Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC pdf

Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ
thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC
Phạm Hùng Vân*
(1)
, Bành Vũ Điền
(2)
, Võ Đức Xuyên An
(3)
, Nguyễn Thị Minh Thư
(3)
, Lê Thị Phi Yến
(3)
,
Đỗ Thị Thanh Thủy
(1)
, Hòang Hiếu Ngọc
(1)

Tóm tắt
Đặt vấn đề: Để có thể tiên đóan được hiệu quả điều trị đặc hiệu và quyết định được thời gian điều trị đặc hiệu cho
bệnh nhân viêm gan mạn tính do nhiễm HCV, các nhà điều trị cần phải có thông tin về kiểu gen của HCV trên bệnh
nhân. Trước đây, xét nghiệm xác định kiểu gen HCV phải được gửi sang Singapore để thực hiện với giá thành khá
cao: trên 180USD/mẫu thử.
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của thử ngiệm RT real-time
PCR sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của virus để định genotype HCV.
Phương pháp nghiên cứu: Từ đầu năm 2006, các tác giả đã xây dựng được phương pháp xác định kiểu gen của
HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và
taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của HCV rồi sau đó so sánh với các trình tự của trong một thư viện các kiểu gen
HCV để xác định được kiểu gene của HCV.
Kết quả nghiên cứu: Từ tháng cuối 5/2006 đến cuối tháng 9/2006, các tác giả đã áp dụng phương pháp này để xác
định kiểu gen HCV cho 234 trường hợp co kết quả thử nghiệm RT real-time PCR dương tính HCV-RNA, kết quả

ghi nhận được cho thấy có đến 55% các mẫu là thuộc genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9% genotype 2, 6%
genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, và <1% là thuộc genotype
2b. Tuy kết quả cho thấy đa số kiểu gen của HCV tập trung ở genotype 1b và 6a, nhưng các tác giả cho là kết quả
này chưa thể phản ảnh thật sự phân bố tỷ lệ kiểu gen HCV trên các người nhiễm HCV tại Việt Nam vì các mẫu thử
được nghiên cứu có thể đa số được lấy từ các bệnh nhân đang trong quá trình điều trị đặc hiệu chứ không phải trước
khi bắt đầu điều trị, và trong số các bệnh nhân này có thể có nhiều bệnh nhân đã bị thất bại điều trị đặc hiệu.
Kết luận: Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ thử
nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC là tiếp cận thích hợp nhất có thể áp dụng
trong chẩn đóan lâm sàng nhiễm HCV trước khi bác sĩ quyết định cho chỉ định điều trị đặc hiệu.
Abstract
Genotyping of HCV by direct sequencing the PCR product coming from the RT realtime PCR using primers
and taqman probe specific to the 5’NC of the virus.
Background: In order to predict the effect of the specific treatment as well as to decide the duration of the specific
treatment given on the chronic hepatitis patients causing by HCV infection, the physicians need to have in hand the
information about the genotype of HCV in the patients’ sera. In the past, such required tests had be done in
Singapore with the high cost: more than 180USD/test.
Objectives: Set-up the method to do the direct sequencing of the PCR product coming from the RT realtime PCR
using primers and taqman probe specific to the 5’NC of the virus for genotyping of HCV
Methods: Started from 2006, the authors have developed the direct sequencing of the PCR product coming from the
RT real-time PCR using primer and taqman probe targetted the 5’NC of the viral genome and align the detected
sequence to the library of HCV genotype sequences to get the result of HCV genotyping.
Results: From end of 5/2006 to end of 9/2006, the authors applied this approach to do the genotype of 234 sera
samples that were HCV-RNA positive detected by RT real-time PCR, and the received results revealed that 55%
were belong to genotype 1b, 20% to genotype 6a, 9% genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2% genotype 1,
1% genotype 1a/1b, 1% genotype 2a/2c, and <1% were belong to genotype 2b. Although the received results have
demonstrated that the majority of the samples were belong to HCV genotype 1b and 6a, the authors have believed
that this does not reflect the real distribution of the incidence of the genotype of HCV among the HCV infected
patients in Viet Nam since the studied samples may be mostly collected from treated patients, not from new patients,
and among these treated patients there were many failure with the treatment.
Conclusions: Genotyping HCV by direct sequencing the PCR products of the RT real-time PCR using primers and

taqman probe specific to the 5’NC is the most appropriate approach that can be applied in clinical diagnosis of HCV
infection prior the specific treatment prescription
Đặt vấn đề
Xác định genotype virus viêm gan C (HCV) là
một chỉ định rất cần thiết trước khi bác sĩ điều trị
tiến hành cho chỉ định điều trị đặc hiệu viêm gan
C vì thời gian điều trị kéo dài bao lâu là tuỳ thuộc
vào type virus viêm gan C mà bệnh nhân đang
nhiễm
[1]
. Hiện nay, trên thế giới có 2 phương pháp
1*
Tác giả chính,
()
Đại Học Y Dược,
(2)
Bệnh Viện Chợ Rẫy,
(3)
Công ty Nam Khoa
1
xác định genotype viêm gan C dựa vào phân tích
một vùng đặc trưng trên vùng 5’NC của bộ gen
HCV đã được nhiều nhà nghiên cứu cũng như lâm
sàng chấp nhận và được thực hiện tại các phòng
thí nghiệm lâm sàng, đó là phương pháp lai trên
vạch dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)
[2]
và phương pháp giải trình tự trên máy Trugene
[3]
.

Tuy nhiên vì hai phương pháp này có giá thành
khá cao nên khó có thể được chỉ định rộng rãi dù
tại Việt Nam tỷ lệ lưu hành HCV là khá cao trên
thế giới (5-8% người bình thường có nhiễm HCV)
[4,5]
và dĩ nhiên đi kèm theo đó là số lượng bệnh
nhân bị viêm gan mạn tính cần phải được điều trị
và theo dõi điều trị khá cao do nhiễm HCV có thể
dẫn đến một tỷ lệ khá cao bị xơ gan và ung thư
gan (4%)
[6]
. Để có thể giúp các nhà lâm sàng có
thể cho chỉ định xác định genotype HCV dễ dàng
hơn, việc tìm kiếm một kỹ thuật xác định
genotype HCV mà không phải sử dụng kỹ thuật
giải trình tự của Trugene và kỹ thuật InoLIPA với
giá thành thấp hơn mà vẫn đạt độ chính xác và
nhạy cảm cao là một việc làm rất cần thiết và đây
cũng mục tiêu chính của đề tài nghiên cứu này của
chúng tôi.
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Các mẫu huyết thanh được đưa vào nghiên cứu
là các mẫu đã xác định và định lượng được HCV-
RNA bằng kỹ thuật real-time PCR thực hiện tại
phòng thí nghiệm R&D của công ty Nam Khoa
với kết quả [+]. Các mẫu này được nhiều phòng
thí nghiệm tại TP. Hồ Chí Minh gửi đến phòng thí
nghiệm R&D của công ty với yêu cầu phát hiện và
định lượng HCV-RNA. Để phát hiện và định
lượng được HCV-RNA, phòng thí nghiệm sử

dụng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR
(reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman
probe) do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ thử
nghiệm này bao gồm một bộ RNAPREP để trích
biệt RNA từ các mẫu huyết thanh theo phương
pháp Chomzynski và Sacchi (số đăng kí chất
lượng: 03200/2001/CBTC-TĐC), bộ cDNA
synthesis hai bước để tổng hợp cDNA từ RNA với
mồi ngẫu nhiên, và bộ TQ real-time PCR mix để
phát hiện và định lượng HCV cDNA bằng phương
pháp real-time PCR dùng taqman probe và mồi
đặc hiệu một đọan đích 240-245bp nằm ở vùng
5’NC của bộ gen HCV (số đăng kí chất lượng:
03201/2001/CBTC-TĐC). Thử nghiệm real-time
PCR được thực hiện trên máy IQ5 của Biorad.
Phương pháp định lượng theo hướng dẫn của bộ
thử nghiệm. Có thể tóm tắt như sau: là trước hết
xây dựng đường chuẩn về mối liên hệ tuyến tính
giữa các nồng độ ban đầu của HCV cDNA chuẩn
(được pha từ mẫu HCV cDNA chuẩn được cung
cấp từ Khoa Sinh, trường Royal Holloway, Đại
Học Luân Đôn) với chu kỳ ngưỡng và sử dụng
đường biểu diễn này để tính được nồng độ ban
đầu của HCV cDNA có trong mẫu thử. Các mẫu
sản phẩm real-time PCR cho kết quả real-time
PCR [+] được làm tinh sạch để thu nhận sản phẩm
PCR với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR
(PCR clean-up kit) do Promega sản xuất (Cat.
#A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được
điện di và định lượng nồng độ DNA bằng máy

Gentquant của Pharmacia. Sau đó, thực hiện phản
ứng giải trình tự sản phẩm PCR đã tinh sạch và
xác định nồng độ ở trên với PCR sequencing mix
của Becman (DTCS: Dye Terminator Cycle
Sequencing) với primer một chiều đặc hiệu tương
thích do phòng R&D của công ty Nam Khoa thiết
kế. Sản phẩm giải trình tự được làm tủa và tinh
sạch bằng phương pháp tủa với ethanol. Cuối cùng
thực hiện giải trình tự trên máy sequencer
CEQ8000 của Becman Coulter. Kết quả giải trình
tự được phân tích trên phần mềm phân tích giải
trình tự của CEQ8000. Cuối cùng, đăng nhập trình
tự giải được lên NCBI blast qua internet để so
sánh với gene bank và lên local blast của phân
mềm miễn phí bio-edit để so sánh với thư viện
HCV genotype mà chúng tôi tự tạo để có được kết
quả genotype.
Kết quả
Trong thời gian từ 24/05/06 đến 30/09/06, có tất
cả 234 mẫu huyết thanh dương tính HCV-RNA
qua xét nghiệm RT realtime PCR dùng mồi và
taqman probe đặc hiệu 5’NC được thực hiện với
qui trình trên. Tất cả 234 mẫu HCV-RNA dương
tính này cũng đã được chúng tôi đồng thời xác
định genotype của HCV. Kết quả định lượng
tương ứng với kết quả xác định genotype được
trình bày trong bảng 1. Phân tích các kết quả trình
bày trong bảng 1 chúng ta thấy 100% các mẫu
cho kết quả phát hiện và định lượng dương tính
HCV-RNA đều cho được kết quả định được

genotype HCV dù kết quả định lượng có thấp đến
mức tối thiểu (là 445copies/ml huyết thanh trong
nghiên cứu này). Kết quả này cho phép nhận định
là phương pháp định genotype HCV bằng giải
trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của phản ứng
real-time PCR dùng taqman probe mà chúng tôi
xây dựng đạt được độ nhạy cao tương đương
phương pháp RT TQ real-time PCR mà công ty
Nam Khoa đã phát triển và hiện đang được sử
dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng
có trang bị real-time PCR. Trong phương pháp RT
TQ real-time PCR này, nồng độ HCV RNA ban
đầu có trong mẫu thử được định lượng nhờ qui
chiếu chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử lên trên
đường biểu diễn chuẩn.
2
Biểu đồ 1 trình bày tỷ lệ phần trăm các genotype
HCV của 234 mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết
quả cho thấy có đến 55% các mẫu là thuộc
genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9%
genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2%
genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype
2a/2c, và <1% là thuộc genotype 2b.
Biểu đồ 2 trình bày đường biểu diễn khuếch đại
và đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa
chu kỳ ngưỡng (Ct) với nồng độ HCV cDNA
chuẩn ban đầu, kết quả cho thấy thử nghiệm TQ
real-time PCR trên các mẫu HCV cDNA chuẩn
đạt độ chính xác khá cao thể hiện qua R ≥0.99 và
hiệu quả PCR trong khỏang 90% - 105%. Biểu đồ

3 minh họa một kết quả TQ real-time PCR phát
hiện chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử với bảng 2
đính kèm tính tóan nồng độ HCV RNA ban đầu có
trong các mẫu thử đó. Lưu í là chúng tôi luôn điều
chỉnh để ngưỡng nền (baseline threshold) đường
biểu diễn khuếch đại trong các mẫu luôn tương
đương với ngưỡng nền của đường biểu diễn
khuếch đại của mẫu chuẩn.
Trong kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm
PCR, kết quả chỉ có thể tốt khi có sản phẩm PCR
thuần nhất, không bị các sản phẩm phụ. Hình 1
3
Bảng 1: Kết quả định genotype so với kết quả định lượng
Kết quả định lượng
copies/ml
Số mẫu Genotype(số mẫu)
100 – 999 1
*
1b(1)
1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(1), 2a/2c(1), 6a(1)
10.000 – 99.999 57 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1), 6a(11)
100.000 – 999.999 123 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30)
1.000.000 – 9.999.999 37 1a(1), 1b(27), 2(5), 6a(4)
10.000.000 – 99.999.999 2
**
1(1), 1b(1)
Tổng cộng 234 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2), 2a/2c(2), 6a(46)
*
mẫu có kết quả định lượng thấp nhất là 445copies/ml huyết thanh.
**

mẫu cao nhất có kết quả định lượng là 13.792.596 copies/ml.
Biểu đồ 1: Biểu đồ cho thấy các tỷ lệ % các
genotype HCV trong 234 mẫu huyết thanh thử
nghiệm
Biểu đồ 2: (A) trình bày đường biểu diễn khuếch đại
và chu kỳ ngưỡng (Ct) của các nồng độ ban đầu của
các HCV cDNA chuẩn. (B) trình bày đường biểu diễn
chuẩn về mối quan hệ giữa Ct với nồng độ ban đầu
của HCV cDNA
(A)
(B)
Biểu đồ 3: Trình bày đường biểu diễn khuếch đại và Ct
của 13 mẫu. Lưu là đường ngưỡng nền (baseline
threshold đã được điều chỉnh để đạt 199.73 như là
ngưỡng nền của đường biểu diễn khuếch đại của các
mẫu chuẩn (biểu đồ 2-A)
Bảng 2: Trình bày Ct của 13 mẫu và nồng dộ HCV-RNA ban đầu có trong các mẫu. Nồng độ này được tính tóan dựa trên các thông số slope và Int
của đường biểu diễn chuẩn ở trên
Type Ident. Ct
Nồng độ HCV-RNA
(copies/ml)
Type Ident. Ct
Nồng độ HCV-RNA
(copies/ml)
Unkn 4492 25.38 409,173 Unkn 4483 30.75 13,027
Unkn 4488 N/A Unkn 4482 N/A
Unkn 4487 31.82 6,554 Unkn 4490 27.61 97,773
Unkn 4486 30.2 18,542 Unkn 4480 N/A
Unkn 4485 N/A Unkn 4494 30.79 12,696
Unkn 4484 26.95 149,353

Unkn
4491 29.91 22,336
Unkn
4493 27.18 128,853
minh họa các kết quả điện di của sản phẩm PCR
sau khi tinh sạch rất là rõ nét, dù nồng độ HCV
trong một số mẫu là khá thấp. Điều này chứng tỏ
qui trình RT real-time PCR mà chúng tôi xây
dựng trên nền tảng dùng bộ thử nghiệm RT TQ
real-time PCR phát hiện và định lượng HCV-RNA
do chúng tôi sản xuất là tối ưu và hòan chỉnh. Tất
cả các mẫu mà chúng tôi giải trình tự được đều
được phân tích trên phần mềm phân tích giải trình
tự của CEQ8000. Đa số các trường hợp các trình
tự giải được có chiều dài phù hợp với chiều dài mà
chúng tôi dự đóan, là từ 190bp đến <200bp. Hình
2 minh họa một biểu đồ tín hiệu được máy ghi
nhận và trình tự của các base. Từ trình tự giải
được, đăng nhập lên NCBI blast để so sánh với
thư viện Los Alamos và nhờ đó có được kết quả
genotype của HCV. Hình 3 minh họa một kết quả
giải trình tự của HCV nhờ đăng nhập lên NCBI
genotype. Chúng tôi cũng đã thử so sánh kết quả
định genotype phương pháp này với kết quả local
blast dùng phần mềm miễn phí bio-edit với thư
viện genotype HCV mà chúng tôi thành lập được,
kết quả như trình bày trong hình 4 cho thấy cả hai
phương pháp đều cho kết quả giống hệt nhau.
Biện luận
Định genotype HCV bằng kỹ thuật giải trình

tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên
vạch của Bayer đều dựa trên một đọan
nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’NC. Đây là cả
hai phương pháp được FDA và y học chấp
nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm
sàng. Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn
phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều
trường hợp không thể phân biệt được các
subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không
cần thiết phải có thiết bị giải trình tự vốn được
xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt
kỹ thuật, do vậy InoLIPA có thể triển khai
thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí
nghiệm lâm sàng nào có trang bị phương tiện
cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA
phải thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả
của phản ứng nested PCR nên khả năng bị
ngọai nhiễm là khá cao và đây chính là lí do
giải thích được tại sao có khá nhiều trường
hợp InoLIPA có kết quả không thể xác định
được genotype
[7,8]
. Để có thể khắc phục được
nhược điểm này, chúng tôi đã nghiên cứu
thành công một qui trình thực hiện RT-PCR
với PCR mix cực kỳ nhạy cảm chỉ cần dùng
mồi vòng trong của HCV-InoLIPA và có
thêm khả năng chống được ngọai nhiễm sản
phẩm khuếch đại nhờ có chứa dUTP và UNG;
và chính nhờ cải tiến quan trọng, HCV-

InoLIPA có khả năng áp dụng được rộng rãi
tại Việt Nam
[8]
. Tuy vậy khả năng triển khai
sử dụng HCV-InoLIPA tại Việt Nam cũng
còn khá xa vời vì giá thành hãy còn khá cao
(#100USD/mẫu) so với điều kiện kinh tế của
nhiều bệnh nhân cũng như khả năng tài chính
củaa các bệnh viện hiện nay. Về phương pháp
giải trình tự của Trugene, các nhà sản xuất
khuyến cáo nên thực hiện trên sản phẩm PCR
của Roche Amplicor, và đây chính là một trở
ngại khá lớn vì giá thành của Roche Amplicor
dành cho HCV rất đắt (trên 120 USD/mẫu
thử). Ngòai giá thành của Roche Amplicor,
các vật liệu tiêu hao khác đi kèm với thử
nghiệm giải trình tự cũng phải đến trên
60USD nữa, do vậy giá thành của một thử
nghiệm genotype HCV bằng giải trình tự của
Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới
180USD. Trong thời gian qua, chúng tôi đã
nghiên cứu thành công một bộ thử nghiệm
RT-PCR với PCR mix dùng cặp mồi hòan
tòan tương thích với hệ thống Trugene nhờ
vậy mà phòng thí nghiệm không nhất thiết
phải sử dụng Roche Amplicor làm RT-
PCR
[8,9]
. Chính nhờ áp dụng thành công này
mà hiện nay giá xét nghiệm HCV genotype tại

trung tâm Medic chỉ còn không qua
120USD/một mẫu thử. Tuy vậy, giá thành này
cũng hãy còn khá cao để có thể được chỉ định
rộng rãi cho các bệnh nhân. Ngòai ra, Trugene
là một hệ thống hòan tòan kín, chỉ được dùng
để đáp ứng yêu cầu định genotype HCV của
lâm sàng do vậy kết quả chỉ có thể hiển thị
được trên màn hình và in ra giấy, do vậy nhà
nghiên cứu không thể có được kết quả trên
một tập tin vi tính để có thể làm blast search
hay nghiên cứu phylogenetic. Thư viện HCV
là một thư viện được xây dựng sẵn và người
dùng có thể cập nhật thêm các kết quả của
mình (thực hiện trên chính máy giải trình tự
của Trugene) vào thư viện này, nhưng không
thể lấy thư viện này ra bên ngòai cũng như
không thể đăng nhập được một trình tự có
được từ các máy giải trình tự khác để search
trên thư viện này. Đây chính là một bất tiện
đặc biệt cho các nhà nghiên cứu khi muốn
nghiên cứu sâu thêm về HCV genotype trên
các kết quả có được từ các nguồn khác nhau.
Phương pháp giải trình tự để định genotype
HCV do chúng tôi phát triển và trình bày
4
trong công trình nghiên cứu này được thực
hiện trên một trình tự dài không quá 200bp
của một sản phẩm PCR dài khỏang 240-
250bp, kết quả từ thử nghiệm RT real-time
PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu một

đọan đích tương tự của Trugene và InoLIPA
trên vùng 5’NC. Chính điều này đảm bảo tính
chính xác của kết quả định genotype HCV do
chúng tôi phát triển không khác gì kết quả
định genotype bằng kỹ thuật giải trình tự của
Trugene vì đọan trình tự đích của phương
pháp của chúng tôi và đọan trình tự đích của
phương pháp Trugen gần như phù hợp nhau
hòan tòan. Sở dĩ chúng tôi nghiên cứu thành
công được công trình này là nhờ chúng tôi có
được các thành công trong nghiên cứu thiết kế
được mồi để chế tạo bộ thử nghiệm RT-PCR
phát hiện HCV tương thích cho thử nghiệm
định genotype HCVbằng kỹ thuật giải trình tự
của Trugene
[8,9,10]
. Ngòai ra, việc nghiên cứu
thành công bộ thử nghiệm RT real-time PCR
dùng mồi và taqman probe để phát hiện và
định lượng HCV-RNA trên một đọan đích đến
240-250bp mà chúng tôi đã nghiên cứu và áp
dụng tại khá nhiều phòng thí nghiệm tại Việt
Nam
[11]
là một bước đi đột phá (phá vở qui
luật là real-time PCR dùng taqman probe chỉ
cho kết quả tối ưu khi sản phẩm khuếch đại
không quá 150bp, chứng minh qua các kết
quả trình bày trong biểu đồ 1-B) và chính nhờ
vậy đã góp nên một yếu tố rất quan trọng để

giảm được giá thành của xét nghiệm định
genotype bằng kỹ thuật giải trình tự này vì
không cần thiết phải thực hiện một RT-PCR
để có sản phẩm PCR dành riêng cho giải trình
tự. Giá thành định genotype HCV bao gồm cả
định lượng HCV-RNA hiện nay của chúng tôi
có khả năng sẽ không quá 50USD/mẫu.
Kết quả của công trình nghiên cứu cho thấy
đa số các mẫu huyết thanh được gửi đến xét
nghiệm định lượng HCV-RNA là thuộc
genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% còn lại
phân phối vào các genotype khác như
genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype
2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b
(1%), genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b
(<1%). Chúng tôi không cho rằng tỷ lệ này
phản ánh thật sự đúng tần số lưu hành các
genotype HCV trong các người nhiễm HCV
tại Việt Nam mà chỉ nói lên được tần số
genotype trong các bệnh nhân sắp, đang và đã
điều trị đặc hiệu bệnh viêm gan mạn tính do
HCV. Chính trên đối tượng nghiên cứu này
nên chúng ta thấy tỷ lệ genotype 1b (là
genotype đáp ứng kém với điều trị đặc hiệu)
là đến 55% với đa số có giá trị định lượng
HCV-RNA khá cao (từ 100.000 đến
10.000.000 copies/ml)
Có một số nhà nghiên cứu cho là nếu định
genotype bằng giải trình tự vùng 5’NC sẽ
không cho kết quả chính xác mà phải giải

trình tự vùng NS5B trên bộ gen của HCV. Sở
dĩ các nhà nghiên cứu này quan niệm như vậy
vì đã có một số y văn trên thế giới chứng
minh là nếu định genotype HCV trên vùng
NS5B thì sẽ có thể phân biệt được các subtype
tốt hơn là dựa trên vùng 5’-NC
[12]
, cũng như là
phân biệt được type 6 với subtype 1b
[13]
hay
1a và 1b chính xác hơn
[14]
. Tuy nhiên các
nghiên cứu như vậy hãy còn khá ít, và kết quả
chính xác hay không lại còn tuỳ thuộc vào thư
viện gen mà chúng ta dùng để phân tích trình
tự giải được
[15]
. Ngoài ra, dù hiện nay đã có
nhiều cải thiện trong thử nghiệm RT-PCR
phát hiện HCV dựa trên vùng NS5B, nhưng
hãy còn kém nhạy cảm xa so với thử nghiệm
trên vùng 5’NC, do vậy quan niệm được nhiều
người thừa nhận nhất hiện nay là: định
genotype dựa trên giải trình tự vùng 5’NC vẫn
là thích hợp và hữu dụng nhất cho lâm sàng vì
độ nhạy cảm cao, còn vùng NS5B chỉ nên
dùng cho các nghiên cứu dịch tễ học về sự
phân bố các genotype HCV vì khả năng phân

biệt các subtype cao
[12, 16-19]
.
Kết luận
Bằng phương pháp giải trình tự một đọan
DNA đích dài dưới 200bp của sản phẩm PCR
kết quả từ thử nghiệm RT-PCR dùng mồi và
Taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC, chúng tôi
đã định được genotype của HCV trong huyết
thanh của bệnh nhân bị viêm gan mạn tính do
nhiễm HCV. Nghiên cứu này đã mở ra được
một khả năng ứng dụng rộng rãi không chỉ
nhờ giá thành xét nghiệm thấp giúp cho các
bác sĩ điều trị không ngần ngại khi cho chỉ
định xét nghiệm cho bệnh nhân, mà còn có thể
triển khai được tại nhiều phòng thí nhiệm hiện
đang có máy giải trình tự mà vẫn ít hay chưa
có hướng ứng dụng trong y học như thực tế
hiện nay chúng ta vẫn thường gặp.
5
Tài liệu tham khảo
1 National Institute of Health Consensus (2002).
Development Conference Statement: Management of
Hepatitis C: 2002 June 10-12. Final Statement
Revisions made September 12, 2002
2. Versant HCV Genotyping Assay (LiPA)
3. Trugene HCV Genotyping Assay (Sequencing)
4. D. T. T Thuy (2000). Luận văn Thạc Sĩ
5. Trịnh Kim Ảnh và CS. Tình hình viêm gan virus B & C
ở bệnh viện Chợ Rẩy. Mạng y khoa net

6. Alter MJ, Semin Liver Dis (1995). Management of
Hepatitis C NIH Consensus Statement 1997; March 24-
26:15(3).


7. Nguyen Bao Toan (2005). HCV genotyping by LIPA kit
and by Trugene sequencer. Why we need and how we
can apply effectively and economically in the clinical
laboratory The Viet Nam National Conference on
laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005
8. Phạm Hùng Vân et al. (2005). LiPA and Trugene HCV
genotyping system - Why we need it and how we can
apply it economically and effectively in the clinical
laboratories in Vietnam?. Bayer’ s customer meeting in
TsingTao, China.
9. Ho Tan Dat (2005) Genotyping the Hepatitis C virus
based on the sequencing of the 5’ non – coding of the
virus genome The Viet Nam National Conference on
laboratory Medicine. 26-28 Oct. 2005
10. Phạm Hùng Vân et al. (2005). Direct sequencing the
PCR product for genotyping of HCV and HPV. Becman
Coulter’ s customer meeting in Singapore.
11. Nguyen Thanh Tong (2005). The complete solution
using molecular biology tool kits for diagnosis
and monitoring HBV & HCV infection. ANCLS
conference 26-28 Oct. 20056. Nguyễn Thanh Hảo
và CS (2000). Genotýp virút viêm gan C ở Việt Nam.
Hội nghị chuyên đề bệnh gan mật. Hội gan mật Hà Nội.
Tháng 4/2000.
12. Syria Laperche, Jean-Jacques Lefrère et al (2005).

Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5’
Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter
Study. Journal of Clinical Microbiology, 43(2); 733-739
13. Chinchai, T., J. Labout, S. Noppornpanth, A.
Theamboonlers, B. L. Haagmans, A. D. Osterhaus, and
Y. Poovorawan. 2003. Comparative study of different
methods to genotype hepatitis C virus type 6 variants. J.
Virol. Methods 109:195–201.
14. Chen, Z., and K. E. Weck. (2002). Hepatitis C virus
genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region
cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J.
Clin. Microbiol. 40:3127–3134.
15. Joseph D.C. Yao (2003). Evaluation of the TRUGENE
HCV 5_NC Genotyping Kit with the New GeneLibrarian
Module 3.1.2 for Genotyping of Hepatitis C Virus from
Clinical Specimens. Journal of clinical microbiology.
4855–4857
16. Cantaloube, J., H. Venault, J. Zappitelli, P. Gallian, M.
Touinssi, H. Attoui, P. Biagini, X. de Lamballerie, and
P. de Micco. 2000. Molecular analysis of HCV type 1 to
5 envelope gene: application to investigations of
posttransfusion transmission of HCV. Transfusion
40:712–717.
17. Germer, J. J., P. N. Rys, J. N. Thorvilson, and D. H.
Persing. 1999. Determination of hepatitis C virus
genotype by direct sequence analysis of products
generated with the Amplicor HCV test. J. Clin.
Microbiol. 37:2625– 2630.
18. Sandres-Saune, K., P. Deny, C. Pasquier, V. Thibaut, G.
Duverlie, and J. Izopet. 2003. Determining hepatitis C

genotype by analyzing the sequence of the NS5b region.
J. Virol. Methods 109:187–193.
19. Tamalet, C., P. Colson, H. Tissot-Dupont, M. Henry, C.
Tourres, N. Tivoli, D. Botta, I. Ravaux, I. Poizot-Martin,
and N. Yahi. 2003. Genomic and phylogenetic analysis
of hepatitis C virus isolates: a survey of 535 strains
circulating in southern France. J. Med. Virol. 71:391–
398.
6