KHẢO sát ẢNH HƯỞNG của CHẤT điều hòa SINH TRƯỞNG và hợp CHẤT hữu cơ đến QUÁ TRÌNH NUÔI cấy IN VITRO LAN TRẦM điện BIÊN (dendrobium parishii)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH
TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY IN VITRO LAN TRẦM ĐIỆN BIÊN
(Dendrobium parishii)

Giảng viên hướng dẫn: TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG QUANG
Lớp: 14060301
Khoá: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018


TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH
TRƯỞNG VÀ HỢP CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH
NUÔI CẤY IN VITRO LAN TRẦM ĐIỆN BIÊN
(Dendrobium parishii)

Giảng viên hướng dẫn: TS. PHAN TƯỜNG LỘC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN TRỌNG QUANG
Lớp: 14060301

Khoá: 18
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018


1

LỜI CÁM ƠN
Quãng đường đại học hơn bốn nắm, mới thoạt nghe có vẻ rất dài nhưng nó cứ
lặng lẽ trôi qua. Rồi cũng đã đến lúc một thế hệ sinh viên nữa cất cao đôi cánh dời khỏi
giảng đường đại học để dấn thân vào cống hiến cho xã hội, cho gia đình. Thời gian
ngồi dưới mái trường Đại học Tôn Đức Thắng không quá dài nhưng nó cho tôi một kỉ
niệm không bao giờ quên từ những môn học chuyền năng lượng cho nhiệt huyết cháy
bỏng đến những không gian sôi động của các hoạt động giải trí. Khóa luận tốt nghiệp
cũng là cột mốc cuối cùng đánh dấu kết thúc một chặng đường và mở ra một chặng
đường mới. Nhân dịp này tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn chân thành đến đấng sinh
thành và dưỡng dục. Chắc hẳn không có lời cám ơn nào có thể đáp lại cho đủ công ơn
của bố mẹ, con cám ơn vì bố mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc cho con dù trong bất cứ
hoàn cảnh nào, là hậu phương vững chắc để con tiến bước vào một tương lại tươi sáng
hơn.
Tôi cũng muốn gửi lời cám ơn ngôi trường thân thương của tôi, trường Đại học
Tôn Đức Thắng. Nơi mà tôi đươc mở mang tri thức và giúp tôi xây dựng ước mơ. Cho
tôi một môi trương thật tốt để học tập và rèn luyện bản thân. Cám ơn khoa Khoa học
ứng dụng và các thầy cô trong khoa đã tận tình chỉ bảo tôi không chỉ những kiến thức
mà cho tôi bao bài học về đối nhân sử thế giúp tôi tự tin hơn khi giao tiếp.
Tôi cũng muốn gửi lời cám ơn chân đến Công ty TNHH Nông Vinh đã tạo điều
kiện rất tốt cho tôi có thể hoàn thành nhiệm vụ khóa luận. Nhân đây tôi cũng muốn gửi
lời cám ơn đến thầy Phan Tường Lộc, người đã hướng dẫn để giúp tôi hoàn thành tốt
khóa luận này, không những thế cô cũng là người mà tối đặc biệt kính trọng. Tôi thán
phục cô vì cô là một giảng viên lớn tuổi nhưng luôn tìm tòi và đổi mới để giúp chúng
tôi có nền tảng tốt trong các môn học.

Cuối cùng tôi muốn gửi một lời chúc sức khỏe và có được một cuộc sống hạnh
phúc tới mọi người thân thương.


2

LỜI CAM ĐOAN
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng
dẫn khoa học của TS. Phan Tường Lộc. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài
này là trung thực và chưa công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu
trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả
thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra, trong luận văn còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu
của các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
về nội dung luận văn của mình. Trường Đại học Tôn Đức Thắng không liên quan đến
những vi phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có).
TP. Hồ Chí Minh, ngày tháng năm
Tác giả


3

TÓM TẮT
NGUYỄN TRỌNG QUANG, Đại học Tôn Đức Thắng, tháng 2/2019
“KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG VÀ HỢP
CHẤT HỮU CƠ ĐẾN QUÁ TRÌNH NUÔI CẤY IN VITRO LAN TRẦM ĐIỆN BIÊN
(Dendrobium parishii)”

Giảng viên hướng dẫn: TS. Phan Tường Lộc
Đề tài được thực hiện tại phồng thí nghiệm của công ty TNHH Nông Vinh trên đối
tượng lan Trầm Điện Biên (Dendrobium parishii): Khảo sát khả năng nhân chồi trên
môi trường MS bổ sung BAP; BAP và Kinetin kết hợp NAA. Khảo sát sự sinh trưởng
của lan Trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) trên môi trường ½ MS, 25g/L đường,
8g/L agar bổ dung các dịch chiết hữu cơ. Đồng thời khảo sát khả năng tạo rễ của các
chồi in vitro trên môi trường ½ MS + 0,5g/L than hoạt tính bổ sung NAA ở các nồng
độ khác nhau.
Môi trường MS có chứa 25g/L đường, 8g/L agar, 100ml nước dừa, bổ sung 1,0mg/L
BAP cho kết quả nhân chồi tốt nhất đạt 7,67 ± 0,34 chồi/mẫu cấy, chồi cao
2,49 ± 0,06cm, 6,22 ± 0,19 lá trong nuôi cấy in vitro lan Trầm Điện Biên (Dendrobium
parishii) sau 60 ngày.
Môi trường nhân chồi tối ưu nhất sau 60 ngày nuôi cấy in vitro lan Trầm Điện Biên
(Dendrobium parishii) là mối trường MS chứa 25g/L đường, 8g/L agar, 100ml nước
dừa, bổ sung 2,0mg/L BAP và 1,0mg/L NAA cho kết quả đạt 6,89 ± 0,96 chồi/mẫu cấy,
chiều cao chồi là 1,76 ± 0,05cm.
Trong môi trường ½ MS có bổ sung 20 g/L khoai tây cho kết quả tốt nhất trong việc
thúc đẩy quá trình sinh trưởng của lan Trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) sau 60
ngày nuôi cấy; chiều cao chồi trung bình đạt 3,78 ± 0,09 cm; chồi có 6,99 ± 0,22 lá;
8,22 ± 0,69 rễ/ mẫu cấy và chiều dài rễ là 1,06 ± 0,14cm.


4

Môi trường thích hợp cho giai đoạn tạo rễ của nuôi cấy in vitro lan Trầm Điện Biên
(Dendrobium parishii) là 1/2MS bổ sung 2,0mg/L NAA và 0,5g/L than hoạt tính. Kết
quả thu được; 10,89 ± 0,51 rễ/mẫu cấy và rễ dài 0,66 ± 0,05cm sau 60 ngày nuôi cấy.

MỤC LỤC
LỜI CÁM ƠN...............................................................................................................................i

LỜI CAM ĐOAN........................................................................................................................ii
TÓM TẮT..................................................................................................................................iii
MỤC LỤC..................................................................................................................................iv
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................................................vii
DANH MỤC HÌNH.................................................................................................................viii
DANH MỤC BẢNG..................................................................................................................ix
DANH MỤC BIỂU ĐỒ...............................................................................................................x
Chương 1. MỞ ĐẦU...................................................................................................................1
1.1

Đặt vấn đề.....................................................................................................................1

1.2

Mục tiêu........................................................................................................................2

1.3

Nội dung thí nghiệm.....................................................................................................2

Chương 2: TỔNG QUAN............................................................................................................3
2.1

Tổng quan về nuôi cấy mô............................................................................................3

2.1.1

Lich sử nuôi cấy mô...............................................................................................3

2.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [2]...................................................3

2.1.3

Môi trường nuôi cấy..............................................................................................4

2.1.3.1 Khoáng đa lượng [2]............................................................................................4
2.1.3.2 Khoáng vi lương [2] [3].......................................................................................4
2.1.3.3

Đường [2]......................................................................................................4

2.1.3.4 Vitamin [3]...........................................................................................................5
2.1.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng [3] [2]..................................................................5


5

2.1.3.6 Các yếu tố khác....................................................................................................7
2.1.4

Các loại môi trường cơ bản....................................................................................7

2.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu..................................................................................7
2.2.1 Sơ lược về chi lan hoàng thảo Dendrobium................................................................7
2.2.1.1 Phân loại, sự đa dạng và phân bố [4]...................................................................8
2.2.1.2 Đặc điểm hình thái...............................................................................................9
2.2.1.3 Các yếu tố tác động đến sự phát triển của Dendrobium....................................12
2.2.2

Phân loại lan Trầm rừng Điện Biên (Dendrobium parishii)..................................14

2.2.3

Sơ lược về lan trẩm rừng Điện Biên (Dendrobium parishii).................................14

2.3

Tình hình nghiên cứu..................................................................................................15

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................................17
3.1

Địa điểm......................................................................................................................17

3.2

Thời gian.....................................................................................................................17

3.3

Vật liệu thí nghiệm......................................................................................................17

3.4

Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm...................................................................................17

3.5

Môi trường nuôi cấy....................................................................................................17

3.6

Điều kiện nuôi cấy......................................................................................................17

3.7

Phương pháp thí nghiệm.............................................................................................18

3.7.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi của
lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro...........................................................18
3.7.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BAP, Kinetin và NAA đến sự hình
thành chồi của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro............................19
3.7.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu cơ
đến sự sinh trưởng của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro...............20
3.7.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây
lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro...........................................................21
3.8

Phương pháp lấy số liệu..............................................................................................21

3.9

Phương pháp xử lý số liệu...........................................................................................22

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................................23


6

4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi của lan
trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro.....................................................................23

4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BA, Kinetin và NAA đến sự hình thành
chồi của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro..........................................28
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu cơ đến sự
sinh trưởng của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro...............................33
4.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan
trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro.....................................................................36
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.............................................................................39
5.1

Kết luận.......................................................................................................................40

5.2

Kiến nghị.....................................................................................................................40

PHỤ LỤC 1...............................................................................................................................40
PHỤ LỤC 2...............................................................................................................................41
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................................54


7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ANOVA

: Analysis Of Variance (Phân tích phương sai)

BAP

: 6-benzylaminopurine

CV

: Coeff Var (hệ số biến thiên).

NAA

: α-naphthaleneaceticd


8

DANH MỤC HÌ
Hình 2. 1: Dendrobium Phalaenopsis [31]....................................................................9
Hình 2. 2: Dendrobium nobile [30]...............................................................................9
Hình 2. 3: Cấu tạo của lan Dendrobium [32]...............................................................10
Hình 2. 4: Dendrobium parishii [33]...........................................................................14
Hình 2. 5: Dendrobium parishii var.semi alba. [33]....................................................15
Hình 2. 6: Dendrobium var.alba. [34].......................................................................15Y
Hình 4. 1: Ảnh hưởng của nông độ BAP đến sự hình thành chồi của lan Trầm Điện
Biên (Dendrobium paishii) in vitro ngày 30.................................................................24
Hình 4. 2: Ảnh hưởng của nông độ BAP đến sự hình thành chồi của lan Trầm Điện
Biên (Dendrobium paishii) in vitro ngày 60.................................................................26
Hình 4. 3: Ảnh hưởng kết hợp của BA, Kinetin và NAA đến sự hình thành chồi của
cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60...................................32
Hình 4. 4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu cơ đến sự sinh
trưởng của cây lan Trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60...............34
Hình 4. 5: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan Trầm Điện
Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60................................................................37

9

DANH MỤC BẢ
Bảng 3. 1: Các ngiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân
chồi của lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro........................................18
Bảng 3. 2: Các ngiệm thức khảo sát ảnh hưởng kết hợp của BAP, Kinetin và NAA đến
sự hình thành chồi của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro............19
Bảng 3. 3: Các nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất
hữu cơ đến sự sinh trưởng của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii)
in vitro.......................................................................................................................... 20
Bảng 3. 4: Các ngiệm thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ
của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro.......................................21Y
Bảng 4. 1: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi của lan trầm Điện
Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 30................................................................23
Bảng 4. 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân chồi của lan trầm Điện
Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60................................................................25
Bảng 4. 3: Ảnh hưởng kết hợp của BA, Kinetin và NAA đến sự hình thành chồi của
cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 30...................................28
Bảng 4. 4: Ảnh hưởng kết hợp của BA, Kinetin và NAA đến sự hình thành chồi của
cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60...................................29
Bảng 4. 5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu cơ đến sự sinh
trưởng của cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60.................32
Bảng 4. 6: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan Trầm Điện
Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60................................................................35


10

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 4. 1: Ảnh hưởng của nông độ BAP đến sự hình thành chồi của lan Trầm Điện
Biên (Dendrobium paishii) in vitro...............................................................................27
Biểu đồ 4. 2: Ảnh hưởng của nông độ BAP đến chiều cao chồi của lan Trầm Điện Biên
(Dendrobium paishii) in vitro sau 60 ngày...................................................................28
Biểu đồ 4. 3: Ảnh hưởng kết hợp của BA, Kinetin và NAA đến sự hình thành chồi của
cây lan trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro................................................30
Biểu đồ 4. 4: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu cơ đến số lá và số
rễ của cây lan Trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60.......................35
Biểu đồ 4. 5: Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy bổ sung chất hữu cơ đến số lá và số
rễ của cây lan Trầm Điện Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60.......................36
Biểu đồ 4. 6: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sự tạo rễ của cây lan Trầm Điện Biên
(Dendrobium parishii) in vitro ngày 60........................................................................38
Biểu đồ 4. 7: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến chiều dài rễ của cây lan Trầm Điện
Biên (Dendrobium parishii) in vitro ngày 60................................................................39


1

Chương 1. MỞ ĐẦU
1.1

Đặt vấn đề
Với nét đẹp kiêu xa kết hợp với sự thanh mảnh và màu sắc rực rỡ không những

thu hút bởi ánh nhìn mà hoa lan còn thu hút người ta bởi mùi hương nồng nàn quến rũ.
Những tưởng mang trọn vẻ đẹp của thiên nhiên núi rừng, sự mộc mạc đơn sơ khi bám
trên những thân gỗ, rủ mai tóc rực rỡ làm ngây ngây ngất lòng người.
Hoa lan được mệnh danh là món trang sức đẹp nhất mà thiên nhiên ban tặng cho
con người. Ngoài vẻ đẹp kiêu kỳ và quến rũ, lan còn có các đặc điểm mà nhiều loài hoa
khác không có được, với hương thơm đặc biệt, đa dạng mà hầu như không có một loại

hương liệu nhân tạo nào có thể so sánh được cùng với ưu điểm lâu tàn [1]. Nhờ những
đặc điểm trên của hoa lan kết hợp với nhu cầu thẩm mỹ ngày càng nâng cao của con
người. Hoa lan không biết từ bao giờ đã chở thành món ăn tinh thần cho mọi người.
Ngoài giá trị tinh thần mà hoa lan mang lại thì không thể không nói đến giá trị
về mặt kinh tế mà loài hoa này mang đến. Hiện nay hoa lan chủ yếu được xuất và nhập
khẩu ở các dạng như: hoa lan cắt cành, chậu hoa hay hoa lan đã trưởng thành bám trên
giá thể là gỗ, sơ dừa, than.... Với kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành thế giới đạt
150 triệu USD [1] thì hoa lan hiện đang là một loài hoa có gia trị cho đầu tư và sản
xuất hàng loạt. Tuy nhiên, nước ta vẫn là nước đang phải nhập khẩu hoa lan cắt cành
do cung không đủ cầu. Một nguyên nhân chính dẫn đến điều đó là do nước ta chưa chủ
động được nguồn giống và sự đa dạng của các giống lan còn thấp.
Với tình hình phát triển chung của các loài lan, Lan Trầm Điện Biên
(Dendrobium parishii) có màu tím nhẹ nhàng ở cánh hoa và màu tím đậm ở lưỡi hoa,
cánh hoa thanh mảnh và mùi thơm phảng phất nhẹ nhàng cũng đang rất hiếm tại Việt
Nam. Để đáp ứng nhu cầu một thị trường lớn trong và ngoài nước thì không thể chỉ
dùng những biện pháp nhân giống truyền thống mà còn cần áp dụng kỹ thuật công
nghệ để tạo ra số lượng giống lớn, giống khỏe mạnh và chứa các đặc tính di truyền. Do


2

đó phương pháp nhân chồi

in vitro là một giải pháp tốt để giải quyết vấn đề này. Từ

ý tưởng trên, đề tài khóa luận: “Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng và
hợp chất hữu cơ đến quá trình nuôi cấy in vitro Lan Trầm Điện Biên (Dendrobium
parishii )” được tiến hành.
1.2

Mục tiêu
Theo dõi khả năng hình thành và phát triển của chồi và rễ của mẫu cấy là cây

lan Trầm Điện Biên trong môi trường nuôi cấy có bổ sung thêm chất điều hòa sinh
trưởng BAP, NAA, kinetin, một số chất hữu cơ. Dựa trên kết quả thu được, kết luận
nồng độ chất điều hòa sinh trưởng và loại chất hữu cơ thích hợp để nuôi cấy loại lan
này.
1.3

Nội dung thí nghiệm
Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP thích hợp để hình thành chồi

trên mẫu cây Lan Trầm Điên Biên (Dendrobium parishii) in vitro.
Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng BAP,Kinetin kết hợp với NAA
thích hợp để hình thành chồi trên mẫu cây Lan Trầm Điên Biên (Dendrobium parishii)
in vitro.
Xác định mức độ ảnh hưởng của các chất hữu cơ đến sự sinh trưởng mẫu cây
Lan Trầm Điên Biên (Dendrobium parishii) in vitro.
Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng NAA thích hợp để hình thành rễ
trên mẫu cây Lan Trầm Điên Biên (Dendrobium parishii) in vitro.


3

Chương 2: TỔNG QUAN
2.1

Tổng quan về nuôi cấy mô

2.1.1 Lich sử nuôi cấy mô

Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc
nuôi cấy tế bào rễ cà chua.[2]
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn.
Ông đã thành công trong việc chuyển cây non của cây sen cạn và cây white lupin từ
môi trường nuôi cấy tối thiểu. Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn thiện.
Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan trọng
cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy (White (1951), Gautherre
(1939), Van Overbeck (1941), Steward và Caplin (1951)). [2]
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiển sự
nhân chồi. [2]
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cấy đánh dấu một
bước tiến trong kỹ thuật nuôi cấy mô. Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho
việc nuôi cấy nhều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến nay. [2]
Năm 1960-1964, morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng nuôi cấy
đỉnh sinh trưởng. Từ kết quả đó lan được xem là cây nuôi cấy mô đầu tiên được thương
mại hóa. Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được phát triển với
tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa. [2]
2.1.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [2]
 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng


4

 Nuôi cấy mô sẹo
 Nuôi cấy tế bào đơn
 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội
 Nuôi cấy bằng các cơ quan: rễ, đoạn thân, chồi, quả, hoa, lá và bao phấn
Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực
vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cáy chồi đỉnh và chồi bên).
Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chưa đầy đủ

chất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hứu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chất kích
thích sinh trưởng thích hợp. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một khoảng thời gian nuôi
cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển
vươn thân, ra lá và rễ để trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất dần
dần thích nghi và phát triển bình thường.
2.1.3 Môi trường nuôi cấy
2.1.3.1 Khoáng đa lượng [2]
Cũng như thành phần của thực vật bậc cao, muối khoáng đa lượng gồm: đạm
(N), lân (P), kali (K), sắt (Fe), canxi (Ca) và magie (Mg).
Sắt (Fe), yếu tố cần thiết cho sự chuyển hóa, được cung cấp phần lớn dưới dạng
chelate: Fe – EDTA, với nồng độ từ 10–30 mg/l.
2.1.3.2 Khoáng vi lương [2] [3]
Thành phần khoáng vi lượng gồm: Mn, B, Zn, Cu, Co, I, Mo, Ni. Các nồng độ
này có từ vài phần nhỏ miligam đến vài miligam trong 1 lít môi trường. Các nguyên tố
khoáng được sử dụng với nồng độ thấp nhưng đónga vai trò quan trọng trong hoạt
động của enzyme.
2.1.3.3 Đường [2]


5

Mô hoặc tế bào được nuôi cấy có sự quang hợp bị hạn chế, chính vì vậy mà
người ta cần bổ sung thêm vào môi trường cấy các glucide cần thiết cho sự tang trưởng
của mô. Thông thường, đường saccharose tạo nên nguồn cacbon tốt nhất và người ta
cung cấp nó ở nồng độ 20g/l. Việc trải qua nồi hấp điện gây ra việc phân hủy đường do
sự thủy phân, nhưng điều này không thể hiện điều bất lợi nào trên kế hoạch phát triển
của thực vật.
2.1.3.4 Vitamin [3]
Vitamin đóng vai trò quan trọng trong quá trình nuôi cấy in vitro. Các loại mô
và tế bào thực vật có khả năng tổng hợp tất cả các vitamin nhưng không đủ về số

lượng. Do đó, phải bổ sung thêm vitamin vào môi trường nuôi cấy. Đặc biệt là vitamin
nhóm B: B1, B2, B3, B5, B6…; Myo-inositol.
2.1.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng [3] [2]
Hay còn gọi là “phytohormone” hoặc hormone thực vật. Chúng đóng vai trò
quan trọng nhất trong quá trình phát triển hình thái và tái sinh cây hoàn chỉnh. Các chất
này được phân ra làm ba nhóm chính:
 Auxin
Auxin có tác dụng tốt đến các quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt động của
tầng phát sinh, sự hình thành rễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng động của thực vật,
sự sinh trưởng của quả và tạo ra quả không hạt...
Auxin kích thích sự sinh trưởng giãn của tế bào. Nhưng nếu kích thích với hàm
lượng quá cao, tác dụng quá mạnh sẽ xảy ra hiện tượng ức chế ngược trở lại, lúc này
auxin sẽ trở thành chất ức chế.
Auxin gây ra tính hướng động của cây. Chúng cũng gây ra sự giảm p H trong
thành tế bào bằng cách phóng thích ion H +, làm thay đổi tính thẩm thấu của tế bào.
Ngoài ra auxin còn kích thích sự tổng hợp các hợp các cấu tử cấu trúc nên thành tế bào


6

như cenlulose, pectin, hemicenlulose… và kìm hãm sự phân giải các chất này. Nhờ quá
trình này mà có thể kéo dài thời gian sinh trưởng và tăng cường quá trình vận chuyển
các chất trong cây.
Auxin gây hiện tượng ưu thế ngọn: khi chồi chính và rễ chính sinh trưởng thì
gây ra sự ức chế sự phát triển của các chồi nách (chồi bên). Hiện tượng này được giải
thích rằng auxin được tổng hợp chủ yếu ở ngọn chính và vận chuyển xuống dưới làm
cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin nên ức chế sinh trưởng. Khi loại bỏ chồi chính
các chồi bên được thoát khỏi sự ức chế của auxin giúp chúng phát triển ngay lập tức.
Có một vài dạng của auxin như: axit β-indol-acetic (IAA), α-Naphthaleneacetic
acid (NAA), 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4D),….

 Cytokinin [2]
Cytokinin được phát hiện qua trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Người ta biết
rằng việc bổ sung nước dừa trong môi trường nuôi cấy sẽ gây ra một hiệu quả làm
thuận lợi ch việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chối. Khi tìm hiểu nguyên
nhân họ phát hiện ra một phức chất hoạt động có nguồn gốc purine. Vào năm 1956
Skoog đã phát hiện và đặt tên là kinetin.
Nhóm cytokinin có hiệu quả cao trong sựu phân chia tế bào nhưng lại không thể
thiếu sự có mặt của auxin vì auxin giúp cho sự nhân đôi của acid deoxyribonucleotide
và cytokinin cho phép tách rới rời các chromosome. Do đó tỷ lệ auxin/cytokinin rất
quan trong đến quá trình sinh trưởng của cây trong nuôi cấy in vitro.
Trong cây, cơ quan chính để tổng hợp lên cytokinin là rễ nên rễ khỏe mạnh thì
tang tổng hợp cytokinin giúp chồi phát triển mạnh.
Cytokinin kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và của cây nguyên vẹn.
Điều này được chứng minh khi một cành được dâm xuống đất kích thích cytokinin nội
sinh giúp lá tồn tại lâu hơn tránh sựu già hóa.


7

Cytokinin cũng giúp giải quyết một vấn đề quan trọng trong việc duy trì sự sống
của mô, kích thích sựu phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân
hóa. Có một số loại cytokinin thường được sử dụng trong nuôi cấy mô in vitro như: 6Benzylaminopurine (BAP), Kinetin, 1-phenyl-3(1,2,3 thiadiazol-5-yl) (TDZ),….
 Gibberelin [2]
Gibberellinđược nhận dạng đầu tiên GA3. Chúng có đặc tính nổi bật trên sựu
kéo dài đốt thân với đặc tính này gibberellin có thể giúp cay lùn trở lại hình dáng bình
thường và giúp các phát hoa phát triển tốt hơn
Trong nuôi cấy in vito gibberellin có tác dụng giúp đỉnh sỉnh sinh trưởng tạo cấu
trúc hình cầu có nhiều mắt cây. Hơn nữa, chúng còn kích thích chuyển hóa vì chunbgs
giúp tổng hợp các emzyme ly giải. Gibberellin được tổng hợp trong phôi đang sinh
trưởng, trong các cơ quan đang sinh trưởng khác như lá non, rễ non, quả non... và trong

tế bào thì được tổng hợp mạnh ở trong lục lạp do vậy kích thích sự nảy mầm, nảy chồi
của các mầm ngủ, của hạt và củ, phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt.
2.1.3.6 Các yếu tố khác
 Độ pH của môi trường nuôi cấy có thể ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình trao
đổi chất của mẫu cấy và thường môi trường được điều chỉnh về 5,7 bằng NaOH
1N hoặc HCl 1N.
 Dịch chiết khoai tây
2.1.4 Các loại môi trường cơ bản
 Môi trường Murashige – Skoog (MS): là môi trường được sử dụng nhiều trvà
rộng rãi nhất trong các thí nghệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật được công bố
công thức vào năm 1962 [3]


8

 Môi trường Gramborg: được dùng nhiều trong nhân giống vô tính đặc biệt là
tách và nuôi tế bào trần [3]
2.2 Tổng quan về đối tượng nghiên cứu
2.2.1 Sơ lược về chi lan hoàng thảo Dendrobium.
2.2.1.1 Phân loại, sự đa dạng và phân bố [4]
 Phân loại
-

Lớp một lá mầm : (Monocotyledons)

-

Bộ

: Orchidales

-

Họ

: Orchidaceae

-

Họ phụ

: Epidendroideae

-

Tông

: Epidendreae

-

Giống

: Dendrobium

 Phân bố
Họ orchidaceae có khoảng 750 chi, 20000 đến 25000 loài, chiếm vị trí thứ hai
sau họ Cúc trong ngành thực vật hạt kín và là họ lớn nhất trong Một lá mầm.
Giống Dendrobium có khoảng 16000 loài và đã được lai tạo thêm nhiều loài
mới. Dendrobium hầu hết là thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây.

Dendrobium chỉ được tìm thấy ở đông bán cầu, trải dài tử Australia, xuyên suốt
nam Thái Bình Dương, Philipphines, Ân Độ, xuất hiện một ít ở Nhật Bản và xất hiện
nhiều nhất ở Đông Nam Á.
Dendrobium tập trung thành hai dạng chính:
 Dạng đứng (Dendrobium Phalaenopsis): thường mọc ở sứ nóng, chịu ẩm, rất
siêng hoa.


9

 Dạng thòng (Dendrobium nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi Nuyis cao
như Đà Lạt…

Hình 2. 1: Dendrobium Phalaenopsis [16]

Hình 2. 2: Dendrobium nobile [15]

2.2.1.2 Đặc điểm hình thái


10

Dendrobium có số lượng khá lớn và phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa
dạng. Nhìn chung, lan thuộc giống Dendrobium đều có các bộ phận sinh dưỡng như rễ,
thân, giả hành, lá và cơ quan sinh sản như hoa, trái.

Hình 2. 3: Cấu tạo của lan Dendrobium [17]
 Rễ
Rễ đa số loài lan đều có hình, trụ, có nhánh bậc 1, bậc 2, bậc 3 hay không, và
thường là rất dài.

Rễ của lan rất độc đáo trong thế giới loài cây. Rễ chúng dày và phần lớn lại
trắng, nhưng lại không sản sinh tràn lan như ồ các cây khác. Rễ gồm một nhân nhỏ bên
trong, một lớp bọc bên ngoài hút nước do những tế bào tạo thành lớp gọi là mạc
(velamen). Lớp này, hút nước xuyên qua bề mặt của nó, gọi là màng bọc rễ hút nước
màu trắng, và nó phát triển phía sau đầu chồi non. Mạc này chứa những sợi tấm mộc tổ
cứng, mạc ấy, có thể hấp thụ hơi nước của không khí, cũng như tích trữ nước mưa và
sương đọng.[17]


11

Nếu rễ bị chết do bị tưới nước quá nhiều thì phải chờ cho đến khi cây phát triển
chồi mới thì mới có thể thay thế, như vậy là cây có thể tồn tại nhiều tháng mà không
cần rễ và không thể hấp thụ chất ẩm. [17]
Ở một số loài có lối sống phụ bì, bám lơ lửng trên vỏ cây khác, nên thân rễ có
thể dài hay ngắn, mâp hay mảnh mai giúp đưa thân bò đi xa hay chụm lại thành các bụi
dài.[4]
 Thân
Dendrobium thuộc nhóm đa thân có hệ thống nhánh nằm ngang bò dài trên giá
thể hoặc nằm sâu trong đất gọi là thân rễ. [4]
Thân

lan

chỉ

có

các

loài

đơn

thân

và

một

số

loài

của

giống Dendrobium và Epidendrum vừa có giả hành, vừa có thân. Các loài lan có thân
thường không có bộ phân dự trữ nước và các chất dinh dường. [17]
 Giả hành
Giả hành là những đoạn phình to, bên trong có các mô mềm chứa dịch nhày làm
giảm sựu mất nước và dự trữ chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điền kiện khô hạn khi
cây sống bám trên cao. Ngoài ra giả hành còn chứa diệp lục tố nên có thể quang hợp để
sinh năng lượng cho cây. [4]
Hình dạng và kích thước của giả hành rất đa dạng: từ nhỏ như chiếc đinh găm
đến lớn như chiếc mũ người lớn, hình cầu thuân dài, hay hình trụ xếp chồng lên nhau
tạo thành thân giả có lá mọc xen kẽ. [4]
 Lá
Các lá mọc xen kẽ nhau và ôm lấy thân giả do lá có tận cùng là một cuộng hay
thuôn dài xuống thành bẹ ôm thân. [4]

12

Lá có hình kim, trụ có rãnh hay phiến mỏng. Dạng lá mềm mại, mọng nước,
nạc, dai, có màu xanh bóng, đậm hay nhạt tùy vào vị trí sống của cây. Phiến lá trải rộng
hay gấp lại theo gân vòng cung như cái quạt hay chỉ gấp lại theo gân giữa như hình chữ
V.
Lá chứa diệp lục tố, làm cho cây quang hợp ánh nắng thành năng lượng.
 Hoa [4]
Dendrobium thuộc nhóm phụ ra hoa ở nách lá. Chồi hoa mọc từ các mắt ngủ
giữa các đọt lá trên thân gần ngọn và cả trên ngọn. Biểu hiện trước khi ra hoa khắc biệt
như có nhiều loài rụng rá trước khi ra hoa.
Hoa mọc thành chùm đươn hay kép hay từng hoa riêng rẽ. Cánh hoa dạng rũ
hay thẳng đứng. Thời gian nở hoa có khi suốt năm. Mặt khác, số lượng cánh hoa trên
cây nhiều nên Dendrobium được xem là giống chủ đạo để cung cấp lan cắt cành.
Bao hoa có hai vòng và ba mảnh bao gồm ba cánh đài và ba cánh tràng. Ba cánh
đài thường có dạng ba cánh hoa giống nhau hai cánh đài lưng dài hơn hai cánh đài bên.
Sựu đa dạng về màu sắc và hình dạng có sự đóng góp của cánh môi rát lớn. Cánh môi
có các dạng như nguyên, chia thùy, khía rang, có tua viền hay chia thành các sượi
mảnh.
 Trái [4]
Họ orchidaceae đều có quả thuộc loại quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra
chỉ còn đính lại với nhau ở đỉnh và gốc.
 Hạt [4]
Một số chứa 10000 dến 100000 hạt. Đôi khi đến 3 triệu hạt nên hạt có kích
thước rất nhỏ nên phôi hạt chưa phân hóa. Sau 12-18 tháng, hạt chin và phát tán nhờ
gió. Khi gặp nấm cộng sinh tương thíc trong điều kiện phù hợp, hạt sẽ nảy mầm.


13

2.2.1.3 Các yếu tố tác động đến sự phát triển của Dendrobium
 Ánh sáng
Lan Dendrobium là loài lan ưa sáng mạnh. Nhờ đó chúng phát triển được các
giả hành thật mạnh mẽ, tất nhiên không thể để ánh nắng chiếu trực tiếp có thể gây cháy
lá [5]. Nhưng lượng ánh sang thấp làm cho than cây mảnh khảnh, lá mỏng, hoa nhỏ
hoặc không có hoa. Do đó ánh sang rất cần thiết cho sựu tang trưởng và ra hoa, lượng
ánh sáng cần thiết bằng khoảng 50% ánh sang mặt trời. Nếu dùng ánh sáng nhân tạo thì
cần 4 đèn neon 40 watt và 2 đèn tròn 40 watt chiếu sang trực tiếp lên phía cây. [4]
 Nhiệt độ
Dendrobium ưa những vùng đất thấp và ấm áp như vùng khí hậu nhiệt đưới và
cận nhiệt đới. Cây trưởng thành cần sự chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm là 6-9 0C.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển của Dendrobium là: 27-320C vào ban ngày và
16-180C vào ban đêm [4]
 Nước
Giúp duy trì độ ẩm trong giai đoạn tăng trưởng. Nếu giữ khô ráo giữa các lần
tưới nước sau giai đoạn tang trưởng sẽ làm cây cứng cáp hơn. [4]
Phải đảm bảo giá thể được thông thoáng để rễ lan được khô ráo, vì chế độ thở
của lan phụ thuộc vào rễ. [5]
 Độ ẩm
Dendrobium cần độ ẩm trong khoảng 50-60%. Nếu trồng trong nhà kính thì nên
dùng máy tạo độ ẩm nếu điều kiện quá khô hạn.
 Giá thể
Giá thể dùng trồng lan phải xốp, thoáng khí và không giữ nước qua lâu như xơ
dừa, than, dớn…