khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm dại gây hại từ các hợp chất sinh học được tách từ cây cỏ mực trong nuôi trồng nấm rơm

1

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Ý nghĩa của đề tài
Các sản phẩm tự nhiên và các dược phẩm được bào chế từ thiên nhiên ngày nay thu
hút sự chú ý hơn so với các loại thuốc Tây được bán phổ biến trên thị trường. Các
hợp chất sinh học này được xem là gốc rễ tốt nhất để bào chế ra các loại thuốc cũng
như dẫn xuất của chúng. Ngoài ra, việc sử dụng các hợp chất có hoạt tính sinh học
từ thiên nhiên cho việc trị bệnh cũng đem lại nhiều lợi ích vì việc bào chế chúng
không để lại chất thải và ít độc hại hơn. Bên cạnh đó nó cũng đem lại nguồn thu
kinh tế không nhỏ trong việc chữa các loại bệnh thông thường như rối loạn tiêu hóa,
biếng ăn, táo bón, buồn nôn,…vì là từ thiên nhiên nên sẽ được người tiêu dùng ưa
chuộng.
Nấm dại gây hại là tác nhân truyền nhiễm chính trong nuôi trồng nấm rơm, loài này
gây ra sự thay đổi trong các giai đoạn phát triển và cả sau thu hoạch. Ngoài ra, trong
một số trường hợp, nấm là nguyên nhân gián tiếp gây ra các rối loạn dị ứng hoặc
gây chết người cho người tiêu dùng do tiết ra độc tố hoặc các chất gây dị ứng.
Thông thường, nấm gây hại được kiểm soát bởi thuốc diệt nấm tổng hợp; tuy nhiên,
việc sử dụng chúng ngày càng bị hạn chế do tác hại của thuốc trừ sâu đối với sức
khỏe con người và môi trường ngày càng lớn [10]. Một trong những hướng nghiên
cứu cần được khai thác cho vấn đề này là tách chiết các hợp chất từ thực vật trong
tự nhiên có khả năng kháng lại nấm dại gây hại trong nuôi trồng nấm rơm.
Có khoảng 6000 loài thực vật được nhắc tới trong y học cổ truyền nhưng trong đó
chỉ có khoảng 350 loài được sử dụng. Vì con số đó nên việc khảo sát chúng mang
đến ý nghĩa lớn cho nền y học cổ truyền nước nhà. Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt
đới gió mùa, có mưa quanh năm nên việc tìm hiểu và tuyên truyền đến mọi người
những bài thuốc dân gian thông qua cây cỏ để chữa bệnh là việc làm cần thiết để
hạn chế những chi phí tốn kém khi dùng thuốc ngoại. Ngoài ra vì đối tượng nghiên
cứu hôm nay là loài Eclipta prostrata L. (Cỏ mực) là loại cây ít người biết đến
công dụng nên để giúp bảo vệ nguồn gen phong phú và phát huy giá trị của loài cây

2

này em xin được thực hiện đề tài khảo sát khả năng kháng khuẩn, kháng nấm dại
gây hại từ các hợp chất sinh học được tách từ cây cỏ mực trong nuôi trồng nấm
rơm.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Trong đề tài này mục tiêu chính là khảo sát tính kháng khuẩn, kháng nấm các hợp
chất sinh học có trong cây thực vật Eclipta prostrata L. (Cỏ mực).
- Để thực hiện điều này cần tìm hiểu rõ các hợp chất sinh học có trong đối tượng
nghiên cứu này là gì.
- Xác định các phương pháp phù hợp đem lại kết quả chính xác, khả quan nhất.
- Định tính sơ bộ các thành phần hóa học có trong dịch chiết cây cỏ mực.
- Phân lập, định danh các loài nấm dại gây hại tới nuôi trồng nấm rơm.
- Thí nghiệm cơ chế đối kháng nấm rơm với các loài nấm quả thể và nấm sợi.
- Đánh giá khả năng kháng khuẩn Salmonella, kháng khuẩn gây sâu răng
Streptococcus mutans và kháng các loài nấm dại của dịch chiết cây cỏ mực trên
Lentinus squarrosulus, Paecilomyces formosus, Coprinus ephemeroides.


3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1. Đặc điểm cây cỏ mực
2.1.1. Danh pháp [22]
Eclipta prostrata L. loại thực vật thuộc chi Eclipta, họ Asteraceae còn được biết đến
với tên gọi cỏ mực. Sở dĩ gọi nó là cỏ mực vì khi vò nát thấy có nước chảy ra đen
như mực.
Giới: Plantae (Thực vật)
Ngành: Spermatophyta (Thực vật có hạt)

Phân ngành: Angiospermae (Thực vật hạt kín)
Lớp: Dicotyledonae (Thực vật hai lá mầm)
Bộ: Asterales (Cúc)
Họ: Asteraceae (Cúc)
Chi: Eclita

Hình 2.1. Eclipta prostrata (Eclipta alba)
(Nguồn: www.amazon.in)

Loài: Eclipta prostrata L.
Tên thường gọi: Cỏ mực, nhọ nồi, hạn liên thảo, lệ trường, phong trường.
Tên khoa học: Eclipta alba (L.) Hassk.; Eclipta prostrata L.
Tên nước ngoài: False Daisy, yerba de tago, bhringraj, Dyer’s weed, Dye-weed,
White eclipta, Éclipte droite (Pháp).
2.1.2. Đặc điểm hình thái [24]
Cỏ mực thuộc loại cây hàng năm mọc bò hoặc thẳng đứng, có lông thưa, cứng với
chiều cao trung bình từ 0,2 – 0,4 m, có thể đến 0,8 m.
Thân: màu nâu, lục nhạt hoặc hơi đỏ tía.
Lá: mọc đối, các phiến lá hẹp và dài tầm 2,5 cm x 1,2 cm. Mép lá nguyên hoặc có
răng cưa cạn, có lông cả ở hai mặt lá. Lá mọc đối có lông 2 mặt, dài 2 – 8 cm, rộng
5 – 15 mm.


4

Hoa: màu trắng hợp thành đầu, mọc ở đầu cành hoặc kẽ lá, có hoa lưỡng tính ở giữa
và hoa cái bên ngoài. Cụm hoa hình đầu màu trắng ở kẽ lá hoặc đầu cành, lá thon
dài 5 – 6 mm, cũng có lông.
Quả: dẹt, có 3 cạnh màu đen dài tầm 3 mm, rộng 1,5 cm, có 2 – 5 vảy nhỏ ở đầu.
2.1.3. Phân bố [24]

Cỏ mực được sử dụng các bộ phận khác nhau trong những vùng nhiệt đới và vùng
cận nhiệt đới như Nam Mỹ, Châu Á và Châu Phi.
Có 3 loại cỏ mực: cỏ mực hoa trắng, cỏ mực hoa vàng, và cỏ mực trái đen nhưng tất
cả 3 loại đều hiện diện khắp nơi trong Ấn Độ, trong vùng đầm lầy, ao hồ, sông rạch
hay chân dãy Himalalaya.
Cỏ mực phân bố ở vùng Nam và Đông Nam châu Á phân phối rộng khắp nơi Ấn
Độ, Trung Hoa, Việt Nam, Thái Lan, Brazil,... Ở Việt Nam phân bố ở khắp các tỉnh,
cây ưa ẩm, ưa sáng. Mùa hoa quả: quanh năm.
2.1.4. Công dụng của cây cỏ mực [24]
Ở Việt Nam: Cỏ mực được dùng để chữa xuất huyết nội tạng như xuất huyết ruột,
ho ra máu, chảy máu lợi, nướu, răng; trị sưng gan, bàng quang, đường tiểu, mụn
nhọt đầu đinh, băng bó ngoài giúp liền xương.
Trên thế giới:
- Đài Loan: thường dùng điều trị: chảy máu, ho ra máu, đi tiểu ra máu, ngứa, viêm
gan, bệnh bạch hầu, tiêu chảy.
- Trung Quốc: người ta dùng cây cỏ mực như một loại dược thảo và thực phẩm để
hỗ trợ tim, dây thần kinh, gan và mắt. Dung dịch trích từ cây là vị thuốc bổ gan
mạnh, trẻ hoá và đặc biệt cho tóc. Đây là một loại thuốc nhuộm thiên nhiên và cũng
dùng để xăm mình.
Khi dùng ngoài da có thể trị các chứng: đau nhức xương khớp, viêm da, dùng trên
da đầu trị chứng rụng tóc và chống độc do bò cạp chích.


5

2.2. Các nghiên cứu về hóa học và dược tính của cây cỏ mực
Hóa học: Các hợp chất hóa học có trong cây như alkaloid, ecliptine, nicotine,
glucoside, coumarine và wedelolacton. [22]
Wedelolactone đã được báo cáo có đặc tính trị liệu để chữa trị viêm gan và xơ gan
(Wagner et al. 1986), kháng khuẩn và chống sự xuất huyết (Kosuge et al. 1985).

Dược tính: Cây cỏ mực có các đặc tính dược lý như kéo mài vết thương, kháng
khuẩn, kháng oxy hóa, chống nhiễm độc gan, chống mỡ trong máu cao, các hoạt
động điều hòa miễn dịch, tăng trưởng tóc và rụng tóc,…[22]
2.2.1. Tình hình nghiên cứu trong nước [5], [8], [9]
Tạp chí khoa học 2015 có bài “Khảo soát hoạt tính kháng oxy hóa và kháng vi
khuẩn Enterobacter cloacae của các cao chiết từ cây Cỏ mực (Eclipta alba Hassk.)”
của trường Đại học Cần Thơ thực hiện bởi Đái Thị Xuân Trang và Võ Thị Tú Anh
cho kết quả tất cả các loại cao chiết từ lá, thân, rễ của cây cỏ mực chiết với bốn loại
dung môi methanol, hexane, chloroform và ethyl acetate đều cho hoạt tính kháng
dòng vi khuẩn Enterobacter cloacae. Bên cạnh đó bài báo cũng chỉ ra hoạt tính
kháng oxy hóa từ cao chiết cỏ mực cao nhất đối với cao ethyl acetate.
Một bài báo cáo khoa học khác cũng cùng tạp chí khoa học 2015 “Khảo sát hoạt
tính kháng khuẩn của dịch chiết cỏ mực (Eclipta alba) đối với vi khuẩn được phân
lập từ ruột tôm sú (Penaeus monodon)” cho ra kết luận dịch chiết cây cỏ mực có
khả năng ức chế sự phát triển của 10/12 chủng vi khuẩn đã phân lập từ 30 mẫu tôm
sú. Trong đó 10 chủng vi khuẩn có khả năng gồm Vibrio parahaemolycus, Vibrio
brasiliensis, Enterobacter kobei, Staphylococcus aureus, Edwardsiella tarda,
Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila,…
Trần Hoàng Hải (2015) đã thực hiện đề tài khóa luận “Khảo sát hoạt tính kháng
khuẩn của cao methanol và các cao phân đoạn được ly trích từ thân cây cỏ mực
(Eclipta alba)”, báo cáo cho thấy các loại cao chiết từ thân cây đều có hoạt tính
kháng khuẩn ở 4 dòng vi khuẩn là Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,
Staphylococcus aureus và Vibrio parahaemolyticus.


6

2.2.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước [14]
Theo bài báo cáo khoa học (Karunambigai, A. và Gayathri Devi et al. 2014) khả
năng kháng khuẩn của cao chiết từ lá và rễ cỏ mực với hai dung môi benzene và

chloroform đều cho kháng lại các chủng vi sinh vật Bacillus subtilis, Escherichia
coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus,
Shigella flexneri. Điều này chứng tỏ cây cỏ mực có khả năng kháng đa dạng các
chủng vi khuẩn.
2.3. Một số chủng nấm gây hại trong nuôi trồng nấm rơm
Nấm rơm là loài nấm phổ biến được sử dụng rất nhiều trong các món ăn của người
Việt Nam. Để tạo ra môi trường tốt nhất trong việc nuôi trồng chúng ngoài các vấn
đề về thời gian nuôi trồng, tưới tiêu, loại phân bón sử dụng mà còn phải kể đến
những thành phần gây độc hại gây bệnh hoặc gây chết nấm rơm như các loài nấm
dại. Trong đề tài nghiên cứu này các loài nấm dại gây hại sẽ được thu hoạch từ trại
nấm rơm tại Bình Chánh sau đó đem về phòng thí nghiệm phân lập và định danh
từng loài. Sau khi phân lập được hoàn toàn, các chủng nấm sẽ được khảo sát mật độ
lan tơ mức độ đối kháng của chúng với nấm rơm trong cùng điều kiện phát triển.
Thêm vào đó để tìm ra phương pháp khả quan loại bỏ các loài nấm dại này ta sẽ
khảo sát thêm khả năng kháng chúng đối với dịch chiết từ cây cỏ mực.
2.4.1. Lentinus squarrosulus [25], [29]
Giới:

Fungi

Ngành:

Basidiomycota

Lớp:

Agaricomycetes

Bộ:

Polyporales

Họ:

Polyporaceae

Chi:

Lentinus

Loài:

Lentinus squarrosulus

Đặc điểm chung

Hình 2.2. Lentinus squarrosulus


7

Lentinus squarrosulus là một loại nấm hoang dã ăn được thường thấy ở châu Á.
Loài này có một số tính năng thú vị như tăng trưởng sợi nấm nhanh chóng, và do đó
có tiềm năng được sử dụng làm thực phẩm, thực phẩm chức năng và dược phẩm.
Đây là một loại nấm màu trắng có khả năng sống hoại sinh, sống trên gỗ chết hoặc
gỗ đã mục nát trong rừng, kích thước khoảng 9 – 12 x 4 – 6 µm. Sợi nấm của
Lentinus squarrosulus chứa protein cao (57,6%) và tổng chất béo thấp (0,5%), giàu
magie (0,4%), kali (3,8%) và vitamin B3 (0,2%).
Lentinus squarrosulus đã được trồng thành công trên vỏ sắn, rơm rạ và trên vỏ cây.
Nó được tìm thấy có hàm lượng chất xơ cao (Fasidi và Kadiri, 1999). Hàm lượng

protein của loại nấm này đã được báo cáo là gấp đôi so với khoai tây Ireland và sáu
lần so với cam (Atikpo et al., 2008), bên cạnh đó hàm lượng axit amin thiết yếu của
nó vượt bậc so với đậu thận.
2.4.2. Paecilomyces formosus [19], [27]
Giới:

Fungi

Ngành:

Ascomycota

Lớp:

Sodariomycetes

Bộ:

Hypocreales

Họ:

Clavicipitaceae

Chi:

Paecilomyces

Loài:

Paecilomyces formosus

Hình 2.3. Paecilomyces formosus

Đặc điểm chung
Paecilomyces là loài nấm có nguồn gốc từ đất và rất phổ biến trong tự nhiên. Nấm
Paecilomyces ký sinh trên nhiều loài côn trùng thuộc bộ cánh cứng, nửa cứng, cánh
màng, cánh vảy và bộ hai cánh. Bào tử nấm nẩy mầm, xâm nhiễm vào bên trong cơ
thể và sinh sản trong xoang máu làm yếu và phá hoại chức năng trao đổi chất và
cuối cùng gây côn trùng chết.


8

2.4.3. Coprinus ephemeroides [26], [28]
Giới:

Fungi

Ngành:

Basidiomycota

Lớp:

Agaricomycetes

Bộ:

Agaricales

Họ:

Psathyrellaceae

Chi:

Coprinus

Loài:

Coprinus ephemeroides

Hình 2.4. Coprinus ephemeroides
(Nguồn: mykoweb.com)

Đặc điểm chung
Coprinus ephemeroides là một loài nấm mực. Loài này chủ yếu được tìm thấy ở các
mẩu phân, phân bón hữu cơ, vụn gỗ nằm vùi trong đất. Mũ nấm nhỏ, khi đụng vào
dễ bị nát, lúc còn non có hình cầu, sau đó xòe to ra và cuối cùng cuộn vào phía
trong mũ nấm. Đỉnh mũ nấm có màu nâu nhạt, xung quanh phủ dày đặc các hạt màu
trắng và các hạt này sẽ chuyển sang màu nâu nhạt khi nấm già. Giai đoạn đầu mũ
nấm có màu trắng trong suốt, tiếp đó chuyển sang màu nâu nhạt và cuối cùng màu
đen.
2.4. Giới thiệu các chủng vi sinh vật trong nghiên cứu
2.4.1. Streptococcus mutans – Vi khuẩn gây sâu răng [3], [6]
Giới:

Bacteria

Ngành:

Firmicutes

Lớp:

Bacilli

Bộ:

Lactobacillales

Họ:

Streptococcaceae

Chi:

Streptococcus

Loài:

Streptococcus mutans

2.4.1.1. Đặc điểm hình thái

Hình 2.5. Sreptococcus mutans
(Nguồn: microbewiki.kenyon.edu)

9

Streptococcus mutans là một giống của các cầu khuẩn gram dương, đường kính
khoảng 0,6 - 0,8 μm, xếp liên tiếp với nhau thành từng chuỗi, dài ngắn khác nhau và
có thể đứng với nhau thành từng đôi hoặc từng đám. Liên cầu không có lông, không
di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram (+) và một số loài có vỏ.
2.4.1.2. Đặc điểm nuôi cấy
Liên cầu, hiếu khí tùy tiện và thường đòi hỏi môi trường nuôi cấy có nhiều chất
dinh dưỡng như máu, huyết thanh, đường... Vi khuẩn phát triển tốt hơn ở điều kiện
môi trường có thêm 5-10 % CO 2. Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37 oC, một số phát
triển được ở 10 - 40oC như liên cầu đường ruột.
Trong môi trường lỏng (canh thang): Liên cầu dễ tạo thành những chuỗi dài không
bị gãy, sau đó tạo thành những hạt nhỏ hoặc những hạt như bông rồi lắng xuống đáy
môi trường nuôi cấy. Do đó sau 24 giờ, môi trường trở nên trong và có lắng cặn.
Trên môi trường đặc: Liên cầu có khuẩn lạc tròn, lồi, bóng khô, màu hơi xám trong.
Những chủng có vỏ khuẩn lạc lầy nhầy.
Trên môi trường thạch máu: Liên cầu phát triển tốt, có thể làm tan máu dưới 3 hình
thức α, β, γ tuỳ thuộc từng nhóm liên cầu
2.4.1.3 Đặc tính sinh hóa
Streptococcus có enzym oxidase, catalase âm tính và hô hấp hiếu khí, kỵ khí tùy
tiện.Vi khuẩn này chuyển hóa các loại carbohydrate khác nhau tạo ra môi trường
acid trong miệng.
2.4.1.4 Sức đề kháng
Nó có thể phát triển mạnh ở nhiệt độ từ 18 – 40oC.
2.4.1.5 Độc tố
Streptolysin O: độc tố này bị mất hoạt tính bởi oxy nên trên môi trường nuôi cấy,
chúng gây tan máu ở phía sâu trong thạch. Độc tố streptolysin O mang tính chất của
một ngoại độc tố, có tính kháng nguyên mạnh vì vậy kích thích cơ thể hình thành

10

kháng thể (anti streptolysin O). Việc định lượng kháng thể này có giá trị trong chẩn
đoán bệnh liên cầu đặc biệt trong bệnh thấp tim và viêm cầu thận cấp.
Streptolysin S: đa số vi khuẩn Streptococcus thường tiết ra loại men này, men gây
tan máu ở bề mặt môi trường nuôi cấy, có tính kháng nguyên yếu vì vậy không kích
thích cơ thể hình thành kháng thể.
2.4.1.6 Khả năng gây bệnh
Vi khuẩn phát triển trong miệng tạo ra môi trường acid. Acid gây phá hủy men răng
tạo vôi răng đóng bám ở các thành lâu ngày làm phá hủy tủy dẫn tới sâu răng. Đây
cũng là nguyên nhân hàng đầu gây ra bệnh sâu răng trên toàn thế giới. Ngoài ra vi
khuẩn này còn gây nhiễm trùng và sinh ra các vấn đề khác trong khả năng giao tiếp.
2.4.2. Salmonella typhi [3], [6]
Giới:

Bacteria

Ngành:

Proteobacteria

Lớp:

Gammaproteobacteria

Bộ:

Enterobacteriales

Họ:

Enterobacteriaceae

Chi:

Salmonella

Loài:

Salmonella typhi

Hình 2.6. Salmonella
(Nguồn: www.sciencephoto.com)

2.3.1.1. Đặc điểm hình thái
Salmonella là vi khuẩn Gram âm (khi nhuộm bằng kỹ thuật Gram thì vi khuẩn bắt
màu đỏ hồng), hình que, kích thước khoảng 0,6 - 2,0 mm; hiếu khí và kị khí tùy ý,
có tiên mao, có thể di động (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum),
không tạo bào tử.
2.3.1.2 Đặc điểm nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi phát triển được trên các môi trường nuôi cấy
thông thường. Trên môi trường thích hợp, vi khuẩn sẽ phát triển sau 24 giờ. Có thể
mọc trên những môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate


11

agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế
hơn nên thường được dùng để phân lập Salmonella.
Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường này là tròn, lồi, trong suốt, có

tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm khuẩn lạc, môi trường xung quanh chuyển
sang màu đỏ.
2.3.1.3 Đặc tính sinh hóa
Salmonella có khả năng lên men glucose và manitol, sinh acid nhưng không lên
men saccharose và lactose, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm
amine từ tryptophane. Salmonella không sinh indol, không làm lỏng gelatin. Có khả
năng khử nitrat thành nitrit.
2.3.1.4 Sức đề kháng
Salmonella có sức sống và sức đề kháng tốt. Ở nhiệt độ từ 18 oC – 40oC vi khuẩn có
thể sống đến 15 ngày. Chịu được lạnh, ở nước đá sống 2 - 3 tháng, nước thường > 1
tháng, trong rau quả 5 - 10 ngày, trong phân 1 đến vài tháng. Salmonella bị diệt ở
nhiệt độ 55oC/30 phút, cồn 90oC/vài phút, các chất khử trùng thông thường diệt
được vi khuẩn dễ dàng (chloramin 3%, phenol 5%).
2.3.1.5 Độc tố
Vi khuẩn Salmonella có thể tiết ra 2 loại độc tố: ngoại độc tố và nội độc tố.
+ Nội độc tố của Salmonella rất mạnh gồm 2 loại: gây ra các chứng bệnh về da như
xung huyết và mụn loét, độc tố trong ruột gây độc về thần kinh, hôn mê, co giật.
+ Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc
tố tác động vào thần kinh và ruột chỉ phát hiện khi kiểm tra vi khuẩn có mặt trong
bụng chuột lang đã nuôi trước đó, sau 4 ngày, tiếp tục cấy chuyền như vậy từ 5 đến
10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm.
2.3.1.6 Khả năng gây bệnh


12

Sau khi Salmonella vào cơ thể người chưa có miễn dịch, thời kỳ ủ bệnh trung bình
từ 10 - 48 giờ (đây là điểm khác biệt rất cơ bản với nhiễm độc thức ăn do tụ cầu,
thời gian ủ bệnh rất ngắn, chỉ vài, ba giờ). Bệnh thương hàn khởi phát đột ngột, sốt
cao liên tục (39 hoặc 40oC), mệt mỏi kèm theo đau bụng, sôi bụng và chướng bụng

là triệu chứng thường thấy. Một số loài Salmonella chỉ gây nhiễm khuẩn nhiễm độc
thức ăn ở người lớn lại có thể gây ra tình trạng bệnh lý rất nặng ở trẻ nhỏ và trẻ sơ
sinh. Bệnh nhi có thể bị nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm xương.
2.5. Cơ chế đối kháng nấm dại với nấm rơm [9], 12], [17]
2.4.1. Kháng sinh
Đây là cơ chế đối kháng gây ức chế hoặc vô hiệu hóa một chất hoặc một sinh vật
bằng cách tiết ra một loại kháng sinh, enzyme hoặc độc tố. Các chất gây ức chế này
chỉ có tính đặc hiệu cao đối với một số loài cụ thể. Khi sinh vật tiết ra enzyme nó
đồng thời phá hủy đi các tế bào khác bằng cách tiêu hóa thành tế bào của chúng và
làm suy giảm vật liệu tế bào cũng như giải phóng đi protoplasmic - chất dinh dưỡng
cho sinh vật ức chế. Ví dụ Aspergillus có tác dụng đối kháng với Penicillium và
Cladosporium. Trichoderma có ảnh hưởng đến xạ khuẩn. Pseudomonas cho thấy sự
đối kháng trên Cladosporium.
2.4.2. Cạnh tranh dinh dưỡng
Cạnh tranh dinh dưỡng xảy ra khi các loài sinh vật cùng sống chung và sử dụng
chung một nguồn dinh dưỡng trong đó sẽ có một loài chiếm ưu thế hơn khiến cho
quá trình phát triển của loài còn lại chậm đi hoặc ngưng lại. Đây cũng là một trong
những vấn đề gây khó khăn cho việc nuôi trồng nấm rơm nếu không phát hiện kịp
thời các loài nấm dại có mức độ cạnh tranh cao trong quá trình nuôi dưỡng.
2.4.3. Ký sinh
Ký sinh là mối quan hệ giữa các loài, trong đó sinh vật có khả năng ký sinh sẽ sống
trên hoặc nằm bên trong cơ thể của một sinh vật khác - vật chủ, gây ra một số tác
hại nhất định và khiến cho vật chủ phải tự thích nghi với lối sống này. Sinh vật có
khả năng ký sinh sẽ sống nhờ vào sự trao đổi chất của vật chủ hoặc giết tế bào vật


13

chủ để hoàn thiện vòng đời của mình. Ký sinh có thể gây ra các bệnh truyền nhiễm
và được xem như là một vũ khí sinh học nguy hiểm hiện nay.

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thời gian: được thực hiện từ tháng 10/2018 đến tháng 1/2019
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Chuyên đề 3, Trường Đại học Tôn Đức Thắng.
3.2. Vật liệu thí nghiệm
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Lá cây cỏ mực được thu hái tại vườn riêng ở Bình Phước thuộc khu vực phía Nam
Việt Nam.
3.2.2. Trang thiết bị thí nghiệm
Cân điện tử

Nồi hấp

Lò vi sóng

Tủ ấm

Bể điều nhiệt

Bếp từ

Tủ lạnh

Tủ sấy

Máy đo quang phổ

Que cấy (vòng, móc)

Erlen 250 ml

Betcher 200 ml

Pipet vạch 1 ml, 10 ml

Đĩa petri

Ống nghiệm

3.2.3. Hóa chất
Dung môi: Ethanol 96o, nước cất
Hóa chất: HClđđ, FeCl3, H2SO4đđ, Choloroform, Na2CO3, thuốc thử Folin.
Môi trường TSA, PGA, BHI, dung dịch nước muối sinh lý 0,9%
3.3. Phương pháp thí nghiệm
3.3.1. Chuẩn bị mẫu
Đối tượng là lá cây cỏ mực được lấy từ tỉnh Bình Phước, chọn loại cây có lá tươi
xanh không bị dập héo sau đó rửa sạch và tách lấy riêng lá.
Cách tiến hành:
- Sấy khô mẫu ở nhiệt độ 60 – 70oC, xay nhuyễn và lưu trữ.
- Đem mẫu đi cân sau đó thử nghiệm với hệ dung môi thích hợp, lắc đều dung dịch.


14

- Sau một thời gian nhất định, đem dung dịch lọc qua giấy lọc.
- Đem dịch chiết đo quang phổ ở bước sóng 765 nm.
Cân mẫu

Sấy, xay

Nhiệt độ 70oC

Chiết dung
môi thích
hợp
Lắc đều
Lọc

Dịch chiết

Hình 3.1. Sơ đồ xử lý mẫu
Xác định độ ẩm của lá cây cỏ mực
Mẫu lá sau khi được rửa sạch đem sấy ở nhiệt độ 75 oC trong vòng 1 giờ tới khi khối
lượng không đổi (sấy ở nhiệt độ quá cao sẽ thất thoát các hợp chất dễ bay hơi) theo
phương pháp sấy khối lượng. Căn cứ vào sự chênh lệch về khối lượng trước và sau
sấy để xác định hàm lượng độ ẩm có trong mẫu lá.
Độ ẩm được xác định theo công thức:

Trong đó:

X: độ ẩm của mẫu nguyên liệu (%)
mđ: khối lượng mẫu trước khi sấy (g)
ms: khối lượng mẫu sau khi sấy (g)


15

3.3.2. Định tính sơ bộ một số thành phần có trong cây cỏ mực
- Polyphenol: Lấy 1 ml dịch chiết sau đó nhỏ vào ống nghiệm vài giọt FeCl 3 5%.
Kết quả nếu xuất hiện kết tủa xanh đen, nâu hoặc lục là có sự hiện diện của

polyphenol.
- Steroids và Triterpenoids: Lấy 1 ml chloroform sau đó thêm vào 1 ml H 2SO4 đđ
hòa với 1 ml dịch chiết. Kết quả dung dịch cho màu đỏ đậm, xanh, xanh tím là có sự
hiện diện của hợp chất steroids và triterpenoids.
- Tannin: Lấy 1 ml dịch chiết cho vào ống nghiệm sau đó nhỏ vài giọt
Pb(CH3COO)2. Nếu dung dịch cho ra kết tủa là có sự hiện diện của hợp chất tannin.
- Coumarine: Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết sau đó nhỏ vài giọt NaOH 10%.
Nếu dung dịch cho màu vàng cam xác định có sự hiện diện của coumarine.
3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố tới dịch chiết cây cỏ mực
 Kết quả khảo sát được chọn sẽ thực hiện theo chỉ tiêu sau:
Xác định hàm lượng polyphenol tổng số (TPC):
Công thức:

PP =

Trong đó:
PP: hàm lượng polyphenol tổng số (mg GAE/g dw).
X: nồng độ acid gallic theo đường chuẩn (mg/ml).
V: thể tích dịch chiết từ m (g) mẫu (ml).
k: hệ số pha loãng.
m: khối lượng mẫu sử dụng (g).
w: độ ẩm mẫu
v: thể tích dịch chiết sử dụng (ml).


16

Thí nghiệm 1: Khảo sát dung môi thích hợp dành cho cây cỏ mực.
Bảng 3.1. Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đối với dịch chiết cây cỏ mực.
Nghiệm thức

Dung môi

1

Nước cất

2

Ethanol 96%

Cân 2 g mẫu cho vào mỗi ống nghiệm, hòa vào ống từng dung môi (theo bảng 3.1)
theo tỉ lệ mẫu : dung môi 1:10 g/mL sau đó đậy bằng giấy bạc ngâm trong bể điều
nhiệt 30 phút, nhiệt độ 50oC. Sau khi chiết tiến hành đem mẫu đi lọc bỏ bã và thu
hồi lấy dịch chiết mong muốn. Hút 1 ml mỗi ống dịch chiết ứng với dung môi tương
ứng ra một ống nghiệm khác. Thêm vào 5 ml thuốc thử Folin, để yên 4 phút, tiếp
tục cho vào 4 ml dung dịch Na2CO3, để yên 5 phút. Tiến hành đem các ống nghiệm
đo quang phổ ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm gồm 2 nghiệm thức, mỗi nghiệm
thức lặp lại 3 lần.
Việc lựa chọn dung môi phù hợp nhất sẽ dựa vào chỉ tiêu theo dõi xác định hàm
lượng polyphenol.
Thí nghiệm 2: Khảo sát về tỉ lệ của dung môi đối với cây cỏ mực.
Bảng 3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu/dung môi đối với
dịch chiết cây cỏ mực.

1

Tỉ lệ nguyên
liệu/dung môi
1:10

2

1:15

3

1:20

Nghiệm thức

Chọn ra dung môi thích hợp nhất ở thí nghiệm 1.
Tiến hành cân 2 g mẫu hòa lần lượt với từng tỉ lệ thể tích tương ứng (theo bảng 3.2)
để trong ống nghiệm đậy bằng giấy bạc sau đó ngâm trong bể điều nhiệt 30 phút,


17

nhiệt độ 50oC. Thực hiện tương tự như thí nghiệm 1 ở bước đo quang phổ. Thí
nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Việc lựa chọn tỉ lệ nguyên liệu : dung môi phù hợp nhất sẽ dựa vào chỉ tiêu theo dõi
xác định hàm lượng polyphenol.
Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới dịch chiết cây cỏ mực.
Bảng 3.3. Khảo sát ảnh hưởng thời gian đối với dịch chiết cây cỏ mực.
Nghiệm thức

Thời gian

1

30 phút

2

45 phút

3

60 phút

Lựa chọn tỉ lệ dung môi/dịch chiết phù hợp nhất ở thí nghiệm 2.
Cân 2 g mẫu hòa theo tỉ lệ đã được chọn để trong ống nghiệm đậy bằng giấy bạc
sau đó ngâm trong bể điều nhiệt 50oC với các mốc thời gian tương ứng (theo bảng
3.3). Thực hiện tương tự bước đo quang phổ ở thí nghiệm 1 sau đó đem các mẫu lần
lượt đo ở bước sóng 765 nm. Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp
lại 3 lần.
Việc lựa chọn thời gian phù hợp nhất sẽ dựa vào chỉ tiêu theo dõi xác định hàm
lượng polyphenol.
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới dịch chiết cây cỏ mực.
Bảng 3.4. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đối với dịch chiết cây cỏ mực.
Nghiệm thức

Nhiệt độ

1

50oC

2

60oC

3

70oC

Cân 2 g mẫu hòa theo tỉ lệ, dung môi và thời gian cố định được lựa chọn ở thí
nghiệm 1, 2, 3 để trong ống nghiệm đậy bằng giấy bạc sau đó ngâm trong bể điều


18

nhiệt với từng nhiệt độ tương ứng (theo bảng 3.4). Thực hiện tương tự bước đo
quang phổ ở thí nghiệm 1 sau đó đem các mẫu lần lượt đo ở bước sóng 765 nm. Thí
nghiệm gồm 3 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần.
Việc lựa nhiệt độ phù hợp nhất sẽ dựa vào chỉ tiêu theo dõi xác định hàm lượng
polyphenol.
3.3.4. Phân lập và định danh nấm dại gây hại trong nuôi trồng nấm rơm
3.3.4.1. Phân lập nấm dại
Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Nấm dại được thu nhận tại trại nấm ở Bình Chánh.
Đối với nấm quả thể: sau khi thu nhận ta tiến hành rửa sạch và lau qua bằng bông
thấm có dính cồn 70o.
Đối với nấm sợi: cân 10 g đất có chứa nấm dại bỏ vào túi nhựa PVC hòa vào 90 ml
nước muối sinh lý được độ pha loãng là 10 -1, tiếp tục pha loãng cho đến khi đạt
nồng độ 10-8.
Bước 2: Phân lập nấm dại
Đối với nấm quả thể: lấy dao tiến hành tách quả thể lấy phần lõi bên trong cấy
chuyền lên đĩa thạch môi trường PGA đã được hấp khử trùng 121 oC, 15 phút. Đem
các đĩa ủ ở tủ ấm 37oC và phân lập tiếp cho đến khi nấm được tách riêng ra hoàn

toàn. Mọi thao tác tiến hành trong tủ cấy vô trùng.
Đối với nấm sợi: lấy micropipet hút 0,1 ml từ ống nghiệm đã pha loãng tới nồng độ
10-8 sang các đĩa môi trường PGA đã được hấp khử trùng 121 oC, 15 phút. Lấy que
cấy trang trang đều bề mặt thạch cho tới khi khô bề mặt. Ủ các đĩa ở tủ ấm 37 oC,
tiếp tục phân lập cho tới khi mẫu nấm được tách biệt hoàn toàn.
Bước 3: Cấy chuyền
Đối với cả hai loại nấm quả thể và nấm sợi ta tiến hành cây chuyền giữ giống ở môi
trường PGA ủ 37oC để tiếp tục thực hiện các thí nghiệm sau.


19

Lưu ý: vì trong suốt quá trình phân lập giống luôn bị nhiễm nên để tránh tình trạng
này luôn luôn thay mới lưỡi dao và khử trùng que cấy liên tục dưới ngọn lửa đèn
cồn.
3.3.4.2 Định danh nấm dại
Nấm dại sau khi phân lập được đem đi định danh tại Công ty TNHH Thương mại và
Dịch vụ Nam Khoa, 793/58 Trần Xuân Soạn, Phường Tân Hưng, Quận 7, Tp.HCM.
Kết quả định danh này dựa trên phương pháp giải trình tự vùng ITS bằng kỹ thuật
PCR, sau đó đem đi so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI bằng công cụ BLAST để phân
loại từng chủng nấm.
3.3.4.3 Khảo sát mức độ đối kháng của nấm rơm với nấm sợi
Chuẩn bị:
Nấm rơm sau khi thu hái đem về rửa sạch và lau qua bằng bông thấm dính cồn. Tiến
hành tách quả thể lấy lõi cấy chuyền lên môi trường PGA đã hấp khử trùng 121 oC,
15 phút. Đem các đĩa nấm ủ ở 37oC.
Nấm sợi sau khi phân lập, cấy chuyền sang đĩa môi trường PGA đã được hấp khử
trùng 121oC, 15 phút. Đem các đĩa ủ ở 37oC.
Cách tiến hành:
Đợi cho các đĩa nấm mọc lên bào tử khi môi trường cạn kiệt chất dinh dưỡng thì hút

thêm vào 5 ml nước muối sinh lý đã hấp khử trùng, lắc đều để dịch hòa tan với bào
tử nấm. Đồng thời chuẩn bị các đĩa môi trường PGA đã hấp khử trùng, đục một lỗ
có đường kính 6 mm lên bề mặt môi trường. Lấy micropipet hút 0,1 ml dịch có bào
tử nấm bơm vào lỗ đã đục, một lỗ là nấm rơm một lỗ nấm sợi đem đĩa ủ ở 30 oC, sau
3 – 4 ngày tiến hành quan sát mức độ đối kháng giữa hai chủng.


20

3.3.4.4 Khảo sát mức độ đối kháng của nấm rơm với nấm quả thể
Chuẩn bị:
Nấm rơm sau khi thu hái đem về rửa sạch và lau qua bằng bông thấm dính cồn. Tiến
hành tách quả thể lấy lõi cấy chuyền lên môi trường PGA đã hấp khử trùng 121 oC,
15 phút. Đem các đĩa nấm ủ ở 37oC.
Nấm quả thể sau khi phân lập, cấy chuyền sang đĩa môi trường PGA đã được hấp
khử trùng 121oC, 15 phút. Đem các đĩa ủ ở 37oC.
Cách tiến hành:
Thực hiện tương tự như với khảo sát đối kháng của nấm sợi. Đợi cho các đĩa nấm
mọc lên bào tử khi môi trường cạn kiệt chất dinh dưỡng thì hút thêm vào 5 ml nước
muối sinh lý đã hấp khử trùng, lắc đều để dịch hòa tan với bào tử nấm. Đục các lỗ
có đường kính 6 mm lên bề mặt môi trường PGA đã chuẩn bị. Lấy micropipet hút
0,1 ml dịch có bào tử nấm bơm vào lỗ đã đục, một bên là nấm rơm một bên là nấm
quả thể đem đĩa ủ ở 30oC, sau 3 – 4 ngày tiến hành quan sát mức độ đối kháng giữa
hai chủng.
3.3.5. Khảo sát khả năng kháng nấm dại của dịch chiết cây cỏ mực trong nuôi
trồng nấm rơm
Sử dụng phương pháp tương tự như kháng khuẩn
Chuẩn bị:
Môi trường: pha môi trường PGA hấp khử trùng 121 oC trong 15 phút, sau đó đổ đĩa,
để nguội ở nhiệt độ phòng, mỗi đĩa khoảng 15 ml.

Nấm dại: đợi nấm lên bào tử sau đó thêm vào 5 ml nước muối sinh lý, lắc đều rồi
đem so độ đục với ống Mc.Farland (có độ đục tương đương 108 CFU/ml).
Chuẩn bị dịch chiết: dịch chiết được lọc qua giấy lọc vô trùng thực hiện trong tủ cấy
vô trùng.


21

Phương pháp thực hiện:
Cấy chuyền nấm dại và nấm mốc đã nuôi trước đó 2 – 3 ngày ra đĩa petri. Sau đó
đục lỗ giếng đường kính 6 – 10 mm lên bề mặt thạch rồi đặt cố định đĩa giấy lọc vô
trùng đã được thấm dịch chiết lên lỗ giếng. Đối với mẫu đối chứng thực hiện tương
tự nhưng đĩa giấy lọc sẽ được thấm nước cất.
Sau đó ủ ở 30oC trong 2 ngày, ghi nhận kết quả đo đường kính tản nấm.
Kết quả: Dựa vào đường kính của dịch chiết kháng nấm ta xác định mức độ kháng
cao hay thấp.
3.3.6. Khảo sát khả năng kháng khuẩn của dịch chiết cây cỏ mực
Chuẩn bị:
Môi trường: pha môi trường TSA, hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút, sau đó đổ
đĩa, để nguội ở nhiệt độ phòng, mỗi đĩa khoảng 15 ml.
Đĩa giấy lọc: cắt giấy lọc thành các đường tròn có đường kính 6 mm, đem hấp khử
trùng ở 121oC trong 15 phút.
Dịch khuẩn: dùng que cấy vòng lấy một vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường
phân lập hòa vào 9 ml nước muối sinh lý đã được hấp khử trùng ở 121 oC, lắc đều
rồi đem so độ đục với ống Mc.Farland (có độ đục tương đương 108 CFU/ml).
Dịch chiết: được lọc qua giấy lọc vô trùng thực hiện trong tủ cấy vô trùng.
Phương pháp thực hiện:
Cấy vi khuẩn lên môi trường: dùng micropippet hút 0,1 ml dịch vi khuẩn bơm vào
đĩa môi trường đã chuẩn bị sẵn. Dùng que cấy trang, trang đều vi khuẩn trên mặt
thạch, tiếp tục cho đến khi mặt thạch khô.

Dùng kẹp vô trùng gấp các đĩa giấy đã thấm dịch chiết theo từng nồng độ, đặt cố
định lên trên bề mặt thạch, sau đó úp ngược đĩa đem ủ ở 37 oC, ghi nhận kết quả sau
24h.


22

Lưu ý:
- Không đặt các đĩa kháng sinh quá sát nhau.
- Đối chứng âm là mẫu nước cất.
Quan sát và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn để xác định tính nhạy cảm của
chất thử, nồng độ ức chế vi khuẩn tối thiểu của dịch chiết. Mức độ kháng khuẩn
được đánh giá theo T.Johnson và cộng sự (1995) như sau:
d ≤ 11 mm: kháng khuẩn thấp
11 ≤ d ≤ 15 mm: kháng khuẩn trung bình
d ≥ 16 mm: kháng khuẩn cao
Xử lý số liệu
Các thí nghiệm lặp lại 3 lần, số liệu được xử lý bằng phần mềm thống kê mô tả
Microsoft Excel 2010 và phân tích hàm ANOVA (Duncan test với alpha = 0.05)
bằng phần mềm SAS 9.0.


23

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định độ ẩm của cây cỏ mực
Số lần
Khối lượng trước Khối lượng sau
Bảng
4.1. (g/lá)

Độ ẩm của lá
mực
lặp lại
khi sấy
khicây
sấycỏ(g/lá)
1
2
3

2,46
2,34
2,44

0,19
0,17
0,22

Độ ẩm trung bình:

Độ ẩm của lá
cây cỏ mực
(%)
92,27
92,73
90,98

91,99% 0,9

Dựa vào bảng 4.1 xác định độ ẩm của lá cây cỏ mực cho thấy độ ẩm của lá sau 3 lần

lặp lại là khá cao (91,99% ± 0,9). Lượng nước còn trong lá tương đối lớn nên điều
này cũng phù hợp cho quá trình tách chiết dịch. Ngược lại độ ẩm cao khiến cho việc
chăm sóc và bảo quản cây cần cẩn thận hơn, việc sấy và xay nghiền lá cây ra để lưu
trữ vận chuyển hay sử dụng dài ngày là cần thiết.
4.2. Định tính sơ bộ một số thành phần trong cây cỏ mực
TênBảng
hợp chất
Thuốc
thử
4.2. Kết quả định
tính sơ
bộ một số thànhHiện
phầntượng
trong cây cỏ Kết
mựcquả
Polyphenol
FeCl3 5%
Xanh đen
+
Steroids
Chloroform + H2SO4 đđ
Xanh tím
+
Triterpenoids
Tannin
Pb(CH3COO)2 10%
Kết tủa
+
Coumarine
NaOH 10%

Vàng cam
+
Ghi chú:

(+): có phản ứng

(-): không phản ứng
a

b


24

Hình 4.1. Định tính hợp chất polyphenol
(a): mẫu chứa dịch chiết

(b): mẫu trắng

a

b

Hình 4.2. Định tính hợp chất steroids và triterpenoids
(a): mẫu chứa dịch chiết

a

b

(b): mẫu trắng


25

Hình 4.3. Định tính hợp chất tannin
(a) mẫu chứa dịch chiết

a

(b) mẫu trắng

b

Hình 4.4. Định tính hợp chất coumarine
(a) mẫu chứa dịch chiết

(b) mẫu trắng

Từ các hình cho thấy tất cả các hợp chất polyphenol, steroids, triterpenoids, tannin
và coumarine đều hiện diện trong dịch chiết cây cỏ mực. Trong đó polyphenol có
khả năng kháng các loài vi khuẩn và nấm bệnh. Đây cũng là cơ sở để chọn loại cây
này và thực hiện đề tài kháng nấm kháng khuẩn trong nuôi trồng nấm rơm.