NGHIÊN cứu TÁCH CHIẾT và KHẢO sát HOẠT TÍNH KHÁNG OXY hóa KHÁNG KHUẨN của TINH dầu mắc mật (clausena indica)

TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT VÀ KHẢO
SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA KHÁNG KHUẨN CỦA TINH DẦU MẮC
MẬT (Clausena Indica)

Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ DUNG
Người thực hiện: PHẠM HỒNG NGỌC TÚ
Lớp

: 14060301

Khoá

: 18

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, NĂM 2018


2

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Tôn Đức Thắng, quý thầy cô
Khoa Khoa học ứng dụng và Bộ môn Công nghệ sinh học đã hết lòng truyền đạt cho
tôi những kiến thức bổ ích về lý thuyết và thực tiễn để tôi có thể hoàn thành tốt nhiệm
vụ học tập trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường.
Để có được khóa luận này, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thị

Dung đã tận tình trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt hơn 3 tháng thực hiện đề tài này.
Tôi xin cảm ơn các cô quản lý phòng thí nghiệm trường Đại học Tôn Đức Thắng đã
nhiệt tình hỗ trợ và giúp đỡ tôi trong thời gian làm khóa luận tại trường.
Xin cảm ơn những người anh, người chị, những người bạn đã ở bên và giúp đỡ tôi,
cùng tôi vượt qua những lúc gặp khó khăn.
Cuối cùng, con xin gửi lời biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến đấng sinh thành đã hi
sinh cả cuộc đời để nuôi nấng, yêu thương và dạy dỗ con lớn khôn đến ngày hôm nay.


3

LỜI CAM ĐOAN
CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH
TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và được sự hướng dẫn của
TS. Trần Thị Dung. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và
chưa được công bố dưới bất kỳ hình thức nào trước đây. Những số liệu trong các bảng
biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các
nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo.
Ngoài ra trong khóa luận còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của
các tác giả khác, cơ quan tổ chức khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung
khóa luận của mình. Trường Đại học Tôn Đức Thắng không liên qua đến những vi
phạm tác quyền, bản quyền do tôi gây ra trong quá trình thực hiện (nếu có).


4

TÓM TẮT
PHẠM HỒNG NGỌC TÚ, Đại học Tôn Đức Thắng, với đề tài “Nghiên cứu tạch chiết

và đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu Mắc mật
(Clausena indica)”, dưới sự hướng dẫn của TS. Trần Thị Dung. Đề tài được thực hiện
tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, trường Đại học Tôn Đức Thắng. Thời gian nghiên
cứu từ tháng 9/2018 đến tháng 01/2019.
Đề tài được thực hiện qua các giai đoạn sau:
-

Giai đoạn 1: Khảo sát ảnh hưởng của tình trạng nguyên liệu đến hiệu suất thu

-

hồi tinh dầu Mắc mật
Giai đoạn 2: Khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu Mắc mật bằng

-

phương pháp DPPH
Giai đoạn 3: Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của tinh dầu Mắc mật

Qua quá trình thực nghiệm, thu được một số kết quả như sau:
-

Trong cùng một thời gian chưng cất như nhau, nguyên liệu lá Mắc mật tươi cho
hiệu suất thu hồi tinh dầu cao nhất với thể tích trung bình là 1,7 mL trong cùng

-

điều kiện thời gian, nhiệt độ.
Tinh dầu Mắc mật có khả năng kháng oxy hóa nhưng ở mức độ rất thấp do
khoảng chênh lệch IC50 của tinh dầu và mẫu đối chứng quá lớn. IC 50 của mẫu tinh

dầu đạt tới 66,9107 mg/mL, trong khi đó IC 50 của mẫu đối chứng vitamin C chỉ

-

đạt 6,4254 mg/mL ở các nồng độ đã thử nghiệm.
Tinh dầu Mắc mật thể hiện hoạt tính kháng khuẩn đối với cả 5 loại vi khuẩn
được khảo sát, tuy nhiên chỉ ở mức độ trung bình. Tinh dầu Mắc mật thể hiện
hoạt lực kháng cao nhất đối với vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae với
đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 17,00 mm và thấp nhất đối với vi


5

khuẩn Bacillus subtilis với đường kính vòng kháng khuẩn trung bình là 10,67
-

mm trong cùng điều kiện thí nghiệm.
Tinh dầu Mắc mật thể hiện hoạt tính kháng nấm đối với cả 4 loại nấm được
khảo sát, tuy nhiên cũng chỉ nằm ở mức trung bình. Nấm Fusarium ambrosium
thể hiện mức độ mẫn cảm với tinh dầu Mắc mật mạnh nhất với hiệu quả kháng
đạt 40,50%, nấm Rhizoctonia solani thể hiện mức độ mẫn cảm với tinh dầu Mắc
mật yếu nhất với hiệu quả kháng đạt 14,833% trong cùng điều kiện thí nghiệm.

MỤC LỤC


6


7

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
DPPH: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl
IC50

: Nồng độ của mẫu ức chế được 50% gốc tự do

HQ

: Hiệu quả kháng

NT

: Nghiệm thức

PGA : Potato glucose agar

DANH MỤC CÁC HÌNH


8

DANH MỤC CÁC BẢNG


9

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ quy trình chưng cất tinh dầu Mắc mật
Đồ thị 4.1 Đồ thị biểu hiện phần trăm ức chế của vitamin C theo các nồng độ

Đồ thị 4.2 Đồ thị biểu hiện phần trăm ức chế của tinh dầu Mắc mật theo các nồng độ


10

CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Như chúng ta đã biết, Việt Nam là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa nên
có hệ thực vật phát triển vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt là nguồn thực vật có
chứa tinh dầu.
Phạm vi sử dụng tinh dầu ngày càng được mở rộng, gắn liền với cuộc sống hàng ngày
của con người, được sử dụng cho việc làm thuốc, chế biến thực phẩm, chế biến hương
liệu, công nghiệp mỹ phẩm,…
Nhu cầu về tinh dầu trong các ngành công nghiệp trong nước đang ngày một tăng lên,
tuy nhiên, việc nghiên cứu, khai thác và chế biến tinh dầu ở nước ta vẫn còn nhiều hạn
chế. Do đó, việc đi sâu nghiên cứu các nguồn tinh dầu của các loài cây có ý nghĩa rất
lớn về mặt khoa học và thực tiễn.
Mắc mật (Clausena indica) thuộc họ Cửu lý hương là một loài cây thân gỗ nhỏ, cao
dưới 10m, thường mọc ở chân núi đá vôi. Lá và quả cây có hương thơm nồng được
người dân ưa chuộng để chế biến các món thịt quay, cá kho,… ngoài ra rễ cây Mắc mật
còn là một vị thuốc dân gian rất quý có tác dụng giảm đau, bảo vệ gan, mật vô cùng
hiệu quả.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế, tầm quan trọng của tinh dầu nói chung và tinh dầu Mắc
mật nói riêng, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu tách chiết và đánh giá hoạt tính
kháng oxy hóa, kháng khuẩn của tinh dầu cây Mắc mật (Clausena indica)”.
1.2 Mục tiêu và phạm vi đề tài


11

Xác định loại nguyên liệu thích hợp có được hiệu suất thu hồi tinh dầu cao nhất với
phương pháp chưng cất tinh dầu bằng lôi cuốn hơi nước, đồng thời khảo sát hoạt tính
kháng oxy hóa, kháng khuẩn của tinh dầu Mắc mật.
1.3 Yêu cầu
- Xác định loại nguyên liệu thích hợp để thu tinh dầu Mắc mật bằng phương pháp
-

chưng cất lôi cuốn hơi nước
Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của tinh dầu Mắc mật
Xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu Mắc mật


12

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây Mắc mật [3]

Cây Mắc mật, hay còn được gọi là Hồng bì núi, Dương tùng hoặc Củ khỉ, là loài thực
vật có hoa thuộc họ Cửu lý hương, thường mọc trên núi đá vôi, chủ yếu ở khu vực
miền núi phía Bắc.
Là loại cây gỗ nhỏ, cao tầm 5-7 m, phân cành thấp. Lá kép lông chim mọc cách nhau,
chiều dài lá tối đa gần 10 cm, chop lá nhọn. Quả Mắc mật hình cầu, thịt có màu trắng
hơi đục hoặc trắng trong, khi chín có thể ăn trực tiếp mà không cần qua chế biến. Mắc
mật ra hoa vào khoảng tháng 4-5, đậu quả vào khoảng tháng 7-8.

Hình 2.1 Quả và lá Mắc mật
Từ xa xưa, người dân vùng núi phía Bắc đã biết sử dụng lá và quả Mắc mật phục vụ
cho việc chế biến món ăn vì chúng có chứa hàm lượng tinh dầu rất cao, làm cho món
ăn có mùi vị rất ngon và đặc trưng. Lá Mắc mật cho đến ngày nay vẫn còn rất nổi tiếng

với những món thịt quay như lợn quay, vịt quay, không chỉ ở miền Bắc mà còn cả miền
Nam. Bên cạnh đó, quả Mắc mật cũng được ưa chuộng cho các món kho, hạt Mắc mật
khô được xay nhuyễn thành bột để làm gia vị.
Ngoài ứng dụng về mặt ẩm thực, Mắc mật còn được xem là một vị thuốc quý khi có
thể đồng thời bảo vệ gan, mật, giảm đau, kháng viêm, kích thích tiêu hóa, sử dụng theo
phương pháp đông y hoặc tây y đều hiệu quả.
2.2 Vài nét về tinh dầu [9]
2.2.1 Khái niệm về tinh dầu


13

Tinh dầu là một hỗn hợp gồm nhiều thành phần có mùi thơm hoặc mùi hắc, được điều
chế chủ yếu từ thực vật và một số loài động vật. Tinh dầu không tan trong nước nhưng
tan tốt trong dung môi hữu cơ, bay hơi ở nhiệt độ thường.
Trong hệ thực vật, hầu hết các loài cây đều có tinh dầu nhưng tập trung chủ yếu là ở
các họ: họ Hoa tán, họ Cam, họ Gừng, họ Long não, họ Cúc, họ Hoa Môi, họ Cửu lý
hương, họ Sim,… Tinh dâu có thê phân bố ở khắp các bộ phận của cây như lá, hoa,
quả, vỏ quả, vỏ thân, rễ, nhựa cây hoặc ở các bộ phận tiết như tế bào tiết, lông tiết, túi
tiết,…
Hàm lượng tinh dầu hiện diện trong các loài thực vật thường dao động từ 0,1-2%, tuy
nhiên một số trường hợp có thể đạt đến 5%.
2.2.2 Tính chất vật lý và tính chất hóa học của tinh dầu
2.2.2.1 Tính chất vật lý

Tinh dầu thường ở dạng lỏng, có mùi thơm hoặc mùi hắc khó chịu, không màu hoặc có
màu vàng nhạt
Hầu hết tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn tỷ trọng của nước (tỷ trọng của nước bằng 1),
ngoài trừ tinh dầu Quế và tinh dầu Đinh hương có tỷ trọng lớn hơn tỷ trọng của nước
Tinh dầu bay hơi được ở điều kiện thường, không tan trong nước và tan nhiều trong các

dung môi hữu cơ
Nhiệt độ sôi của tinh dầu không ổn định mà phụ thuộc vào các thành phần hóa học có
trong tinh dầu
2.2.2.2 Tính chất hóa học

Thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu là các hợp chất thuộc nhóm Terpenoid (là các
hydrocarbon không no), do đó chúng rất dễ bị phân hủy hoặc oxy hóa dưới tác dụng


14

của nhiệt độ, ánh sáng, không khí, tạo thành các hợp chất khác làm biến đổi tính chất
ban đầu của tinh dầu
2.2.3 Các sản phẩm của tinh dầu
2.2.3.1 Tinh dầu dạng cô kết

Sản phẩm tinh dầu cô kết thu được từ phương pháp ngâm chiết tĩnh, dùng để sản xuất
nước hoa khô. Sản phẩm này ngoài tinh dầu còn chứa sáp và chất béo, có dạng sệt, đặc,
có thể sử dụng trực tiếp.
2.2.3.2 Tinh dầu tinh khiết

Sản phẩm tinh dầu tinh khiết được thu nhận bằng cách loại bỏ các tạp chất như sáp,
chất béo bằng ethanol tinh khiets, sau đó làm lạnh đột ngột và loại bỏ chất kết tinh.
Phần dịch thu được đem đi cô quay chân không loại dung môi thu được tinh dầu tinh
khiết.
2.2.3.3 Nước chưng

Đây là phần nước còn lại sau khi lóng, gạn thu tinh dầu trong phương pháp chưng cất
lôi cuốn hơi nước, áp dụng các loại tinh dầu có giá trị thương mại cao, vì trong phần
nước thu được có chứa một phần tinh dầu hòa tan và phân tán. Nước chưng được xem

như là một sản phẩm trong kỹ nghệ hương liệu.
2.2.3.4 Nước hoa

Là sản phẩm phối hợp đa dạng của tinh dầu thiên nhiên hay tinh dầu tổng hợp hoặc bán
tổng hợp, được hòa tan trong cồn, trong đó được bổ sung thêm chất định hương để tăng
đậm mùi hương của nước hoa và mùi được lưu giữ lâu hơn. Mỗi thành phần trong nước
hoa đều được chuẩn độ chính xác để không làm biến tính tinh dầu, dẫn đến biến đổi
mùi thơm của tinh dầu.


15

2.2.4

Cách bảo quản tinh dầu

Tinh dầu cần được phải loại bỏ hết nước, bảo quản nơi mát, không có ánh sáng. Lưu
giữ tinh dầu trong các chai lọ thủy tinh vừa phải, có miệng nhỏ
2.3 Các phương pháp tách chiết tinh dầu

Với sự phát triển nhanh chóng của khoa học kỹ thuật, hiện nay có rất nhiều phương
pháp tách chiết tinh dầu. Để lựa chọn phương pháp tách chiết tinh dầu hợp lý cần dựa
trên yêu cầu về chất lượng sử dụng, giá thành thiết bị, sản phẩm và đặc điểm của tinh
dầu chứa trong nguyên liệu như:
-

Tính bay hơi
Tính bay hơi theo hơi nước ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau
Tính hòa tan trong nước
Tính hòa tan trong các dung môi hữu cơ bay hơi và không bay hơi

Dễ hấp thu ở thể khí

Sản phẩm tinh dầu thu được phải đạt các yêu cầu sau:
2.3.1

Có hương vị tự nhiên của nguyên liệu ban đầu
Quy trình kỹ thuật và phương pháp trích ly phải khai thác hết tinh dầu có trong
nguyên liệu với chi phí tối thiểu.
Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước

Phương pháp này dựa rên sự thẩm thấu, hòa tan, khuếch tán, lôi cuốn theo hơi nước
của những hợp chất hữu cơ trong tinh dầu chứa trong các mô khi tiếp xúc với hơi nước
ở nhiệt độ cao. Phương pháp này đang được sử dụng rất phổ biến vì có thể ứng dụng
với cả nguyên liệu tươi hoặc khô.
Nguyên liệu được rửa sạch (nếu là nguyên liệu tươi), để nguyên hoặc cắt nhỏ tùy tính
chất của nguyên liệu, cho vào nồi cất. Cho luồng hơi nước đi qua hoặc đun trực tiếp
cùng với nước, hơi nước cùng hơi tinh dầu bay hơi sang bộ phận làm lạnh (ống sinh
hàn), ngưng tụ lại thành giọt và chảy xuống ống hoặc bình gạn. Tinh dầu có tỷ trọng
nhỏ hơn tỷ trọng của nước sẽ nổi lên trên, một vài trường hợp tinh dầu nặng hơn nước
sẽ chìm xuống dưới. Sau khi tắt thiết bị, không nên xả van thu tinh dầu liền mà nên để
yên vài phút để lắng tinh dầu. Khi thu tinh dầu nên thu cả phần nước vì trong phần


16

nước đó vẫn còn lẫn một ít tinh dầu, tồn tại ở 2 dạng: phân tán và hòa tan. Đối với dạng
phân tán, chỉ cần để lắng hoặc ly tâm sẽ thu được tinh dầu. Đối với dạng hòa tan, có thể
cho muối ăn vào làm tăng tỷ trọng của nước, giúp tinh dầu nổi lên trên hoặc dung dung
môi hữu cơ dễ bay hơi để chiết rồi cô quay đuổi dung môi.
Trong một vài trường hợp, một số chất mẫn cảm với nhiệt, dễ bị biến tính ngay cả ở

nhiệt độ sôi bình thường của chúng (oxy hóa, đồng phân hóa, polymer hóa,…). Đối với
những chất như vậy, ta phải áp dụng phương pháp chưng cất chân không, nghĩa là
chưng cất ở áp suất thấp theo nguyên tắc, áp suất giảm thì nhiệt độ sôi giảm theo.
Ở quy mô phòng thí nghiệm, người ta thường sử dụng bộ dụng cụ chưng cất thủy tinh
Clavenger với các ưu điểm: quy trình kỹ thuật đơn giản, dễ chế tạo, thiết bị nhỉ gọn,
thời gian thực hiện tương đối nhanh. Tuy nhiên, phương pháp này không nên được ứng
dụng cho loại nguyên liệu có hàm lượng tinh dầu thấp, tinh dầu có cấu phần dễ bay
hơi.
2.3.2

Phương pháp ly trích dưới sự hỗ trợ của vi sóng

Dưới tác dụng của vi sóng, nước trong tế bào nóng lên làm áp suất bên trong tăng đột
ngột, các mô chứa tinh dầu bị vỡ và tinh dầu thoát ra, được hơi nước lôi cuốn theo sang
bộ phận làm lạnh hoặc hòa tan lập tức vào dung môi đang bao phủ bên ngoài nguyên
liệu.
Do kiến tạo của các mô tinh dầu không giống nhau nên mức độ chịu ảnh hưởng từ vi
sóng của các loại mô này là khác nhau. Điều này được chứng minh thông qua thời gian
ly trích.
Phương pháp này có thể xem là giống với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước
nhưng vận tốc nhanh hơn rất nhiều vì nước được làm nóng nhanh bởi vi sóng.
2.3.3

Phương pháp sử dụng dung môi hòa tan

Khi sử dụng phương pháp này, dung môi phải đạt các yêu cầu sau:
-

Hòa tan hoàn toàn và nhanh chóng các thành phần có mùi thơm trong nguyên

-

liệu
Hòa tan kém các hợp chất sáp, nhựa dầu trong nguyên liệu
Không xảy ra phản ứng hóa học với tinh dầu


17

-

Không biến chất khi tái sử dụng nhiều lần
Độ tinh khiết cao, không ăn mòn thiết bị, không tạo hỗn hợp nổ với không khí
Độ nhớt kém
Điểm sôi của dung môi thấp hơn điểm sôi của cấu tử dễ bay hơi nhất trong tinh
dầu

Tuy nhiên trong thực tế, không có loại dung môi nào đáp ứng hoàn toàn các yêu cầu
trên mà chỉ ở mức độ tương đối. Thông thường người ta sử dụng các loại dung môi như
petroleum ether, diethyl ether, ethanol, methanol, hexane,…
Nguyên liệu sau khi làm sạch được ngâm trong dung môi bằng bình chứa với tỷ lệ
thích hợp và được xáo trộn đều trong suốt thời gian ly trích. Giữ nguyên liệu chìm
hoàn toàn trong dung môi từ 24-48h, thu dịch trích ly, làm khan bằng Na2SO4, lọc lại
bằng giấy lọc sau đó đem đi cô quay đuổi dung môi. Sản phẩm thu được sau khi cô
quay gồm tinh dầu, nhựa, sáp, chất béo,… Cho ethanol tinh khiết vào hỗn hợp trên,
khuấy đều ở nhiệt độ phòng liên tục trong vài ngày, sau đó làm lạnh về 10-15oC, lọc lại
bằng giấy lọc. Ở nhiệt độ này, nhựa và chất béo sẽ đông lại, chỉ còn tinh dầu hòa tan
trong ethanol. Đem dung dịch này đi cô quay, thu được tinh dầu tinh khiết.
2.3.4

Phương pháp hấp thụ

Phương pháp này được áp dụng cho nguyên liệu là các loại hoa có khả năng tạo tinh
dầu ngay cả sau thu hái hoặc dùng để tách tinh dầu của một số loại cây có hàm lượng
tinh dầu thấp nhưng có giá trị kinh tế cao.
Người ta sử dụng chất béo động vật hoặc thực vật đã được tinh chế (ngày nay còn có
vaselin và parafin tinh khiết) để hấp thụ những chất dễ bay hơi. Theo nguyên tắc đó,
hương thơm từ hoa sẽ được chất béo hấp thụ sau một thời gian nhất định.
Dùng các khay gỗ có kích thước 60x100x8 (cm). Giữa chiều cao của khay lắp một
miếng kính. Trát chất béo lên hai mặt kính, độ dày 1 cm, vạch thêm vài đường để tăng
diện tích tiếp xúc bề mặt hấp thụ. Khi chồng các khay này lên nhau sẽ tạo thành một
hộp kín có đáy và trần là hai lớp chất béo. Hoa tươi rửa sạch, để ráo nước, urải đều lên
trên, chồng các khay lên nhau, để yên. Lớp chất béo dưới đáy sẽ hấp thụ trực tiếp tinh
dầu do hoa tiết ra, lớp chất béo trên trần sẽ hấp thụ những hợp chất dễ bay hơi bốc lên.
Sau một thời gian, hoa cũ được lấy ra, hoa mới được thay vào, liên tục cho đến khi lớp
mỡ bão hòa tinh dầu, khi đó chúng được gọi là sáp hoa. Đem sáp hoa này trộn đều với


18

ethanol tinh khiết ở nhiệt độ phòng. Thay dung dịch ethanol liên tục cho đến khi chất
béo không còn mùi thơm của tinh dầu. Đem dịch ly trích này làm lạnh về 15oC và lọc
bỏ chất kết tinh, cô quay đuổi dung môi thu được tinh dầu tinh khiết.
2.3.5

Phương pháp lên men

Phương pháp này áp dụng cho các nguyên liệu chứa tinh dầu dưới dạng tiềm tang
(trạng thái liên kết glucose). Nguyên liệu sau khi làm sạch được ủ hoặc cho them các
loại enzyme vào để xúc tác quá trình lên men. Tùy thuộc vào bản chất của loại tinh dầu

có trong nguyên liệu mà chọn phương pháp tách chiết tiếp theo cho phù hợp: chưng cất
hơi nước, hấp thụ,…
2.3.6

Phương pháp ép

Phương pháp này được áp dụng với các loại nguyên liệu có tinh dầu được chứa trong
vỏ tươi như vỏ chanh, vỏ quýt, vỏ cam,… Có thể thực hiện phương pháp này bằng tay
hoặc bằng máy. Tinh dầu sau khi ép sẽ hơi đục, cần được để lắng một thời gian để
trong lại, hương thơm của tinh dầu dịu nhẹ, không quá nồng.
2.4 Tinh dầu Mắc mật

Tinh dầu Mắc mật thông thường được thu từ lá và quả Mắc mật, vì tại hai bộ phận đó
có chứa hàm lượng tinh dầu cao nhất, bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước.
Tinh dầu Mắc mật có tỷ trọng nhẹ hơn nước, màu vàng rất nhạt, vị thơm ngọt đặc
trưng, càng để lâu tinh dầu càng sánh lại.
Thành phần hóa học của tinh dầu trong quả và lá Mắc mật không hoàn toàn giống
nhau. Ngoài ra, thành phần chất thơm trong tinh dầu Mắc mật còn phụ thuộc rất nhiều
vào loại giống, khí hậu, đất đai tại địa phương trồng, kỹ thuật chăm sóc,…
Tinh dầu Mắc mật thực tế không có giá trị thương mại cao như các loại tinh dầu khác,
tuy nhiên, tinh dầu này vẫn được người dân phía Bắc sử dụng để chế biến thức ăn hoặc
làm thuốc chữa các bệnh liên quan đến sự viêm nhiễm, bảo vệ gan,…
2.5 Các vi khuẩn gây bệnh thường gặp
2.5.1 Escherichia coli [1]
2.5.1.1 Đặc điểm sinh vật học


19

Escherichia coli (E. coli) là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình khoảng 0,5x(23) µm, không sinh nha bào. Hầu hết có lông và di động được. E. coli là vi khuẩn hiếu

khí tùy tiện, dễ dàng phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ
thích hợp khoảng 37oC, pH 7-7,2. Thời gian thế hệ của E. coli khoảng 20-30 phút/thế
hệ.
Trong môi trường lỏng, sau 4-5 giờ nuôi cấy, E. coli đã làm đục nhẹ môi trường, thời
gian lưu trữ càng lâu, độ đục càng tăng, sinh khối vi khuẩn sẽ lắng xuống đáy ống
nghiệm.
Trên môi trường thạch thường, sau khoảng 24 giờ nuôi cấy, E. coli sẽ sinh khuẩn lạc.
Khuẩn lạc này có màu trắng hơi đục, tròn bóng, bờ đều, đường kính dao động khoảng
1-3 mm.
2.5.1.2 Khả năng gây bệnh

Trong hệ tiêu hóa, E. coli chiếm khoảng 80% trên tổng số các sinh hiếu khí, chúng
cộng sinh với cơ thể, tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn, sản xuất một số vitamin
và cân bằng sinh thái các vi khuẩn. Tuy nhiên, E.coli là một vi khuẩn gây bệnh cơ hội
quan trọng trong các vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ở trẻ em, viêm đường tiết niệu, viêm
đường mật, nhiễm khuẩn huyết. Ngoài ra, E.coli còn có thể gây một số bệnh như viêm
phổi, viêm màng não, nhiễm khuẩn vết thương,…
2.5.1.3 Phòng và trị bệnh

Phòng bệnh: Hiện tại chưa có lọa vaccine nào có thể phòng ngừa được vi khuẩn này.
Điều quan trọng trước mắt là cần chú ý vệ sinh an toàn thực phẩm. Thực hiện nghiêm
ngặt nguyên tắc vô khuẩn khi thăm dò hoặc đặt thông đường tiết niệu.
Trị bệnh: Vì E. coli là loài vi khuẩn phát triển nhanh, mạnh, có tỷ lệ kháng thuốc cao
nên cần lập kháng sinh đồ để chọn ra loại kháng sinh phù hợp nhất. Khi bệnh nhân
đang có triệu chứng tiêu chảy cần tiếp nạp nước điện giải ngay để tránh mất sức.
2.5.2 Staphylococcus aureus [2]
2.5.2.1 Đặc điểm sinh vật học


20

Staphylococcus aureus (S. aureus) (tụ cầu vàng) là vi khuẩn hình cầu, có đường kính
0,8-1 µm, thường đứng tụ lại thành chùm như chùm nho. Là vi khuẩn Gram (+), không
có vỏ, không có lông và không sinh nha bào.
S. aureus dễ dàng phát triển trên các môi trường nuối cấy thông thường, với khoảng
nhiệt độ khá rộng tù 10-45oC. Trong môi trường canh thang, vi khuẩn phát triển mạnh
làm đục đều môi trường, để một thời gian sẽ lắng cặn xuống đáy. Trong môi trường
thạch thông thường, vi khuẩn phát triển nhanh tạo khuẩn lạc có dạng chữ S, có màu
vàng chanh. Trong môi trường thạch máu, vi khuẩn phát triển nhanh tạo khuẩn lạc có
dạng chữ S, làm tan máu hoàn toàn.
2.5.2.2 Khả năng gây bệnh

Nhiễm khuẩn ngoài da: Vi khuẩn thường ký sinh ở da và niêm mạc, chúng xâm nhập
qua vết thương hoặc lỗ chân lông trên da làm nhiễm khuẩn và sinh mủ. Mức độ viêm
nhiễm phụ thuộc vào mức độ đề kháng của cơ thể và độc lực của vi khuẩn.
Nhiễm khuẩn huyết: Loại nhiễm khuẩn này thường xảy ra sau nhiễm khuẩn tiên phát,
thông thường là nhiễm khuẩn ngoài da, sau đó vi khuẩn xâm nhập vào máu rồi di
chuyển đến các cơ quan nội tạng, gây hội chứng apxe (ở gan, phổi, não, xương). Điều
này gây viêm tắc tĩnh mặc, dẫn đến tỷ lệ tử vong cao.
Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp: Nguyên nhân gây ra là do ăn uống thực phẩm có
chứa độc tố ruột hoặc do tụ cầu cư trú sẵn trong đường ruột, khi lạm dụng kháng sinh
trong thời gian dài, các loại vi khuẩn bình thường sẽ bị tiêu diệt, làm tăng khả năng
sinh sôi nảy nở cho tụ cầu vàng và đồng loạt tiết độc tố gây bệnh. Bệnh nhân thường có
các triệu chứng nôn mửa, tiêu.chảy dữ dội, đi ngoài nhiều nước, có thể gây sốc do mất
nước và điện giải.
2.5.2.3 Phòng và trị bệnh

Phòng bệnh: Tăng cường công tác vệ sinh môi trường, vệ sinh cá nhân và vệ sinh ăn
uống. Khử trùng kỹ càng các dụng cụ y khoa trước khi tái sử dụng nhằm hạn chế khả
năng xâm nhiễm.

Trị bệnh: Lập kháng sinh đồ để chọn ra loại kháng sinh thích hợp. Thường sử dụng các
loại kháng sinh như: Oxacillin, Kanamycin, Getamycin,…


21

2.5.3 Bacillus subtilis [1][4][18]
2.5.3.1 Đặc điểm sinh vật học

Bacillus subtilis (B. subtilis) là trực khuẩn Gram (+), ngắn và nhỏ, đầu tròn, kích thước
khoảng 1,5x3x(0,5-0,8) µm, đứng riêng lẻ hoặc liên kết với nhau tạo thành chuỗi ngắn.
Di chuyển bằng tiên mao, sinh bào tử.
Là vi sinh vật hiếu khí, nhiệt độ thích hợp khoảng 37oC, pH trung tính. Trên môi
trường thạch, khuẩn lạc có dạng tròn, viền răng cưa, màu vàng xám, tâm sẫm màu, sau
3-4 ngày, đường kính khuẩn lạc khoảng 3-5 mm, hơi nhăn và màu sẫm lại.
2.5.3.2 Ứng dụng của B. subtilis

B. subtilis thường không có khả năng gây bệnh, chúng chỉ có nguy cơ gây hư hỏng
thực phẩm, làm mất giá trị cảm quan. Mặt khác, chúng được xem là một lợi khuẩn rất
có ích cho nhiều lĩnh vực.
Cải thiện sức khỏe con người:
-

Đóng góp vào nguồn dinh dưỡng và enzyme tiêu hóa: B. subtilis trực tiếp cung
cấp chất dinh dưỡng cho vật nuôi, đặc biệt là acid béo và vitamin. Ứng dụng vi
khuẩn B. subtilis trong nuôi trồng thủy sản thường cho kết quả cao về tỷ lệ sống,
tỷ lệ tăng trưởng và hiệu quả kinh tế. Bên cạnh đó, chúng còn sản sinh các

-

enzyme thủy phân như protease, lipase,... giúp quá trình tiêu hóa diễn ra tốt hơn.
Tăng cường các phản ứng miễn dịch: B. Subtilis có thể làm tăng đáp ứng miễn
dịch không đặc hiệu

Cải thiện môi trường sống:
-

Phân hủy chất thải: B. subtilis có khả năng tiết các enzyme phân hủy các chất
hữu cơ như polysaccharide, chất đạm, chất béo thành các đơn vị cấu tạo nhỏ
hơn. Ngoài ra chúng còn tham gia vào quá trình amon hóa protein, nghĩa là phân

-

giải các hợp chất hữu cơ có chứa nito và giải phóng NH3.
Giải độc NH3, H2S: Trong điều kiện kỵ khí, các acid amin không được vô cơ hóa
hoàn toàn, gây tích lũy nhiều hợp chất như NH 3, CO2, H2S, acid hữu cơ, rượu,


22

mecaptan và những chất độc như diamin, tomain, indol, scatol. Trong trường
hợp này, B. subtilis đóng vai trò thúc đẩy quá trình phân hủy các hợp chất, giảm
lượng chất dư thừa, giảm phát sinh khí độc, mùi hôi dưới đáy ao (đối với ngành
thủy sản).
Ức chế tác nhân gây bệnh: Được xem như là một lợi khuẩn với tốc độ phát triển khá
tốt, B. subtilis còn được sử dụng cho việc ức chế tác nhân gây bệnh thông qua các khả
năng như tiết kháng sinh kháng lại các vi sinh vật gây bệnh, cạnh tranh dinh dưỡng và
cạnh tranh chất sắt với các vi sinh vật gây bệnh làm giảm thiểu khả năng sinh sản và
phát triển của chúng.
2.5.4

Ralstonia solanacearum [15][20]

Đặc điểm sinh học: Ralstonia solanacearum (R. solanacearum) là vi khuẩn kỵ khí,
Gram (-), gây bệnh trên thực vật. Chúng sinh sống trong các mảnh vụn thực vật, cây
bệnh, hạt hoặc các cơ quan nhân giống sinh dưỡng như các loại củ. R. solanacearum có
thể tồn tại trong nước tinh khiết ở thời gian rất dài (40 năm ở 25oC) hoặc tồn tại trong
thời tiết mát mẻ, đi vào trạng thái khả thi nhưng không thể nuôi cấy.
Cơ chế gây bệnh: R.solanacearum xâm chiếm xylem, làm héo cây chủ (được gọi là héo
Granville), xảy ra ở cây thuốc lá, cà chua, cà tím, khoai tây, hạt tiêu,…
2.5.5

Xanthomonas oryzae pv. Oryzae [12]

Đặc điểm sinh học: Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Xoo) là vi khuẩn Gram (-), không
định hình (thường có dạng roi), kích thước (0,55-0,75)x(1,35-2,17) µm. Khuẩn lạ màu
vàng, tròn, lồi và mịn. Vi khuẩn này sinh sống tốt trong điều kiện nhiệt độ 26-30oC, đối
với giai đoạn tăng trưởng ban đầu thì nhiệt độ 20oC là thích hợp nhất. Vùng pH phù
hợp cho loại vi khuẩn này là 4,8-8,0, pH tối ưu khoảng 6,0-6,5. Gây bệnh trên thực vật,
đặc biệt là trên lúa gạo.
Cơ chế gây bệnh: Xoo gây bệnh bạc lá, là một loại bệnh quan trọng nhất của cây lúa.
Chúng xâm nhiễm thông các lỗ hở tự nhiên hoặc các vết nứt, vết thương trên hạt gạo,
thân, rễ sau khi thu hoạch hoặc cỏ dại xung quanh. Bên cạnh đó, chúng còn có thể mọc
trong thân cây, sau đó lây nhiễm vào gân lá hoặc xylem gây tắc nghẽn mạch nước, dinh


23

dưỡng làm héo cây. Do Xoo lây lan nhờ dòng nước nên rất dễ tạo thành dịch vào mùa
mưa, ngập lụt.

2.6 Các loại nấm gây bệnh thực vật
2.6.1 Brachycladium papaveris
2.6.2 Fusarium ambrosium [19]

Ffusarium ambrosium (F. ambrosium) ký sinh hoặc hoại sinh trên cây trồng, cây ăn quả
và rau. Hệ sợi nấm lan tỏa và lấp kín mạch gỗ, làm cản trở quá trình vận chuyển nước
từ rễ lên các bộ phận khác của cây dẫn đến héo cây. Bên cạnh đó loài nấm này còn tiết
ra chất độc gây héo rũ cây
2.6.3

Rhizoctonia solani [7]

Rhizoctonia solani (R. solani) là một loại nấm đảm, có khả năng tồn tại trong khoảng
nhiệt độ lớn từ 5-42oC, nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 28-31oC. Ngoài ra khoảng
pH của chúng cũng rộng không kém, từ 2-8, trong đó pH tối thích là khoảng 5-7.
Gây bệnh khô vằn hại lúa (một loại bệnh khá nghiêm trọng đối với nông nghiệp lúa
nước) và lở ổ rễ ở cây rau. Bệnh thường phát sinh ở các bẹ lá già phía dưới. Trong điều
kiện nhiệt độ tối thích kết hợp với độ ẩm cao trong mùa mưa, hoặc nước ở các đồng
ruộng lên quá cao, cấy quá dày sẽ làm tốc độ lây lan tăng nhanh.
2.6.4

Sclerotium rolfsii [13][14]

Sclerotium rolfsii (S. rolfsii) là một mầm bệnh nấm hoại tử trong đất, phát triển trong
điều kiện hiếu khí, nên thường xuất hiện ở rất gần mặt đất. Chúng có thể tồn tại trong
vài năm, và có thể không cần vật chủ. S. rolfsii phát triển ở nhiệt độ cao (27-35oC)
trong điều kiện ẩm ướt và đất có tính acid (pH 3-7).
S. rolfsii gây bệnh trên rất nhiều loài thực vật. Tơ nấm của chúng phát triển nhanh
mạnh bao lấy vật chủ, tiêu diệt các mô thực vật bằng cách sản xuất acid axalic và các
enzyme phân hủy thành tế bào, gây hư thối cây, quả,…

2.7 Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc

tự do DPPH [10][11]
2.7.1 Sơ lược về gốc tự do và chất chống oxy hóa


24

Gốc tự do được định nghĩa là những phân tử có khả năng tồn tại độc lập có chứa một
electron tự do. Nhiều gốc không ổn định và có tính phản ứng cao. Chúng có thể cho
hoặc nhận electron từ các phân tử khác, do đó chúng có thể hoạt động như chất oxy
hóa hoặc chất khử. Các gốc tự do tấn công các đại phân tử quan trọng dẫn đến tổn
thương tế bào và phá vỡ cân bằng nội môi. Mục tiêu của các gốc tự do bao gồm các
loại phân tử trong cơ thể, trong đó, lipid, nucleic acid và protein là các mục tiêu chính.
Chất chống oxy hóa là một phân tử đủ ổn định để cho một electron cho gốc tự do và vô
hiệu hóa nó, làm giảm thiểu khả năng gây hại. Các chất chống oxy hóa trì hoãn hoặc ức
chế tổn thương tế bào thông qua đặc tính “dọn” gốc tự do. Các chất chống oxy hóa có
thể là Glutathione, Ubiquinol, Uric acid được tạo ra trong quá trình trao đổi chất bình
thường trong cơ thể, hoặc có thể là các hợp chất vi lượng như Vitamin E (αtocopherol), Vitamin C (Ascorbic acid) và B-carotene, những chất này cơ thể không tự
sản xuất mà chúng được cung cấp qua chế độ ăn uống hàng ngày.

Hình 2.2 Cơ chế "bắt" gốc tự do của chất chống oxy hóa
2.7.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
2.7.2.1 Nguyên tắc


25

Các chất có khả năng chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen,
làm giảm độ hấp thu ở bước sóng cực đại, khi đó màu của dung dịch sẽ nhạt dần,

chuyển từ màu tím sang màu vàng nhạt.
2.7.2.2 Tính toán

Kết quả khả năng dọn gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau:

DPPH scavenged (%) =

AB − AA
x100
AB

Trong đó: AB: độ hấp thu của dịch mẫu sau khi được ủ 30 phút
AA: độ hấp thu của mẫu blank (dung dịch DPPH)

CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm tiến hành thí nghiệm
3.1.1 Địa điểm

Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học – Khoa Khoa học ứng dụng, Bộ môn Công nghệ
sinh học, Trường Đại học Tôn Đức Thắng, Thành phố Hồ Chí Minh
3.1.2

Thời gian

Đề tài được thực hiện từ tháng 9/2018 đến tháng 1/2019
3.2 Vật liệu thí nghiệm
3.2.1 Vật liệu để chưng cất tinh dầu Mắc mật

Lá Mắc mật tươi được mua tại quận Thủ Đức, Thành phố Hồ Chí Minh
3.2.2

-

Vật liệu thử hoạt tính kháng khuẩn
Escherichia coli