KỸ THUẬT REAL TIME PCR PHÁT HIỆN và PHÂN BIỆT e COLI còn SỐNG và đã CHẾT TRONG THỰC PHẨM

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR PHÁT
HIỆN VÀ PHÂN BIỆT E.COLI CÒN
SỐNG VÀ ĐÃ CHẾT TRONG THỰC
PHẨM

Người hướng dẫn: TS. BS PHẠM HÙNG VÂN
Người thực hiện: PHAN HOÀNG VINH
Lớp: 14060302
Khoá: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KỸ THUẬT REAL-TIME PCR PHÁT
HIỆN VÀ PHÂN BIỆT E.COLI CÒN
SỐNG VÀ ĐÃ CHẾT TRONG THỰC
PHẨM

Người hướng dẫn: TS. BS PHẠM HÙNG VÂN

Người thực hiện: PHAN HOÀNG VINH
Lớp: 14060302
Khoá: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2019


iii


4

LỜI CẢM ƠN

Vậy là thời gian làm khóa luận cũng đã kết thúc với bao nhiêu là kỷ niệm và
cảm xúc trong tôi, để khóa luận tốt nghiệp này được hoàn thành tốt như hôm nay tôi
xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến quý thầy cô, gia đình, bạn bè và
những người thân xung quanh tôi đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi từ kiến thức
chuyên môn đến động viên tinh thần trong suốt thời gian qua từ khi tôi nhận đề tài
khóa luận tốt nghiệp cho đến khi hoàn thành.
Cùng với lòng biết ơn đó tôi xin gởi lời cảm ơn đến Quý thầy cô khoa Khoa
học ứng dụng, bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Tôn Đức Thắng những
người đã truyền lòng nhiệt huyết, năng lượng và những kiến thức chuyên môn cho
tôi vô cùng bổ ích trong suốt thời gian tôi học tập tại trường.
Bên cạnh đó tôi cũng xin được cảm ơn ban lãnh đạo, các phòng ban cùng với
các anh chị QC & DV tại Công Ty TNHH Thương Mại & Dịch Vụ Nam Khoa đã
đồng ý và tạo mọi điều kiện thuận lợi và tốt nhất để cho tôi có cơ hội được thực
hiện và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp tại Công Ty.
Lời cảm ơn sâu sắc này tôi xin gởi đến TS. BS PHẠM HÙNG VÂN người
đã ở bên cạnh tôi truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm thực tiễn, luôn dạy bảo,

quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian tôi làm khóa luận tốt nghiệp tại
Công Ty. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn Thầy chúc Thầy thật nhiều sức
khỏe để tiếp tục dẫn dắt các thế hệ tiếp theo. Tôi xin cảm ơn Thầy!
Cùng với tình cảm yêu thương và lòng biết ơn tôi xin gởi lời cảm ơn này đến
cha mẹ đấng đã sinh thành dưỡng dục không ngại khó khăn đã cho tôi mọi thứ tốt
đẹp như ngày hôm nay. Cảm ơn tất cả bạn bè và mọi người xung quanh đã động
viên giúp đỡ tôi trong suốt khoảng thời gian vừa qua.


5

LỜI CAM ĐOAN

CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI
CÔNG TY TNHH THƯƠNG MẠI VÀ DỊCH VỤ NAM KHOA
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự
hướng dẫn khoa học của TS. BS PHẠM HÙNG VÂN. Các nội dung nghiên cứu,
kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào
trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét,
đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau, có ghi rõ trong phần
tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số
liệu của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn
gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách
nhiệm về nội dung luận văn của mình. Trường đại học Tôn Đức Thắng không liên
quan đến những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực
hiện (nếu có).

TP. Hồ Chí Minh, ngày 05 tháng 02 năm 2019

Tác giả


6

PHAN HOÀNG VINH


7

TÓM TẮT


8

An toàn vệ sinh thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hiện nay
nhưng làm sao ta có thể biết được thực phẩm đó có bị nhiễm khuẩn không và vi
khuẩn đó còn sống hay đã chết, đặc biệt là vi khuẩn E.coli nguyên nhân hàng đầu
gây ra ngộ độc thực phẩm ở người vì vậy nội dung của đề tài này là tôi sẽ sử dụng
kỹ thuật real-time PCR để phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã chết trong
thực phẩm.
Thông qua kỹ thuật nhuộm Gram và định danh bằng IDS ta xác định được vi
khuẩn E.coli là trực khuẩn Gram âm có khả năng sinh Ind thử nghiệm đặc trưng của
vi khuẩn E.coli.
Cùng với việc sử dụng các cặp mồi đặc hiệu (cặp mồi định danh E.coli) cơ
chất phát huỳnh quang là Taqman probe của kỹ thuật real-time PCR. Kết quả cho
thấy qua 6 chủng vi khuẩn E.coli ở hai trạng thái còn sống và đã chết ta thấy được
nồng độ DNA của E.coli còn sống sau khi tăng sinh sẽ cao hơn nồng độ DNA của
E.coli còn sống trước tăng sinh, nói lên sự sinh trưởng và phát triển của E.coli, còn
ở trạng thái chết thì nồng độ DNA trước và sau khi tăng sinh là bằng nhau chứng tỏ

không có sự sinh trưởng và phát triển nhưng vẫn có sự hiện diện vi khuẩn E.coli.
Như vậy, với kỹ thuật real-time PCR được sử dụng trong việc phát hiện
E.coli còn sống hay đã chết trong thực phẩm với 6 mẫu thực nghiệm góp phần cho
công tác kiểm soát thực phẩm bị nhiễm khuẩn, ngăn ngừa ngộ độc do vi khuẩn
E.coli gây ra, giúp phát hiện sự hiện diện của E.coli đã chết mà phương pháp thông
thường không thể phát hiện được đó chính là kết quả của đề tài khóa luận tôi đã
thực hiện.
Sinh viên thực hiện: PHAN HOÀNG VINH
Giáo viên hướng dẫn: TS. BS PHẠM HÙNG VÂN
Đề tài “Kỹ thuật Real-Time PCR phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã
chết trong mẫu thực phẩm”


9

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 11/2018 đến tháng 02/2019
Địa điểm: Công ty TNHH TM và DV Nam Khoa số 793/58 Trần Xuân Soạn,
phường Tân Hưng, quận 7, TP. Hồ Chí Minh.

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN..........................................................................................................ii
LỜI CAM ĐOAN...................................................................................................iii
TÓM TẮT...............................................................................................................iv
MỤC LỤC…………...……………………………………………………………...v
DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT...........................................................vii
DANH MỤC BẢNG.............................................................................................viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ............................................................................ix
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................x
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU………...…………………………………………………..1
1.1.

Đặt vấn đề...................................................................................................1

1.2.

Nội dung nguyên cứu..................................................................................1

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN...................................................................................3
2.1. Giới thiệu về Escherichia coli.......................................................................3
2.1.1. Phân loại khoa học:................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm cấu trúc và đặc tính sinh học................................................4
2.1.3. Phân loại..................................................................................................5
2.1.4. khả năng gây bệnh..................................................................................7
2.1.5. cơ chế gây bệnh......................................................................................7
2.1.6. Con đường lây lan và nguồn gốc lây nhiễm.......................................10
2.1.7. Nguyên tắc phòng bệnh và điều trị......................................................11
2.2. Chuẩn đoán, định danh vi khuẩn E.coli....................................................11
2.3. Những nghiên cứu và khảo sát về ngộ độc thực phẩm do E.coli gây ra.
.......................................................................................................................... 15


10

2.4. Kỹ thuật real- time PCR.............................................................................18
2.4.1. Kỹ thuật PCR........................................................................................18
2.4.2 Ứng dụng................................................................................................21
2.4.3. Real-time PCR.......................................................................................22
2.4.3.1 Hoá chất và thuốc thử được sử dụng trong kỹ thuật real-time PCR
.......................................................................................................................... 23
2.4.3.2 Biểu đồ biểu diễn khuếch đại của kỹ thuật real-time PCR..............25

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP..................................................28
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..............................................................28
3.1.1. Thời gian nghiên cứu............................................................................28
3.1.2. Địa điểm................................................................................................28
3.2. Vật liệu, dụng cụ và thiết bị.........................................................................28
3.2.1. Mẫu........................................................................................................28
3.2.2. Hoá chất sinh phẩm..............................................................................28
3.2.3. Thiết bị được sử dụng...........................................................................29
3.3. Phương pháp thực hiện...............................................................................29
3.3.1 Quy trình trình hiện...............................................................................29
3.3.2 Giải thích quy trình...............................................................................30
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN..........................................................32
4.1. So sánh kết quả cấy thông thường và real-time PCR trong việc phát hiện
sự hiện diện của vi khuẩn E.coli........................................................................32
4.2. So sánh kết quả real-time PCR..................................................................32
4.3 So sánh và bàn luận kết quả........................................................................34
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ........................................................35
5.1. Kết luận........................................................................................................35
5.2. Kiến nghị......................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO.....................................................................................36


11

DANH MỤC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AAF
BHI

: Aggregative adhesion firm briae
: Brain heart Infusion Agra

CFA

: Clonisation Factor Antigen

DAEC
ETEC
EIEC
EAEC
EPEC
EHEC
GMP
LT
MAEC
PCR
SS
ST
Stx
UPEC
HUS

: Diffusely adherent E.coli
: Enterotoxigenic E.coli
: Enteroinvasive E.coli
: Enteroaggregative E.coli
: Enteropathogenic E.coli
: Enterohaemorrhagic E.coli
: cGMC-cyclic guanosine monophosphate
: Heat labile toxin
: Meningitidis-associated E.coli

: Polymerase Chain Reaction
: Salmonella shigella agar
: Heat Stable Toxin
: Shiga toxin
: Uropathogenic E.coli
: Haemolytic uraemic syndrome

DANH MỤC BẢNG


12

Bảng 2.1 Bảng phân tích số vụ và nguyên nhân ngộ độc thực phẩm năm 200. 16
Bảng 3.1 Các thiết bị được sử dụng trong đề tài.................................................29
Bảng 3.2 Thể tích giữa mix và mẫu thử nghiệm khi chạy real-time PCR…….31
Bảng 4.1 Kết quả real-time PCR thể hiện nồng độ DNA...…………………….39


13


14

DANH MỤC SƠ ĐỒ, BIỂU Đ

Sơ đồ 1 Quy trình định danh vi khuẩn E.coli......................................................12
Biểu đồ 2.1. Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh
quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sánh kích thích vào mỗi
chu
kỳ nhiệt

Sơ đồ 2. Quy trình Phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã chết bằng kỹ
thuật real-time PCR………………………………………………………………29


15

DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1: Escherichia coli (E.coli ).........................................................................3
Hình 2.2 Khuẩn lạc E.coli trên môi trường MC.................................................14
Hình 2.3 Kết quả nhuộm Gram của vi khuẩn E.coli...........................................14
Hình 2.4 Kết quả thử nghiệm sinh hóa bằng IDS...............................................15
Hình 2.5 Cơ chế phát huỳnh quang của Taqman probe trong real-time PCR..25
Hình 4.1 Biểu đồ khuếch đại mẫu E.coli sống trước và sau tăng sinh...............32
Hình 4.2 Biểu đồ khuếch đại mẫu E.coli chết trước và sau tăng sinh................33


1

CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Ở xã hội phát triển như hiện nay thì thực phẩm là một phần tất yếu trong cuộc

sống hằng ngày và đi theo đó ngộ độc thực phẩm cũng trở thành mối quan tâm hàng
đầu của xã hội. Theo như số liệu của FAO và WHO khoảng 90% các vụ ngộ độc là
do sử dụng thực phẩm có nguồn gốc từ động vật đã bị nhiễm khuẩn. Có nhiều vi
khuẩn gây ra ngộ độc thực phẩm nhưng trong đó vi khuẩn thường gặp nhất và chủ
yếu nhất chính là vi khuẩn E.coli, tình trạng ngộ độc thực phẩm đang có xu hướng
ngày tăng cao và ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng.

Vì thế việc phát hiện ra vi khuẩn E.coli có trong thực phẩm là việc vô cùng
quan trọng và quan trọng hơn là có thể biết được E.coli đó còn sống hay đã chết để
biết được sự hiện diện của E.coli trong thực phẩm, từ đó đánh giá được chất lượng
của thực phẩm hạn chế tối đa vấn đề ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng đến sức khỏe
cộng đồng vì nó gây ra bệnh tiêu chảy ở trẻ em, viêm màng não, rối loạn tiêu hóa,
khi bị nhiễm E.coli nặng có thể dẫn đến ngộ độc cấp tính, mất nước có thể dẫn đến
tử vong nếu không có sự điều trị kịp thời. Vi khuẩn E.coli có mặt ở khắp mọi nơi
trên trái đất, vòng đời của nó khá lâu và sinh sản cực nhanh đồng thời khả năng lây
lan bệnh rất cao tuy nhiên chúng có kích thước rất nhỏ nên chúng ta không thể quan
sát và biết được sự hiện diện của chúng trong thực phẩm, vì thế ta phải sử dụng kỹ
thuật real-time PCR để phát hiện và phân biệt E.coli còn sống và đã chết trong thực
phẩm một cách nhanh chóng, hiệu quả và chính xác ngoài ra kỹ thuật real-time PCR
còn giúp tránh được hiện tượng dương tính giả do DNA tế bào chết gây ra dẫn đến
sai kết quả thí nghiệm. Từ đó ta có thể kiểm soát được thực phẩm an toàn làm giảm
nguy cơ lây lan bệnh qua con đường thực phẩm, ta sẽ có được những thực phẩm an
toàn bảo vệ sức khỏe cho con người và vật nuôi.
1.2.



Nội dung nguyên cứu
Nuôi cấy, phân lập và tăng sinh vi khuẩn E.coli
Thiết lập kỹ thuật real-time PCR để phát hiện E.coli còn sống và đã chết


2



Chạy real-time PCR thu nhận kết quả



Phân tích, so sánh và biện luận kết quả real-time PCR

Kết quả của đề tài sẽ cung cấp thêm các dữ liệu, cơ sở khoa học và cách nhận
diện cho quá trình phát hiện E.coli còn sống và đã chết một cách nhanh nhất về sự
hiện diện của E.coli trong thực phẩm, là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về
E.coli trong các mẫu thực phẩm.


3

CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về Escherichia coli
2.1.1. Phân loại khoa học:
Giới (regnum):

Bacteria

Ngành (phylum):

Proteobacteria

Lớp (class):

Gammaproteobacteria

Bộ (ordo):

Enterobacteriales

Họ (familia):

Enterobacteriaceae

Chi (genus):

Escherichia

Loài (species):

E.coli

Danh pháp hai phần: Escherichia coli

Hình 2.1: Escherichia coli (E.coli )
Theo www.fao.org/Preventing-E.Coli-in Food

 Lịch sử phát hiện Escherichia coli.
Escherichia coli hay còn được gọi là E.coli được Theodor Escherich nhà vi
khuẩn học người Áo phát hiện đầu tiên vào năm 1885 trong quá trình điều trị và
nghiên cứu về bệnh tiêu chảy, chúng được tìm thấy ở tã lót của trẻ em. Vi khuẩn
E.coli được chọn làm đại diện điển hình cho họ vi khuẩn đường ruột bởi vì nó sống
ký sinh trong ruột già vì thế nó được đặt tên là Bacterium coli.
Sau khi ông Theodor Escherich qua đời năm 1911 thì loài vi khuẩn này đã
được các nhà khoa học đổi tên rất nhiều lần nhưng đến năm 1919 thì được thống
nhất trên toàn thế giới với tên gọi là Escherichia coli ( viết tắt là E.coli) để vinh
danh và tưởng nhớ đến ông người đầu tiên đã tìm ra được loài này [45].
Những nghiên cứu về vi khuẩn E.coli đã có nhiều thành tựu và ứng dụng nổi

bật, vi khuẩn E.coli có thể tạo ra một bộ môn học vô cùng quan trọng trong lĩnh vực
vi sinh học nói riêng và sinh học nói chung bao gồm nhiều kiến thức liên quan đến
vi sinh từ hình thái, sinh lý đến thành phần sinh hóa, sinh học phân tử, di truyền học
ở loài vi khuẩn này.
E.coli thường được sử dụng làm mô hình rất quan trọng trong các thí
nghiệm bởi vì tốc độ sinh sản của chúng rất nhanh kỹ thuật nuôi cấy đơn giản, đặc


4

biệt là chủng vi khuẩn E.coli K12 được sử dụng rất nhiều, khi E.coli được thải qua
phân ra bên ngoài thì nó có khả năng sinh trưởng và tạo nên quần thể tự do ở môi
trường bên ngoài.
Mặc dù chúng ký sinh trong ruột động vật nhưng hầu hết các chủng E.coli
đều vô hại nó giúp cho quá trình tiêu hóa được thuận lợi hơn tuy nhiên vẫn có một
số chủng có độc tính có thể gây ngộ độc thực phẩm và các bệnh đường ruột đặc
trưng là chủng E.coli O157:H7 khi chúng được thải ra bên ngoài từ phân và được
quay trở lại vào cơ thể con người. Tỷ lệ E.coli trong đường ruột rất cao nên nó được
sử dụng để đánh giá chỉ tiêu an toàn thực phẩm và nguồn nước [11],[32]. Ngoài ra
vi khuẩn E.coli còn có khả năng cộng sinh với vật chủ để sản sinh ra vitamin K và
vitamin B12 là hai loại vitamin rất cần thiết cho cơ thể con người và động vật [20].
Mặc dù E.coli đã được nghiên cứu kỹ càng nhất và nhiều nhất nhưng cho đến nay
nó vẫn được các nhà khoa học tiếp tục nghiên cứu và quan tâm sâu sắc nhất vì hầu
như các loại bệnh điều có liên quan đến vi khuẩn E.coli.
2.1.2. Đặc điểm cấu trúc và đặc tính sinh học
Escherichia coli là trực khuẩn Gram âm có hai đầu tròn, hình que, có kích
thước trung bình từ 0.5 x (2-3)µm, có thể đứng riêng lẻ hoặc có khi xếp chung
thành một chuỗi dài. Trong môi trường có kháng sinh, môi trường không thuận lợi
thì hình dáng của vi khuẩn như sợi chỉ, chúng sống kí sinh trong ruột già, đường
tiêu hóa của người và các động vật máu nóng. Rất hiếm khi chủng E.coli có vỏ

nhưng hầu hết chúng đều có lông và có khả năng di động bằng tiên mao, chúng
không tạo bào tử, có thêm vỏ vi khuẩn nếu chủng đó có độc lực [45],[25].
 Tính chất nuôi cấy
Vi khuẩn E.coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí tùy ý chúng rất dễ dàng phát
triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường kể cả là môi trường tổng hợp rất
nghèo chất dinh dưỡng. Nhiệt độ mà vi khuẩn E.coli có thể phát triển là từ 5 oC đến
40oC nhưng nhiệt độ tốt nhất là khoảng 37 oC, độ pH tốt nhất là từ 6.4 đến 7.4.
Trong điều kiện thích hợp vi khuẩn E.coli phát triển rất nhanh, thời gian thế
hệ chỉ khoảng 20 đến 30 phút. Khi cấy vào môi trường lỏng (như môi trường canh


5

thang) thì sau 3 đến 4 giờ vi khuẩn đã làm đục nhẹ môi trường, sau 24 giờ môi
trường sẽ bị đục đều và sau 2 ngày thì trên bề mặt môi trường sẽ có một lớp váng
mõng, vào những ngày sau có thể thấy dưới đáy ống sẽ lắng cặn E.coli, đều đó cho
thấy tốc độ tăng trưởng của vi khuẩn E.coli là rất nhanh nhưng nó không mộc trên
môi trường canh thang Selenit [2],[6].
Trên môi trường thạch thông thường cơ bản thì sau khoảng 8 đến 10 giờ thì
ta có thể quan sát được khuẩn lạc E.coli qua kính lúp. Sau 24 giờ khuẩn lạc có kích
thước khoảng 1,5mm. Hình thái khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn E.coli là hình chữ
S nhưng cũng có thể gặp dạng hình R (xù xì) hoặc M (nhầy) có màu trắng đục và
ướt. Trên các môi trường phân lập khác nhau, các chất chỉ thị màu khác nhau khuẩn
lạc sẽ có màu khác nhau ví dụ như trên môi trường thạch lactose E.coli sẽ có khuẩn
lạc màu vàng, hoặc có thể là màu hồng nếu khuẩn lạc mọc trên môi trường
MacConKey, các đặc điểm hình thái này có thể bị biến đổi khác nhau qua nhiều lần
cấy truyền liên tục. Nhưng E.coli không mọc được trên môi trường SS.
Một số chủng E.coli sẽ có tính chất nuôi cấy riêng biệt phù hợp cho từng
chủng nó được ứng dụng trong việc sàn lọc nhanh các chủng E.coli ví dụ như vi
khuẩn E.coli EAEC tạo thành váng đặc khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton

[5].
 Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn E.coli có thể lên men được nhiều loại đường, hầu hết các vi khuẩn
E.coli đều lên men lactose sinh acid hỗn hợp, sinh Indonl và sinh hơi trừ EIEC, có
khả năng khử nitrate thành nitrite, có enzyme lysindecacboxydase, không phân giải
được Ure, không sinh H2S, không thủy phân gelatin, không sử dụng citrate. Để phân
biệt được vi khuẩn E.coli và một số vi khuẩn đường ruột khác người ta thường sử
dụng thử nghiệm IMViC và kết quả của thử nghiệm nếu là E.coli sẽ là (+)(+)(-)(-)
hay (-) (+) (-)(-) [1],[7].


6

2.1.3. Phân loại
Dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà vi khuẩn E.coli được chia thành các type
huyết thanh khác nhau. Với sự kết hợp của các kháng nguyên O, K và H sẽ có rất
nhiều type huyết thanh khách nhau và được ký hiệu là O và K.
Kháng nguyên O (Somatic antigen): Nó là kháng nguyên của vách tế bào
được cấu tạo bởi lipopolysaccharide, đối với vi khuẩn E.coli người ta đã xác định
được gần 160 yếu tố kháng nguyên O. Đặc tính của kháng nguyên O này là có khả
năng chịu được nhiệt độ cao, nó không bị phân hủy khi thủy phân ở 100oC trong 2
giờ và có khả năng kháng cồn vì nó không bị hủy khi tiếp xúc cồn 50% nhưng lại bị
hủy bởi formon 5%, chúng rất là độc vì chỉ cần một lượng ít khoảng 0.05mg là có
thể đủ để giết chết chuột nhắt trong 24 giờ.
Khi kháng nguyên O khi gặp huyết thanh tương ứng sẽ xảy ra phản ứng
ngưng kết kháng nguyên O. Kháng nguyên O giữ vai trò quyết định đối với khả
năng gây bệnh và có tính chất chuyên biệt cho từng loại vật chủ kí sinh [15].
Kháng nguyên giáp mô K (Capsular antigen): Kháng nguyên K được cauas
tạo bởi polysaccharide hay là protein nó đã được xác định có khoảng 100 yếu tố
nằm ngoài kháng nguyên O và được chia làm ba loại khác nhau là: loại A, loại B và

loại L. Trong đó loại A tồn tại dưới dạng vỏ ta có thể quan sát được dưới kính hiển
vi quang học thông thường, còn loại B và loại L tồn tại dưới dạng màng rất mỏng
nên ta chỉ có thể quan sát được bằng kính hiển vi điện tử. Nếu kháng nguyên K che
phủ hoàn toàn thân của vi khuẩn thì nó sẽ ngăn cản phản ứng ngưng kết kháng
nguyên O. Ngoài ra kháng nguyên K còn giúp cho vi khuẩn E.coli bám vào tế bào
biểu mô trước khi xâm lấn đường tiêu hóa hay đường tiết niệu của vật chủ.
Kháng nguyên lông H (Flagellar antigen): Nó được cấu tạo bởi protein và đã
có hơn 50 yếu tố kháng nguyên H đã được xác định. Đặc tính của kháng nguyên H
này là không chịu được nhiệt độ cao, nó sẽ bị hủy khi tiếp xúc với cồn 50% và các
enzyme proteinase nhưng chúng không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H
gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết.


7

Kháng nguyên tiên mao F (Fimbrial antigen): Nó có dạng hình sợi và dài
khoảng 4µm giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột của vật chủ vì thế kháng
nguyên F rất quan trọng trong việc gây ra bệnh của vi khuẩn E.coli [12],[44].
Dựa vào vị trí gây bệnh, đặc điểm gây bệnh, yếu tố độc lực và các gen độc
lực khác nhau mà các chủng E.coli gây bệnh ở người được chia thành hai nhóm
chính: Nhóm thứ nhất là nhóm gây bệnh đường ruột ( IPEC- intestinal pathogenic
E.coli) hay E.coli gây tiêu chảy ( DEC-Dierrheagenic E.coli). Nhóm thứ hai là
nhóm gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC- extraintestinal pathogenic E.coli) [14].










Các loại E.coli gây bệnh đường ruột ( IPEC) được biết hiện nay là :
EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột.
ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh độc tố ruột.
EIEC ( Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập ruôt.
EAEC (Enteroaggregative E.coli): E.coli ngưng tập ruột.
DAEC (Diffusely adherent E.coli): E.coli bám dính phân tán.
EHEC (Enterohaemorrhagic E.coli): E.coli gây xuất huyết ruột.
Hai loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột được biết đến hiện nay và quan

trọng nhất là:
 MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não.
 UPEC (Uropathogenic E.coli): E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu [1],
[21],[29].
2.1.4. khả năng gây bệnh
Mặc dù vi khuẩn E.coli chiếm tỷ lệ cao nhất (khoảng 80%) trong số vi khuẩn
hiếu khí trong đường ruột nhưng hầu như chúng vô hại đối với đường tiêu hóa tuy
nhiên cũng có một số chủng ra gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, viêm
đường mật, nặng hơn có thể gây viêm màng não, viêm phổi ở trẻ mới sinh ngoài ra
còn gặp trong nhiễm trùng ngoại khoa [36]. Theo báo cáo của chương trình quốc gia
giám sát tính kháng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường gặp từ năm 1988 đến
1994 thì vi khuẩn E.coli đứng thứ 2 về tỷ lệ phân lập được ở nước ta chỉ sau vi
khuẩn Staphylococcus aureus.


8

2.1.5. cơ chế gây bệnh.
Tùy vào các chủng E.coli khác nhau mà sẽ có các cơ chế gây bệnh khác nhau

 Chủng vi khuẩn ETEC-E.coli : E.coli sinh độc tố ruột.
Là tác nhân gây ra bệnh tiêu chảy giống như vi khuẩn tả, chỉ cần một hoặc hai
độc tố ruột là vi khuẩn ETEC có thể gây bệnh cho vật chủ, hai yếu tố độc lực gây
bệnh của ETEC là: khả năng bám dính vào niêm mạc ruột và sản xuất độc tố, nhưng
yếu tố quyết định đến khả năng gây tiêu chảy là do độc tố ruột
Có 2 loại độc tố ruột được sản sinh đó là: Độc tố chịu được nhiệt ST (heat
Stable Toxin) là nội độc tố và độc tố không chịu nhiệt LT (heat labile toxin ), LT là
ngoại độc tố gồm hai loại LT I và LT II. Một chủng vi khuẩn ETEC-E.coli có thể
sinh ra một trong hai hoặc cả hai độc tố trên. Việc chuẩn đoán chủng vi khuẩn này
bằng cách xác định sự có mặt của độc tố ruột chịu được nhiệt ST [31],[41].
 EIEC- E.coli xâm nhập ruột
EIEC gây bệnh chủ yếu là do khả năng xâm nhập vào niêm mạc đại tràng gây viêm
loét và hoại tử niêm mạc đại tràng. Nó gây ra bệnh bằng cách sinh ra nội độc tố
Shigella. Có thể xác định chủng vi khuẩn này bằng các thử nghiệm xâm nhập được
thực hiện bằng cách nhỏ 1 giọt chất nuôi cấy vào mắt chuột lang [33].
 EAEC-E.coli bám dính kết tập ruột
EAEC thường gây tiêu chảy kéo dài hoặc mạn tính ở trẻ nhỏ, nó cũng là nguyên
nhân chủ yếu gây ra nhiễm khuẩn đường tiêu hóa ở khách du lịch. Hiện nay cơ chế
gây bệnh của nó vẫn chưa được các nhà khoa học làm sáng tỏa hoàn toàn nhưng yếu
tố độc lực chính gây ra bệnh đó là các điểm bám dính kết tập AAF (aggregative
adhesion firm briae) yếu tố điều hòa bám dính kết tập aggR. Độc tố EAST-1
(enteroaggretive heat-stable toxin-1) này có khả năng phá hủy các tế bào biểu mô,
điểm bám dính kết tập AAF được xem là yếu tố quyết định độc lực của chủng vi


9

khuẩn EAEC này. Khi nuôi cấy trên canh thang Muller-Hinton, EAEC sẽ tạo thành
một váng đặc trưng trên bề mặt môi trường và tính chất này cũng thường được sử
dụng để sàn lọc nhanh các chủng E.coli [28],[40].

 EHEC- E.coli: E.coli gây xuất huyết ruột
Chúng còn được gọi là E.coli sinh độc tố Shiga, đặc chưng của chủng này là vi
khuẩn E.coli O157:H7 là nguyên nhân chủ yếu gây ra bệnh lây truyền qua con
đường thực phẩm dẫn đến tỷ lệ nhiễm EHEC và tỷ lệ tử vong tăng cao hằng năm.
Độc tố chính của EHEC là Stx ( Shiga toxin) hay độc tố gây độc lên tế bào Vero VT
(Verocytotocyn) nó làm hủy hoại các vi nhung mao và hấp thu các tế bào biểu mô
ruột gây nên sự ức chế quá trình tổng hợp nên protein của tế bào biểu mô đại tràng
dẫn đến làm chết tế bào gây nên hội chứng HUS (haemolytic uraemic syndrome hội chứng tan máu) [40],[43].
 DAEC-E.coli bám dính phân tán
DAEC là chủng E.coli gây bệnh được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến trong
thời gian gần đây. Nó được xác định là một chủng gây bệnh riêng biệt so với các
chủng vi khuẩn khác vì nó không có gen độc lực đặc trưng như các chủng khác.
DAEC nó là loại E.coli gây bệnh ngoài đường ruột (ExPEC) hay còn được gọi là vi
khuẩn gây bệnh cơ hội khi “lạc chỗ” vì chúng có thể là thành viên của hệ vi khuẩn
vô hại bình thường trong đường ruột nhưng khi chúng đi lạc vào máu, dịch tủy não
và đi vào đường tiết niệu thì chúng sẽ gây ra bệnh đặc biệt là những người có đề
kháng bị suy giảm [17],[23].
 MAEC (Meningitidis-associated E.coli): E.coli gây viêm màng não
Chúng có kháng nguyên vỏ miễn dịch với polysaccharide nhóm B của vi khuẩn
Neisseria meningitides. Cho đến nay những thông tin về các căn bệnh do vi khuẩn
này gây nên ở trẻ em vẫn chưa được làm rỏ một cách chính xác nhất. Theo kết quả


10

nghiên cứu cho thấy tới 80% các trường hợp viêm màng não ở trẻ sơ sinh là do
chủng MAEC gây nên.
 UPEC E.coli gây nhiễm khuẩn đường tiết niệu
Chúng là nguyên nhân hàng đầu của việc nhiễm trùng đường tiết niệu, yếu tố độc
lực quan trọng quyết định đến khả năng gây bệnh của UPEC là P-pili. Nhờ Pili này

mà vi khuẩn UPEC E.coli có thể gắn đặc hiệu vào kháng nguyên P là một trong
những kháng nguyên nhóm máu. Những vi khuẩn này có chứa các gen mã hóa cho
các yếu tố độc lực như: yếu tố bám dính, vỏ và các độc tố AFA/Dr gây bám dính
phân tán EAST-1 phá hủy tế bào biểu mô [8],[9].
2.1.6. Con đường lây lan và nguồn gốc lây nhiễm
Sự lây nhiễm vi khuẩn E.coli chủ yếu là qua phân tươi của động vật khi được
thải ra môi trường bên ngoài, người ta cũng còn phát hiện ra vi khuẩn E.coli có
trong thực phẩm như sữa chưa được tuyệt trùng, thịt, rau củ quả tươi sống từng
được bón phân chưa qua xử lý, ngoài ra thực phẩm bị nhiễm E.coli trong quá trình
tăng trưởng, thu hoạch, sau thu hoạch vận chuyển mất vệ sinh. Đồng thời các yếu tố
như nhiệt độ, pH, nguồn nước không đạt tiêu chuẩn cũng tạo điều kiện cho vi khuẩn
E.coli phát triển [19].
Ô nhiễm thịt cũng là nguyên nhân chính của nguồn gốc lây nhiễm E.coli.
Thịt xay có nguy cơ nhiễm E.coli nhiều hơn thịt mảnh vì trước đó trong thịt xay vi
khuẩn E.coli đã được trộn lẫn vào nhau trong quá trình nghiền và có thể không bị
giết chết hoàn toàn được trong quá trình đun nấu, trong khi đó thịt mảnh vi khuẩn
E.coli chỉ có ở trên bề mặt nên ta có thể dễ dàng tiêu diệt được vi sinh vật.
Vi khuẩn E.coli cũng có thể lây truyền trực tiếp từ người này sang người
khác qua các trung tâm chăm sóc sức khỏe, bệnh viện, viện dưỡng lão hoặc bất cứ
nơi nào người tiếp xúc với phân của người đã bị nhiễm bệnh đây cũng là nguyên