Thiết lập phản ứng real time PCR phát hiện và phân biệt vi khuẩn gram + và gram

1

TÓM TẮT
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thị Bé Hương
Giảng viên hướng dẫn: TS. Trần Nhật Phương
Đề tài: “Thiết lập phản ứng Real time PCR phát hiện và phân biệt vi khuẩn Gram
[+] và Gram [-]” được thực hiện từ tháng 09/2018 đến tháng 01/2019 tại phòng thí
nghiệm Công ty TNHH Dịch Vụ và Thương Mại Nam Khoa.
Đề tài thực hiện gồm 4 nội dung sau:
-

Nội dung 1: Cấy phân lập các chủng vi khuẩn trên môi trường đĩa thạch phù

-

hợp.
Nội dung 2: Ly trích DNA của vi khuẩn
Nội dung 3: Thiết lập phản ứng Real-time PCR sử dụng màu huỳnh quang

-

Eva green.
Nội dung 4: Ghi nhận đỉnh chảy của vi khuẩn Gram [+] và Gram [-]. Khảo

sát trên mẫu vi khuẩn kiểm chủng.
Qua thực nghiệm, thu được một số kết quả như sau:
Đỉnh chảy của vi khuẩn Gram [+]: 91oC
Đỉnh chảy của vi khuẩn Gram [-]: 90oC


2

MỤC LỤC
Table of Contents


3

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PCR

Polymerase Chain Reaction

DNA

DeoxyRibonucleide Acid

dNTP

Deoxiribonucleotide triphosphat

BA

Blood Agar

MC

Mac Conkey Agar

CAXY

Chocolate Agar

BHI

Brain Heart Infusion


4

DANH MỤC BẢNG, SƠ ĐỒ, BIỂU ĐỒ
Sơ đồ 3.1 Quy trình phân biệt vi khuẩn Gram [+] và Gram [-]
Bảng 4.1 Bảng ghi nhận đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [+]
Biểu đồ 4.1 Đường biểu diễn khuếch đại chủng vi khuẩn Gram [+]
Bảng 4.2 Bảng ghi nhận đỉnh chảy nhóm vi khuẩn Gram [-]
Biểu đồ 4.2 Đường biểu diễn khuếch đại chủng vi khuẩn Gram [-]


5

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn
Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào vi khuẩn Gram [+]
Hình 2.3 Cấu trúc vách tế bào vi khuản Gram [-]
Hình 2.4 Nguyên tắc kỹ thuật nhuộm Gram dựa vào sự khác
nhau giữa vách tế bào vi khuẩn Gram [+] và Gam [-]
Hình 2.5 Quy trình nhuộm Gram
Hình 2.6 Cầu khuẩn Gram [+] và Trực khuẩn Gram [-]
Hình 2.7 Nguyên tắc kỹ thuật Real-time PCR
Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của SYBR GREEN
Hình 2.9 Cơ chế hoạt động của Tapman probe

Hình 2.10 Cơ chế hoạt động của probe lai
Hình 3.1 Cấy phân lập E. coli trên môi trường MC và Staphylococcus aureus
trên môi trường BA


6

CHƯƠNG 1.
1.1

MỞ ĐẦU

Đặt vấn đề
Vi khuẩn là loài sinh vật bậc thấp, tồn tại gần như ở mọi nơi,

tăng trưởng rất nhanh dưới những điều kiện thích hợp, nhưng
chúng ta không thể qua sát bằng mắt thường vì kích thước của vi
khuẩn rất nhỏ. Vi khuẩn được các nhà khoa học chia làm 2 loại:
Gram [+] và Gram [-].
Vi khuẩn Gram [+] với màng dày nhưng ít nguy hiểm hơn với
con người. Cơ thể chúng ta có khả năng sản sinh ra hợp chất, tấn
công màng ngoài vi khuẩn Gram dương và từ đó tiêu diệt chúng.
Còn đối với vi khuẩn Gram âm, chúng có tới hai lớp màng. Đặc biệt
là màng ngoài cùng được bọc bởi một nang. Nó không những cản
thuốc nhuộm Gram mà còn cản mọi kháng nguyên của cơ thể và
cả thuốc kháng sinh. Vì vậy, vi khuẩn Gram âm nguy hiểm hơn vi
khuẩn Gram dương.
Hai nhóm vi khuẩn Gram [+] và Gram [-] được phân biệt bằng
cách nhuộm Gram, đặt theo tên nhà vi khuẩn học người Đan Mạch
đã tìm ra cách phân biệt chúng, Hans Christian Gram. Đây là bước

đầu tiên của mọi nghiên cứu về vi khuẩn học, đóng vai trò quan
trọng trong phác đồ điều trị bệnh nhiễm khuẩn.
Ngày nay, khi các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng phát
triển, kỹ thuật nhuộm Gram đã không còn là phương pháp phổ
biến trong phòng thí nghiệm vi sinh, bởi vì có một loại vi khuẩn mà
các nhà khoa học gọi là những vi khuẩn thứ ba, không phản ứng rõ
ràng với phương pháp nhuộm Gram như Chlamydia, Legionelles,
Pseudomonas, …


7

Từ những hạn chế nêu trên của kỹ thuật nhuộm Gram, chúng tôi
thực hiện đề tài “Thiết lập phản ứng Real time PCR phát hiện và
phân biệt vi khuẩn Gram [+] và Gram [-]”.

1.2

Mục tiêu đề tài
Đề tài nhằm mục tiêu thiết lập phản ứng Real time PCR để

phát hiện vả phân biệt vi khuẩn Gram [+] và Gram [-].

1.3

Ý nghĩa đề tài
Kỹ thuật Real-time PCR khắc phục được những mặt hạn chế của kỹ thuật

nhuộm Gram, với những ưu điểm sau: độ chính xác cao, ít sai sót do không phụ
thuộc quá nhiều vào thao tác của người thực hiện.

8

CHƯƠNG 2.

TỔNG QUAN

2.1 Tổng quan về vi khuẩn
2.1.1 Định nghĩa
Vi khuẩn là những đơn bào không có màng nhân, thuộc nhóm
Procaryote, có thể quan sát được bằng kính hiển vi. Là nhóm hiện
diện đông nhất trong sinh giới, vi khuẩn hiện diện khắp nơi trong
đất, nước và ở dạng cộng sinh với các sinh vật khác, có đầy đủ đặc
điểm của một vi sinh vật như khả năng tự tổng hợp chất dinh
dưỡng để phát triển và nhân lên.
Tổng sinh khối vi khuẩn trên Trái đất nhiều hơn tất cả các loài
thực vật và động vật cộng lại.

2.1.2 Đặc điểm
Vi khuẩn là loài vi sinh vật xuất hiện đầu tiên trên trái đất, 3.5
tỷ năm về trước. Đó là các vi sinh vật hóa thạch còn để lại vết tích
trong các tầng đá cổ, rất giống với vi khuẩn lam ngày nay.
Có kích thước rất nhỏ bé, phân bố khắp mọi nơi trên Trái đất
và có rất nhiều chủng loại. Trong quá trình tiến hóa lâu dài vi
khuẩn đã tạo cho mình những cơ chế điều hòa trao đổi chất để
thích ứng được với những điều kiện sống rất khác nhau, kể cả
những điều kiện bất lợi.

9

Vi khuẩn thiếu các bào quan như lục lạp và ty thể, và chúng
không có nhân thực sự như trong các tế bào nhân chuẩn. Thay vào
đó, nhân tế bào chỉ gồm một chuỗi ADN không có thành phần
protein và không có màng nhân. Vi khuẩn cũng có màng tế bào và
thành tế bào, thường được làm bằng peptidoglycan.
Sinh trưởng nhanh, phát triển mạnh. Phương thức sinh sản của
vi khuẩn là sinh sản vô tính bằng cách nhân đôi tế bào, số lượng tế
bào tăng lên theo cấp số nhân.

2.1.3 Phân loại vi khuẩn
Để phân loại khuẩn, các nhà khoa học đã căn cứ vào hình thái
và các đặc tính sinh học.
2.1.3.1 Phân loại theo hình dạng vi khuẩn
Mỗi loại vi khuẩn có hình dạng và kích thước nhất định, do
vách của tế bào vi khuẩn quyết định. Hình thái là một tiêu chuẩn
rất quan trọng đóng vai trò định hướng, đồng thời kết hợp với với
các yếu tố khác như tính chất sinh vật hoá học, kháng nguyên của
vi khuẩn và khả năng gây bệnh để phân loại vi khuẩn. Vi khuẩn có
rất nhiều hình dạng khác nhau, được chia làm 3 nhóm chính như
sau:
- Cầu khuẩn (cocci): là những vi khuẩn hình cầu, cũng có thể
hình hơi bầu dục hoặc hình ngọn nến. Khi 2 vi khuẩn hình
cầu đứng giáp nhau thì thường không tròn nữa mà chỗ tiếp
giáp thường dẹt lại.
- Trực khuẩn (bacillus): là những vi khuẩn hình que, hai đầu
tròn hoặc vuông, có thể 1 hoặc 2 đầu phình to.
- Xoắn khuẩn (spirillum): là những vi khuẩn hình sợi lượn sóng
và di động

10

Hình 2.1 Hình dạng vi khuẩn
A-Trực khuẩn; B-Liên cầu khuẩn; C-Tụ cầu khuẩn;
D-Song cầu khuẩn; E-Xoắn khuẩn; F-Phẩy khuẩn
2.1.3.2 Phân loại theo quá trình trao đổi chất
Dựa vào nguồn cacbon và nguồn năng lượng, người ta phân
loại vi khuẩn thành 4 kiểu sau:
-

Vi khuẩn quang tự dưỡng
Vi khuẩn hóa tự dưỡng
Vi khuẩn quang dị dưỡng
Vi khuẩn hóa dị dưỡng

2.1.3.3 Phân loại theo hình thức hô hấp
Dựa vào phản ứng với oxy, vi khuẩn có thể được xếp vào 3 nhóm:
-

Vi khuẩn hiếu khí: chỉ có thể mọc khi có sự hiện diện của

-

oxy.
Vi khuẩn kị khí: chỉ có thể mọc khi không có oxy.
Vi khuẩn hiếu khí/kị khí tùy ý: có thể mọc cả khi có hay
không có sự hiện diện của oxy.

2.1.3.4 Phân loại theo sự bắt màu thuốc nhuộm
Một công cụ quan trọng để phân loại vi khuẩn là nhuộm Gram.
Nhuộm Gram giúp phân vi khuẩn thành 2 nhóm: Gram [+] và


11

Gram [-], dựa vào thành phẩn cấu tạo và tính chất bắt màu của
vách tế bào vi khuẩn.
Vi khuẩn Gram [+]: bắt màu tím.
Vi khuẩn Gram [-]: bắt màu hồng đến đỏ.

2.2 Vi khuẩn Gram [+]
2.2.1 Định nghĩa
Vi khuẩn Gram [+] là vi khuẩn có thể giữ lại màu nhuộm sau
khi khử màu do có lớp peptidoglycan dày trong thành tế bào. Bằng
cách nhuộm với crystal violet, vi khuẩn Gram [+] được phát hiện
bắt màu tím khi quan sát qua kính hiển vi [9].
Một số vi khuẩn Gram [+]: Streptococcus, Clostridium,
Lactobacillus, Bacillus cereus, Enterococcus feacalis,...

2.2.2 Đặc điểm
Thành tế bào là lớp đơn, thẳng, đều, kém đàn hồi và cứng hơn.
Độ cứng của thành tế bào là do số lượng peptidoglycan nhiều,
chiếm khoảng 80%. Thành tế bào của vi khuẩn gram dương có axit
muramic, chiếm khoảng 16-20% tổng trọng lượng khô của tế bào
và thậm chí thành tế bào có khả năng kháng kiềm, có chứa axit
teichoic [9].
Các vi khuẩn Gram dương tạo ra ngoại độc tố (exotoxins). Ví
dụ: vi khuẩn Clostridium botulinum phát triển trong thực phẩm đến

một số lượng đủ lớn rồi mới sinh nội độc tố botulin (gây ngộ độc
thịt) [8].
Vi khuẩn Gram dương mẫn cảm với kháng sinh hơn, do thiếu
lớp màng ngoài.
Hàm lượng lipid chỉ ở mức 1-4%.


12

2.2.3 Cấu trúc vách tế bào

Hình 2.2 Cấu trúc vách tế bào vi khuẩn Gram [+]
Vách tế bào Gram [+] rất dày khoảng 20-80nm, gồm một lớp
peptidoglycan còn được gọi là murein chiếm 80%-90% thành phần
vách tế bào. Peptidoglycan là loại polime xốp, không tan, khá cứng
và bền vững bao quanh tế bào như một mạng lưới.
Cấu trúc cơ bản của peptidoglycan gồm 3 thành phần: Nacetylglucosamine

(NAG),

acid

N-acetylmuramic

(NAM)

và

tetrapeptide gồm cả loại L và D acid amine. Bên trong lớp
peptidoglycan là acid teichoic - hợp chất polymer của ribitolphosphate và glycerol phosphate - một thành phần đặc trưng của

tế bào vi khuẩn Gram [+] vừa liên kết với peptydoglycan vừa liên
kết với màng sinh chất. Phần liên kết với peptidoglycan gọi là acid
lipoteichoic.

2.3 Vi khuẩn Gram [-]
2.3.1 Định nghĩa
Vi khuẩn Gram [-] là nhóm vi khuẩn không giữ được màu
nhuộm tím (crystal violet) sau bước khử màu trong quá trình
nhuộm Gram, vì trong giai đoạn khử màu, cồn sẽ phân hủy màng
ngoài của vi khuẩn Gram âm, làm cho thành tế bào xốp hơn,


13

không giữ lại được màu tím. Lớp peptidoglycan của vi khuẩn Gram
[-] mỏng hơn, nằm giữa màng sinh chất và màng ngoài của vi
khuẩn, làm cho chúng bắt màu của safranin. Vì vậy, khi quan sát
dưới kính hiển vi vi khuẩn sẽ có màu đỏ hoặc hồng [9].
Một số vi khuẩn Gram [-]: Vibrio, Rhizobium, Escherichia coli,
Acinetobacter baumannii, …

2.3.2 Đặc điểm
Ở vi khuẩn Gram âm, thành tế bào có hai lớp, lượn sóng,
không đồng đều và đàn hồi hơn và ít cứng hơn trong đó độ đàn hồi
của thành tế bào là do lượng peptidoglycan ít hơn, khoảng 2-12%.
Thành tế bào của vi khuẩn Gram âm nhạy cảm với kiềm, axit
muramic chỉ chiếm 2-5% tổng trọng lượng khô và axit teichoic
không có trong thành tế bào [9].
Vi khuẩn Gram âm tạo ra nội độc tố (endotoxins). Ví dụ: vi
khuẩn Vibrio cholerae sau khi xâm nhập vào cơ thể sẽ tiết ra độc tố cholera toxin và

gây bệnh dịch tả [8].
Ít mẫn cảm với kháng sinh hơn do có lớp màng ngoài bảo vệ.
Hàm lượng lipid rất cao khoảng 11-22%.

2.3.3 Cấu trúc vách tế bào


14

Hình 2.3 Cấu trúc vách tế bào vi khuản Gram [-]
Vách tế bào G- mỏng hơn vách tế bào G+, dày khoảng 510nm, có cấu trúc phức tạp gồm 2 lớp. Trong cùng là một lớp
peptidoglycan mỏng, cách một lớp không gian chu chất và tới lớp
màng ngoài (outer membrane) là phức hợp lipidpolysaccharide
gồm lipoprotein và lipopolysaccharide.
Màng ngoài có cấu trúc gần giống tế bào chất nhưng
phospholipid hầu như chỉ gặp ở lớp trong, còn ở lớp ngoài là
lipopolysaccharide dày khoảng 7.5-10 nm gồm 3 thành phần:
+

Lipid

A.

+

Polysaccharide

lõi.

+

Kháng
Màng

ngoài

nguyên
còn

có

thêm

O.
các

protein:

+ Protein cơ chất: porin ở vi khuẩn còn gọi là protein lỗ xuyên
màng với chức năng cho phép một số phân tử đi qua như
dipeptide,

disaccharide,

các

ion

vô

cơ…

+ Protein màng ngoài: chức năng vận chuyển một số phân tử riêng
biệt và đưa qua màng ngoài như: nucleotide, vitamin B12,…
+ Lipoprotein: đóng vai trò liên kết lớp peptidoglycan bên trong với
lớp màng ngoài

2.4 Các phương pháp phân loại vi khuẩn Gram dương
và Gram âm
2.4.1 Kỹ thuật nhuộm Gram
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân
biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm (Gram dương và Gram âm)
dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào.


15

Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó vào
năm 1884, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram.
2.4.1.1 Nguyên tắc
Dựa trên sự khác nhau giữa vách tế bào. Vi khuẩn Gram [+] có
thành tế bào dày, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan, chất này
có khả năng giữ phức hợp tím tinh thể không bị tẩy màu bởi cồn.
Trong khi đó, lớp thành tế bào peptidoglycan của vi khuẩn Gram [-]
mỏng hơn và có thêm màng lipopolysaccharide (LPS) bên ngoài
nên không đủ sức giữ được màu của phức hợp tím tinh thể.

Hình 2.4 Nguyên tắc kỹ thuật nhuộm Gram dựa vào sự khác
nhau giữa vách tế bào vi khuẩn Gram [+] và Gam [-]
2.4.1.2 Cách thực hiện:

-

Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm. Dùng que cấy lấy một ít
vi khuẩn hòa vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến

-

kính.
Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn.
Dùng thuốc nhuộm tím tinh thể nhuộm mẫu trong 1

-

phút.
Rửa nước tối đa 5 giây.
Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút.
Rửa bằng nước trong 10 giây.
Phủ lên mẫu với ethanol 96o vài lần cho đến khi không
xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút). Dung


16

dịch này sẽ rửa sạch thuốc nhuộm kiềm không kết gắn,
vi khuẩn Gram dương giữ lại màu tím, còn vi khuẩn
-

Gram âm mất màu.
Rửa nước.
Nhuộm tiếp với safranin . Cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt

giữ thuốc nhuộm lần này, nhưng vi khuẩn Gram dương
không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram
âm trở nên hồng. Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới

-

nhất.
Rửa qua nước. Để khô

Hình 2.5 Quy trình nhuộm Gram
2.4.1.3 Kết quả:
Quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt
màu tím, Gram âm bắt màu hồng.
Giải thích: Tế bào vi khuẩn trước hết được nhuộm với thuốc nhuộm tím
Crystal violet, sau đó là dung dịch Lugol, tạo thành phức chất tím-iod bên trong
thành tế bào. Khi tẩy cồn, lớp lipit ở màng ngoài của vi khuẩn Gram [-] bị hòa tan
làm tăng tính thấm của màng và làm rửa trôi phức tím-iod, vi khuẩn Gram [-] trở lại


17

không màu. Khi nhuộm bổ sung Safranin, tế bào sẽ bắt màu thuốc nhuộm này (màu
đỏ). Ở vi khuẩn Gram [+], cồn làm cho các mao quản trong peptidoglycan co lại, do
đó phức chất tím-iod bị giữ lại trong thành tế bào và vi khuẩn chỉ bắt màu tím của
Crystal violet.

Hình 2.6 Cầu khuẩn Gram [+] và Trực khuẩn Gram [-]
2.4.1.4 Ưu điểm, nhược điểm:
Ưu điểm:
- Cho kết quả nhanh

- Dễ thực hiện
Nhược điểm:
- Những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi
khuẩn Gram [+] nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram
[-], đó là:
• Phết vi khuẩn ở lứa cấy quá già (trên 24h), cấu trúc vách
vi khuẩn Gram [+] không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ,
•

do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của cồn.
Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất
đi iod. Trường hợp này có thể nhận biết khi dung dịch

•

lugol không còn sậm màu.
Tẩy màu bằng cồn quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram [+]
cũng bị tẩy màu.


18

- Những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi
khuẩn Gram [-] nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram
[+], đó là:
• Phết vi khuẩn quá dày làm cho cồn không thể tẩy màu
toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm.
• Tẩy màu bằng cồn quá nhanh hay dung dịch cồn bị pha
quá loãng làm cho màu không được tẩy khỏi tế bào vi
khuẩn.

2.4.2 Kỹ thuật sinh học phân tử
2.4.2.1 Phương pháp PCR
Kỹ thuật nhân DNA đặc hiệu, còn gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp hay kỹ
thuật PCR (polymerase chain reaction) được Karl Mullis và cộng sự phát minh vào
năm 1985 đã đem lại một cuộc cách mạng trong di truyền học phân tử. Đây là một
kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao)
một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men.
PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích
khác nhau như: phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chuẩn đoán những bệnh
nhiễm trùng, tách dòng gene và xác định huyết thống.
Sự ra đời của kỹ thuật khuếch đại DNA bằng PCR đã có tác động lớn đến tốc
độ và độ chính xác trong xác định một loài hoặc một chủng vi khuẩn. Thay vì dựa
vào các xét nghiệm kiểu hình tiêu tốn thời gian và chủ quan, giờ đây người ta có thể
nhanh chóng khuếch đại các vùng gen vi khuẩn cụ thể bằng PCR và so sánh chúng
ở cấp độ trình tự và các trình tự sẵn có trên ngân hàng gen.
Năm 2000, phương pháp Nested PCR đã được phát triển để phát hiện và
phân biệt giữa 14 loại vi khuẩn Gram [+] và Gram [-], dựa trên các trình tự được
bảo tồn của gen ribosome 16S. Các đoạn mồi được thiết kế sao cho các sản phẩm có
kích thước khác nhau sẽ được tạo ra, để tạo điều kiện cho việc phân loại Gram rõ
ràng. PCR đặc hiệu cho vi khuẩn Gram [-] sẽ tạo ra một sản phẩm khuếch đại 985
bp và một sản phẩm 355 bp đặc trưng cho vi khuẩn Gram [-]. Các sản phẩm được


19

phát hiện bằng điện di trên gel. Việc xác định hoàn thành trong 3,5 giờ. Ở thời điểm
này thì đây là một xét nghiệm chẩn đoán nhanh trong việc xác nhận chẩn đoán
nhiễm trùng và cũng xác định tình trạng Gram của vi khuẩn có độ đặc hiệu và độ
nhạy cao [10].

2.4.2.2 Phương pháp Real-time PCR
Real-time PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển
thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng. Vì vậy người làm thí nghiệm không
cần thiết phải làm tiếp các thí nghiệm đọc và phân tích kết quả nhằm xác định có
sản phẩm khuếch đại hay không.
Năm 2003, phương pháp Real-time PCR được sử dụng để phát hiện phân
biệt vi khuẩn Gram [+] và Gram [-], các mồi khuếch đại vùng 16S của DNA vi
khuẩn. Các mồi PLK1 (5-TAC GGG AGG CAG CAG T-3) và PLK2 (5-TAT TAC
CGC GGC TGC T-3), các tác nhân đầu dò quá trình lai DNA gắn huỳnh quang
ISN2 (5-CCG CAG AAT AAG CAC CGG CTA ACT CCG T-3) và ISP2 (5-CCT
AAC CAG AAA GCC ACG GCT AAC TAC GTG-3) phát ra ánh sáng ở các bước
sóng khác nhau (640nm-705nm) và có thể được sử dụng để phát hiện và phân biệt
nhuộm Gram [+] hay Gram [-] của DNA vi khuẩn bằng tín hiệu huỳnh quang [13].
Các sản phẩm PCR được lai với hai đầu dò lai có nhuộm
huỳnh quang chỉ liên kết riêng với vi khuẩn Gram [+] hoặc Gram
[-]. Các tín hiệu huỳnh quang khác nhau (640nm và 705nm) có thể
được máy khuếch đại phát hiện và cho phép phân biệt vi khuẩn
Gram. Các đầu dò lai hóa huỳnh quang cho phép phát hiện nhanh
lượng DNA vi khuẩn thấp và phân loại vết Gram chính xác, giúp
các nhà lâm sàng quyết định nhanh phác đồ điều trị và cho phép
sử dụng kháng sinh sớm hơn [13].
Năm 2011, hai phương pháp Real-time PCR sử dụng Taqman
probes và màu huỳnh quang (SYBR GREEN) được dùng để phân
biệt 31 tác nhân gây bệnh (20 Gram dương và 11 Gram âm). Các


20

kỹ thuật Real-time PCR này đã chứng minh mối tương quan tốt với
kết quả đã được chứng minh trước đó. Bằng cách sử dụng phương

pháp này, việc phát hiện vi khuẩn đã được cải thiện từ 47,6% lên
95,3%, cho thấy chúng là các xét nghiệm nhạy cảm, nhanh chóng
trong chẩn đoán bệnh [11].

2.5 Kỹ tuật Real-time PCR
2.5.1 Nguyên tắc
Real-time PCR,cũng dựa trên,PCR thường, nhưng phương pháp,này có thể
,định lượng được,hàm lượng DNA/RNA,có trong mẫu nhờ,các chất nhuộm,phát
huỳnh quang. Sau khi nhân bản, các sản phẩm, PCR mục tiêu,sẽ được theo,dõi hàm
lượng theo, một thời gian, thật của phản ứng.

Hình 2.7 Nguyên tắc kỹ thuật Real-time PCR
Thông thường một, chu trình, Real-time PCR gồm, ba bước:
• Bước 1: Biến, tính


21

Nhiệt độ phản, ứng là 94oC trong, 30 giây đến 1 phút, hai mạch DNA,
khuôn bị, biến tính, duỗi xoắn, và tách ra.
• Bước 2: Bắt, cặp
Nhiệt độ được, hạ thấp xuống, nhiệt độ Ta (nhiệt độ bắt cặp) của mồi,
khoảng 40-70oC trong, 30 giây đến 1 phút, cho phép các, mồi bắt cặp, vào
khuôn.
• Bước 3: Kéo dài
Nhiệt độ tăng, lên 72oC, là nhiệt độ thích, hợp nhất cho, enzyme DNA
, polymerase để hoạt, động tổng hợp, mạch mới từ, đoạn mồi. Thời gian này
tùy thuộc, độ dài của, trình tự DNA, cần khuếch đại (từ 30 giây, đến và
phút).

2.5.2 Các thành phần trong phản ứng Real-time PCR
Một phản ứng Real-time PCR thường gồm 6 thành phần cơ bản:
2.5.2.1 DNA mạch khuôn
DNA mạch đôi hay mạch đơn đều có thể là nguồn vật chất ban đầu cho phản
ứng PCR, chúng được tách chiết từ tế bào thực vật, động vật, vi khuẩn hoặc virus.
Ngoài ra, RNA cũng là một nguồn vật liệu cho phản ứng khuếch đại nếu nó được
phiên mã thành cDNA. Nồng độ DNA ban đầu trong phản ứng không được quá cao,
có thể chỉ cần một phân tử DNA ban đầu cho một phản ứng PCR ở khoảng 10 5 bản
sao.
2.5.2.2 Mồi
Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR, có vai
trò làm mồi cho hoạt động kéo dài mạch của enzyme DNA polymerase. Do đó, việc
thiết kế mồi phải thật chính xác, tránh ảnh hưởng đến hiệu quả và độ chuyên biệt
của phản ứng. Nồng độ mồi trong mỗi phản ứng phải được tính toán ối ưu bằng
thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch đại kí sinh,


22

ngược lại sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao. Giới hạn nồng độ
mồi thường là 0.1-1µl.
Thiết kế phải tuân thủ những nguyên tắc sau:
-

Nhiệt độ tan chảy của mồi xuôi và mồi ngược không khác nhau quá 5oC.
Tránh sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược.
Tránh các cấu trú kẹp tóc trong thành phần mỗi mồi.
Thành phần nucleotide của mồi phải cân bằng.
Tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
Thành phần GC khoảng 40-60%.

Trình tự mồi phải đặc trưng cho trình tự DNA cần nhân bản.

2.5.2.3 Enzyme Taq polymerase
Enzyme Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn Thermus
aquaticus, sống ở các suối nước nóng. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ
biến tính. Ngày nay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với
nhiều chức năng chuyên biệt và hoàn thiện hơn. Tth polymerase là một enzyme tách
chiết từ Thermus themophilus có khả năng hoạt động như một enzyme phiên mã
ngược khi có mạch RNA khuôn và ion Mg ++, nhưng với sự hiện diện của DNA
khuôn và MG++, Tth polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA.
2.5.2.4 MgCl2
Có vai trò là một cofactor cho enzyme DNA polymerase hoạt động. Ngoài ra,
mồi; DNA bản mẫu; dNTPs, EDTA cũng có thể liên kết với MgCl 2 và do đó sẽ cạnh
tranh với DNA polymerase. Nếu nồng độ MgCl 2 cao sẽ dẫn đến hiện tượng khuếch
đại kí sinh. Vì vậy, phải thiết kế nồng độ MgCl 2 tối ưu nhất cho từng phản ứng PCR
cụ thể, thông thường từ 1.5-4mM.
2.5.2.5 Dung dịch đệm
Dung dịch đệm bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8.3), KCl. Thành
phần và nồng độ dung dịch đệm tùy thuộc vào loại DNA polymerase. Dung dịch
đệm có vai trò trong việc tạo sự kết hợp giữa các dNTP, kích hoạt DNA polymerase.
Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh đến tính đặc hiệu và hiệu suất phản ứng.


23

2.5.2.6 dNTPs
Gồm bốn loại nucleotide được dùng trong phản ứng PCR là: dATP, dTTP,
dGTP, dCTP. Nồng độ của mỗi loại nu trong mỗi phản ứng là 200-250mM. Nếu
nồng độ dNTPs cao hơn sẽ làm giảm hiệu quả khuếch đại phản ứng PCR và sự mất
cân bằng nồng độ giữa các loại nu sẽ làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.

2.5.3 Các kiểu phản ứng Real-time PCR
2.5.3.1 Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng màu huỳnh quang
Nguyên tắc
Màu huỳnh quang, chèn vào sợi, đôi DNA có ái, lực rất cao khi, có sự hiện
diện của sợi đôi DNA và ái lực này làm cho sợi đôi phát được ánh sáng, huỳnh
quang khi nhận được là nguồn sáng kích thích. Do đó, cho nên sau mỗi chu, kỳ
phản ứng, máy sẽ xác định, được cường độ, ánh sáng huỳnh, quang phát ra, tăng
lên.
Cơ chế hoạt động
Khi có sự hiện diện của sản phẩm khuếch đại, màu huỳnh quang sẽ bị chèn
vào và tập trung trên các sợi đôi DNA của sản phẩm khuếch đại, sẽ phát tín hiệu
huỳnh quang khi bị chiếu bởi nguồn sáng kích thích.

Hình 2.8 Cơ chế hoạt động của SYBR GREEN


24

Lúc đầu ethidium bromide được sử dụng bản chất ethidium bromide cho
phãn ứng real-time PCR này, nhưng được thay thế bởi SYBR Green vì gây ung thư
nên hạn chế sử dụng.
Mọi DNA mạch đôi hiện diện phẩm không đặc hiệu trong phản ứng thì trong
phản ứng đều có khả năng bắt màu và phát huỳnh quang nên nếu có các sản sự định
lượng trở nên không chính xác. Để phát hiện các sản phẩm không đặc hiệu trong
phản ứng, người ta xây các biện pháp khắc phục dựng một đường cong “nóng chảy”
(melting curve) bằng cách nâng nhiệt độ phản ứng và đo giá trị cường thời điểm
nhiệt độ ánh sáng huỳnh quang phát ra tại các độ khác nhau. Nhiệt độ nóng chảy
của phân tử DNA phụ thuộc vào số lượng và thành trình tự DNA mục tiêu phần
nucleotide. Do đó, dựa vào đường cong “nóng chảy”, ta có thể phát hiện sự hiện

diện của các sản phẩm không đặc hiệu và tiến hành. Các biện pháp khắc phục rất đa
dạng sao cho việc nhân bản là như: thiết kế primer sao cho hiệu quả bắt cặp với là
tối ưu, khảo sát nồng độ các thành phần tham gia phản ứng như: Taq polymerase,
MgCl2, dNTP… hoàn toàn đặc hiệu.
Ưu điểm: được dùng để theo dõi sự khuếch đại bất cứ phân tử mạch đôi DNA
nào; không cần đầu dò nên giảm quy trình chuẩn bị cũng như giá thành.
Nhược điểm: có thể dương tính giả vì không phân biệt được sản phẩm không
đặc hiệu
2.5.3.2 Kỹ thuật Real-time PCR sử dụng Taqman probe
Nguyên tắc
Trong kỹ thuật này, ngoài các đại đặc hiệu từ DNA đích thành phần cơ bản
còn chứa hai thành phần quan trọng để probe có thể phát huỳnh quang được khi có
sự hiện diện của sàn phẩm khuếch, đó là:
-

Taqman probe: là những oligonucleotides có trình tự bổ
sung với một trình tự đặc hiệu trên DNA đích i là reporter)
còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng (gọi là


25

quencher) để hấp phụ được ánh và trình tự này dài khoảng
24-30 bases với đầu 5’ có gắn chất phát huỳnh quang (gọi
-

là reporter) còn đầu 3’ có gắn chất hấp phụ tương ứng.
Enzyme Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’exonuclease để
có khả năng thủy giải cắt bỏ probe khi probe này bắt cặp
khi enzyme kéo dài mồi tổng hợp sợi bổ sung, lên sợi

khuôn và tổng hợp sợi bổ sung cản đầu 3’ của mồi khi
enzyme kéo dài mồi
Cơ chế hoạt động
Khi chưa có sự nguyên vẹn do vây mà huỳnh quang phát xuất hiện của sản

phẩm khuếch đại đặc hiệu từ DNA đích thì Taqman probe vẫn còn ra được từ
repoter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ của prode hấp phụ được huỳnh quang khi
nhận được nguồn sáng kích, ống thử nghiệm sẽ không phát thích.
Khi bắt đầu có sự xuất hiện nhiệt độ bắt cặp và sẽ bị enzyme Taq polymerase
sản phẩm khuếch đại đặc hiệu thì Taqman probe sẽ bắt cặp vào sợi khuôn của sản
phẩm này ở giai đoạn cắt bỏ để kéo dài mổi tổng hợp nên sợi bổ sung, do vậy mà
reporter của Taqman probe sẽ bị nhận được nguồn sáng kích thích, cắt rời xa
quencher và phát được huỳnh quang khi.