Nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin và đánh giá khả năng sản xuất insulin của tế bào biệt hóa

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT INSULIN CỦA
TẾ BÀO BIỆT HÓA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
GV. Th.S PHẠM VĂN PHÚC

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG
MSSV: 3064379
LỚP: CNSHTT K32

Cần Thơ, tháng 11/2010
i


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU BIỆT HÓA TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ
MÁU CUỐNG RỐN NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO TIẾT INSULIN
VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SẢN XUẤT INSULIN CỦA
TẾ BÀO BIỆT HÓA

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
GV. Th.S PHẠM VĂN PHÚC

SINH VIÊN THỰC HIỆN
NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG
MSSV: 3064379
LỚP: CNSHTT K32

Cần Thơ, tháng 11/2010
ii


PHẦN KÝ DUYỆT

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(ký tên)

SINH VIÊN THỰC HIỆN
(ký tên)

Phạm Văn Phúc

Nguyễn Thị Phương Dung

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
(ký tên)

i


LỜI CẢM ƠN
Luận văn này không những là kết quả của sáu tháng nghiên cứu tại phòng Thí
nghiệm và Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự nhiên mà còn là tâm
huyết của em sau hơn 4 năm ñại học mà em ñã không ngừng cố gắng ở viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học Cần Thơ.
Lời cảm ơn chân thành trước tiên em xin gửi ñến thầy Phan Kim Ngọc, người ñã
ñem ñến cho em ý tưởng cũng như khơi dậy niềm ñam mê nghiên cứu về lĩnh vực tế
bào gốc.
Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Văn Phúc ñã hướng dẫn tận tình và tạo
ñiều kiện tốt nhất ñể em thực hiện ñề tài này.
Rất cảm ơn anh Đoàn Chính Chung, người ñã tận tình chỉ bảo, chia sẻ kinh
nghiệm làm việc và giúp ñỡ em xuyên suốt thời gian em làm việc ở phòng thí nghiệm
tế bào gốc.
Cảm ơn anh Nguyễn Thanh Tâm, anh Phạm Quốc Việt, chị Vũ Bích Ngọc cùng
các anh chị và các bạn ñang làm việc ở lab tế bào gốc ñã nhiệt tình giúp ñỡ chia sẽ
kinh nghiệm làm việc cũng như kinh nghiệm sống ñể em hoàn thiện mình.
Cảm ơn các thầy cô viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học ñã tích
cực hỗ trợ, nhắc nhở và giúp ñỡ em trong thời gian làm ñề tài.
Cảm ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ Sinh học tiên tiến khóa 32 ñã quan tâm,
chia sẽ ñộng viên em vượt qua khó khăn ñể hoàn thành công việc của mình.

Trên hết, con xin gửi lời tri ân sâu sắc ñến ba mẹ, người ñã cho con ñược sinh ra,
ñược nuôi dạy và lớn lên trong tình yêu thương vô bờ bến. Cảm ơn ba mẹ ñã luôn ủng
hộ mọi quyết ñịnh của con và luôn bên cạnh ñộng viên cổ vũ cho con trong bất cứ
hoàn cảnh nào.
Sáu tháng làm việc ở phòng thí nghiệm tế bào gốc là quãng thời gian em sẽ
không bao giờ quên ñược khi vừa phải ñối mặt với bao ñiều khó khăn vừa ñược nếm
trải bao nhiêu vui buồn và mới mẻ. Cuộc sống mới, môi trường làm việc mới, bạn bè
mới và kiến thức hoàn toàn mới ñã từng là trở ngại lớn nhất ngăn cản em theo ñuổi
ii


khác vọng của mình. Mặc dù vậy, em vẫn luôn tự an ủi và ñộng viên mình kiên trì
theo ñuổi ñam mê dù biết phía trước vẫn còn nhiều khó khăn vất vả. Điều mà em ñạt
ñược sau khóa luận này không những là kinh nghiệm làm việc mà còn là kiến thức về
những thành tựu mới, kỹ thuật mới mà trước nay em chưa từng ñược tiếp xúc. Hơn
thế nữa, ñiều ñáng quý nhất mà em học ñược nơi ñây là phong thái làm việc tích cực
và năng ñộng, phương pháp ñối mặt và giải quyết tình huống khó khăn trong nghiên
cứu khoa học, cách cư xử với bạn bè, ñồng nghiệp và mọi người trong xã hội. Em tin
rằng tất cả những gì em góp nhặt ñược nơi ñây sẽ là hành trang vững chắc ñể em bắt
ñầu cho một tương lai mới tươi sáng nhưng cũng ñầy thử thách sau này.

iii


TÓM TẮT
Tiểu ñường loại 1 là một bệnh tự miễn, gây ra bởi các tế bào miễn dịch tấn công tế
bào beta của tuyến tụy dẫn ñến sự thiếu hụt insulin ñiều hòa lượng ñường trong máu.
Cho ñến nay, tuy có rất nhiều phương pháp chữa trị tiểu ñường nhưng nói chung ñều
có tính chất tạm thời kèm theo những tác dụng không mong muốn, không thể sử dụng
ñể ñiều trị dứt ñiểm cho bệnh nhân. Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn là nguồn

tế bào gốc ñầy tiềm năng trong ứng dụng ñiều trị tiểu ñường, ñặc biệt là tiểu ñường
loại 1. Bằng cách biệt hóa tế bào gốc thành tế bào tiết insulin và chuyển vào cơ thể
bệnh nhân, liệu pháp tế bào gốc có thể giúp ñiều trị triệt ñể bệnh tiểu ñường trong
tương lai gần.
Trong nghiên cứu này, tế bào gốc trung mô ñược thu nhận từ máu cuống rốn
trẻ sơ sinh và ñược ñánh giá thông qua hình thái, khả năng tăng sinh và sự biểu hiện
marker bề mặt. Các tế bào này sau ñó ñược cảm ứng tiền biệt hóa trong L- DMEM có
bổ sung β-mercaptoethanol, Nicotinamide và FBS trong 48 giờ, sau ñó ñược biệt hóa
trong H- DMEM bổ sung β-mercaptoethanol, Nicotinamide và FBS. Hiệu quả biệt
hóa ñược ñánh giá thông qua 3 tiêu chuẩn: sự thay ñổi hình thái, sự sản xuất insulin
và sự biểu hiện các gen chuyên biệt của tế bào tiết insulin. Kết quả phân tích cho thấy
tế bào ñược phân lập từ máu cuống rốn chính là các tế bào gốc trung mô cần thu
nhận. Sau 4 ngày biệt hóa, tế bào ñược cảm ứng bắt ñầu co lại và hình thành cụm.
Cụm tế bào có hình thái giống cụm tiểu ñảo và bắt màu ñỏ thẫm với DTZ vào ngày
biệt hóa thứ 12. Khi phân tích Real Time PCR, các tế bào này biểu hiện các gen
Insulin, Ngn 3, sau 4 ngày biệt hóa và biểu hiện các gen Insulin, Pdx1, Ngn 3 sau 8
ngày và 12 ngày biệt hóa. Kết quả nhuộm dithizon và hóa miễn dịch tế bào sau 12
ngày biệt hóa với kháng thể kháng insulin cho thấy tế bào biệt hóa có khả năng sản
xuất insulin như tế bào beta của ñảo tụy.
Từ khóa: Tiểu ñường loại 1, tế bào gốc trung mô, máu cuống rốn, tế bào tiết
insulin, Reverse Transcription Realtime PCR.

i


MỤC LỤC
Trang
KÝ TÊN HỘI ĐỒNG
LỜI CẢM ƠN
TÓM TẮT ............................................................................................................... i

MỤC LỤC ............................................................................................................... ii
DANH SÁCH BẢNG ............................................................................................. v
DANH SÁCH HÌNH .............................................................................................. vii
TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................ x
CHƯƠNG 1- GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn ñề ........................................................................................................ 1
1.2. Mục tiêu ñề tài ................................................................................................. 2
CHƯƠNG 2- LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1. Tế bào gốc ........................................................................................................ 3
2.2. Máu cuống rốn ................................................................................................ 3
2.3. Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn ........................................................ 4
2.3.1. Tế bào gốc trung mô .............................................................................. 4
2.3.2. Đặc ñiểm của tế bào gốc trung mô máu cuống rốn ............................... 4
2.3.3. Ưu thế của việc sử dụng tế bào gốc trung mô máu cuống rốn .............. 8
2.4. Bệnh tiểu ñường .............................................................................................. 8
2.4.1. Tình hình phát triển bệnh tiểu ñường trên thế giới và việt nam ............ 9
2.4.2. Phân loại bệnh tiểu ñường ..................................................................... 9
2.4.3. Các phương pháp ñiều trị tiểu ñường .................................................... 11
2.4.4. Tế bào tiết insulin .................................................................................. 15
2.5. Một số phương pháp biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn
thành tế bào tiết insulin ......................................................................................... 19
ii


2.5.1. Biệt hóa bằng hóa chất........................................................................... 20
2.5.2. Biệt hóa bằng chuyển gen ...................................................................... 21
CHƯƠNG 3- PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu .................................................................................. 23
3.1.1. Vật liệu................................................................................................... 23
3.1.2. Dụng cụ và thiết bị................................................................................. 24

3.1.3. Hóa chất ................................................................................................. 26
3.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................... 29
3.2.1. Thu nhận máu cuống rốn ....................................................................... 29
3.2.2. Nuôi cấy và chọn lọc tế bào gốc trung mô ứng viên từ máu
cuống rốn người ............................................................................................... 30
3.2.3. Đánh giá ñặc ñiểm tế bào gốc trung mô ứng viên ñược thu nhận
từ máu cuống rốn người................................................................................... 33
3.2.4. Cảm ứng biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người
thành tế bào tiết insulin ..................................................................................... 34
3.2.5. Đánh giá hiệu quả biệt hóa .................................................................... 35
CHƯƠNG 4- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc trung mô ứng viên bằng Ficoll từ
máu cuống rốn người ............................................................................................. 40
4.2. Xác ñịnh ñặc ñiểm tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn ........................ 44
4.2.1. Hình thái tế bào ứng viên....................................................................... 44
4.2.2. Khả năng tăng sinh và tự làm mới ........................................................ 45
4.2.3. Sự biểu hiện một số marker bề mặt ....................................................... 46
4.3. Đánh giá sự biểu hiện gen và sự sản xuất inlulin của tế bào ñược
cảm ứng biệt hóa .................................................................................................... 49
4.3.1. Sự thay ñổi kiểu hình và khả năng bắt màu với Dithizon ở tế bào
iii


biệt hóa............................................................................................................. 49
4.3.2. Kết quả nhuộm hóa miễn dịch tế bào .................................................... 53
4.3.3. Kết quả sự biểu hiện các gen chuyên biệt trên các mẫu tế bào
biệt hóa ............................................................................................................ 54
CHƯƠNG 5- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận ............................................................................................................ 61
5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

iv


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1. Thông tin primer dùng trong nghiên cứu ............................................... 23
Bảng 3.2. Danh sách dụng cụ dùng trong nghiên cứu ............................................. 24
Bảng 3.3. Danh sách thiết bị dùng trong nghiên cứu .............................................. 25
Bảng 4.1. Kết quả phân tích marker bề mặt tế bào ứng viên ................................. 46
Bảng 4.2. Kết quả biểu hiện gene của tế bào sau khi phân tích Tm sản phẩm
khuếch ñại bời RT-qPCR. ....................................................................................... 56
Bảng 4.3. Kết quả phân tích melting curve SYBR gen của tế bào trước biệt hóa (xem phụ
chương)
Bảng 4.4. Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào trước biệt hóa (xem
phụ chương)
Bảng 4.5. Kết quả phân tích +/- SYBR gen của tế bào trước biệt hóa (xem phụ
chương)
Bảng 4.6. Kết quả phân tích melting curve gen của tế bào 4 ngày biệt hóa (xem phụ
chương)
Bảng 4.7. Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào 4 ngày biệt hóa (xem
phụ chương)
Bảng 4.8. Kết quả phân tích +/- Assay SYBR gen của tế bào 4 ngày biệt hóa
(xem phụ chương)
Bảng 4.9. Kết quả phân tích melting curve gen của tế bào 8 ngày biệt hóa (xem phụ
chương)
Bảng 4.10. Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào 8 ngày biệt hóa
(xem phụ chương)
Bảng 4.11. Kết quả phân tích +/- Assay SYBR của tế bào 8 ngày biệt hóa (xem phụ

chương)

v


Bảng 4.12. Kết quả phân tích melting curve gen của tế bào 12 ngày biệt hóa (xem phụ
chương)
Bảng 4.13. Kết quả phân tích quantification SYBR gen của tế bào 12 ngày biệt hóa
(xem phụ chương)
Bảng 4.14. Kết quả phân tích +/- Assay SYBR gen của tế bào 12 ngày biệt hóa (xem
phụ chương)
Bảng 4.15. Giá trị ñịnh lượng tương ñối biểu hiện gen theo công thức 2-∆∆Ct (xem phụ
chương)

vi


DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. (a) Nguyên tắc nhận diện Markers bề mặt tế bào bằng chất nhuộm
huỳnh quang; (b) Nguyên tắc hoạt ñộng của máy flow cytometer .......................... 7
Hình 2.2. Phương pháp cấy ghép tiểu ñảo ............................................................... 13
Hình 2.3. Sự sản xuất insulin trong tuyến tụy.......................................................... 15
Hình 2.4. Quá trình hình thành insulin .................................................................... 17
Hình 2.5. Quá trình glucose kích thích tế bào beta tiết insulin ................................ 18
Hình 2.6. Quá trình insulin kích thích sự hấp thu glucose ....................................... 19
Hình 3.1. (a) Flask nuôi tế bào; (b) Màng lọc vô trùng; (c) Đĩa 6 giếng;
(d) Electric pipetteman ............................................................................................. 24
Hình 3.2. (a) Máy ly tâm lạnh; (b) Kính hiển vi ñảo ngược; (c) Tủ thao tác
vô trùng; (d) Tủ nuôi cấy tế bào.............................................................................. 25
Hình 3.3. Khái quát quy trình thí nghiệm ................................................................ 29

Hình 3.4. Thao tác lấy máu từ cuống rốn ............................................................... 30
Hình 3.5. Khái quát quy trình thu nhận tế bào ñơn nhân từ máu cuống rốn ........... 30
Hình 3.6. Phương pháp thu nhận tế bào ñơn nhân từ máu cuống rốn;
(a) Hút máu bằng kim tiêm; (b) Pha loãng máu với PBSA;
(c) Bơm dung dịch máu vào Ficoll

(d) Dung dịch máu trên lớp Ficoll ............... 31

Hình 3.7. (a) Thao tác thay môi trường trên flask, (b) Thao tác thay môi trường
trên ñĩa 6 giếng ........................................................................................................ 32
Hình 3.8. Khái quát quy trình biệt hóa..................................................................... 35
Hình 3.9. Các chu kì nhiệt trong thiết lập phản ứng RT-qPCR ............................... 38
Hình 3.10 (a) Thao tác xử lý mẫu với trizol; (b) Thao tác chuyển mẫu ñã xử lý
với trizol vào tube sạch; (c) mẫu sau khi hòa ñều với chloroform;
(d) Mẫu tách lớp sau khi ly tâm với chloroform; (b) Thao tác hút phase trong;
(f) Thao tác chuyển phase trong vào tube mới......................................................... 39
vii


Hình 4.1. Kết quả mẫu máu sau khi xử lý Ficoll; (a) kết quả nghiên cứu này;
(b) kết quả ñược ñưa ra bởi Tunku Kamarul Zaman ............................................... 40
Hình 4.2. Tế bào sau khi huyền phù vào môi trường nuôi cấy (X10) .................... 41
Hình 4.3. Tế bào sau 7 ngày nuôi cấy (X20) ........................................................... 42
Hình 4.4. Tế bào sau 20 ngày nuôi cấy (X10) ......................................................... 42
Hình 4.5. Tế bào sau 3 lần cấy chuyền (X40) .......................................................... 44
Hình 4.6. Kết quả nuôi cấy MSC từ các mô khác nhau của
R. A. Musina et al. (a) MSC tủy xương. (b) MSC từ mô mỡ. (c) MSC từ da.
(d) MSC từ bánh nhau. ............................................................................................. 45
Hình 4.7. Tế bào hình thành colony (X40) ............................................................. 46
Hình 4.8. Kết quả phân tích marker bởi hệ thống FACS – Calibur:

(a) CD44-PE; (c) CD90-PE; (d) CD105-FITC; (f) CD34-FITC; (g) CD45-FITC;
(h) HLA-DR-FITC ................................................................................................... 47
Hình 4.9. Sự thay ñổi hình thái tế bào trong quá trình biệt hóa
(a) MSCs trước khi biệt hóa.

(b) MSCs sau 4 ngày biệt hóa

(b) MSCs sau 6 ngày biệt hóa. (d) MSCs sau 8 ngày biệt hóa
(c) MSCs sau 10 ngày biệt hóa. (e) MSCs sau 12 ngày biệt hóa ............................. 51
Hình 4.10. MSC trước khi biệt hóa, tế bào sau 5 ngày biệt hóa, tế bào biệt hóa
sau khi nhuộm dithizon; (a)(b)(c) Kết quả nghiên cứu của Huijuan Yuan et al;
(d)(e)(f) Kết quả biệt hóa của nghiên cứu này. ........................................................ 52
Hình 4.11. So sánh kết quả nhuộm DTZ (a) Tế bào tiết insulin biệt hóa từ
tế bào gốc từ da (W. Guo et al). (b) Bào tiết insulin biệt hóa từ MSC tủy
xương chuột (Zeinab Neshati et al) (c) Tế bào tiểu ñảo nhuộm với dithizon .......... 53
Hình 4.12. Kết quả hóa miễn dịch tế bào. (a) cụm tế bào trước khi nhuộm;
(b) cụm tế bào phát sáng xanh sau khi nhuộm nhân; (c) cụm tế bào phát sáng
ñỏ sau khi nhuộm màng. .......................................................................................... 54
viii


Hình 4.13. Kết quả phân tích giá trị Tm của phản ứng Real time PCR;
(a) mẫu tế bào chưa biệt hóa; (b) tế bào sau 4 ngày biệt hóa; (c) tế bào sau
8 ngày biệt hóa; (d) tế bào sau 12 ngày biệt hóa...................................................... 55
Hình 4.14. Kết quả phân tích Real-time PCR:
(a ) tế bào ñược chưa cảm ứng biệt hóa; (b) tế bào 4 ngày biệt hóa;
(c) tế bào 8 ngày biệt hóa; (d) tế bào 12 ngày biệt hóa ............................................ 56
Hình 4.14. Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Ngn3 ........................... 57
Hình 4.15. Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Pdx1 ........................... 58
Hình 4.16. Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Glut2 .......................... 58

Hình 4.17. Kết quả ñịnh lượng tương ñối sự biểu hiện gen Insulin ........................ 59
Hình 4.18. Temperature profile của phản ứng RT-qPCR khi phân tích gen tế bào
trước khi biệt hóa (xem phụ chương)
Hình 4.19. Temperature profile của phản ứng RT-qPCR khi phân tích gen tế bào 4
ngày biệt hóa (xem phụ chương)
Hình 4.20. Temperature profile của phản ứng RT-qPCR khi phân tích gen tế bào 8
ngày biệt hóa (xem phụ chương)
Hình 4.21. Temperature profile của phản ứng RT-qPCR khi phân tích gen tế bào 12
ngày biệt hóa (xem phụ chương)

ix


TỪ VIẾT TẮT
ADDL

Amyloid Beta- Derived Diffusible Ligands

BM

Bone Marrow

CD

Cluster Designation/ Cluster Of Differentiation

DTZ

Dithizon

EDTA

Ethylamin Tetraacetic Acid Disodium

EGF

Epithelial Growth Factor

eIF

Eukaryotic Initiation Factor

EPC

Endothelial Progenitor Cells

FBS

Fetal Bovine Serum

FCS

Fetal Calf Serum

GADPH

Glyceraldehyde 3-Phosphate Dehydrogen

GLUT

Glucose Transproter

H-DMEM

High Glucose Dulbecco’s Modied Eagle’s Medium

HLA

Human Leukocyte Antigen

HSC

Hematopoietic Stem Cells

IMDM

Iscove’s Modified Dulbecco Medium

L-DMEM

Low Glucose Dulbecco’s Modiied Eagle’s Medium

MafA

Mammalian Homologue Of Avian

MPB

Mobilized Peripheral Blood

MSC

Mesenchymal Stem Cells

Ngn

Neurogenin

NIH

National Institutes Of Health

PBS

Phosphate Buffer Saline

Pdx

Pancreatic and Duodenal Homeobox

PSC

Pluripotent Stem Cells
x


SC

Stem Cells

SH

Src Homology

TGF-β

Transforming Growth Factor- Β

UCB

Umbilical Cord Blood

USSC

Unrestricted Somatic Stem Cells

USSC

Unrestricted Somatic Stem Cell

HSCT

Hematopoietic Stem Cell Transplantation

RT-qPCR

reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

ICC

immunocytochemistry

xi


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1.

Đặt vấn ñề
Tiểu ñường loại 1 hiện ñang trở thành một trong những căn bệnh nguy hiểm nhất

ở người. Tiểu ñường loại 1 là một căn bệnh ñặc biệt nguy hiểm không kém AIDS vì
bệnh có thể xuất hiện ở mọi lứa tuổi và có khả năng di truyền; hơn nữa, những triệu
chứng lâm sàng của bệnh thường không ñược nhận ra ñến sau khi hệ miễn dịch của
bệnh nhân phá hủy hơn 90% tổng tế bào beta của tuyến tụy. Bệnh có liên quan ñến sự
kháng insulin hay sự ñào thải của hệ miễn dịch cơ thể ñối với tế bào β- tế bào có vai
trò chính trong việc tiết insulin ñiều hòa lượng ñường trong máu. Cho ñến nay, ñã có
rất nhiều nghiên cứu ñược thực hiện nhằm tìm kiếm phương pháp hữu hiệu nhất cho
việc chữa trị căn bệnh này như ñiều chỉnh chế ñộ ăn uống và vận ñộng, sử dụng thuốc,
tiêm insulin, hay cấy ghép cơ quan nhưng ñều mang tính chất tạm thời và có thể gây di
chứng nguy hiểm về sau cho bệnh nhân. Hướng ñiều trị lý tưởng ñối với bệnh nhân
tiểu ñường loại 1 là bổ sung những tế bào beta bị mất trong ñảo tụy ñồng thời ñảm bảo
tế bào mới cấy ghép không bị hệ miễn dịch của bệnh nhân ñào thải. Một phương pháp
hiện ñược ñánh giá rất cao về hiệu quả chữa trị tiểu ñường loại 1 là sử dụng tế bào gốc
biệt hóa thành tế bào tiết insulin và chuyển vào cơ thể bệnh nhân. Phương pháp này

không những có nhiều ưu ñiểm vượt bậc mà còn khắc phục ñược những nhược ñiểm
cố hữu của những phương pháp trước ñây. Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn ñã
và ñang ñược quan tâm nghiên cứu do nguồn thu nhận dồi dào và không vướng phải
các rào cản về ñạo ñức sinh học. Các nhà khoa học hy vọng rằng với tính chất ña tiềm
năng, khả năng phù hợp miễn dịch cũng như khả năng tự làm mới của mình, MSC hứa
hẹn sẽ là một liệu pháp hữu hiệu trong y học. Tuy nhiên, trên thế giới cho ñến nay ñã
có rất nhiều nghiên cứu biệt hóa tế bào gốc thành tế bao tiết insulin nhưng vẫn chưa
tạo ra tế bào tiết insulin có khả năng ñiều trị lâm sàn.
Từ những lý do nêu trên, tôi thực hiện ñề tài “Nghiên cứu biệt hóa tế bào tiết
insulin từ tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người và ñánh giá khả năng tiết insulin
của tế bào biệt hóa” nhằm góp phần nghiên cứu tạo ra tế bào tiết insulin có thể ñược

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

1

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

Trường ĐHCT

ứng dụng trong y học cho việc ñiều trị các bệnh nhân tiểu ñường nói chung và tiểu
ñường loại 1 nói riêng.
1.2.

Mục tiêu ñề tài

-

Phân lập tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người

-

Biệt hóa tế bào gốc trung mô máu cuống rốn người thành tế bào tiết insulin
bằng hóa chất

-

Đánh giá sự biểu hiện các gen chuyên biệt trên tế bào biệt hóa và ñánh giá khả
năng tiết insulin của tế bào biệt hóa

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

2

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

Trường ĐHCT

CHƯƠNG 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1.

Tế bào gốc
Một cách khái quát, tế bào gốc (stem cell_SC) là những tế bào chưa có chức

năng, có khả năng phân chia liên tục và biệt hóa thành những kiểu tế bào khác nhau
trong cơ thể. Theo thông tin ñược báo cáo từ viện sức khỏe quốc gia Mỹ (National
institutes of health_NIH), SC có hai tính chất ñặc biệt mà tế bào biệt hóa không có:
-

Một là, SC là tế bào có khả năng tự làm mới (self- renewal) và phân chia liên

tục trong một thời gian dài mà vẫn duy trì ñược trạng thái không biệt hóa.
-

Hai là, tế bào gốc có khả năng biệt hóa (differentiate) hay chuyển biệt hóa

(transdifferentiate) thành những tế bào có chức năng khác nhau ở ñiều kiện in vivo hay
in vitro phù hợp.
2.2.

Máu cuống rốn
Theo “Chương trình máu cuống rốn quốc gia” (National cord blood program) của

Mỹ, sau khi trẻ sơ sinh ra ñời, phần máu còn ñọng lại trong mạch máu của bánh nhau
và cuống rốn ñi kèm ñược gọi là máu cuống rốn (umbilical cord blood_UCB). Sau khi
ñứa trẻ ra ñời, phần máu này không cần thiết cho trẻ cũng như người mẹ, nên thường
bị xem là chất thải.
UCB chứa tất cả các thành phần của máu như hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và
huyết tương. Từ hơn hai năm trước ñây, UCB ñã ñược ñánh giá có thể là sự lựa chọn
cho nguồn mô máu dùng trong dị ghép cứu chữa cho bệnh nhân mắc bệnh thiếu kháng
nguyên bạch cầu. UCB còn là nguồn khác của tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic stem
cells_HSC) có thể thay thế tủy xương và máu ngoại vi. Gần ñây, UCB ñược sử dụng
ngày càng nhiều trong việc lưu trữ tế bào máu không những dùng trong ñiều trị cho

bệnh nhân rối loạn chức năng máu mà còn cho những bệnh nhân mắc bệnh kháng
miễn dịch di truyền, những bệnh về trao ñổi chất và khối u rắn.
Ca cấy ghép máu cuống rốn ñầu tiên ñược thực hiện năm 1988 bởi Gluckman et
al. Từ thành công của ca cấy ghép này, việc lưu trữ UCB càng có ý nghĩa quan trọng.
Ngân hàng UCB ñầu tiên ñã ñược thành lập dùng cho dị ghép vào năm 1993 bởi
Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

3

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

Trường ĐHCT

Rubinstein ở trung tâm máu New York. UCB hiện nay ñang trở nên rất có giá trị trong
y học, cho ñến nay, có ñến hơn 80 bệnh khác nhau ñược ñiều trị bằng UCB.
Ngoài khả năng ñiều trị các bệnh về máu, UCB còn là nguồn SC quan trọng hiện
nay ñang ñược các nhà khoa học ñầu tư nghiên cứu. Trong máu cuống rốn, có rất
nhiều kiểu SC khác nhau bao gồm: tế bào gốc tạo máu (Hematopoietic stem
cells_HSC), tế bào gốc sinh dưỡng không giới hạn (unrestricted somatic stem
cell_USSC), tế bào tiền thân nội mô (endothelial progenitor cell_EPC), tế bào gốc
trung mô (mesenchymal stem cell_MSC), tế bào gốc tiền thân ña năng máu cuống rốn
(cord blood multipotent progenitor cell_CB-MPCs).
2.3.

Tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn
2.3.1.

Tế bào gốc trung mô

Thuật ngữ Mesenchymal Stem Cell (MSC) ñược ñề xuất bởi Maureen Owen và
cộng sự dựa trên một phần nghiên cứu của Alexander Friendenstein (1924). Khái
niệm này ñược phổ biến hơn bởi Arnold Caplan vào những năm cuối thập niên 80 và
trong suốt thập niên 90. MSC ñược xác nhận là nguồn tế bào gốc ña tiềm năng
(Pluripotent Stem Cell- PSC) vì chúng có thể biệt hoá thành nhiều loại tế bào khác
nhau có nguồn gốc từ trung phôi bì.
MSC có thể ñược thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau trong cơ thể như tủy
xương, mô mỡ, các lớp nội mô lót thành tĩnh mạch và ñộng mạch, chất nhầy
Wharton’s Jelly của cuống rốn người, trong ñó nguồn thu nhận ñược quan tâm nhiều
nhất hiện nay là máu cuống rốn.
2.3.2.

Đặc ñiểm của tế bào gốc trung mô máu cuống rốn

2.3.2.1.

Hình thái tế bào

MSC có hình dạng rất ñặc trưng, có thể nhận ra bằng cách quan sát dưới kính
hiển vi. Tế bào có thân nhỏ và dài chứa một nhân to dạng tròn, hạch nhân rất rõ rệt.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

4

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học

Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

2.3.2.2.

Trường ĐHCT

Kiểu hình miễn dịch của MSC

MSC không thể ñược nhận diện bởi chỉ một phương pháp riêng lẻ mà phải bằng
sự phối hợp một loạt các tiêu chí khác nhau. Tuy nhiên, MSC có thể ñược nhận biết
bởi tập hợp các marker (marker profiles) là các kháng nguyên bám trên bề mặt tế bào
Trong quyển “Principles of regenerative medicine”, Anthony Atala nhấn mạnh
những phân tử CD (cluster designation or cluster of differentiation) bám trên bề mặt tế
bào là marker phổ biến nhất có thể dùng ñể nhận ra MSC. Trong ñó, các phân tử Stro1, SH2(CD105), SH3, SH4(CD73), CD29, CD44, CD54, CD105, CD133, CD166
dương tính với MSC, còn các phân tử CD11, CD 14, CD19, CD31, CD34, CD45,
CD79, HLA- DR ñược xác ñịnh là âm tính với MSCs (Dean et al, 2000). Thêm vào ñó,
kết quả nghiên cứu của Oscar K. Lee et al (2004) cho thấy trong quần thể tế bào trung
mô máu cuống rốn, các marker CD29, CD 38, CD44, CD48, CD49, CD51, CD58,
CD73 dương tính ñặc trưng cho MSC. Ngoài ra, có một số các marker khác như GD2
(Caridad Martinez et al, 2007), BMPR, CD34+Sca1+ Lin- profile, Sca-1... trong các
nghiên cứu gần ñây cũng ñược xác ñịnh là dương tính với MSC.
Trên thực tế, chỉ có một số marker ñược dùng ñể nhận ra MSC trong quần thể tế
SC từ UCB. Vì trong UCB có chứa nhiều kiểu tế bào gốc khác nhau, nên khi muốn
nhận diện MSC từ quần thể này, việc cần thiết là phải tìm các marker thể hiện dương
tính với MSC nhưng âm tính với các loại tế bào gốc còn lại, và ngược lại nếu các
marker ñược chọn âm tính với MSC thì phải dương tính với các loại tế bào gốc khác
trong quần thể tế bào ñược xét.
Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng một số marker tiêu biểu như sau: CD34,
CD44, CD45, CD90, CD105, HLA-DR
Kiểu hình miễn dịch dự ñoán của MSC ñối với các marker này là:

CD44+CD90+CD105+ CD34-CD45-HLA-DRMarker dương tính (trên 90% số tế bào trong tổng số tế bào khảo sát biểu hiện)
-

CD44 là một loại glycoprotein bám dính trên bề mặt tế bào, nó có vai trò quan

trọng trong trao ñổi chất và tiến triển của khối u ác tính ở người. Kháng nguyên CD44
hiện diện ở tế bào lympho T, hạch bạch huyết, hồng cầu, tế bào não và tế bào nội mô.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

5

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

Trường ĐHCT

Sự biểu hiện của CD44 cũng ñược chứng minh xuất hiện ở MSC. CD44 liên quan ñến
khả năng gắn kết của tế bào bạch huyết trên tế bào nội mô, khả năng tìm về (homing)
cơ quan lympho ngoại vi, các vị trí viêm và tập hợp bạch cầu. CD44 còn gây tín hiệu
phóng thích cytokine và hoạt hóa tế bào T.
-

CD90: là là loại immunoglobulin nhỏ nhất, bám dính trên bề mặt tế bào (Clark

và Springer, 1999). Ở người, CD90 biểu hiện ở các dòng SC như MSC, HSC, KSC và
những mô không phải lympho như nguyên bào sợi, tế bào thần kinh và tế bào nội mô
hoạt hóa. CD90 có chức năng tổng hợp và phóng thích các chất kích thích sinh trưởng

như cytokine, những thành phần của dịch ngoại bào giúp sửa chữa mô tổn thương
(Lynn Kisselbach et al, 2009).
-

CD105: hay endoglin, là protein liên quan ñến sự tăng sinh và tình trạng thiếu

oxy cảm ứng (hypoxia-inducible), biểu hiện nhiều ở tế bào nội mô angiogenic (tế bào
có chức năng sửa chữa và bảo vệ mạch máu). Ngoài ra, CD105 còn ñược biết ñến như
là glycoprotein chuyển màng loại 1 và là một phần của thụ thể TGF-β. Endoglin biểu
hiện mạnh ở tế bào nội mô thành mạch máu, và syncytiotrophoblasts của bánh nhau.
Nó cũng ñược tìm thấy trên tế bào mono hoạt hóa, MSC và tế bào leukemic của dòng
lymphoid và myeloid. Những nghiên cứu gần ñây còn cho thấy CD105 liên quan ñến
chức năng bảo vệ tế bào và chống lại sự chết theo chương trình (apoptosis).
Marker âm tính (dưới 2% số tế bào trong tổng số tế bào khảo sát biểu hiện)
-

CD34 là glycoprotein bề mặt, biểu hiện ở giai ñoạn sớm của HSC và những tế

bào tạo máu nguyên thủy từ máu cuống rốn hay từ tủy xương cũng như tế bào nội
màng. Các phân tử này có khả năng ñiều hòa sự bám dính của tế bào tạo máu. Mặc dù
kháng nguyên này ñược phân vào loại marker cho tế bào tạo máu nhưng cũng có
nghiên cứu ñồng thời cho thấy nó chưa biểu hiện ở quần thể SC. Dựa vào trạng thái
biệt hóa, tế bào âm tính với CD34 có khả năng là tế bào nguyên thủy tạo máu, tuy
nhiên chúng cũng ñược xem là chuyên biệt cho tiền trung mô như hủy cốt bào, tế bào
sụn, tế bào cơ, tế bào mỡ và một số tế bào khác.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

6

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

-

Trường ĐHCT

CD45 biểu hiện mạnh ở dòng HSC. CD45 ñược biết ñến như là marker cho

bạch cầu. CD45 hiện diện ñến 10% vùng bề mặt của tế bào lympho nhưng biểu hiện ít
hơn ở các tế bào bạch huyết khác.
-

HLA-DR: (human leukocyte antigens) là thụ thể bề mặt tế bào, ñặc trưng cho tế

bào lympho T. Nó biểu hiện ở tế bào máu cuống rốn và tế bào máu ngoại vi dương tính
với CD34, bao gồm ñại thực bào (macrophage), tế bào mono, tế bào lympho. Tần số
biểu hiện HLA-DR dương tính ở tế bào CD34+CD38+ cao hơn CD34+CD38−. Có giả
thuyết cho rằng tế bào càng biệt hóa biểu hiện phân tử này biểu hiện càng mạnh.
Một phương pháp rất thông dụng ñược dùng trong việc nhận diện các marker bề
mặt ñó là phương pháp nhuộm huỳnh quang. Bằng phương pháp này, các marker ñược
nhận diện và bám bởi các kháng nguyên ñặc hiệu có gắn nhân tố phát huỳnh quang.
Nhờ các nhân tố huỳnh quang bám dính, các marker mục tiêu sẽ ñược nhận diện thông
qua hệ thống máy flow cytometer (FC).

Hình 2.1. (a) Nguyên tắc nhận diện Markers bề mặt tế bào bằng chất
nhuộm huỳnh quang; (b)Nguyên tắc hoạt ñộng của máy flow cytometer
2.3.2.3. Khả năng biệt hóa

MSC từ máu cuống rốn cũng có khả năng biệt hóa in vitro và ex vitro thành các
dòng tế bào khác nhau (Pittenger et al 1999), bao gồm tế bào xương (Sila-Asnaet et al,
2007; Friedmand et al,2006), tế bào sụn (Bernardoet et al, 2007), tế bào cơ (Toma et
al, 2002), tế bào mỡ và tế bào thần kinh (Sanchez-Ramos et al, 2000).

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

7

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

2.3.3.

Trường ĐHCT

Ưu thế của việc sử dụng tế bào gốc trung mô máu cuống rốn

Vì MSC có ñặc ñiểm miễn dịch học ñặc biệt ñó là ức chế sự tăng sinh của tế bào
lympho ở ñiều kiện invitro và kéo dài sự sống của mô ghép invivo (Bartholomew et
al., 2002) nên MSC tồn tại ñược lâu trong môi trường dị ghép (Liechty et al., 2000).
Nguồn MSC từ máu cuống rốn hiện nay ñược sử dụng phổ biến hơn so với các
nguồn khác vì việc thu nhận không cần phải có những thao tác phức tạp và không làm
tổn thương cơ thể cho như khi thu nhận từ tủy xương hay máu ngoại vi.
MSC từ máu cuống rốn có rất nhiều ưu thế so với các dòng tế bào gốc khác:
-

Hơn hẳn tế bào gốc tủy xương, MSC từ máu cuống rốn có thể khắc phục ñược

sự thải loại miễn dịch của cơ thể vì các tế bào này chưa phát triển những ñặc ñiểm ñể
hệ miễn dịch nhận diện.
-

Được nghiên cứu và công nhận là PSC, MSC từ máu cuống rốn có khả năng

biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau như tế bào xương, sụn, cơ, mỡ, gân, thần
kinh, tế bào tiết insulin (GAO Feng et al)... Tuy nhiên khả năng biệt hóa có thể giảm
sau nhiều lần cấy chuyền trong nuôi cấy in vitro…
-

Máu cuống rốn rất dồi dào, dễ thu nhận và bảo quản. Tế bào gốc từ máu cuống

rốn ít khi mang mầm bệnh nên an toàn cho cấy ghép.
-

Ngoài ra, trẻ sau khi sinh sẽ không sử dụng ñến UCB nữa, do ñó, việc sử dụng

MSC từ UCB là hoàn toàn hợp ñạo ñức và có thể sử dụng thay thế vai trò chữa bệnh
của tế bào gốc phôi vì không vướng phải vấn ñề ñạo ñức sinh học.
2.4.

Bệnh tiểu ñường
Đái tháo ñường – hay thường gọi ñơn giản là bệnh tiểu ñường (diabetes) - là một

bệnh lý trong ñó cơ thể không có khả năng ñều hòa lượng ñường trong máu, ñiều này
làm cho lượng ñường trong máu của người bệnh thường xuyên cao hơn mức cho phép
(trên

4 mmol/L). Bệnh có liên quan trực tiếp ñến việc cơ thể hoặc không sản xuất ñủ

insulin, hoặc không phản ứng ñúng cách với insulin ñược sản xuất.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

8

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học


Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 32tt – 2010

2.4.1.

Trường ĐHCT

Tình hình phát triển bệnh tiểu ñường trên thế giới và Việt Nam

Vào khoảng giữa những năm 80 của thế kỷ trước, tổng số người mắc bệnh tiểu
ñường trên thế giới vào khoảng 30 triệu. Ngày nay con số ñó ñã lên tới 246 triệu và
theo dự ñoán tới năm 2025 số người mắc bệnh sẽ lên tới 380 triệu. Căn bệnh này làm
ảnh hưởng rất lớn tới nền kinh tế thế giới. Ước tính, mỗi năm trên thế giới người ta
phải bỏ ra khoảng 215 ñến 375 tỷ ñô la ñể chữa căn bệnh này. Thực tế ñó cho thấy
bệnh tiểu ñường có xu hướng tăng mạnh theo sự phát triển của xã hội, ñặc biệt là tiểu
ñường loại 2.
Kết quả nghiên cứu của SARAH WILD và cộng sự (2004) cho thấy số người mắc
bệnh tiểu dường sẽ tăng gấp ñôi vào năm 2030 so với năm 2000 ñồng thời số người
mắc bệnh tiểu ñường ở các nước ñang phát triển tăng cao hơn so với các nước phát
triển.

Theo xu hướng ñó, Việt Nam cũng không nằm ngoài những nước ñược xem là có
nguy cơ cao phát triển bệnh tiểu ñường trên thế giới. Tính toán của Hội người giáo dục
bệnh ñái tháo ñường Việt Nam cho thấy: Tỷ lệ người mắc bệnh ñái tháo ñường năm
2002 chiếm 2,7%, ñến 2008 ñã tăng lên 5,7% dân số. Tỷ lệ người mắc bệnh ñái tháo
ñường ở các thành phố lớn chiếm tỷ lệ 7,2% dân số.
PGS.TS Tạ Văn Bình (Chủ tịch Hội người giáo dục bệnh ñái tháo ñường Việt
Nam) phát biểu rằng với tỷ lệ tăng từ 8-20% mỗi năm: "Việt Nam không phải là quốc
gia có tỷ lệ ñái tháo ñường lớn nhất thế giới, nhưng bệnh ñái tháo ñường ở Việt Nam
phát triển nhanh nhất thế giới". Phó giáo sư cũng cho biết thêm “Mỗi phút trên thế giới
có 6 người chết vì bệnh ñái tháo ñường (3,2 triệu người chết/năm), tương ñương với số
người chết do HIV/AIDS”
2.4.2.

Phân loại bệnh tiểu ñường

Bệnh tiểu ñường không phân loại theo các giai ñoạn bệnh khác nhau mà dựa trên
khả năng ñáp ứng glucose của cơ thể.
2.4.2.1.

Tiểu ñường loại 1 (type 1 diabetes)

Tiểu ñường loại 1 là một bệnh tự miễn, xảy ra do sự hủy diệt các tế bào beta của
tuyến tụy bởi hệ thống miễn dịch của bệnh nhân. Tiểu ñường loại 1 chiếm khoảng 5-

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học

9

Viện NC & PT Công nghệ Sinh học