc được giải thích theo một số cơ chế sau:
Với tính chất xúc tác, nano bạc vô hiệu hóa các enzyme mà vi khuẩn và nấm
cần cho quá trình trao đổi chất của tế bào dẫn đến rối loạn quá trình biến dưỡng của vi
khuẩn. Tác động này làm cho vi khuẩn bị tiêu diệt nhanh chóng [9].

10


Hạt nano bạc liên kết với các nhóm chứa phospho trong phân tử DNA làm rối
loạn quá trình sao chép DNA làm chết vi khuẩn [31].
Các hạt nano bạc tương tác với nhóm –SH của các protein, enzyme trên màng
tế bào dẫn đến sự thay đổi hình thái và gia tăng tính thấm của màng. Sự vận chuyển

vật chất qua màng tăng làm vỡ màng tế bào của vi khuẩn [31].
Nano bạc giúp tạo ra các oxygen hoạt tính từ trong nước hoặc không khí tương
tác với các lipid màng làm tổn thương màng [31].

Hình 1.1 Cơ chế diệt khuẩn của nano bạc
Nhờ có kích thước rất nhỏ (0,1nm – 100nm), Diện tích bề mặt tổng cộng của
nano bạc rất lớn và hiệu quả hoạt động của nano bạc tăng đáng kể so với hạt bạc có
kích thước lớn hơn (micro). Đây là ưu điểm của hạt nano bạc so với hạt bạc có kích
thước lớn và với ion. Theo tính toán lý thuyết nano bạc có hoạt tính mạnh hơn ít nhất
40 lần trên mỗi đơn vị bạc so những dung dịch keo bạc thông thường. Vì vậy, người ta
có thể sử dụng ít bạc hơn để đạt được hiệu quả tương đương. Điều này rất có ý nghĩa
vì theo EPA (Environmental Protection Agency), một người chỉ có thể dùng tối đa 350
µg/ liều dùng mỗi ngày, nếu nhiều hơn sẽ bị hiện tượng Argyria hay còn gọi là trúng
độc bạc. Nếu dùng 1 đến 2 muỗng cà phê/ngày (20ppm) tương đương 100 – 200
μg/ngày (thấp hơn so với khuyến cáo của EPA về hàm lượng bạc trong nguồn nước
cung cấp ở Mỹ), ta sẽ có hiệu quả phòng bệnh rất tốt. Điều này đảm bảo cho người

11


dùng có thể sử dụng nano bạc như một chất bổ sung trong bữa ăn hay trong nước uống
mà không bị hiện tượng Argyria [26].
Về ảnh hưởng của nano bạc đến sức khỏe con người, các nhà khoa học cho rằng
nano bạc có khả năng diệt vi khuẩn, mà tiêu hóa của con người có được là do các vi
khuẩn có lợi cho cơ thể và vì thế, họ vẫn nghi ngờ rằng các hạt nano bạc cũng có thể
diệt các vi khuẩn này và ảnh hưởng đến sức khỏe. Tuy nhiên cho đến nay chưa thấy
công trình nào công bố sự tác hại của nano bạc. Các nghiên cứu tại Odense
Universitets Hospital [26] cũng đã chứng minh rằng các hạt nano bạc được hấp thu
vào trong cơ thể mà không hề gây ra một tác dụng phụ nào cúng như gây độc cho cơ
thể. Các nhà khoa học còn chứng minh các hạt nano bạc sẽ được giải phóng ra cơ thể

theo thời gian [26]. Các hãng sản xuất những sản phẩm chức nano bạc chẳng hạn như
Samsung phát biểu rằng các sản phẩm của họ đều được thử nghiệm và cho đến nay họ
vẫn khẳng định tính an toàn của nó đói với sức khỏe của người sử dụng [3].
1.1.3. Một số ứng dụng của nano bạc
Trong y học
Một số sản phẩm chứa nano bạc như khăn ăn, khăn vệ sinh khô cho cả bé lẫn
người lớn, băng đắp bỏng, đắp vết thương, găng tay, quần áo dùng trong y tế với khả
năng diệt khuẩn cao tới 99%.
Hãng dược phẩm Nucryst ở Fort Saskachevan, Alberta (Canada) đã đưa bạc
nano vào miếng băng gạc để băng những vết loét do bỏng vì chúng có tác dụng diệt
khuẩn mạnh hơn so với hạt bạc bình thường.
Trong công nghiệp
Bạc nano được đưa vào các polymer như polyethylene (PE), polypropylene
(PP) có khả năng giết chết nhiều loại vi khuẩn: tụ cầu khuẩn vàng, Bacillus
pneumoniae, E.coli... Ứng dụng của việc phân bố nano trong các chất dẻo, polymer,
hiện nay người ta đã sản xuất các mặt hàng tiêu dùng có tính kháng khuẩn chứ các hạt
nano bạc như tủ lạnh; máy điều hòa; máy giặt, trong máy giặt công nghệ nano bạc tạo
thành hệ thống diệt khuẩn của máy mà không cần phải đun sôi nước, cách làm trên vừa
ít hao tốn điện năng những vẫn đảm bảo hiệu quả; ngoài ra còn ứng dụng vào bình sữa
cho trẻ sơ sinh; hộp đựng thực phẩm...v.v.

12


Hãng Mummybear (Hàn Quốc) gần đây đã giới thiệu công nghệ Nano Silver
được ứng dụng vào sản xuất bình sữa và dụng cụ đựng thức ăn cho trẻ. Những sản
phẩm này đã được bộ y tế, Viện dinh dưỡng, Cục an toàn vệ sinh thực phẩm,
Vinacontrol cấp chứng nhận tiêu chuẩn sản phẩm và chất lượng.
Ngoài ra, ngày nay người ta còn ứng dụng nano bạc trong các sản phẩm như
nước rửa rau, các loại sơn, mỹ phẩm,...v.v.

Trong nông nghiệp
Sản phẩm thuốc trừ bệnh cây MIFUM 0,6 DD được sản xuất với nồng độ hạt
nano bạc 1000ppm và chitosan 5000ppm. MIFUM 0,6 DD được khảo nghiệm trừ bệnh
đạo ôn, lem lép hạt trên lúa thuộc địa bàn tỉnh Lâm Đồng và đã được chứng tỏ ưu việt
của mình, cả 2 liều lượng 0,5 lít MIFUM 0,6 DD và 1 lít MIFUM 0,6 DD/ha đều cho
hiệu quả cao trong việt phòng trừ bệnh đạo ôn cổ bông, lem lép hạt trên lúa, nhất là
trong giai đoạn 3 – 7 ngày sau khi phun.
Trong công nghệ xử lý nước
Việc sử dụng nano bạc trong công nghệ xử lý nước khá mới mẻ. Do bề mặt
riêng khá lớn, hạt nano bạc có hoạt tính khá cao trong vấn đề xử lý nước nhiễm khuẩn
và đã được khá nhiều nhà khoa học nghiên cứu [10]. Phòng thí nghiệm Công nghệ
Nano đã sử dụng vật liệu polyurethane mút xốp tẩm nano bạc (PU/Ag) để xử lý nước
uống nhiễm khuẩn E.coli. Nước qua hệ thống lọc PU/Ag không còn vi khuẩn và uống
được theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) [5].
1.1.4. Các phương pháp chế tạo nano bạc và nhận diện nano bạc
Có hai phương pháp để tạo vật liệu nano, phương pháp từ dưới lên và phương
pháp từ trên xuống. Phương pháp từ dưới lên là tạo hạt nano từ các ion hoặc các
nguyên tử kết hợp lại với nhau. Phương pháp từ trên xuống là phương pháp tạo vật
liệu nano từ vật liệu khối ban đầu.
Đối với hạt nano kim loại như hạt nano vàng, bạc, bạch kim,... thì phương pháp
thường được áp dụng là phương pháp từ dưới lên. Nguyên tắc là khử các ion kim loại
như Ag+, Au+ để tạo thành các nguyên tử Ag và Au. Các nguyên tử sẽ liên kết với nhau
tạo ra hạt nano. Các phương pháp từ trên xuống ít được dùng hơn nhưng thời gian gần
đây đã có những bước tiến trong việc nghiên cứu theo phương pháp này.

13


Phương pháp khử hóa học
Trong phương pháp này, ion Ag+ dưới tác dụng của chất khử sẽ tạo ra nguyên tử

Ag0, sau đó các nguyên tử này kết hợp với nhau tạo thành các hạt nano bạc [2].
Các tác nhân hóa học có thể sử dụng là: NaBH 4, sodium citrate, citric acid,
EDTA, ethanol, ethylene glycol, hydrogen, hydrogen peroxid, hydroxylamine,
hydrazine, formaldehyde và các dẫn xuất của nó [1], [31], [30]...v.v.
Để các hạt phân tán tốt trong dung môi mà không bị kết tụ thành đám, người ta
sử dụng phương pháp tĩnh điện để làm cho bề mặt các hạt nano có cùng điện tích và
đẩy nhau hoặc dùng phương pháp bao bọc chất hoạt động bề mặt. Phương pháp tĩnh
điện đơn giản nhưng bị giới hạn bởi một số chất khử. Phương pháp bao phủ phức tạp
nhưng vạn năng hơn, hơn nữa phương pháp này có thể làm cho bề mặt hạt nano có các
tính chất cần thiết cho các ứng dụng. Các hạt nano Ag, Au, Pt, Pd, Rh với kích thước
từ 10 đến 100 nm có thể được chế tạo từ phương pháp này.
Phương pháp khử vật lý
Phương pháp này sử dụng các tác nhân vật lý như điện tử, sóng điện từ năng
lượng cao như tia gamma, tia hồng ngoại, tia tử ngoại, tia laser, tia UV để khử ion Ag +
thành nguyên tử Ag0 [37], [34]. Dung dịch muối bạc không có thêm chất phụ gia nào
khác có thể được chiếu bằng phương pháp chiếu xạ với bức xạ năng lượng cao, quá
trình này tạo ra các electron hydrate hóa và hydro nguyên tử có khả năng khử bạc ion.
Phương pháp khử hóa lý
Đây là phương pháp trung gian giữa hóa học và vật lý. Nguyên lý là dùng
phương pháp điện phân kết hợp với sóng siêu âm để tạo hạt nano. Phương pháp điện
phân thông thường chỉ có thể tạo được màng mỏng kim loại. Trước khi xảy ra sự hình
thành màng, các nguyên tử kim loại sau khi được điện hóa sẽ tạo các hạt nano bám lên
điện cực âm. Lúc này người ta tác dụng một xung siêu âm đồng bộ với xung điện phân
thì hạt nano kim loại sẽ rời khỏi điện cực và đi vào dung dịch[2].
Phương pháp khử sinh học
Phương pháp sinh học sử dụng các tác nhân như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm có
khả năng khử ion bạc tạo nguyên tử bạc kim loại.
Từ lâu người ta đã biết các vi sinh vật như vi khuẩn, nấm men, nấm mốc giữ vai
trò quan trọng trong việc xử lý các độc tố kim loại nhờ khả năng khử các ion kim loại.

14


Sastry và cộng sự [16] đã nhận thấy có sự hình thành các hạt nano vàng khi cho loài
nấm Verticillum sp. tiếp xúc với ion vàng. Klaus và cộng sự [9] cũng đã chứng minh
được có sự hiện của nano bạc trong vùng chu chất của Pseudomonas stutzeri AG259
khi cho vi khuẩn này tiếp xúc với dung dịch bạc nitrate. Tuy nhiên việc áp dụng đặc
tính khử kim loại để biến vi sinh vật thành các nhà máy sản xuất các hạt nano kim loại
chỉ mới được quan tâm đến trong thời gian gần đây [8].
Phương pháp này có nhiều ưu điểm như: thiết bị nuôi cấy đơn giản, môi trường
nuôi cấy rẻ tiền, không phụ thuộc nhiều vào hóa chất và thiết bị đắt tiền, dễ thực hiện,
thân thiện với môi trường do không sử dụng các hóa chất độc hại. Ngoài ra nó có thể
áp dụng với quy mô sản xuất lớn mà chi phí đầu tư ban đầu lại rất thấp. Vì vậy, các
nhà nghiên cứu ngày càng quan tâm đến các phương pháp sinh tổng hợp. Phương pháp
sinh tổng hợp tạo ra các hạt nano bạc có khả năng sản xuất với qui mô lớn do các hạt
được ổn định ngay trong quy trình sản xuất bởi các protein, chúng giúp tạo lớp bảo vệ
cho các hạt nano bạc.
Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc
Theo một số tài liệu thì các nhà khoa học đã nghiên cứu và chỉ ra rằng một số
chủng vi sinh vật sau đây có khả năng tổng hợp nano bạc [7], [8], [31], [26], [32], [18]:
Nấm: Fusarium oxysporum, Fusarium semitectum, Aspergillus fumigatus,
Aspergillus

flavus,

Phaenerochaete

chrysosporium,

Penicillium

fellutanum,

Verticillium sp…v.v.
Vi khuẩn: Pseudomonas stutzeri,, Lactobacillus sp, Bacillus licheniformis,
Bacillus subtilis, Klebsiella pneumonia…v.v.
Xạ khuẩn: Rhodococcus sp, Thermomonospora…v.v.
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở vi sinh vật vẫn chưa được tìm hiểu
tường tận nhưng đa số giả thuyết cho rằng quá trình này liên quan đến hoạt động của
enzyme khử nitrate (nitrate reductase) do vi sinh vật tiết ra. Quá trình khử bắt đầu bởi
sự vận chuyển electron từ các chất cho electron đến Ag + để khử các ion Ag+ tạo thành
các nguyên tử Ag. Các enzyme phụ thuộc NADH như nitrate reductase đóng vai trò
chất vận chuyển điện tử. Bên cạnh các enzyme này, một số naphthoquinone và
anthraquinone tìm thấy ở nấm Fusarium oxysporum cũng có thể đóng vai trò chất

15


truyền điện tử trong quá trình khử kim loại bởi tính chất oxi hóa khử đặc trưng của
chúng [7], [34].
Dựa vào vị trí của các đám nguyên tử nano bạc được tổng hợp mà người ta chia
quá trình tổng hợp sinh học thành hai dạng [29]:
Tổng hợp nội bào: sản phẩm nano bạc tạo ra nằm bên trong tế bào. Các chủng
vi sinh vật có khả năng tổng hợp nano bạc nội bào là Psedomonas stutzeri [8],
Rhodococcus sp, Verticillium sp, Bacillus licheniformis [20]...
Vì sản phẩm nano bạc tạo ra nằm trong tế bào nên để nhận được sản phẩm cần
phải phá vỡ màng tế bào bằng hóa chất hoặc sóng siêu âm, sau đó ly tâm tách bỏ các
mãnh vỡ tế bào. Theo S.Basavaraja [26] ưu điểm của quá trình này là có thể kiểm soát
được kích thước hạt nano bạc.
Tổng hợp ngoại bào: sản phẩm được tạo ra nằm bên ngoài tế bào vi sinh vật.

Các chủng Fusarium oxysporum [7], Fusarium semitectum [26], Aspergillus fumigatus
[8], Aspergillus flavus [31], Phaenerochaete chrysosporium [26], Lactobacillus sp
[32], Penicillium fellutanum [18],… tổng hợp nano bạc theo kiểu này.
Để thu sản phẩm nano bạc ngoại bào cần dùng các phương pháp tách tế bào ra
khỏi dịch nuôi cấy như ly tâm, lọc… sau đó thu lấy phần dịch nổi.
Theo tài liệu [26], ưu điểm của quá trình này là không cần đến các phương pháp
phá màng tế bào để thu nhận sản phẩm.
Các phương pháp nhận diện nano bạc
-

Phương pháp phổ tử ngoại và phổ khả kiến UV – Vis

Phương pháp này dùng để xác định độ tinh khiết của một hợp chất, nhận biết
cấu trúc các chất, phân tích hỗn hợp xác định khối lượng phân tử, dự đoán kích thước
phân tử…, khi tiến hành đo phổ của các mẫu thì mỗi mẫu sẽ cho ta một dạng phổ có
chiều cao đỉnh phổ xác định và đặc trưng cho dạng hợp chất đó. Do vậy khi đo phổ
hấp thu của dung dịch bạc nano ta sẽ thu được dạng phổ có đỉnh với chiều cao lớn nhất
ứng với bước sóng khoảng 380 - 450 nm. Từ kết quả đó ta sẽ xác định được sơ bộ rằng
ta đã chế tạo ra dung dịch bạc nano [26].

16


Hình 1.2 Phổ UV – Vis của dung dịch nano bạc [32]
-

Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua - Transmission Electron Microscopy (TEM) là
một công cụ rất mạnh trong việc nghiên cứu cấu trúc ở cấp độ nano. Nó cho phép quan

sát chính xác cấu trúc nano với độ phân giải lên đến 0,2 nm. Do đó, phương pháp này
ngày càng được sử dụng rộng rãi trong việc nghiên cứu vật liệu nano. Nguyên tắc của
phương pháp hiển vi điện tử truyền qua: trong phương pháp này, hình ảnh thu được
chính là do sự tán xạ của chùm electron xuyên qua mẫu.
Công dụng chủ yếu của thiết bị này là để xác định một cách chính xác kích
thước của hạt nano mà cụ thể ở đây là hạt nano bạc tạo thành. Dựa vào ảnh chụp các
phần tử nano bạc bằng kính hiển vi điện tử truyền qua chúng ta xác định được kích
thước và hình dáng của hạt nano tạo thành, đồng thời xem xét xem kích thước đó đã
đảm bảo là tốt hay chưa để hoạch định quá trình điều chế nano bạc.
-

Máy đo nhiễu xạ tia X (XRD)

Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray diffraction) được sử dụng để phân tích các
vật liệu có cấu trúc, nó cho phép xác định hằng số mạng và các đỉnh đặc trưng cho các
cấu trúc đó. Đối với kim loại, phương pháp XRD cho phép xác định chính xác sự tồn
tại của kim loại trong mẫu dựa trên các đỉnh thu được so sánh với các đỉnh chuẩn của
nguyên tố đó.

17


Hình 1.3 Phổ XRD của nano bạc (Nguồn: Công ty TNHH nghiên cứu khoa học
và phát triển công nghệ HELEN)
1.2. Khái quát chung về bacillus licheniformis
1.2.1. Phân loại khoa học vi khuẩn Bacillus licheniformis
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Bacillales

Họ: Bacillaceae
Chi: Bacillus
Loài: Bacillus licheniformis
1.2.2. Đặc điểm phân bố
Bacillus licheniformis là vi khuẩn thường được tìm thấy trong đất. Nó được tìm
thấy trên lông chim, đặc biệt là ngực và lưng bộ lông, và thường xuyên nhất trong các
loài chim ở trên mặt đất và các loài chim thủy sinh. B. licheniformis còn được tìm thấy
và phân lập ở các suối nước nóng [26].
1.2.3. Đặc điểm hình thái, sinh hóa
Hình thái: Là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng di động và khả năng
Tạo nội bào tử (endospore) [26] gần như hình cầu giúp nó tồn tại trong thời
gian dài khi gặp điều kiện sống khắc nghiệt.
Bộ gen: Có chiều dài là 4,22Mb chứa khoảng 4200 gen mã hóa cho 4192
protein [34].

18


Đặc điểm sinh hóa: B. licheniformis cho phản ứng catalase dương tính, sử dụng
khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Có thể
tổng hợp một lượng lớn enzyme amylase và protease [1]. Có khả năng gây ngộ độc
thực phẩm với các triệu chứng như: đau bụng, tiêu chảy, nôn mữa [7].
1.2.4. Đặc điểm nuôi cấy
Là vi khuẩn chịu nhiệt có thể sống ở nhiệt độ 55 oC, dễ nuôi cấy ở môi trường
thông thường như LB, pH thích hợp cho sự phát triển là pH = 7.
Không giống với các thành viên khác trong chi Bacillus là các vi sinh vật hiếu
khí, Bacillus licheniformis là vi sinh vật kị khí tùy ý.
Sau 18 – 20 giờ nuôi cấy, vi khuẩn mọc thành váng trên bề mặt môi trường.
Bacillus licheniformis dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, khuẩn lạc
có màu trắng đục, lồi, bề mặt sần sùi.

Vi khuẩn này thường được sử dụng trong công nghiệp chất tẩy, bột giặt, xử lý
nước thải do có khả năng tiết enzyme protease, amylase ngoại bào, ngoài ra còn được
dùng làm thuốc trừ nấm bệnh trên cây trồng.
1.2.5. Cơ chế tổng hợp nano bạc và nhận diện nano bạc
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy vi khuẩn này có khả năng sinh tổng hợp
nano bạc nội bào khi cho nó tiếp xúc với dung dịch muối nitrate bạc [20], [25].
Cơ chế của quá trình tổng hợp nano bạc ở loài này vẫn chưa được xác định cụ
thể. Nhưng theo Kalimuthu cùng cộng sự (2008) [20] thì B. licheniformis có khả năng
tổng hợp NADH và các enzyme phụ thuộc vào NADH ở bên trong tế bào của nó, trong
đó quan trọng nhất là enzyme nitrate reductase (enzyme khử nitrate) được mô tả như
hình 1.2. Enzyme này có vai trò khử gốc NO 3- và vận chuyển electron từ chất cho
electron là NADH đến chất nhận là Ag+ để khử Ag+ thành Ag0.

19


Hình 1.4 Cơ chế tổng hợp nano bạc ở vi khuẩn Bacillus licheniformis [20]
1.3. Một số nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc từ vi sinh vật ở trong nước và trên
thế giới
1.3.1. Một số nghiên cứu trên thế giới
Vào năm 2001 Klaus-Joerger nhận thấy vi khuẩn Pseudomonas stutzeri AG259
phân lập từ mỏ bạc có thể khử Ag + trong dung dịch muối AgNO3 thành các hạt Ag
nano trong vùng chu chất của nó [8].
Tiếp sau đó, rất nhiều báo cáo cho thấy các chủng vi sinh đơn bào (vi khuẩn)
hoặc đa bào (nấm sợi, nấm đảm) đều có khả năng khử Ag + tạo bạc nano theo các cơ
chế ngoại bào hoặc nội bào. Cụ thế như A.Ahmad chứng minh khả năng tổng hợp nano
bạc của nấm Fusariuim oxysporum [7]. Sastry và cộng sự nhận thấy Verticillium sp và
Fusariuim oxysporum khi tiếp xúc với ion Au3+ và Ag+ sẽ nhanh chóng khử các ion
này tạo thành hạt nano kim loại. N.Duran nghiên cứu cơ chế khử Ag + thành Ag0 của
F.oxysporum [34]. S.Basavaraja khảo sát quá trình sinh tổng hợp bạc nano ngoại bào

bởi nấm Fusarium semitectum [26]. K.C.Bhainsa xác định có sự hình thành nano bạc
khi cho nấm Aspergillus flavus tiếp xúc với muối bạc nitrate. K.Kalimuthu khảo sát
khả năng tổng hợp nano bạc của vi khuẩn Bacillus licheniformis [16]. N.Saifuddin
nghiên cứu phương pháp tổng hợp nano bạc nhờ Bacillus subtilis [29]. N.Mokhtari sử
dụng Klebsiella pneumonia để thu nhận bạc nano [20].
Đã có báo cáo rằng các hạt nano bạc có độ ổn định cao (40 nm) có thể được
tổng hợp bằng cách hấp thụ các ion bạc dung dịch với sự có mặt của môi trường của vi

20


khuẩn không gây bệnh, Bacillus licheniformis (Kalishwaralal và cộng sự 2008b). Hơn
nữa, các tinh thể bạc nano bạc phân tán tốt (50 nm) được tổng hợp bằng cách sử dụng
vi khuẩn Bacillus licheniformis (Kalishwaralal và cộng sự 2008a). Saifuddin
(Saifuddin và cộng sự, 2009) [33] đã mô tả một cách tiếp cận mới tổng hợp tổng hợp
để hình thành các hạt nano bạc bằng cách sử dụng sự kết hợp của môi trường trên bề
mặt của B. subtilis và bức xạ vi sóng trong nước. Họ đã báo cáo sự tổng hợp tế bào
ngoại bào của các hạt nano Ag phân tán (5-50nm) bằng cách sử dụng các chất siêu phủ
của B. subtilis, nhưng để tăng tỷ lệ phản ứng và giảm sự kết hợp của các hạt nano được
tạo ra, họ đã sử dụng bức xạ vi sóng có thể cung cấp sự nóng lên đồng nhất xung
quanh Các hạt nano và có thể hỗ trợ quá trình chín của các hạt không có sự tổng hợp.
Các tinh thể nano bạc của các chế phẩm khác nhau được tổng hợp thành công bởi
Pseudomonas stutzeri AG259 (Klaus và cộng sự, 1999) [9]. Các chủng vi khuẩn kháng
bạc, Pseudomonas stutzeri AG259, phân lập từ một mỏ bạc, tích tụ các hạt nano bạc
bên trong nội tạng, cùng với một số sulfua bạc, có kích thước từ 35 đến 46nm
(Slawson và cộng sự, 1992). Các hạt lớn hơn được hình thành khi P. stutzeri AG259
thử thách với nồng độ cao của ion bạc trong quá trình nuôi cấy, dẫn đến sự tạo thành
các hạt nano bạc trong tế bào có kích thước khác nhau từ vài nm đến 200 nm (KlausJoerger et al 2001, Klaus và cộng sự, 1999) [9]. Trong một nghiên cứu khác, đã được
báo cáo về sự tổng hợp nhanh các hạt nano kim loại bạc bằng cách sử dụng sự giảm
các ion Ag+ trong dung dịch bởi các siêu vi trùng của Klebsiella pneumonia, E. coli, và

Enterobacter cloacae (Enterobacteriacae) (Shahverdi và cộng sự, 2007) [36]. Quá
trình tổng hợp là khá nhanh và các hạt nano bạc đã được hình thành trong vòng 5 phút
của các ion bạc tiếp xúc với tế bào lọc. Enzyme nitrat reductase có thể có trách nhiệm
cho việc hấp thụ các ion bạc. Người ta cũng cho biết phát xạ ánh sáng nhìn thấy có thể
làm tăng tổng hợp các hạt nano bạc (1-6 nm) bởi các chất siêu phủ của K. pneumoniae
(Mokhtari và cộng sự, 2009) [32]. Các hạt nano bạc phân tán và ổn định cũng được
tổng hợp thành công với công nghệ sinh học [Ag (NH 3)2]+ sử dụng Aeromonas sp.
SH10 và Corynebacterium sp. SH09 (Mouxing và cộng sự, 2006). Người ta đã tiên
đoán rằng [Ag (NH3)2]+ phản ứng đầu tiên với OH- tạo ra Ag2O, sau đó chuyển hóa
thành độc lập và giảm đến các hạt nano bạc bằng sinh khối. Các dòng Lactobacillus,
khi tiếp xúc với ion bạc, dẫn đến sự tổng hợp các hạt nano trong tế bào vi khuẩn (Nair

21


và Pradeep 2002) [32]. Người ta đã báo cáo rằng sự phơi nhiễm của vi khuẩn lactic có
trong sữa chua với hỗn hợp các ion bạc có thể được sử dụng để phát triển các hạt nano
bạc. Sự tạo mầm của hạt nano bạc xảy ra trên bề mặt tế bào qua đường và các enzyme
trong thành tế bào, và sau đó các hạt nhân kim loại đã được vận chuyển vào tế bào, nơi
chúng được tổng hợp và phát triển thành những hạt lớn hơn.
Các vi sinh vật sử dụng hệ enzyme khử nitrate để đưa AgNO 3 về Ag tạo nên
những hạt nano có kích thước rất nhỏ, chỉ khoảng dưới 40nm, do đó làm tăng hiệu quả
kháng khuẩn khi so sánh với phương pháp hoá – lý cổ điển [8].
1.3.2. Một số nghiên cứu trong nước
Hiện nay, hướng sinh tổng hợp nano bạc ứng dụng công nghệ vi sinh vật đang
được nghiên cứu và mới phát triển tại Việt Nam. Một số nghiên cứu tiêu biểu như:
Nghiên cứu sinh tổng hợp bạc nano bằng nấm Fusarium oxysporum (Nguyễn Hoàng
Ngọc Phương và cộng sự (2009)), Nghiên cứu sinh tổng hợp nano bạc bằng sinh khối
vi khuẩn B.subtilis và B.licheniformis (Phan Huê Phương (2010)) nghiên cứu này đã
mở ra con đường sinh tổng hợp nano bạc bằng cách khảo sát sinh khối ủ với AgNO 3.

Nghiên cứu sử dụng dịch nội bào Bacillus subtilis để tổng hợp hạt nano bạc (AgNP –
silver nanoparticle) Nhóm tác giả Trần Đăng Khoa, Đỗ Thụy Thủy Tiên, Ngô Đại
Nghiệp (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM) sử dụng dịch
nội bào vi khuẩn Bacillus subtlis chuyển hóa AgNO3 thành dung dịch AgNP. Hạt nano
bạc được tổng hợp tốt nhất ở 60 0C với pH = 7.0 và tỷ lệ dịch nội bào với bạc nitrate là
3:17.
Như vậy, nano bạc tổng hợp từ vi sinh vật có nhưng ưu điểm như: kích thước
hình cầu, được bảo vệ bởi protein nội bào, không sử dụng hóa chất độc hại, thân thiện
với môi trường... Sẽ có ý nghĩa trong việc ứng dụng sản xuất phục vụ các lĩnh vực điều
trị trong vật liệu Y – Sinh, dược phẩm, các loại chế phẩm trong nông nghiệp... Việc
nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp nano bạc từ chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis
phân lập từ phân chim cút là nghiên cứu cần thiết.

22


CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu phân chim cút được lấy tại xã Điện Thắng, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng
Nam.
- Vi khuẩn Bacillus licheniformis phân lập từ phân chim cút ủ 25 – 30 ngày
- Ba dòng vi khuẩn gây bệnh được dùng kiểm định trong nghiên cứu này bao
gồm E.coli, Bacillus cereus, Ralstonia solanacearum (giống bảo quản lạnh sâu -22oC)
được cung cấp bởi được cung cấp bởi khoa sinh – môi trường, Đại học Sư phạm – Đại
học Đà Nẵng.
2.1.2. Phạm vi nghiên cứu
Địa điểm thu mẫu ở thực địa:
Xã Điện Thắng, thị xã Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam.
Địa điểm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:

Phòng thí nghiệm Vi sinh – hóa sinh – sinh lý thực vật, PTN Công nghệ sinh
học, PTN sinh học phân tử thuộc khoa Sinh – Môi trường, trường Đại học Sư Phạm –
Đại học Đà Nẵng.
2.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập, định danh chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis từ phân
chim cút.
Nội dung 2: Khảo sát khả năng sinh tổng hợp nano bạc từ dịch ngoại bào và
sinh khối Bacillus licheniformis:
-

Khảo sát thời gian sinh tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis;

-

Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ AgNO3 (1mM, 2mM) đến quá trình sinh
tổng hợp nano bạc của Bacillus licheniformis;

-

Phân tích giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD);

-

Phân tích hình dạng hạt nano bạc thông qua kính hiển vi điện tử truyền qua
(TEM).

23


2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm sinh tổng hợp nano bạc được bố trí theo sơ đồ sau đây:

Phân lập vi khuẩn từ mẫu phân
chim cút ủ hoai
Định danh chủng vi sinh
vật
Giữ giống
Hoạt hóa giống

Nuôi cấy chìm trong môi trường LB lỏng
(30oC, 150rpm, 24h)

Ly tâm 6000rpm/15
phút
Trộn 100ml dịch
ngoại bào với 100ml
AgNO3 (1mM,
2mM)

Che kín bình, lắc
150rpm, 5 ngày

Trộn 5g sinh khối ướt
với 100ml AgNO3
(1mM, 2mM)

Che kín bình, lắc
150rpm, 5 ngày

Trộn 5g sinh khối ướt
với 100ml nước cất, lắc
150rpm, 1-2 ngày
Ly tâm thu dịch,
trộn với 100ml
AgNO3 (1mM,
2mM)

Che kín bình, lắc
150pm, 5 ngày

24


Hình 2.1 Sơ đồ sinh tổng hợp nano bạc từ vi khuẩn Bacillus licheniformis

Bảng 2.1 Bố trí các lô thí nghiệm, [25], [35]
Công thức 1 (CT1)
Dịch ngoại bào (vi sinh

Công thức 2 (CT2)
Sinh khối + Dung dịch

Công thức 3 (CT3)
Dịch ngoại bào (vi sinh

tiết ra môi trường) +

AgNO3 (1mM, 2mM)

vật tiết ra nước cất) +

Dung dịch AgNO3

Dung dịch AgNO3

(1mM, 2mM)

(1mM, 2mM)

Ở CT1, 100ml dịch nổi sau ly tâm (dịch ngoại bào) sẽ được ủ với 100ml AgNO3
1mM và 2mM, các bình ủ sẽ được che kín, lắc ở 150rpm trong thời gian từ 1 – 6 ngày,
thu dịch tổng hợp.
Ở CT2, trộn 5g sinh khối ướt với 100ml AgNO3 1mM và 2mM các bình ủ sẽ
được che kín, lắc ở 150rpm trong thời gian từ 1 – 6 ngày, sau đó tiến hành phá vỡ tế
bào vi khuẩn bằng cách cho vào máy siêu âm với sóng siêu âm tần số 37 KHz trong 15
phút (chia thành 5 chu kỳ, mỗi chu kỳ 3 phút). Ly tâm 6000rpm/15 phút, bỏ xác tế bào,
thu dịch tổng hợp.
Ở CT3, sinh khối sau khi lắc với nước cất từ 1 – 2 ngày (dịch lọc) sẽ được ly
tâm bỏ sinh khối và dịch lọc sẽ ủ với AgNO3 1mM và 2mM, các bình ủ sẽ được che
kín, lắc ở 150rpm trong thời gian 1 – 6 ngày, thu dịch tổng hợp
Sau khi thu được dịch tổng hợp nano bạc từ các công thức trên, tiến hành quét
phổ UV – Vis ở bước sóng 300 – 70nm, kiểm tính tra kháng khuẩn của dịch nano bạc,
phân tích nhiễu xạ tia X (XRD), chụp kính hiển vi điện tử truyền qua TEM.
2.3.2. Phương pháp thu mẫu và phân lập
- Thu mẫu: Mẫu phân chim cút sau 25 – 30 ngày được thu tại xã Điện Thắng –
thị xã Điện Bàn – tỉnh Quảng Nam, mẫu được bảo quản nhiệt độ phòng.
- Phân lập: Các mẫu được phân lập trên môi trường thạch Luria – Bertani (LB),
pH7 bao gồm: pepton 10g/l, cao nấm men 5g/l, NaCl 10g/l, agar 20g/l.
Mẫu được rửa sạch trong nước cất vô trùng và tiến hành pha loãng mẫu với

nước cất vô trùng ở các nồng độ từ 10 -3 – 10-7. Hút 100µl dịch pha loãng mỗi mẫu

25