Phương pháp xác định hàm lượng Vitamin

MỞ ĐẦU

Vitamin là thành phần không nhiều nhưng lại hết sức quan trọng trong thực
phẩm. Nó cần thiết cho sự phát triển, duy trì và thực hiện các hoạt động
chức năng của cơ thể con người
Vitamin được tổng hợp chủ yếu trong cơ thể thực vật và vi sinh vật, người và
động vật hầu như không thể tự tổng hợp được vitamin. Tuy nhiên cũng có
một vài vitamin đặc biệt như :vitamin C được tổng hợp hầu hết cơ thể động
vật, vitamin A, D chỉ phát hiện thấy trong cơ thể người ,động vật nhưng
không có trong thực vật.
Nhu cầu về vitamin trong cơ thể người rất ít nhưng nhất thiết phải được cung
cấp đầy đủ qua thức ăn có nguồn từ động vật, thực vật, vi sinh vật.khi thiếu
vitamin người và động vật sẽ mắc bệnh.
Có nhiều vitamin nhưng được chia làm 2 nhóm lớn: vitamin tan trong nước và
vitamin tan trong chất béo.
Do vitamin có cấu tạo hóa học rất khác nhau, nên mỗi loại vitamin có những
phản ứng hóa học đặc trưng khác nhau .Người ta sử dụng các phản ứng hóa
học đặc trưng đó để định tính và định lượng vitamin

1


VITAMIN
Vitamin, hay sinh tố, là phân tử hữu cơ cần thiết ở lượng rất nhỏ cho hoạt động
chuyển hoá bình thường của cơ thể sinh vật. Có nhiều loại vitamin và chúng
khác nhau về bản chất hoá học lẫn tác dụng sinh lý.
Các loại vitamin
Vitamin A, B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, D1, D2, D3, D4, D5, E, K
Vitamin A, D, E, K hòa tan trong chất béo
Vitamin B, C hòa tan trong nước
Vitamin A

Còn có các tên là retinol, axerophthol...
Vitamin A tồn tại trong tự nhiên gồm 2 dạng:
Retinol: dạng hoạt động của vitamin A, nó được đồng hoá trực tiếp bởi cơ thể.
Tiền vitamin A: nó chính là một tiền chất của vitamin A được biết đến nhiều
dưới tên bêta-caroten. Tiền chất này được chuyển hoá bởi ruột thành vitamin A
để cơ thể có thể sử dụng.
Vitamin A1, A2 được gặp ở trạng thái tự nhiên trong cơ thể động vật:

Vitamin A có nhiều chức năng quan trọng đối với cơ thể con người:

2


Thị giác: mắt được cấu tạo bởi các sắc tố có chứa vitamin A. Nó được hấp thụ
bởi luồng thần kinh được vận chuyển nhờ dây thần kinh thị giác. Vì vậy sự có
mặt của vitamin A là một phần không thể thiếu đối với việc đảm bảo thị giác
của con người.
Các mô: Vitamin A kích thích quá trình phát triển của các biểu mô như mô
sừng, ruột và các con đường hô hấp. Nó cũng ảnh hưởng đặc biệt đến da, kích
thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da như trứng cá.
Sự sinh trưởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con người,
nên vitamin A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển cua phôi thai và trẻ
em. Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xương, thiếu vitamin A
làm xương mềm và mảnh hơn bình thường, quá trình vôi hoá bị rối loạn.
Hệ thống miễn dịch: do các hoạt động đặc hiệu lên các tế bào của cơ thể,
vitamin A tham gia tích cực vào sức chống chịu bệnh tật của con người.
Chống lão hoá: Vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự phát
triển của các gốc tự do.
Chống ung thư: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn đến
ngăn chặn được một số bệnh ung thư.

Vitamin D
Còn có các tên là antirachitic factor, calcitriol...
Đây là một nhóm hóa chất trong đó về phương diện dinh dưỡng có 2 chất quan
trọng là ecgocanxiferon (vitamin D2) và colecanxiferon (vitamin D3). Trong
thực vật ecgosterol, dưới tác dụng của ánh nắng sẽ cho ecgocanxiferon. Trong
động vật và người có 7-dehydro-cholesterol, dưới tác dụng cửa ánh nắng sẽ cho
colecanxiferon.
Vai trò:
Hình thành hệ xương: vitamin này tham gia vào quá trình hấp thụ canxi và
photpho ở ruột non, nó còn tham gia vào củng cố, tu sửa xương.
Cốt hóa răng: tham gia vào việc tạo ra độ chắc cho răng của con người.
Chức năng khác: vitamin D còn tham gia vào điều hoà chức năng một số gen.
Ngoài ra, còn tham gia một số chức năng bài tiết cảu insulin, hormon cận giáp,
hệ miễn dịch, phát triển hệ sinh sản và da ở nữ giới.

3


Vitamin E
Vitamin E là một chất chống oxy hoá tốt do cản trở phản ứng xấu của các gốc
tự do trên các tế bào của cơ thể.
Vai trò:
Ngăn ngừa lão hoá: do phản ứng chống oxy hoá bằng cách ngăn chặn các gốc
tự do mà vitamin E có vai trò quan trọng trong việc chống lão hoá.
Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin C tạo thành nhân tố quan trọng làm
chậm sự phát sinh của một số bệnh ung thư.
Ngăn ngừa bệnh tim mạch: vitamin E làm giảm các cholestrol xấu và làm tănng
sự tuần hoàn máu nên làm giảm nguy cơ mắc các bênh tim mạch.
Hệ thống miễn dịch: kích thích hệ thống miễn dịch hoạt động bình thường bằng
việc bảo vệ các tế bào...

Vitamin B1
Còn có các tên là thiamin, aneurin...
Vitamin B1 đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra năng lượng cần thiết cho
các hoạt động chức năng của con người.
Vai trò:
Đồng hoá đường: vitamin B1 cần thiết cho việc tạo ra một loại enzym (tham gia
vào thành phần của coenzyme) quan trọng tham gia vào quá trình chuyển hoá
đường và quá trình phát triển của cơ thể. Khi thiếu vitamin B1 axit pyruvic sẽ
tích lũy trong cơ thể gây độc cho hệ thống thần kinh. Vì thế nhu cầu vitamin B1
đối với cơ thể tỉ lệ thuận với nhu cầu năng lượng.
Nhân tố ngon miệng: kích thích sự tạo thành một loại enzyme tham gia vào quá
trình đồng hoá thức ăn, kích thích cảm giác thèm ăn.
Sự cân bằng về thần kinh: Vitamin B1 tham gia điều hòa quá trình dẫn truyền
các xung tác thần kinh, kích thích hoạt động trí óc và trí nhớ.
Vitamin B2
Còn có các tên là riboflavin...
4


Vitamin B2 giữ vai trò xác định trong các phản ứng của một số enzyme cần
thiết cho quá trình hô hấp (tham gia vào thành phần của các enzyme vận
chuyển hiđrô).
Vai trò:
Cân bằng dinh dưỡng: vitamin B2 tham gia vào sự chuyển hoá thức ăn thành
năng lượng thông qua việc tham gia sự chuyển hoá glucid,lipid và protein bằng
các enzyme.
Nhân tố phát triển
Tình trạng của da
Thị giác: vitamin B2 có ảnh hưởng tới khả năng cảm thụ ánh sáng của mắt nhất
là đối với sự nhìn màu. Kết hợp với vitamin A làm cho dây thần kinh thị giác

hoạt động tốt đảm bảo thị giác của con người.
Vitamin C
Còn có các tên là acid ascorbic...
Vitamin C là một chất chống oxy hoá tốt, nó tham gia vào nhiều hoạt động sống
quan trọng của cơ thể.
Vai trò:
Kìm hãm sự lão hoá của tế bào: nhờ phản ứng chống oxy hoá mà vitamin C
ngăn chặn ảnh hưởng xấu của các gốc tự do, hơn nữa nó có phản ứng tái sinh
mà vitamin E - cũng là một chất chống oxy hoá - không có.
Kích thích sự bảo vệ các mô: chức năng đặc trưng riêng của viamin C là vai trò
quan trọng trong quá trình hình thành collagen, một protein quan trọng đốI với
sự tạo thành và bảo vệ các mô như da, sụn, mạch máu, xương và răng.
Kích thích nhanh sự liền sẹo: do vai trò trong việc bảo vệ các mô mà vitamin C
cũng đóng vai trò trong quá trình liền seo.
Ngăn ngừa ung thư: kết hợp với vitamin E tạo thành nhân tố quan trọng làm
chậm quá trình phát bệnh của một số bênh ung thư.
Tăng cường khả năng chống nhiễm khuẩn: kích thích tổng hợp nên interferon chất ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn và virut trong tế bào.

5


Dọn sạch cơ thể: vitamin C làm giảm các chất thải có hại đối với cơ thể như
thuốc trừ sâu, kim loại nặng, CO, SO2, và cả những chất độc do cơ thể tạo ra.
Chống lại chứng thiếu máu: vitamin C kích thích sự hấp thụ sắt bởi ruột non.
Sắt chính là nhân tố tạo màu cho máu và làm tăng nhanh sự tạo thành hồng cầu,
cho phép làm giảm nguy cơ thiếu máu.
ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
A) ĐỊNH TÍNH VITAMIN
I)

Nhóm vitamin tan trong chất béo

1) Các phản ứng của vitamin A (retinol)
a) Phản ứng của vitamin A với H2SO4
Nguyên tắc: khi tác dụng với H2SO4 đặc, vitamin A bị mất nước tạo thành sản
phẩm ngưng tụ có màu hồng không bền, sau đó biến đổi nhanh thành màu đặc
trưng của lipocrom.
Nguyên liệu và hóa chất: Dầu cá được hòa tan trong clorofooc với tỷ lệ 1/5;
H2SO4 đặc.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch vitamin A trong clorofooc và
hai giọt H2SO4 đặc. Lắc đều, quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm, giải
thích kết quả.
b) Phản ứng của vitamin A với SbCl3
Nguyên tắc: Vitamin A có tác dụng tương hỗ với SbCl3 bão hoà trong
chlorofooc, bị mất nước tạo thành sản phẩm ngưng tụ có màu, sau đó có sự biến
đổi màu trong ống nghiệm.
Hóa chất: SbCl3 bão hòa trong chlorofooc không ngậm nứơc; dầu cá.
Dụng cụ: ống nghiệm (1), lọ đựng hóa chất (2).
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 2 giọt dầu cá và 1ml SbCl3 bão hòa trong
chlorofooc. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết
quả?

6


c) Phản ứng của vitamin A với FeSO4
Nguyên tắc: Trong môi trường axit, vitamin A tác dụng với FeSO 4 tạo thành sản
phẩm có màu không ổn định (đối với carotin là tiền của vitamin A tạo thành
màu đặc trưng)
Hóa chất và nguyên liệu: FeSO4 bão hòa trong CH3COOH kết tinh, H2SO4(đ),

dầu cá tươi.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1ml FeSO 4 bão hòa trong
CH3COOH và 4 giọt H2SO4(đ) .quan sát sự biến đổi màu trong ống nghiệm và
giải thích hiện tượng.
2) Phản ứng của vitamin K với anilin
Nguyên tắc: Metinon có cấu trúc tương tự vitamin K 1, được tổng hợp nhân tạo,
có hoạt tính sinh học cao. Khi metinon tác dụng với anilin tạo thành các hợp
chất màu. Phản ứng như sau:

O

O

CH3
H 2N

CH3

Aniline

NH

HO
CH3

O
Metinon
2methyl 1,4 naphtoquinon

O

2 methyl 3 phenyl
amino 1,4 naphtoquinon

(dạng oxy hoá)
HO
Metinon

(dạng khử)

Nguyên liệu và hóa chất: vitamin K 0,2% trong cồn, anilin chưng cất lại.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml vitamin K 0,2% và 10 giọt thuốc thử
anilin. Lắc đều, quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả.
3) Các phản ứng của vitamin E (Tocopherol)
a) Phản ứng của vitamin E với FeCl3

7


Nguyên tắc:

Tocopherol

tác

dụng với

FeCl3, bị

oxy

hóa thành

tocopherylquinon. xảy ra phản ứng sau:

Hóa chất: FeCl3 5%, vitamin E 0,1% trong cồn.
Dụng cụ: ống nghiệm, lọ đưng hóa chất.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 10 giọt vitamin E 0,1% và 10 giọt FeCl 3 5%,
lắc đều. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải thích kết quả?
b) Phản ứng của vitamin E với HNO3
Nguyên tắc: dưới tác dụng của HNO 3 đặc, vitamin E bị oxi hóa thành hợp chất
kinon
Nguyên liệu và hóa chất:vitamin E( 0.1 %) trong cồn 96 0 ,HNO3(đ)
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 10 giọt vitamin E (0.1 %) và 1ml HNO 3(đ)
lắc nhẹ, để 1 đến 2 phút quan sát và giải thích hiện tượng.
4) Phản ứng của vitamin D (canxipherol)
a) Phản ứng của vitamin D với anilin
Nguyên tắc: trong môi trường axit ,vitamin D tác dụng với anilin,tạo thành hợp
chất màu đặc trưng.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 4 giọt dầu cá, 1 ml clorofooc và 4 giọt
thuốc thử anilin,lắc đều. trong ống nghiệm xuất hiện các thế nhũ tương có màu.
Đun ống nghiệm sôi trong 30 giây, dung dịch biến đổi thành màu đặc trưng.
b) Phản ứng của vitamin D với SbCl3
Nguyên tắc: vitamin D tác dụng với SbCl3 trong clorofooc tạo thành hợp chất
màu đặc trưng.
Tiến hành: cho vào ống nghiệm khô 1 ml dầu cá tan trong clorofooc. Lắc đều
quan sát màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả

8

c)phản ứng với brome
Khi cho dung dịch Br2/CHCl3 vào dung dịch vitamin thì chất lỏng sẽ có màu
xanh.
Tiến hành:
Cho vào ống nghiệm 3 giọt dầu cá sau đó thêm giọt dung dịch Br 2/CHCl3 .chờ
môtl lúc dung dịch xuất hiện màu xanh.
II) Nhóm vitamin tan trong nước.
1)

Phản ứng phát huỳnh quang của vitamin B1

a) phản ứng tạo thành thiocrom
Nguyên tắc: Trong môi trường kiềm, dưới tác dụng của ferrixianuakali, tiamin
bị oxi hóa thành tiocrom. Dưới ánh sáng của tia tử ngoại, tiocrom phát huỳnh
quang có màu đặc trưng.phản ứng như sau:

Nguyên liệu và hóa chất: Vitamin B 1 1%, NaOH 10%, K3[Fe(CN)6] 1%, rượu
izobutilic.
Tiến hành: Cho vào ống nghiệm 20 giọt vitamin B1 1%, 10 giọt NaOH 10% và
5 giọt K3[Fe(CN)6] 1%. Lắc đều cho đến khi dung dịch xuất hiện màu. Thêm
vào ống nghiệm 20 giọt rượu izobutilic, lắc đều, sau đó để yên, dung dịch trong
ống tạo thành 2 lớp ngăn cách. Để ống nghiệm dưới ánh sáng mặt trời hoặc
dưới ánh đèn tia tử ngoại, quan sát sự tạo thành huỳnh quang, giải thích kết
quả.
b) phản ứng AgNO3
Nguyên tắc: Thiamin phản ứng với nitrat Ag để cho kết tủa màu xám.
Tiến hành:Dùng 2ml dung dịch vitamin B1 ,axit hóa bằng axit nitric loãng 0.1%
và them vào đó 1 ml dung dịch AgNO30.5%, các màng kết tủa xuất hiện.
9

c) Phản ứng với thuốc thử diazo (hỗn hợp của axit sulfannilic và natri nitric)
Nguyên tắc: vitamin B1 phản ứng với thuốc thử diazo sẽ cho màu vàng da cam
hoặc đỏ
Nguyên tắc: Cho vào ống nghiệm 0.5 ml dung dịch axit sulfannilic vào 0.5 ml
dung dich natri nitric, thêm vào đó vài giọt dung dịch vitamin B 1 và 10 giọt
carbonat Na 10%.Lắc ống nghiệm ta sẽ thấy màu đỏ da cam
2) Phản ứng của vitamin B6 (Pyridoxin) với FeCl3:
Nguyên tắc: Pyridoxin tác dụng với FeCl3 tạo thành phức chất có màu đặc
trưng.phản ứng như sau:

Hóa chất: pyridoxin 1%; FeCl3 5%;
Dụng cụ: ống nghiệm (1); lọ đựng hóa chất (2)
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml pyridoxin 1% và 5 giọt FeCl3, lắc đều.
Quan sát sự xuất hiện màu trong ống nghiệm, giải thích kết quả?
3) Các phản ứng của vitamin C
a). Phản ứng của vitamin C với ferrixianuakali (K3[Fe(CN)6])
Nguyên tắc: Vitamin C có 2 nhóm enol linh động dễ dàng tham gia vào các
phản ứng oxy hoá khử với một số chất như: ferrixianuakali; 2,6 – diclorophenol
indolphenol, iot.phản ứng xảy ra như sau:

10


Hóa chất: K3[Fe(CN)6] 5%; FeCl3 5%; axit ascorbic 1%.
Dụng cụ: ống nghiệm , lọ đựng hóa chất .
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 1ml axit ascorbic 1%, 1ml K 3[Fe(CN)6] 5% và
3 giọt FeCl3 5%, lắc nhẹ. Quan sát sự xuất hiện màu trong các ống nghiệm, giải
thích kết quả?
b) Phản ứng của vitamin C với 2,6-diclorophenol indophenol (2,6D)

2,6D trong môi trường kiềm có màu xanh, trong môi trường axit có màu
hồng, khi tác dụng với vitamin C, phản ứng oxi hóa –khử diễn ra như sau:

Hóa chất:axit ascorrbic 1%, 2,6D 0.01%; HCl 2%
Tiến hành: cho vào ống nghiệm 20 giọt 2,6D 0.01% và 2 giọt HCl 2%dung dịch
xuất hiện màu.sau đó cho 10 giọt
B) ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN
I)Xác định Vitamin A trong thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao
Chuẩn bị dụng cụ:
- Hệ thống máy HPLC, Shimadzu
- Cột Purospher Star RP-18e( 150x4.6mm,5um)
- Cân phân tích có độ chính xác 0.1mg
- bộ chưng cất có ống sinhhàn hồi lưu
- bình định mức 10ml
- pipet các loại : 0.1ml, 0.5ml,1ml, 2ml, 5ml, 10ml,...
11


- ống Hatch
- Dụng cụ thủy tinh các loại: Becher, erlen.
Chuẩn bị hóa chất:
Hóa chất phải là loại tinh khiết được sử dụng để phân tích , gồm:
nước cất loại dùng cho HPLC
- Dietyl ete tinh khiết không có Peroxit
- Etanol
- Dung dịch Kalihydroxyde( KOH) 2M trong cồn : hòa tan 11.2g KOH trong
100ml cồn 96o
- Dung dịch Kalihydroxyde ( KOH) 2% trong nước : Hòa tan 2g KOH trong
100ml nước cất

- Acetonnitrile, HPLC
- Na2SO4 khan.
Cách tiến hành:
Xây dựng đường chuẩn:
Nếu dùng chuẩn vitamin A thì phân tích ngay trên thiết bị HPLC. Nếu Dùng
vitamin A dưới dạng este, thí dụ như vitamin A acetat, vitamin A palmitat,...thì
phải tiến hành xà phòng hóa để giải phóng vitamin A ra thể tự do rồi mới tiến
hành phân tích bằng HPLC.
Xây dựng đường chuẩn dùng Vitamin A palmitat
Quá trình xà phòng hóa:
Cân 18.32 mg vitamin A palmitat tương ứng với 10mg vitamin A ( phân tử
lượng của Vitamin A là 286, phân tử lượng của vitamin A Palmitat là 524) cho
vào bình cầu có cổ nhám, thêm 20-40ml dung dịch KOH 2M trong etanol và
0.5natri ascorbat. lắp ống sinh hàn hồi lưu . Đặt trên nồi cách thủy, xà phòng
hóa ở nhiệt độ 70oC trong 30 phút.
Chuyển dung dịch còn nóng vào một bình lóng, rửa bình cầu nhiều lần bằng
H2O cất và tập trung nước rửa vào bình lóng.
Chú ý: lượng nước không được quá 3 lầnlượng KOH 2M để tránh hình thành
nhủ tương có thể gây mất Vitamin A khi chiết.
Vitamin A từ dung dịch đã xà phòng hóa được chiết 3 lần bằng dietyl ete không
có peroxit 3 lần, mỗi lần 40ml. Tập trung lớp ete chiết được vào một bình lóng.
Rửa lớp ete nhiều lần với nước cất (mỗi lần 50ml) cho đến khi không còn vết
kiềm (thử với phenolphtalein). Loại nước trong dịch chiết etebằng cách lọc qua
lớp Na2SO4 khan, rửa lớp Na2SO4 ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lốp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn. Cặn còn lại hòa tan trong
acetonitrile, chuyển sang bình định mức 10ml. Định mức đến vạch bằng
acetonitrile. Dung dịch này dùng để làm dung dịch vitamin A chuẩn gốc
(1000mg/l)
Dung dịch chuẩn 100ug/ml: hút chính xác 1ml dung dịch vitamin A chuẩn gốc
1000ug/ml vào bình định mức 10ml. Định mức tới vạch bằng ACN.

12


Chuẩn bị mẫu thử :
Cân khoảng 10g mẫu thử đã được nghiền nhỏ ( nếu cần) cho vào bình cầu thuỷ
tinh có cổ nhám và tiến hành xà phòng hoá như đã ghi ở phần trên.
Sau khi rửa dịch chiết ete bằng 15ml KOH 2% và nhiều lần với nước cất ( mỗi
lần 50ml) cho đến khi không còn vết kiềm ( thử với phenoltalein) . Loại nước
trong dung dịch chiết ete bằng cách lọc qua lớp NaSO 4 khan , rửa lớp Na2SO4
ba lần, mỗi lần với 10ml ete.
Gộp tất cả lớp ete vào bình quả lê. Cô quay đến cạn . Hoà tan phần còn lại bằng
chính xác 1ml dung dịch pha động ( vortex 15giây và siêu âm 3 phút) . Lọc
dịch đục qua màng lọc 13mm, 0.45um và thu dịch lọc và tiến hành phân tích
trên HPLC.
Chuẩn bị mẫu kiểm tra hiệu suất thu hồi:
Cho thêm 0.5ml dung dịch chuẩn 10ng/ml vào 10g mẫu trắng . đồng nhất mẫu
bằng chách siêu âm khoảng 1 phút. tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị
đối với mẫu thử.
Tiến hành phân tích trên HPLC:
Điều kiện phân tích :
- pha động
- tốc độ dòng
- detector UV, λ= 325nm
tiêm các dung dịch mẫu thử nghiệm theo thứ tự sau:
- Các dịch chuẩn . Dựng đừơng chuẩn giữa nồng độ các chuẩn vitamin A và
diện tích của các chuẩn Vitamin A. Tính toán hệ số tương quan hồi quy tuyến
tính.
- Dung dịch mẫu trắng
- Dung dịch mẫu kiểm soát. tính hàm lượng các vitamin A trong dịch chiết. và

trong mẫu thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên .Tính độ thu hồi mẫu
kiểm soát (R).
- Các dung dịch mẫu thử nghiệm. tính hàm lượng vitamin A trong dịch chiết
( Co ) thông qua đường chuẩn xây dựng ở bước trên.
Tinh kết quả:
Hàm lượng vitamin A có trong mẫu được tính theo công thức sau:
C = Co/m
Trong đó:
- C là hàm lượng Vitamin A có trong mẫu Tính theo mg/Kg
- Co là hàm lượng Vatamin A trong dịch chiết.( Co) thông qua đường chuẩn,
mg/L
- m : Khối lượng (g

13


II.Định lượng vitamin C theo phương pháp chuẩn độ
1)Phương pháp sử dụng 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP
a)Nguyên tắc:
Vitamin C (axit ascorbic) hòa tan trong nước, dễ bị phân hủy dưới tác dụng của
các chất oxi hóa và bền trong môi trường axit. Vì vậy người ta thường chiết axit
ascorbic của mẫu phân tích bằng các dung dịch axit như axit axetic 5%, axit
metaphôtphoric 2%.
Phương pháp dựa trên nguyên tắc axit ascorbic có khả năng oxi hóa khử thuận
nghịch chất chỉ thị 2,6 - diclophenol - inodophenol – DPIP. Dựa vào lượng chất
chỉ thị tiêu tốn tính ra lượng axit ascorbic có trong mẫu phân tích. Phản ứng
xẩy ra như sau:

Chất chỉ thị này có khả năng chuyển màu khi PH của môi trường thay đổi từ
kiềm sang axit, có màu tím trong khoảng PH từ 4 đến 5 và có màu hồng ở PH <

4.
b)Hóa chất :
Dung dịch HCl 1% và CH3COOH 5%.
Dung dịch axit metaphosphoric (HPO3) 2% hay axit axetic 1%.
Dung dịch amoni oxalate (C2H8N2O4) bão hòa.
Tinh thể KI.
Dung dịch H2SO4 2%.
axit ascorbic (Vitamin C) tinh khiết ( bảo quản kín trong lọ màu tối).
Dung dịch hồ tinh bột 1%.
Dung dịch thuốc chỉ thị DPIP 0.001N: cân 0.15g DPIP cho vào bình định
mức dung tích 500 ml, them 350ml nước cất, cho tiếp dung dịch đệm phôtphat
PH = 6,9 đến 7,0 đến vạch mức. vì trong nước, thuốc thử bị phá hủy nhanh nên
được pha với dung dịch đệm. Thuốc thử DPIP được bảo quản trong bình có
màu ở nơi tối ( không quá 7 ngày).
Dung dịch đệm phosphate PH = 6.9 đến 7,0: trộn 2 thể tích KH 2PO4
(9,075 gam KH2PO4 trong 1 lit nước cất) và 3 thể tích Na 2HPO4 (11,867 gam
Na2HPO4 .2H2O trong 1 lit nước cất) với nhau trước khi đem dùng.
c)Tiến hành:
1.
Cân 10 đến 50 g rau tươi hoặc 5 đến 10 g sản phẩm đóng hộp, tùy theo
hàm lượng Vitamin C có trong từng lọ nguyên liệu. Cho mẫu vào cối sứ.
2.
Cho thêm 4,5 ml HCl 1% (hoặc CH 3COOH 5%) vào cối (ngập kín mẫu).
Khi lấy mẫu tránh dung dụng cụ bằng sắt hoặc đồng. Nghiền mẫu không quá 10
phút.

14