KĨ THUẬT WESTERN BLOT

KĨ THUẬT WESTERN BLOT
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT
1.1 Sơ lược về Sir Edwin Southern
1.1.1 Sơ lược cá nhân
1.1.2 Thành tựu
1.2 Khái niệm
1.3 Nguyên lí
1.4 Quy trình
1.4.1 chuẩn bị mẫu
1.4.2 chạy điện di một chiều với SDS page
1.4.3 Chuyển protein từ gen đến màng
1.4.4 Lai với Antibody
1.4.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh
1.5 Ưu, nhược điểm
1.5.1 Ưu điểm
1.5.2 Nhược điểm
1.5.3 Đọc kết quả xét nghiệm western blot
1.6 Hệ thống V3 Western Blot.
1.7 So sánh với phương pháp ELISA
1.8 Ứng dụng

CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG
2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giới và ở Việt Nam
2.1.1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới
2.1.2 Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
2.2 giới thiệu hội chứng Taura-TS
2.2.1 Khái niệm
2.2.2 Đặc điểm cấu trúc của gene của Taura-TS
2.2.3 Biểu hiện bệnh hội chứng Taura ở tôm

2.3 Các phương pháp và kĩ thuật chuẩn đoán virus Taura
2.3.1 Chuẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng
2.3.2 Phương pháp miễn dịch
2.3.3 phương pháp chuẩn đoán mẫu dỏ gene
2.4 Vật liệu và phương pháp
2.4.1 Các dung dịch gốc để nhuộm màu gel
2.4.2 Các dung dịch để thực hiện Western Blot
2.4.3 Vật liệu
2.4.3.1 Kháng thể
1

1


2.4.3.2 Mẫu
2.4.4 Phương pháp
2.5 Kết quả
KẾT LUẬN
TÀI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU
Với những thành công trong công nghệ sinh học trong những năm gần
đây, trên thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ
thực vật đã có sự chuyển hướng rõ rệt. Cùng với những thành công lớn trong
công nghệ sinh học, thì các kĩ thuật về sinh học phân tử ra đời: phương pháp
western blot, PCR,…Phương pháp western blot là một kĩ thuật quan tromg được
sử dụng trong tế bào và sinh học phân tử. Bằng cách sử dụng western blot, các
nhà nghiên cứu có thể xác định được protein cụ thể trong một hỗn hợp phức
tạp có chứa các protein chiết xuất từ tế bào.
CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT

1.1 Sơ lược về Sir Edwin Southern
1.1.1 Sơ lược cá nhân.

2

2


-

Sir Edwin Southern là một nhà sinh học phân tử người
Anh từng đoạt giải thưởng Lasker, giáo sư danh dự tại Đại
học Oxford và là đồng nghiệp của Trinity College, Oxford.
Ông được biết đến rộng rãi nhất với việc phát minh ra blot
miền Nam, xuất bản năm 1975 và hiện là một quy trình
thí nghiệm phổ biến và phát triển Southern blot cho DNA
vào năm 1997.

1.1.2 Thành tựu
- Người chiến thắng trong giải thưởng quốc tế Gairdner
-

Foundation (1990)
Trao tặng Huân Chương Hoàng gia của Hội Hoàng Gia

-

London (1998)
Giải thưởng danh giá Albert Lasker cho nghiên cứu y học
lâm sàng (2005)

1.2 Khái niệm
-

Western blot là kĩ thuật xét nghiệm protein trên
polyacrylamide gel chuyển đến môi trường bền vững hơn

-

và cố định.
Là kĩ thuật lai giữa protein với protein(giữa kháng nguyên
với kháng thể) protein kháng nguyên được phát hiện qua
phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.

3

3


1.3 Nguyên lí
Trong Western Blot, một hỗn hợp protein được phân tách bằng điện
di SDS-PAGE, miếng gel được ngâm với sodium dodecyl sulfate (SDS) – là
một tác nhân biến tính protein. Các vạch protein được chuyển lên màng
nitrocellulose và từng vạch protein được phát hiện bằng cách ngâm
màng cellulose với kháng thể đơn dòng và đa dòng có gắn enzyme hoặc
đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan
tâm được kết hợp bởi kháng thể đánh dấu phóng xạ, vị trí của nó trên
các điểm có thể được phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm film X
quang.

1.4 Quy trình tiến hành

1.4.1 Xử lí mẫu
- Nên lấy mẫu từ toàn bộ mô hay canh trường (môi trường nuôi cấy) tế bào.
Đầu tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học như sử dụng máy nghiền (khi
lượng mẫu lớn), sử dụng máy đồng hóa (máy nghiền đồng thể) hoặc siêu
4

4


âm (với số lượng mẫu nhỏ). Cũng có thể phá hủy tế bào bằng một trong các
phương pháp hóa học như trên. Tuy nhiên, những mẫu virus hay mẫu lấy từ môi
trường cũng có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot, không
bắt buộc phải là nghiên cứu tế bào.
- Có thể sử dụng các loại chất tẩy rửa, muối, và đệm để thúc đẩy ly giải tế bào
và

hòa

tan

protein. Thường

bổ

sung

các

chất

kìm

hãm

protease và phosphatase để ngăn chặn sự phá hủy mẫu bằng chính các enzyme
có trong mẫu. Nên tiến hành chuẩn bị mô ở nhiệt độ thấp để tránh hiện
tượng biến tính protein và suy giảm (mất chức năng).
- Phối hợp kỹ thuật hóa sinh và cơ học – bao gồm nhiều phương pháp lọc và ly
tâm – có thể được sử dụng để phân tách các thành phần tế bào và các bào
quan khác nhau.

1.4.2 Chạy điện di một chiều với SDS page
- Phổ biến của điện di gel sử dụng gel polyacrylamide và bộ

đệm được nạp với SDS (sodium dodecylsulfate): là một
chất khử amionic gây biến tính protein bằng cách bao
quanh bộ khung polypeptide khiến các phân tử duỗi
thẳng ra.

5

5


-

Hỗn hợp protein được hoà tan trong dung dịch sodium
dodecyl sulfate(SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ

-

phá tất cả các nối không cộng hoá trị của protein ban đầu.
Điện tích âm có đựơc do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều
điện tích của bản thân proteinban đầu; vì thế điện tích
ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện
tích của phức hợp.Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu
để chạy điện di. Sau đó các mẫu được nạp vào các giếng

-

trong gel.
Độ phân giải của SDS-Page là rất rất lớn, các phức hành
được tách thành hàng trăm vết bang trên gel. Khi điện di
kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một
dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất

nhuộm màu như Coomassie blue.
1.4.3 Chuyển protein từ gen đến màng
- Để các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các
protein được chuyển từ trong gel lên một màng
-

nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride (PVDF).
Phương pháp chính để chyển các protein và sử dụng một
dòng điện để kéo protein gel vào protein gel vào PVDF

hoặc màng nitrocellulose.
 Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có

thể được kiểm tra bằng cách nhuồm màng với coomassise Brilliant Blue
hoặc S thuốc nhuộm ponceau. Ponceau S là phổ biến hơn của hai, do độ
nhạy cao hơn và độ hoà tan nước, sau này làm cho nó dễ dàng hơn để
sau đó destain và thăm dò màng.
1.4.4 Lai với Antibody

6

6


- Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã
phân tách trên gel. Rửa màng lai từ 5-10 phút trong dung dịch TBS.
- Ủ trong dung dịch khoá.
- sau khi rửamangf lai 2 lần TBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.
- Ủ màng lai đã cố định protein trong 1-2 giờ với một kháng thể sơ cấp (primary
antibody) với sự kích động nhẹ. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ
bám vào protein và sẽ tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với
protein quan tâm.
- Sau rửa màng lai 2-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.
- Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody) có
enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong một
tiếng có sự kích động nhẹ.
- sau rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10Min cho mỗi lần rửa.
- Sau rửa màng lai lần cuối với TBS.
- Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếu
mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kì nơi
nào có mặt phức hợp protein-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở
bất kì nơi nào có mặt protein quan tâm.
- Đặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sang phát

ra do enzyme.
1.4.5 Phát hiện và phân tích hình ảnh

7

7


- Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền có
khả năng phản ứng với các enzyme (như peroxidase) được rang buộc với các
kháng thể thứ cấp.
- Phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hoà tan thành một
dạng không hoà tan của một màu sắc khác tủa thành vết ngay bên cạnh các
enzyme và qua xuất hiện vết trên màng.
- Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bởi ánh sang và sự phát xạ kích
thích sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh được trang
bị với các bộ lọc khí thải thích hợp chụp một hình ảnh kĩ thuật số và cho phép
phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử số lượng phân tử.
- Phương pháp phát hiện Chemilumnescent phụ thuộc vào ủ màng lai với một
chất nền sẽ luminesce khi tiếp xúc với reporter trên kháng thể thứ cấp. Ánh sang
sau đó được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp một
hình ảnh kĩ thuật số.
1.5 Ưu, nhược điểm
1.5.1 Ưu điểm
- Đây là một trong những phương pháp xét nghiệm gián

tiếp tìm kháng thể kháng kháng nguyên của virus HIV,
thường làm sau nguy cơ 3 tháng và là một trong những
-

xét nghiệm có giá trị khẳng định.
Theo tổ chức y tế thế giới quy định: để đánh giá trường
hợp (+) dương tính với HIV cần thiết phải có ít nhất 2 mẫu

thử dương tính:
+ Elisa + Western blot
+ Hoặc IFA + Western blot
- Ưu điểm nổi bật của xét nghiệm này là kháng nguyên nào
cũng có thể phát hiện HIV1&2 kháng nguyên tinh chế
được điện li trong gel Polyacrylamide và được chuyển
-

sang giấy nitrocellulose và được ủ với huyết thanh.
Hầu như các kháng thể kháng kháng nguyên của HIV đều
được phát hiện kể cả những kháng thể của kháng nguyên
quan trọng nhất:

8

8


+ Kháng thể P24 ( Kháng nguyên lõi tiền nhân của P24 và P55).
+ Kháng thể kháng gen vỏ gp160 và các mảnh tạo ran ó gp 120.
+ Kháng thể kháng protein màng gp41 mà hầu hết nhiễm HIV đều có
liên quan đến cấp độ lâm sang của họ.
+ Kháng thể kháng các sản phẩm gen của Polymerase P31, P51, P66.
+ Kháng thể đối với gen tat P14, gen nef P27, gen vif P23 và của gen
gag P31.P9.P7 tuy không thường xuyên xuất hiệ. Nhạy hơn Elisa vì pha loàng
2log huyết thanh.

1.5.2 Nhược điểm.
- Nhược điểm của phương pháp xét nghiệ nay là khó và đắt

hơn Elisa, phụ thuộc chủ quan người đọc bằng mắt
thường và đòi hỏi thời gian 24h.
1.5.3 Đọc kết quả xét nghiệm western blot.
- Đọc kết quả xét nghiệm Western blot :
+ Kết quả dương tính khi :
 Theo trung tâm kiểm soát bệnh tật của Mỹ CDC: khi có kháng thể
kháng vỏ và ít nhất một dải bang đặc trưng khác của HIV. Ngoài
ra cần có sự có mặt của P41 là đủ để kết luận (+).
 Theo tiêu chuẩn của y tế thế giới: (+) khi có 2 dải protein vỏ (+),
Protein lõi, Protein Polymerase.
+ Kết luận là âm tính: khi không có dải bang nào đặc trưng cho HIV.
+ Kết qủa không xác định:
 Khi những hình thái xuất hiện dải bang khác không đủ tiêu chuẩn
nêu trên và phải xét nghiệm lại sau 2-3 tháng vì kháng thể kháng
kháng nguyên lõi (P17 P24, P55) chứng tỏ có nhiễm trùng sớm
với HIV.
 Bộ sinh phẩm mới đòi hỏi không một dải bang nào không (-) mới
được coi là âm tính và phải có P24, P31, P41 hay P160 mới được
coi là dương tính.
 Tỉ lệ (+) giả cũng có thể có tuy rất ít ví có người Western blot (-)
nhưng nuôi cấy lại là (+). Tỉ lệ chỉ xảy ra trên khoảng 1/250 000
người khi sử dụng đồng thời Elisa và Western Blot.
 Khuyến cáo sử sụng Elisa cùng với Western blot để khẳng định
HIV (+)
1.6 Hệ thống V3 Western Workflow
9

9


Bio-Rad’s V3 Western Workflow là một phương pháp gồm 5 bước để đơn giản
quy trình western blotting:
B1: Tách biệt protein
Chứa một công nghệ độc đáo được xây dựng vào hoá học gel cho phép
-

nhanh chóng, chất lượng cao, tách biệt protein trong thời gian ít nhất là 15 phút.
- B2: Hình tượng hoá các protein
Sử dụng công nghệ miễn phí vết,covalently liên kết với protein, sau 1phút
kích hoạt trên một MP ChemiDoc màn hình.
- B3: Chuyển protein
Trans-Blot Turbo hệ thống là một protein bộ máy chuyển giao nhanh
chóng có thể Làm giảm các bước chuyển giao ít nhất là 3 phút, trong khi duy trì
chuyển protein cao hiệu quả trên một loạt các khối lượng phân tử.
- B4: Xác minh chuyển giao protein
ChemiDoc MP màn hình kết hợp với công nghệ bẩn miễn phí cho phép
xác minh ngay lập tức chuyển protein.
- B5: Validate và quantitate
Có thể được để xác nhận dữ liệu wedtern thấm qua bình thường hoá
protein tổng số kết hợp với protein vệ sinh.
1.7 So sánh với phương pháp ELISA.

1.7.1 Phương pháp Elisa (enzyme immune assay)

Còn được gọi là EIA ( enzyme immune assay)
- Nguyên tắc: dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng

nguyên và kháng thể được gắn với một enzyme bằng liên
kết đồng hoá trị. Kháng nguyên được gắn bó với giếng
10

10


plastic và kháng thể liên kết với enzyme và được gắn với
kháng nguyên. Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị
rửa trôi đi. Enzyme được giữ lại và vì vậy lượng kháng thể
gắn enzyme được phát hiện bằng cách cho them vào một
cơ chất (introphenol phosphate) làm thay đổi màu do
hoạt tính của enzyme. Độ màu tạo thành là tỉ lệ với lượng
enzyme bám ở giếng plastic, từ đó suy ra lượng kháng
thể, sau đó tiếp tục suy ra lượng kháng nguyên.
- Quy trình:
+ phương pháp này được thiết kế cho việc phát hiện và định lượng
vật chất như peptides, protein, antibodies,…
+ Kĩ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyê,
kháng thể và chất tạo màu, được thực hiện qua 2 bước:
 Phản ứng miễn dịch học: là sự kết hợp giữa kháng nguyên và
kháng thể.
 Phản ứng hoá học: thông qua hoạt tính xúc tác của enzyme
làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O để oxy hoá chất chỉ
thị màu, do đó làm thay đổi màu của hỗn hợp trong dung dịch
thí nghiệm
+ Kĩ thuật này khá nhạy cảm và đơn giản, cho phép xác định được
kháng nguyên hay kháng thể ở một nồng độ rất thấp.
1.7.2 So sánh
- Phát hiện màu

- Mẫu dò
+ Trích từ protein của tế bào.
+ Phức hợp protein-kháng nguyên sơ câp-kháng nguyên thứ cấp.
+ Gắn với enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ.
+ Chạy trên gel SDS-PAGE.
+ Tắc nghẽn với protein dư.
+ Kháng thể đối kháng với protein X được đánh dấu phóng xạ hay
enzyme.
+ Trích từ kháng nguyên
+ Phức hợp giữa kháng nguyên-kháng thể.
+ Cho thêm chất tạo màu.
11

11


+ Chạy trên đĩa plastic.
+ Tắc nghẽn với kháng nguyên dư.
+ Kháng thể gắn đặc hiệu với kháng nguyên thông qua enzyme.
1.8 Ứng dụng
Phương pháp western blot được ứng dụng để:
- Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của
-

protein trong mô.
Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu.
Đánh giá độ lớn của gen mục tiêu.
Định dạng protein mục tiêu.
Phân tích cây trồng chuyển đổi gen.
Đánh gía tính chuyên biệt của antibody.

Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra.
Phân tích sự phát triển của thực vật.

Trong thực tế, western blot được ứng dụng để:
-

Xác định bênh nhân có kháng thể chống HIV trong mẫu huyết thanh không.
Western Blot sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêm gan B.
CHƯƠNG 2: ỨNG DỤNG
2.1 Tình hình bệnh và tác hại bệnh trên thế giới
và Việt Nam
2.1.1 Tình

hình
nuôi
tôm
trên thế
giới.
Hiện nay, nghề nuôi tôm đang trên đà phát triển mạnh vầ một trong những
nghành đem lại thu nhập lớn cho nền kinh tế quốc dân của một số nước trên
thế giới. Tuy nhiên, nghề nuôi tôm gặp không ít khó khan do tôm mắc bệnh và
gây chết hang loạt. Một rong những bệnh nguy hiểm nhất đối với tôm nuôi hiện
nay do virus gây nên là virus hội chứng Taura (TSV). Bệnh xảy ra ở tất cẩ các
nước nuôi tôm và ảnh hưởng lớn đến nghề nuôi tôm công nghiệp trên thế giới
(Nguyễn Văn Hảo,2000). Trong thời gian qua, virus hội chứng taura(TSV) đã bùng
phát ở nhiều khu vực nuôi tôm trên thế giới, đặc biệt là các nước châu Mỹ12

12

Latinh. Vào tháng 4/2005 virus hội chứng Taura lại gây dịch lớn ở Châu
Mỹ(Infofis, 6/4/2005), khiến sản lượng tôm của Venezuela sụt giảm khoảng 90%.
Và dần dần virus hội chứng Taura cũng đã lây lan sang các nước Châu Á khi tôm
TCT được du nhập và nuôi nhiều như ở Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan. Năm
1999/2000 TSV được phát hiện ở TCT tại Trung Quốc và Đài Loan (Tu et al., 1999;
Yu và Song,2000) với 19 trường hợp thông báo cho OEI từ Đài Loan vào năm
1999, dẫn đến 700.000 trường hợp và 200.000 tôm chết vào năm 2000 và dẫn
đến 500.000 trường hợp vầ 50.000 tôm chết vào năm 2001.

2.1.2 Tình

hình
nuôi
tôm tại
Việt
Nam.
Việt Nam có nhiều điều kiện thuận lợi để phát triển nghề nuôi tôm biển.
Sản lượng tôm xuất khẩu toàn quốc đã từng đạt 40-45 ngàn tấn/năm, chiếm gần
10% sản lượng tôm Châu Á, mang lại lợi ích đáng kểcho người nuôi tôm (Lý Thị
Thanh Loan 2001). Cùng với sự phát triển của nghề nuôi tôm trên qui mô công
nghiệp,”dịch bệnh” tôm tại Việt Nam cũng đã bắt đầu xuất hiện ngay từ những
năm đầu thập niên 90. Năm2003, bệnh hội chứng Taura đã bùng phát ở tôm thẻ
chân trắng, gây ảnh hưởng nghiêm trọng tại nhiều vùng nuôi như Quảng Ninh,
Phú Yên, Bạc Liêu, Cà Mau.

2.2 Giới thiệu về hội chứng Taura-TS.
2.2.1 Khái

niệm.
Tên phổ thông thường gọi là virus gây bệnh hội chứng Taura(TSV). Ngoài ra

có một số tên gọi khác chỉ tác nhân gây bệnh hội chứng Taura (Taura Syndrome
Disease-TSD); bệnh đỏ đuôi (Red Tail Disase-RTD) (Lightner,1996).

2.2.2 Đặc

điểm
cấu
13

13


trúc
của
gene
của
Taura-

TS.
TST là loại virus RNA có dạng hình khối 20 mặt, đường kính 30-32nm, Không

-

có vỏ envelope được sao chép trong nguyên sinh chất tế bào vật chủ.
Genome của TSV có kích thước khoảng 9kb, xoắn đơn thẳng, có 10.205
nucleotid, tạo chuỗi poly-A-3’, chứa hai khung đọc mở (Open Reading
Frame-ORF) lớn.
2.2.3 Biểu

hiện

bệnh
hội
chứng
Taura ở
Tôm.
Hội chứng Taura được biết là bệnh của tôm thẻ chân trắng ở giai đoạn còn
nhỏ xảy xa trong khoảng 14-40 ngày sau khi thả. Tôm bị hội chứng Taura thường
lầ hội chứng loại tôm giống nhỏ, khoảng 0.05-5g , tuy nhiên tôm lớn hơn cũng
có thể bị ảnh hưởng. Quá trình diễn biến của bệnh hội chứng Taura xuất hiện
chủ yếu trong giai đoạn của một chu kì lột xác. Biểu hiện bệnh tiến triển theo
hai pha:
+ Pha tiền cấp tính có biểu hiện:
 Thường thấy tôm chết hoặc hấp hối trong lưới hoặc nằm dưới đáy bể.
 Tôm thường yếu và mất phương hướng khi di chuyển.
 Biểu hiện sự lan toả vùng sắc tố đỏ làm cho toàn thân tôm có màu đỏ
nhạt, quạt đuôi và chân bò có màu đỏ rõ rệt và thường chết trong khi
lột xác.

14

14


 Vỏ mềm, ruột trống rỗng và thường ở giai đoạn muộn của chu kì lột

xác.
 Là điểm nhạy cảm trong quá trình phát sinh bệnh hội chứng Taura.
+ Pha mãn tính có biểu hiện: Biểu hiện kiểu tổn thương của bệnh do
vi khuẩn gây ra như có nhiều điểm bị đen hoá.
2.3 Các phương pháp và kỹ thuật chẩn đoán

virus Taura.
2.3.1 Chẩn

đoán
dựa
vào
triệu
chứng
lâm
sàng.
Ở thời kì phát bệnh tôm có màu đỏ nhợt nhạt, toàn bộ vỏ thân và ở đuôi
có màu đỏ rõ rệt (bệnh đỏ thân, hồng thể) kèm theo những dấu hiệu tiêu biểu
mỏng vỏ, xoang tiêu hoá rỗng, tôm thường chết nhiều trong thời kì lột xác.
2.3.2 Phươn
g pháp
miễn
dịch.
Có thể sử dụng Monoclonal Antibodies (Mas) để xác định TSV ở những
mẫu huyết và dịch tế bào đồng thể từ tôm. Mas còn có thể áp dụng để kiểm tra
những mẫu mô đông lạnh, hoặc đã cố định. Hiện trên thị trường có sản phẩm
của DiagXotics.
2.3.3 Phươn

g pháp
chẩn
đoán
bằng
15

15

mẫu dò
gen.
Nguyên lí của phương pháp là sử dụng một đoạn oligonucleotide (thiết kế
trên trình tự gene đặc hiệu của TSV) gắn với một chất chỉ thị và gọi là mẫu dò
(probe). Chất chỉ thị có thể là enzyme, đồng vị hoặc chất phát huỳnh quang…Sau
đó lai probe với DNA-RNA của virus. Những probe này được tổng hợp trong
phòng thí nghiệm hoặc từ những nguồn thương mại. Phương pháp này có độ
chính xác đặc hiệu, độ nhạy lớn hơn những phương pháp chẩn đoán truyền
thống, tế bào học cổ điển.
2.4 Vật liệu và phương pháp.

2.4.1 Các

dung
dịch
gốc để
nhuộm
-

gel.
Dung dịch nhuộm (0.025% Coomassie Brillant Blue R250; 40% methanol; 7%

-

acetic acid).
Dung dịch giải nhuộm I (40% methanol; 7% acetic acid).
Dung dịch giải nhuộm II (5% methanol; 7% acetic acid).

2.4.2 Các

dung
dịch
gốc để
thực
hiện
wester
n blot.
Towbin transferbuffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20%meOH, 0.1%SDS).
2.4.3.1 Kháng thể
16

2.4.3 Vật liệu

16


2.4.3.1
-

Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng tổng hợp kháng với WSSV, IHHNV,
MBV, YHV (được sản tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện

-

Sinh Học Nhiệt Đới).
Kháng thể sơ cấp: kháng thể đa dòng đặc hiệu với RTV ( được sản tại phòng

thí nghiệm Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện Sinh Học Nhiệt Đới).

- Kháng thể thứ cấp: IgG kháng huyết thanh thỏ kháng IgY, được đánh dấu
enzyme Peroxidase.
2.4.3.2 Mẫu
- Chuẩn bị mẫu
+ Protease của tôm cũng như của các loài động vật thuỷ sinh khác là
protease nội bào, nó tập trung nhiều nhất ở cơ quan tiêu hoá , sau đó dến nội
tạng và cơ thịt. Đặc biệt ở tôm do đặc điểm hệ tiêu hoá nội tạng nằm ở phần
đầu nên hệ enzyme sẽ tập trung nhiều nhất ở phần đầu sau đó đến các cơ quan
khác.
+ Mẫu đầu và nội tạng tôm sú được phân tách từ tôm sú sống , loại
40-50 con/kg được nuôi ở Cần Thơ . Tôm được chở trong thùng sục khí về
phòng thí nghiệm , rửa sạch và giất chết bằng cách trộn với đá vụn , tỷ lệ tôm/
đá là 1:3, sau đó tách lấy đầu hoặc nội tạng .
+Xay đầu tôm trên cối xay thịt , nghiền nhuyễn bằng cối inox với cát
thạch anh đã xử lý và làm sạch . Nội tạng chỉ nghiền . Dùng dung môi (nước cất ,
dung dịch muối sinh lí, đệm phosphate, đệm Tris HCl) với các tỉ lệ khác nhau ,
khuấy đảo liên tục ở điều kiện nhiệt độ 0-4 độ C trong 40 phút để chiết rút
enzyme , ly tâm lạnh ở 4 độ C , tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 p để loại bỏ
phần cặn , thu dịch chiết (DC) . Khảo sát ảnh hưởng tỷ lẹ dung môi và loại dung
môi chiết với mẫu.
- Mẫu được lấy
+ Virut gây hội chứng đỏ đuôi thu từ tôm sú (RTV- Pm) được nhân
lên trong tế bào côn trùng SF9.
+ Virut gây hội chứng đuôi thu từ tôm thẻ chân trắng (RTV- Pv) được
nhân lên trong tế bào côn trùng SF9.
2.4.4

Phươn
g pháp.

17

17

Khá


2.4.4.1 Phương pháp SDS-PAGE.
- SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) là phương pháp điện di
protein đứng, để phân tách được các thành phần protein theo trọng lượng
phân tử .
- Chuẩn bị mẫu để điện di:
+Mẫu nhận trực tiếp từ phòng Công Nghệ Tế Bào Động Vật-Viện Sinh
Học Nhiệt Đới.
+Trong một Tube Eppendorf, trộn một thể tích (V) mẫu protein với
một thể tích (V) 2X Treatment buffer.Đặt vào nồi đun cách thuỷ đang sôi trong 2
phút. Mẫu sau khi chuẩn bị xong nên giữ trong đá bào cho đến khi thực hiện thí
nghiệm.
+ Dùng pipette với đầu tip (cone) nhỏ, cho mẫu từ từ vào giếng
gel.Luôn luôn để một giếng chứa thang protein chuẩn.
-Thực hiện điện di
+Đậy nắp máng điện di. Nối 2 điện cực vào bộ cấp điện.
+ Bật điện bộ nguồn. Chỉnh dòng điện 100mA.
+ Quan sát sự di chuyển của vạch màu trong gel điện di, nếu vạch
màu chạm đáy gel, tắt bộ điện nguồn. Quá trình điện di đã hoàn tất.
+ Đổ bỏ dung dịch điện di. Gở khuôn gel ra máng. Cẩn thận gở tách
gel ra khỏi khuôn gel để tiến hành nhuộm hay blotting.
2.4.4.2 Phương pháp Western Blot.
Sau khi thực hiện chuyển Protein lên gel SDS ta thực hiện phản ứng gắn
protein-kháng thể bằng phương pháp Western blot với những bước như sau:

 Tách bỏ phần stacking gel ra khỏi running gel. Ngâm running gel trong Towbin

transfer buffer trong 5-15 phút để cân bằng ion.
 Ứng với mỗi gel, cắt giấy thấm và màng nitrocellulose cho vừa với cassetle.
 Làm ướt màng nitrocellulose bằng cách thả dần vào trong khay nước nước cất
trong 2-3 phút.

 Đặt gel lên màng rồi cho vào giữa hai tờ giấy thấm dày đã cắt ở bước 2. Sau

đó kẹp chúng vào giữa hai tấm bọc nylon mềm (sponge) và kẹp vào cassette.
Tất cả các thao tác này đều được phải thực hiện trong một khay chứa Towbin
transfer buffer.
18

18


 Dùng một pipette thuỷ tinh lăn lên trên để đuổi bỏ bọt khí (nếu có) giữa các

lớp.
 Cho dung dịch Towbin transfer buffer vào buồng để ngập hai hai lưới điện cực.
 Cho cassette đã chuẩn bị ở bước 4 và 5 vào buồng, chú ý đặt mặt có màng
nitrocellulose gần lưới điện cực [+].
 Đặt buồng lên trên máy khuấy từ. Nối hệ thống làm lạnh vào buồng. Bật máy





quay từ để làm lạnh dung dịch đệm trong quá trình chuyển band.

Nối buồng với bộ cấp năng. Bật bộ điện cấp năng và điều chỉnh điện thế 50V.
Sau khi hoàn tất chuyển band, chuyển điện thế về zero, tắt nguồn điện.
Tháo cassette và lấy màng ra khỏi hệ thống.
Màng nitrocellulose này sẽ được đưa vào quy trinh phát hiện bằng phản ứng

miễn dịch.
 Ủ màng trong 100ml dung dịch TTBS hoặc TTBS có chứa 5% skim milk (blocking
buffer) trong một giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4 độ C.
 Đổ bỏ dịch này, Rửa 3 lần Trong 10 phút với TTBS, tiếp tục ủ màng với TTBS có
pha kháng thể đặc hiệu (primary antibody) ở độ pha loãng 1/5000. Thời gian ủ
là 60 phút ở 37độ C.
 Rửa màng 3 lần trong 10 phút bằng TTBS.
 Ủ tiếp màng trong dung dịch TTBS có pha kháng thể cộng hợp ở nộng độ
1/50000. Thời gian ủ là 60 phút ở 37 độ C.
 Rửa màng 3 làn trong 10p bằng TTBS .Sau bước này, tiến hành quá trình sinh
màu.
 Cho màng vào dung dịch hiện màu( pha dung dịch hiện màu bằng cách cho
1mg DAB vào 4ml PBS ,trộn đều. Lọc qua giấy lọc. Sau đó cho 120ul dung dịch
CoCl2 1% vào dịch lọc trên. Tiếp tục cho 3ul H2O2 vào dịch mới pha). Ủ trong
tối 5- 30p cho đến khi màu xanh nâu của các band đặc hiệu hiện rõ.
 Rửa màng nhiều lần với nước cất. Chụp hình ngay. Nếu muốn lưu lại thì dể khô
rồi gói trong giấy bạc .
 Mẫu được phân loại bằng điện di trên gel polyacrylamide12,5% chuyển thấm
qua màng nitrocellulose blocking bằng TTBS hoăc TTBS có chứa 5% skim milk.
 Ủ với kháng nguyên mục tiêu trên màng với kháng thể sơ cấp.
 Rửa.
 Hiện màu.
 Chụp hình.
2.5 Kết quả.
- Giếng 1: Thang protein chuẩn Low Range.

19

19


- Giếng 2,3: Dịch siêu ly tâm tế bào nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Long An (RTVPmLA/SLT).
- Giếng 4,5: Dịch tế bào (DTB) Sf9.
- Giếng 6,7: DTB nhiễm RTV từ tôm sú thu ở Cần Giờ bị bệnh (RTV-PmCG).
- Giếng 8: DTB nhiễm virus thu từ tôm sú long An bị bệnh RTV (RT-PmLA)
- Giếng 9,10: DTB nhiễm RTV từ tôm thẻ chân trắng (RTV-PvM).
 Nhận xét: Kết quả cho thấy một số vạch protein từ gel điện di đã được
thể hiện trên màng lai này. Đó là các protein gắn đặc hiệu với kháng thể.
Kết qủa xác định được một số vạch protein từ các mẫu nhiễm virus khác
so với mẫu tế bào đối chứng.

KẾT LUẬN
1. Western blot là một kĩ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi để phát triển
các protein cụ thể trong các mẫu.
2. Sử dụng điện di gen tách các protein có nguồn gốc biến tính bằng chiều dài
của chuỗi polypeptide hoặc bởi cấu trúc 3-D của protein.
3. Các protein đó được chuyển giao cho một màng, nơi đang thăm dò (phát
hiện) bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu vớiprotein.
4. Western blot còn được sử dụng trong các lĩnh vực sinh học phân tử, hoá
sinh, immuunogenetics và các ngành sinh học phân tử khác.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. />
tbm=isch&sa=1&ei=BiYoW93aAcG0rQGwmYygDQ&q=V3+WESTERN+WORKF
LOW&oq=V3+WESTERN+WORKFLOW&gs_l=img.3...3209.5230.0.5759.10.10.

20

20


0.0.0.0.171.1292.0j10.10.0....0...1c.1.64.img..0.0.0....0.TzZGgSOjXmI#imgdii=
1adfEMp_sRPw2M:&imgrc=F3hLYSy7Cal4CM:1
2. />
3. />4. />
%E1%BB%87-dna-t%C3%A1i-t%E1%BB%95-h
%E1%BB%A3p-c%C3%B4ng-ngh%E1%BB%87-sinh- h%E1%BB%8Dc?p=85

2.5.1.1

Phư

phá

PAG

21

21