Góp phần nghiên cứu tác dụng chống viêm của chế phẩm chứa papain

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ Y T Ế

TRƯỜNG ĐẠI HỌC

Dược HÀ NỘI

VŨ HỒNG ANH

GÓP PHẦN NGHIÊN

cứu TÁC DỤNG

CHỐNG VIÊM CỦA CHẾ PHẨM c h ứ a
PAPAIN
Chuyên ngành : Dược lý - Dược lâm sàng
Mã sô

: 03.02.02

LUẬN VÃN THẠC s ĩ

Dược HỌC

NGƯÒI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS. TS. NGUYỄN XUÂN THẮNG

HÀ N Ộ I— 1999

QcAm

ơqí

T ôi xin bày tỏ lòng biết ơn sầu sắc tới

^?íạtíựềềt (^UÔM

người thày đ ã tận tình hướng dẫn tôi hoàn thành bản luận văn
này.

T ôi xin chân thành cảm ơn cha mẹ, các thày giáo, cô giáo trường
Đ ại học D ược H à N ội, đặc biệt các thày giáo, cô giáo, các cô kỹ thuật
viên Bộ m ôn H oá sinh - V i sinh, các anh, chị, bạn bè đồng nghiệp đ ã
động viên, giúp đ ỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian học tập và thực hiện
đ ề tài.

H à N ội, ngày 29 tháng 12 năm 1999
( ĩ) ũ 'T õềttg. c  n h


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Globulin miễn dịch

Ig

Immuno-globulin

Tĩ,

Interleukin

INF

Interferon

NSAID

Non-steroid anti-inflammatory drug Thuốc chống viêm phi steroid

PAF

Platelet activating factor

Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu

TNF

Tumor necrosis factor

Yếu tố hoại tử khối u


M ỤC LỤC

Trang
Phần 1. Đặt vấn đề

3

Phần 2. Tổng quan

5

2.1. Tổng quan lý thuyết về viêm

5

2.2. Tổng quan về enzym chống viêm

14

2.3. Một số dược liệu có tác dụng chống viêm

18

Phần 3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

20

Phần 4. Thực nghiệm và kết quả

28

Phần 5. Bàn luận

54

Phần 6. Kết luận

58

Tài liệu tham khảo

61


M ỤC LỤC

Trang
Phần 1. Đặt vấn đề

3

Phần 2. Tổng quan

5

2.1. Tổng quan lý thuyết về viêm

5

2.2. Tổng quan về enzym chống viêm

14

2.3. Một số dược liệu có tác dụng chống viêm

18

Phần 3. Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

20

Phần 4. Thực nghiệm và kết quả

28

Phần 5. Bàn luận

54

Phần 6. Kết luận

58

Tài liệu tham khảo

61


PH ẦN 1. ĐẶT VẤN ĐỂ

Viêm là quá trình bệnh lý rất phổ biến, gặp trong nhiều bệnh, do nhiều
nguyên nhân gây ra. Nhìn chung, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể,
giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây viêm. Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo
dài sẽ dẫn đến những rối loạn chức năng của các cơ quan, bộ phận của cơ thể,
gây ra nhiều ảnh hưcmg xấu, có khi nguy hiểm tới tính mạng của ngưòi bệnh,
Vì vậy, việc phát huy tác dụng bảo vệ và ngăn ngừa các yếu tố có hại của

viêm là rất cần thiết và quan trọng.
Để đáp ứng được yêu cầu đó, ngưòi ta đã nghiên cứu ra nhiều loại thuốc
chống viêm như thuốc có cấu trúc steroid, thuốc chống viêm phi steroid
(NSAID). Các thuốc này đa phần có nguồn gốc hoá dược, đã được sử dụng từ
nhiều năm nay. Bên cạnh tác dụng tốt, chúng vẫn chứa đựng những yếu tố bất
lọi đối vói cơ thể như gây suy giảm miễn dịch, xốp xương, kích ứng đưòfng
tiêu hoá, ảnh hưởng tód quá trình đông máu, tạo máu...
Từ những nguyên nhân trên, ngưòi ta hướng đến tìm kiếm các thuốc
chống viêm được chế tạo từ những chất gần gũi với cơ thể con người, và các
thuốc

chống

viêm

có

chứa các

enzym

như protease

(papain,

a-

chymotrypsin...), đã ra đời. Tuy nhiên, hiện nay số lượng thuốc chống viêm có
nguồn gốc enzym ở Việt Nam còn ít, phần lớn đều do nước ngoài sản xuất,
Trong khi đó, nước ta lại có nhiều nguồn nguyên liệu, nhất là dược liệu, có thể

tách chiết được các enzym để sử dụng, ví dụ papain có trong nhựa đu đủ. Đây
là một điều kiện thuận lọi để chúng ta có thể tự sản xuất các loại thuốc chống
viêm có chứa enzym, góp phần làm giảm giá thành của thuốc và không phải
nhập của nước ngoài.
Trước đây, ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về papain
nhưng chủ yếu tập trung vào khía cạnh trợ giúp tiêu hoá mà chưa quan tâm


tìm hiểu tác dụng chống viêm. Do đó, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Góp
phần nghiên cứu tác dụng chống viêm của chế phẩm chứa papain”.
Đề tài này nhằm một số mục tiêu sau đây:
© Sơ bộ theo dõi tác dụng chống viêm của chế phẩm chứa papain
khi dùng trong và bôi ngoài da.
® Thử kết hợp tác dụng chống viêm của papain và một vài dược
liệu chống viêm khác.
® Theo dõi sự biến đổi của một vài chỉ số hoá sinh trong quá
trình viêm, dưới tác dụng của chế phẩm chứa papain.

Giới hạn phạm vi đề tài:
-

Thuật ngữ “chế phẩm” sử dụng trong đề tài này không dùng để
chỉ một dạng thuốc hoàn chỉnh mà dùng để chỉ một dạng pha chế
đơn giản phục vụ cho quá trình nghiên cứu.

-

Thuật ngữ “papain” được sử dụng theo nghĩa rộng để chỉ các
enzym có trong nhựa đu đủ mà thành phần chính là papain.

PH ẦN 2. TỔNG QUAN

2.1. Tổng quan lý thuyết về viêm.
Theo Ado (1973), viêm là một phản ứng tại chỗ của các mạch máu, tổ
chức liên kết và hệ thần kinh đối với tác nhân gây bệnh và có liên hệ với tính
phản ứng của cơ thể,
Theo Vũ Triệu An, viêm là một phản ứng bảo vệ của cơ thể mà nền tảng
là phản ứng tế bào, phản ứng này được hình thành và phát triển phức tạp dần
trong quá trình tiến hoá của sinh vật. [2, 62]
Trong Từ điển Bách khoa Dược học định nghĩa: Viêm là một phản ứng
tại chỗ của cơ thể, do các mô bị kích thích hoặc thương tổn. Đó là một phản
ứng phức tạp của các mô liên kết và của tuần hoàn mao mạch ở nơi bị tác
động, được biểu hiện bằng các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau và rối loạn
chức phận. [15, 630]
2.1.1. Nguyên nhân gây viêm: [2, 62], [10, 6-8]
Có nhiều nguyên nhân gây viêm, có thể chia thành hainhóm như

sau:

2.1.1.1. Nguyên nhân bên ngoài:
- Sinh vật: do nhiễm vi khuẩn, virus, ký sinh trùng.
- Vật lý: cơ học (đụng dập, chấn thương), nhiệt (bỏng nóng hoặc bỏng lạnh),
bức xạ ion.
- Hoá học: các chất hòa tan gây hoại tử tế bào như các dung dịch hoá chất
(acid, kiềm, muối...) hoặc các chất đặc gây thực bào của bạch cầu.
2.1.1.2. Nguyên nhân bên trong:
Các nguyên nhân bên trong có thể gặp như hoại tử tổ chức, xuất huyết,
tắc mạch, rối loạn thần kinh dinh dưỡng (viêm tắc động mạch), do phản ứng
kháng nguyên — kháng thể ...

Tuy nhiên, rất khó phân biệt rõ ràng hai loại nguyên nhân gây viêm như
trên vì trong thực tế, các nguyên nhân bên ngoài thường kèm theo các biến đổi


trong cơ thể và từ đó lại tạo ra các nguyên nhân bên trong.
2.1.2. Các phản ứng xảy ra trong quá trình viêm:
Trong quá trình viêm, tại ổ viêm và trong cả cơ thể diễn ra hàng loạt các
phản ứng, theo nhiều giai đoạn khác nhau.
2.1.2.1. Các phản ứng chính tại ổ viêm:
Tại ổ viêm, có hai loại phản ứng chính xảy ra: [2, 62], [10, 49-80], [24,
1-31
a ) Phản ứng tuần hoàn;
Phản ứng này xảy ra rất sớm sau tổn thưcttig và phát ưiển ở mức độ
khác nhau, phụ thuộc vào sự trầm trọng của tổn thương mô và theo một trình
tự sau:
a/

Co mạch chdfp nhoáng ở các tiểu động mạch xảy ra ngay sau khi có tác

nhân kích thích, do hưng phấn thần kinh co mạch và các cơ trơn bị kích thích.
Tiếp sau đó có hiện tượng giãn mạch. Đầu tiên là giãn các tiểu động mạch rồi
mao mạch và tiểu tĩnh mạch dẫn đến tăng tuần hoàn tại chỗ nhằm cung cấp
năng lượng cho hoạt động tại ổ viêm (gây nóng và đỏ) và đưa nhiều bạch cầu
tới làm nhiệm vụ bảo vệ. Nguyên nhân của hiện tượng giãn mạch là do ba yếu
tố chính:
+ Hưng phấn thần kinh giãn mạch ở vùng động mạch và tiểu động mạch.
+ Do tác động của các yếu tố tìiể dịch có mặt tại ổ viêm như histamin,
bradykinin, leucotrien ... gây co tế bào nội mô; hoặc các cytokin (IL-1, TNF,
ĨNF-y ...) gây nên sự tái tổ chức cấu trúc bộ xưofng tế bào, dẫn đến hình thành
những vùng nối gian bào rộng, những lỗ hổng giữa các tế bào.

+ Các sợi liên kết ở vùng mao mạch bị tổn thưong do một số enzym nội bào
có thể phá huỷ norepinephrine, là chất cần thiết để duy trì trương lực mao
mạch. (Norepinephrine thường tìm thấy ở khoảng gian bào),
b/

Phản ứng tuần hoàn quá mạnh trên dẫn tới các rối loạn nghiêm ưọng

như giãn mạch cực độ, dòng máu chảy chậm dần, gây tăng tính thấm thành

6


mạch làm thoát địch ri viêm giàu protein vào các mô quanh huyết quản. Do sự
chèn ép của dịch rỉ viêm và do một số yếu tố mạch máu như liệt thần kinh vận
mạch, tế bào nội mạc sưng to, tăng độ nhớt của máu... gây ớ máu làm mất
tuần hoàn từ đông mạch sang tĩnh mạch, thiếu ôxi gây rối loạn chuyển hoá
nghiêm ưọng, tổn thương tổ chức và viêm phát triển toàn diện (biểu hiện lâm
sàng là phù và đau).
P) Phản ứng tế bào;
Đây là phản ứng cơ bản nhất phản ánh khả năng bảo vệ của cơ thể
chống viêm và trong phản ứng này, bạch cầu đóng vai trò quan trọng nhất. Do
tốc độ tuần hoàn chậm lại, các bạch cẩu, chủ yếu là bạch cầu đa nhân trung
tính dạt vào thành mạch, bám vào nội mô rồi dừng lại tại một điểm, gọi là
vách tụ bạch cầu. Dưới tác dụng của các chất trung gian hoá học như IL-1,
TNF và nội độc tố, bạch cầu và tế bào nội mô bộc lộ hai loại phân tử dính ưên
bề mặt là selectin, integrin. Nhờ đó, khả năng dính của bạch cầu với tế bào nội
mô tăng lên rõ rệt.
Sau khi dính vào tế bào nội mô, bạch cầu chuyển động nhẹ dọc theo bề
mặt nội mồ, luồn những chân giả vào khe hở giữa các tế bào nội mô. Chúng
xuyên qua vùng nối đã giãn rộng giữa các tế bào nội mồ để xen vào giữa tế

bào nội mô và màng đáy, và từ đó đi vào khoảng gian bào ngoài mao mạch.
Hiện tượng xảy ra dưới tác đụng của một số chất hoá ứng động (nên gọi là
hiện tượng hoá ứng động bach cầu): các sản phẩm của vi khuẩn (các peptid có
aciđ amin tận cùng là N-formyl-methionin ), các thành phần của hệ thống bổ
tíiể bị hoạt hoá (C3a, C5a, C5b, 6, 7), các sản phẩm chuyển hoá của acid
arachidonic theo đưòfng lipogenase hoá (đặc biệt là leucotrien B4), các
cytokin, các mảnh vụn sợi tạo keo và các sản phẩm phân huỷ tế bào, tơ huyết
và các sản phẩm phân huỷ của tơ huyết. [10, 61-67]
Tại ổ viêm, các bạch cầu được hoạt hoá và khi được hoạt hoá, khả năng
thực bào của chúng tăng lên rõ rệt.

7


Trước tiên, các tiểu phần bị thực bào dính vào bề mặt của bạch cầu nhờ
sự nhận biết của bạch cầu. Các bạch cầu và đại thực bào có thể dính trực tiếp
với tác nhân nhiễm trùng hoặc các mảnh tế bào bị phân hủy nhờ ái lực hoá học
giữa hai bề mặt. Tuy nhiên, phần ldfn các vi sinh vật không bị nhận biết mà
chúng chỉ gắn với các receptor đặc biệt trên bể mặt bạch cầu khi bị bao bọc
bỏd các yếu tố gọi là opsonin. Có hai opsonin chính: Thứ nhất là đoạn Fc của
phân tử IgG (bị bộc lộ khi IgG gắn với kháng nguyên đặc hiệu) sẽ dính với
receptor FcyR trên màng bạch cầu. Thứ hai là thành phần C3b và thành phần
ổn định của nó là C3bi (được sinh ra do hoạt hoá bổ thể bởi cơ chế miễn dịch
và không miễn dịch) sẽ gắn với các receptor 1, 2, 3 của bổ thể (CRl, 2, 3).
[10, 68-691
Sau khi dính với đối tượng thực bào, bào tucfng tạo thành một màn bao
vây quanh đối tượng rồi dần đần nuốt đối tượng ứiực bào. Khi đó, có thể có
các khả năng sau xảy ra: [2, 66], [10, 70-75]
+ Đối tượng thực bào bị tiêu đi bỏfi lysosom: Khi các vi khuẩn bị thực bào,
chúng tập trung ở Ichông bào và gắn với màng bào tương tạo thành thể

phagosom. Màng của ứiể phagosom sát nhập với màng bào tương của các hạt
lysosom tạo thành thể phagolysom. Thành phần của các hạt lysosom đổ vào
phagolysom khiến cho phagolysom chứa nhiều hydrolase của các hạt ưa acid,
(trong quá trình này, bạch cầu đa nhân mất hạt dần dẩn). Các hydrolase phân
hủy vỉ trùng, đồng thời tiêu hủy cả tế bào thực bào.
+ Đối tượng thực bào có thể tồn tại lâu trong tế bào như bụi than trong thực
bào ở phổi (gây bệnh bụi than)...
+ Đối tượng ứiực bào tồn tại trong thực bào và theo thực bào đi nơi khác gây
ra những ổ viêm mới (như trong bệnh lao mãn tính). Nếu các vi khuẩn tồn tại
theo cách này, chúng sẽ được bao bọc để chống lại tác động của các thuốc
kháng khuẩn và các cơ chế để kháng khác.
+ Đối tượng thực bào có thể bị nhả ra mà thực bào không chết.

8


+ Đối tưọíng thực bào cũng có thể đủ độc để làm chết thực bào (như vi khuẩn
lao, liên cầu khuẩn). Khi đó, chúng sẽ làm giải phóng các sản phẩm của bạch
cầu ra ngoài tế bào, trong đó có các men lysosom, các chất chuyển hoá hoạt
tính dẫn xuất oxy, các sản phẩm chuyển hoá của aciđ arachidonic (như
prostaglandin, leucotrien). Các chất này sẽ góp phần gây tổn thương mô,
khuếch đại hậu quả của những kích thích viêm ban đẩu và làm kéo dài phản
ứng viêm.
2.1.2.2. Các phản ứng hệ tìiống và sự thay đổi của các chỉ số hoá sinh:
Sau khi hiện tượng viêm xảy ra, toàn thân sẽ có những biến đổi. Sớm
nhất là các rối loạn thần kinh như mỏi mệt, mất ngủ rồi đến các rối loạn khác
về thân nhiệt, tuần hoàn, tiêu hoá... Nhiệt độ cơ thể táng, nhất là khi viêm có
kèm theo nhiễm trùng. Đặc biệt đáng chú ý là sự thay đổi về các chỉ số của
mấu:
- Tăng bạch cầu là hiện tượng phổ biến của phản ứng viêm, đặc biệt là viêm

do nhiễm trùng. Bạch cầu thường tàng tới 15000 — 20000 trong Iml máu
nhưng cũng có khi còn tăng cao hofii. Phần lớn các trường hợp viêm là tăng
bạch cầu đa nhân trung tính, tăng các lympho bào. [10, 121], [22, 28'
- Tốc độ máu lắng tăng
- Ngoài sự biến đổi về mặt tế bào còn có sự thay đổi các chỉ số hoá sinh của
máu. Rõ rệt nhất là sự thay đổi các thành phần protein huyết thanh. Trong các
trường hợp viêm, người ta thấy có sự tăng cua jRbrinogen, tăng protein c phản
ứng, giảm albumin, tàng globulin (cả a , p, và y) của huyết thanh, từ đó dẫn
đến tỷ số A/G giảm. [1, 329-330], [17, 27-401
- Các glucoprotein tăng, (trong đó có cả a 1 và a 2-gỉucoprotein). Trong a j glucoprotein có seromucoid a j (còn gọi là oromucoid), có trọng lượng phân tử
ứiấp (44000), hoà tan trong acid pechloric. Seromucoid có chứa 17% galactose
— mannose, 11,5% glucosamin, 10% acid siaiic. Điện đi ở pH 3,9, nó tách ra
khỏi toàn bộ glucoprotein. Trong quá trình viêm, hàm lượng của seromucoid

9


táng lên đáng kể. [7, 860], [17, 347], [22, 28], [37, 298-300].
- Các mucoprotein tăng. [22, 28]
- Đối với các nguyên tố vi lượng trong huyết thanh ứiì có sự tăng của sắt, giảm
đồng. [22 , 28]
2.J.3. Các chất trung gian hoá học tham gia vào quá trình viêm:
Trong phản ứng viêm có sự tham gia của rất nhiều chất trung gian hoá
học. Các chất này được giải phóng ra ngay khi có tác động ban đầu của viêm
và trong suốt quá ưlnh viêm, duy trì và khuếch đại phản ứng viêm. Chúng có
nguồn gốc khác nhau như từ huyết tương, tế bào hay tổn thucfng mô. Các chất
trung gian hoá học gồm có:
2.1.3.1. Các amin hoạt mạch: [10, 82-84]
- Histamin, được giải phóng do sự mất hạt của các dưỡng bào khi đáp ứng với
các kích thích: tổn thương vật lý (chấn thucfng, bỏng), phản ứng miễn dịch gắn

kháng thể với dưỡng bào, các đoạn của bổ thể được gọi là các độc tố gây phản
vệ (C3a và C5a), các protein làm giải phóng histamin xuất phát từ bạch cầu,
các neuropeptid, các cytokin (IL-1, IL-8). Histamin gây giãn các tiểu động
mạch và gây tăng tính thấm của các tiểu tĩnh mạch.
- Serotonin được giải phóng từ các tiểu cầu bị kích thích khi chúng kết dính
sau khi tiếp xúc với sợi tạo keo, ADP, phức hợp kháng nguyên — kháng thể,
hoặc do yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF) có nguồn gốc từ các dưỡng bào trong
các phản ứng đo tác động trung gian của IgE, Serotonin có tác động tương tự
như histamin.
2.1.3.2. Các protease của huyết tưoíng; [10, 84-87], [24]
- Hệ thống bổ thể, trong đó đáng chú ý là các thành phần C3a và C5a làm tăng
tính t h ^ tíiành mạch và gây giãn mạch, chủ yếu do giải phóng histamin từ
các dưỡng bào. C5a cũng hoạt hoá đường chuyển hoá lipoxygenase của acid
arachidonic ở các bạch cầu đa nhân trung tính và bạch cầu đcfn nhân, gây giải
phóng tiếp các chất trung gian hoá học của viêm. C5a còn là tác nhân hoá ứng

10


động mạnh đối vói bạch cầu.
- Bradykìnin, một chất gây giãn mạch và tăng tính thấm thành mạch, được giải
phóng từ a 2'globulin khi hệ thống kinin bị hoạt hoá dưới tác dụng của yếu tố
Hageman (yếu tố XII của đưcmg đông máu nội sinh) hoạt hoá.
- Hệ thống đông và tiêu tơ huyết: Hệ thống đông máu là một loạt những
protein huyết tương có thể bị hoạt hoá bởi yếu tố Hageman. Bước cuối cùng là
sự chuyển fibrinogen thành fibrin do tác động của tìirombin, Trong quá trình
này có sự hình thành các fibrinopeptid, gây tăng tính ứiấm thành mạch và có
hoạt tính hoá ứng động đối với bạch cầu.
Có thể sơ đồ hoá sự hình thành của các amin hoạt mạch và các protease
huyết tưofng trong quá trình viém như sau:

Dưỡng bào
1
Histamin

Tổn thương mô
ộ
XI ^ Xla
u
Hoạt hoá hệ
Thống đông máu
u
Fibrin

r

Yếu tố Hageman
(XII ^ Xlla)
\
r
Plasminogen

Hoạt hoá plasminogen

ị<
Fibrinopeptid

Prekallikrein
ị
Kallikrein
u

Bradykininogen
ị
Bradykinin

Plasm in

Hệ thống bổ thể

Hiện tượng
Miên dich
Hình 1. Sơ đồ quá trình hình thành của một số chất trung gian hoá học trong
quá trình viêm [38, 78]

11


2.1.3.3. Các chất chuyển hoá của acid arachidonic: [10, 87-89], [20]
Các chất chuyển hoá của acid arachidonic như prostaglandin,
prostacyclin,

thromboxan

(chuyển

hoá

theo

đường

cyclooxygenase),

leucotrien (chuyển hoá theo đưòmg lipoxygenase). Acid arachidonic là một
thành phần bình thưòíng của màng lipid và được giải phóng do tác động của
phospholipase A2. Các chất chuyển hoá của nó như prostacyclin và
thromboxan đóng vai trò quan trọng trong điều hoà đông máu. Trong viêm,
prostaglandin E2 làm tăng tốc độ dòng máu và kết hợp với các yếu tố khác
làm tăng tính thấm thành mạch và gây đau. Chất này có hiệu quả chống viêm
do làm tăng AMP vòng và ức chế chức năng hiệu ứng của tế bào viêm. Còn
các leucotrien là các chất trung gian tiền viêm mạnh, có tác dụng hoá ứng
động bạch cầu.
2.13.4. Yếu tố hoạt hoá tiểu cầu (PAF): [10, 89-91], [38, 78-79]
PAF là một dẫn xuất của phospholipid màng, được sinh ra sau khi hoạt
hoấ phospholipase A2 và thưòng được giải phóng đồng thời vói các chất
chuyển hoá của acid arachidonic. Nhiều loại tế bào có khả nàng tổng họfp PAF
như bạch cầu đa nhân, đại thực bào, dưỡng bào, tiểu cẩu, tế bào nội mô, tế bào
biểu mô. PAF hoạt hoá mạnh bạch cầu đa nhân trung tính, kích thích sự dính
và xuyên mạch của bạch cáu, giải phóng các men của thể tiêu, sinh oxy phản
ứng và các eicosanoid; gây hoạt hoá và kết dính tiểu cầu.
2.13.5. Các cytokin: [10, 96-102], [38, 79-80]
Các cytokin do nhiều loại tế bào sản xuất ra (chủ yếu là lympho bào và
đại thực bào bị hoạt hoá), tham gia vào các phản ứng miễn dịch tế bào và cũng
giữ vai trò quan trọng trong phản ứng viêm. Các cytokin chính gồm yếu tố
hoại tử khối u (TNF a và |3) và các interleukin (IL-1, IL-6,

TNF, IL“l,

IL-6 tham gia phát triển phản ứng viêm tại chỗ hoặc hệ thống, một số phản
ứng có ứiể trở thành mãn tính. Tại chỗ, chúng làm hoạt hoá nội mô, tăng tổng
hợp các phần tử dính của tế bào nội mô. Chúng còn gây sốt, làm tăng lượng

12


bạch cầu đa nhân trung tính, tăng sinh nguyên bào sợi và kích thích tổng hợp
collagen... Còn IL-8 là một tác nhân hoá ứng động và hoạt hoá mạnh đối với
bạch cầu đa nhân trung tính. Nó là chất cảm ứng mạnh của các cytokin khác,
chủ yếu là TNF và IL-1.
2.Ỉ.4. Vai trò của viêm, và một số cơ ch ế tác dụng của các thuốc chống viêm:
Từ các thông tin trên cho thấy, nhìn chung, viêm là một phản ứ ig bảo
vệ của cơ thể vì viêm làm tăng tuần hoàn tại chỗ, tăng chuyển hoá, tạo nhiều
năng lưcmg cho phản ứ ig bảo vệ, tăng thực bào, ẩm bào, tăng sinh kháng thể,
tâng nội tiết, tăng hoạt động của hệ liên võng nhằm loại trừ tác nhân gây viêm,
kích thích quá trình hình thành sẹo... Do đó, về nguyên tắc cần tôn trọng phản
ứng viêm. [2, 70]
Tuy nhiên, nếu viêm nặng và kéo dài sẽ gây ảnh hưởng xấu cho cơ thể.
Các chất mới sinh có thể gây rối loạn chuyển hoá, tổn thưcíng tổ chức lan
rộng, rối loạn nhiều chức phận của cơ tíiể, có khi nguy hiểm đến tính mạng
của ngưòd bệnh. Vì thế, trong những trường hợp viêm quá mức cần phải có tác
động của thuốc chống viêm.
Trên thế giới, các thuốc chống viêm đã được sử dụng từ lâu, kinh điển
là hai nhóm thuốc chống viêm steroid và phi steroid (ví dụ Aspirin,
Paracetamol, Inđomethacin...) với cơ chế ức chế quá trình giải phóng aciđ
arachidonic từ màng phospholipid do ức chế phospholipase A2 [15, 6321, [21 ];
ức chế cyclO'Oxygenase nên ngăn cản quá trình chuyển acid arachidonic thành

prostaglandin (các NSAID) hay ức chế 5-lipoxygenase nên ngăn cản quá trình
chuyển acid aiachidonic thành các leucotrien. [15, 631-632], [201
Hiên nay, trên cơ sở những hiểu bết mới về cơ sở phân tử của phản ứng
viêm, người ta đang tập trung nghiên cứu các thuốc chống viêm mới nhằm vào

một số cơ chế mới như sau: [20]
- Úc chế các protease kim loại ở khoảng gian bào.
- ức chế các chất hoá ứng động và các cytokin.

13


- úc chế các protein tyrosin kinase và các kinase nội bào khác.
- Úc chế phosphodiesterase.
- Điều hoà các receptor của nhân tế bào.

2.2. Tổng quan về enzym chống viêm.

2.2.ỉ. Sơ ỉược vê các enzym chống viêm:
Các thuốc chống viêm hoá dược, bên cạnh khả năng chống viêm, còn
chứa đựng nhiều tác dụng phụ như gây loét dạ dày, dễ làm chảy máu... Vì vậy,
trên thế giới, người ta đang hưóíng đến sử đụng các enzym có tác dụng chống
viêm như trypsin, a - chymotrypsin, serratiopeptidase, amylase, papain... Các
enzym này có ưu điểm là tương đối gần gũi với cơ thể con người nên đã phần
nào giúp tránh được những tác dụng không mong muốn. Các enzym này giúp
tiêu hủy các mảnh vụn tế bào, fibrin và các protein huyết tưcfng kết tập tại
vùng bị tổn ửiương, đồng ửiời với việc kích ửiích hiện tượng thực bào. Từ đó,
chúng giúp giảm nhanh phù viêm và cải thiện sự lưu thông máu. Tuần hoàn
mao mạch được phục hồi sẽ đảm bảo cung cấp đủ oxy và dinh dưõíig cho
vùng mô bị tổn thương. Bên cạnh đó, các enzym này còn giúp điều hoà các
chất trung gian hoá học của viêm như protein pha cấp, các cytokin, các
receptor kết dính

giảm khả nãng hoạt hoá hệ thông bổ ứiể của các phức hợp

miễn dịch màng tế bào, làm giảm sự nguy hiểm của các phản ứng quá mức. Sự
phục hồi nhanh chóng các điều kiện chuyển hóa sinh lý đó đã giúp cho việc
cải thiện hàng rào bảo vệ miễn dịch và phục hồi nhanh chóng mô tổn thưoíng.
Trong quá trình này, khác với các chất chông viêm có nguồn gốc hoá dược,
các enzym tác động một cách sinh lý và không cho thấy bất cứ tác dụng bất
lợi nào đối với hệ miẻn dịch. [25, 121-123J
Nhờ những đặc tính trên, các enzym ngày càng được sử dụng nhiều
trong điều trị chấn thương hoặc phòng chấn thưcíng trong thể thao, hoặc dùng
điều trị hỗ trợ trong các trường hợp viêm. Hiện nay, nhiều hãng dược phẩm đã

14


đưa ra thị trường những loại thuốc chống viêm có chứa các enzym. Ví dụ, chế
phẩm Danzen của hãng Takeda có hoạt chất là serratiopeptidase, có tác dụng
chống viêm và phù nề. Seưatiopeptidase có khả nâng thuỷ phân bradykinin,
phân huỷ fibrin và fibrinogen, làm tiêu mủ và đờm... [28, 230]. Hãng Sanofi
pharma đưa ra chế phẩm Alphachymotrypsine choay có chứa a

-

chymotrypsin. a - chymotrypsin là một enzym tách từ tuyến tụy, có tác dụng
phân giải protein, dùng trong chỉ định chống viêm và phù nề do chấn tíiưcíng
hoặc sau phẫu thuật [15, 1381, [27, 16901, [28, 32]. Biệt dược Alphintem của
hãng Leurquin Mediolanum có trong thành phần hai enzym là trypsin và
chymotrypsin, có tác dụng ức chế giai đoạn tiết địch ri viêm của quá trình
viêm [28, 33]. Một enzym khác cũng có khả năng chống viêm và phù nể là a amylase cũng được hãng Sanofi pharma sử dụng làm dược chất chính trong
hai sản phẩm Maxilase và Maxilase — Bacitracine [16, 299-300]...
2.2.2. Giới thiệu về papain:
2.2.2.1. Nguồn gốc, cấu tạo và tính chất;

Papain được lấy từ nhựa cây đu đủ Carica papaya L. Papayaceae [8,
360], [15,472-473]. Người ta thưòíng dùng danh từ papain để chỉ một hỗn hợp
enzym, trong đó, ngoài thành phần chính là papain còn có một số thành phần
khác với hàm lượng ít hcfn nhiều như chymopapain, lysozym, peptidase A,
lipase... [26,402], [34, 1154]
Papain CÓ ký hiệu là E.c. 3.4.22.2 trong hệ thống phân loại enzym [25,
11]. Papain ỏ dạng kết tinh hay bột có màu trắng hơi vàng, dễ tan trong nước
và glycerin, khồng tan trong phần lổfn các dung môi hữu cơ. Papain có phồn tử
lượng 23400 [15, 473] (còn nếu coi papain là một hỗn hợp enzym thì phân tử
lượng của nó vào khoảng 21000 - 23700 [26, 402]). Cấu trúc bậc 1 của nó
gồm 212 acid amin với trung tâm hoạt động là cystein ở vị trí 25 có mang
nhóm -SH. Điểm đẳng điện của papain Ịà pHj = 8,75. Papain là một protease
tương đối bền. Nó ổn định và hoạt động ưong khoảng pH tưcfng đối rộng (3-

15


11), bền vững trong dung dịch trung tính. Nó có thể chịu được nhiệt độ 70°c ở
pH 7 trong 30 phút mà không mất hoạt tính, ở dạng bột, papain có thể chịu
được nhiệt độ sấy khô tới 100°c trong 3 giờ. Tuy nhiên, pH và nhiệt độ tốt
nhất cho hoạt động của papain là ở pH 5 - 7, và nhiệt độ 60 - 70°c, íuỳ theo
từng loại cơ chất. [26, 402], [34, 1154] (Cũng có tài liệu cho rằng à nhiệt độ
cao hcfn 90°c, papain sẽ mất tác dụng [8, 361]).
Papain được hoạt hoá bởi các chất khử (ví dụ, thioglycolat, glutathion,
cystein, sulfid, bisulfid, thiosulfat, cyanid), là nh&ig chất làm cho trung tâm
hoạt động của papain ở dạng nhóm -SH. Papain bị bất hoạt khi nhóm -SH bị
oxy hóa, chuyển thành liên kết disulfua. Các chất ức chế papain là các chất
oxy hóa, các thuốc thử phản ứng với nhóm -SH (ví dụ như iodoacetat,
iodoacetamid, meửiyl bromid, N-ethylmaleimid), các ion kim loại nặng (ví dụ,
và các muối thủy ngân hữu cơ. Sự bất hoạt

papain dưới tác đông của các kim loại nặng có tính thuận nghịch, nó được
phục hồi khi có mặt EDTA và các chất khử (ví dụ như cystein). [26, 402-403^
2.2.2.2. Tác dụng sinh học và dược lý của papain:
Papain làm mềm thịt ăn, làm trong đồ uống và làm mềm da. Papain
phân huỷ protein, đồng thời cũng được dùng làm xúc tác trong tổng hợp các
chất angiotensin, dynorphin, enkaphalin, peptid... [15,473
Papain có tác dụng chống viêm, chống phù. Nó có khả năng tiêu huỷ
các mô chết mà không làm ảiih hưởng tới các mô xung quanh. Tuy nhiên, ò
một số cá tìiể, papain có thể gây phản ứng dị ứng như làm ngứa, rộp khi dùng
ngoài da hoặc gây viêm dạ dày khi dùng trong. [26,403]
Papain có tác dụng trị giun đũa, giun kim, sán lợn, làm một số vi trùng
Gram (-) và Gram (+) ngtag phát triển. Papain còn có tác đụng làm đông sữa,
tác dụng giảm độc đối với toxin và toxalbumin, alcaloid. [8, 362], [26,403 J
Nhờ các tác dụng trên, trong y dược, người ta sử dụng papain làm thuốc

16


tẩy giun, trợ giúp tiêu hoá trong những trường hợp đầy bụng khó tiêu, viêm dạ
dày — ruột. Papain còn được sử dụng hỗ trợ trong các trường hợp viêm, phù
sau phẫu thuật, sau chấn thương, nhiễm trùng và dị ứng. Nó còn được sử dụng
trong các loại kem dưỡng đa, kem đánh răng, trong chế phẩm làm sạch kính
tiếp xúc mềm... [26, 403J
2.2.2.3. Một số chế phẩm chống viêm chứa papain có ở Việt Nam;
® Papase (Anh): [4, 1181]
-

Dạng thuốc: Viên nén chứa 10000 đơn vị enzym phân huỷ protein chiết
xuất từ cây đu đủ, chủ yếu là papain.

-

Tác đụng và chỉ định: Chống viêm và phù nề; điều trị và phòng chứng phù
nề và viêm kèm theo các tổn thưoíng do chấn thưoìig, nhiễm khuẩn hoặc
phản ứng viêm.

-

Liều đùng: Ngày đầu, dùng 4 lần/ ngày X 2 viên.
Ngày sau, dùng 4 lần/ ngày X 1 viên.
Dùng ít nhất 5 ngày liền.

-

CCĐ; Bệnh máu chậm đông, dùng phối hợp với thuốc chống đông.

® Papaynol: [4, 1181]
-

Dạng thuốc; Siro 80mg papain/ 20g
Viên nén, viên nhện 0 ,lg papain

-

Tác dụng: Phân huỷ protein.

-

Chỉ định: Chậm tiêu, viêm dạ dày, ruột.

-

Liều dùng; Ngày 0,2 - 1,0g chia 2 - 3 lần vào ngay sau bữa ăn.

CD Lysopaine (Boehringer Ingelheim); f ỉ 6, 347], [28, 548]
-

Dạng thuốc: Viên ngậm, ống 24 viên.

-

Thành phần (cho 1 viên):
Lysozym chlorhydrat (26000 uFIP/ mg)
Papain (30 nK/ mg)

5mg
2mg

Bacitracin

200UI

17


Tinh dầu bạc hà
-

Tác dụng: Chống viêm, kháng khuẩn và kháng virus.

-

Q iỉ định: Các trường hợp viêm, nhiễm trùng ồ vùng miệng, hầu, thanh
quản, tưa lưỡi, viêm amidan; điều trị ưước và sau phẫu thuật thanh quản,
rạch ap-xe, cắt amiđan, nhổ răng.

-

Liều dùng: 4-6 viên/ ngày, ngậm cho tan từ từ (không nhai hoặc nuốt).

-

Chống chỉ định; Trẻ còn bú (đo có tinh dầu bạc hà).

2.3, Một sô được liệu có tác dụng chòng viêm:
Trong dân gian, từ lâu người ta đã biết đến và sử dụng nhiều dược liệu
có tác dụng chống viêm như ngưu tất, bồ công anh, Hên kiều, hoàng cầm...
Các dược liệu này cũng đã được nghiên cứu về thành phần hoá học, tác dụng
dược lý, tác dụng sinh học...
2.3.ỉ. Ngưu tất (Achyranthes bidentata Blume. Amaranthaceae) [3, 219-220],
[5, 856], [8.48-49J
“ Ngưu tất còn có tên là cây cỏ xước, hoài ngưu tất. Bộ phận dùng là rễ phơi
hay sấy khô.
- Thành phần hoá học: Trong rễ nguH tất có saponin triterpen mà phần genin là
acid oleanic C30H48O3, các sterol ecdysteron, inokosteron, muối kaỉi.
- Tính vị: Vị chua, đắng, tính bình, khống độc, quy kinh can, thận. Có tác
dụng phá huyết, hành ứ (sống), bổ can thân, mạnh gân cốt (chếbiến chín).
- Tác dụng dược lý; làm giảm sức co bóp của tim ếch, ức chế sự co bóp của
khúc tá tràng, hoi gây lợi tiểu, liều cao có tác dụng kích thích tử cung, gây hạ
cholesterol máu, hạ huyết ấp, chống viêm.

- Công dụng: Nguxi tất được dùng để chữa thấp khófp, đau lưng, bế kinh, cao
huyết áp, tăng cholesterol máu, vữa xơ động mạch, chẫh thưoíng tụ máu, viêm
họng.
2.3.2. Hoàng cầm (Scutellaria baicalensis Georg. Lamiaceae): 15, 560], [8,

18


311-314]
- Bộ phận dùng là rễ phơi hay sấy khồ của cây hoàng cầm.
- Thành phần hoá học: Trong rễ hoàng cầm có tinh dầu, các dẫn xuất của
ílavon như baicalin Q iH igO ii, scutelarin (hay woogonin) C16H 12O 11

tanin

và chất nhựa.
- Tính vị: Vị đắng, tính hàn, quy kinh tâm, phế, can, đẻfm và đại tràng. Có tác
dụng thanh nhiệt táo thấp, tả hoả, giải độc, cầm máu, an thai.
- Tác dụng dược lý: hạ huyết áp, có tác dụng ức chế nhiều loại vi trùng như
bạch hầu, tả, tụ cầu..., giảm sốt, lợi tiểu, có tác dụng của vitamin p, rất ít độc.
- Công dụng: Hoàng cầm được dùng để chữa cao huyết áp, nhức đầu, mất ngủ,
sốt cao kéo đài, ho, kiết lỵ, đái dắt, ung nhọt, nôn ra máu, chảy máu cam, đi
ngoài ra máu, băng huyết, động thai.

19


___ _

_ ________ _ _

_ __A__ ___V _______ ,

____^ __ _________ A _ _ _ ^ ■

PHAN 3. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u

3.1. Nguyên liệu
3.1.Ỉ. Papain thô (nhựa đu đủ sấy khô tán bột), lấy từ quả cây đu đủ (Carica
papaya L. Papayaceae) thu tại vườn Viện Rau quả, Gia Lâm, Hà Nội.
Quả đu đủ xanh, còn ở ưên cây (chọn loại vừa, không già quá cũng
không non quá), dùng gạc mềm lau sạch vỏ quả. Dùng dao inox hoặc cật tre,
nứa rạch nhẹ nhàng dọc theo quả (không rạch sâu quá). Các đưòmg rạch cách
nhau khoảng 3 cm. Nhựa đu đủ chảy ra được hứng vào cốc sạch, bảo quản
lạnh trong quá trình vận chuyển. Dàn mỏng nhựa ứiu được trên các khay tráng
men, sấy ở nhiệt độ 50 - 6 0°c cho khô, tiếp tục sấy ở 80®c đến khô hoàn toàn.
Nghiền nhỏ được bột papain thô. Bảo quản trong lọ sạch, nút kín, đặt trong
bình hút ẩm.

3.1.2. Papain đã sơ bộ tinh ch ế hằng phương pháp đông khô (gọi tắt là papain
đông khô).
Nhựa đu đủ đã sấy khô, tán bột, đem đồng íhể trong nước cất đã được
làm lạnh từ trước tới khoảng 0 - 4°c. Quá trình đồng thể được tiến hành trong
thiết bị chuyên dùng, được ngâm trong nước đá đang tan. Sau khỉ đồng thể lần
thứ nhất, chắt lấy dịch trong. Nhựa còn lại được cho thêm nước cất đã làm
lạnh tới khoảng 0 - 4°c, tiếp tục đồng thể lần thứ 2 và thu lấy dịch trong như ồ
trên. Các dịch trong được đem ly tâm lanh 1 hoặc 2 lần với tốc độ 10000
vòng/ phút, trong 30 phút ở nhiệt độ 4"C. Dịch ly tâm thu được đem rót vào
các bình nón thuỷ tinh sạch, dung tích 250 nil (các bình nón này đã được làm
lạnh từ trước bằng cách để vào ngăn đá tủ lạnh khoảng 30 phút). Lượng dịch

trong mỗi bình chỉ dày khoảng 4 mm. Để các bình nón qua đêm trong ngân đá
tủ lạnh ờ nhiệt độ khoảng

-15°c . Khỏd động máy đông khô để hệ thống

làm

lạnh và bcfm chân không hoạt động. Khi đạt tới nhiệt độ và áp suất cần thiết,

20


lắp các bình nón vào máy và tiến hành đông khô liên tục trong 8 giờ, thu được
các tinh thể xốp nhẹ, màu vàng nhạt. Bảo quản papain đồng khô trong lọ sạch,
nút kín, đặt trong bình hút ẩm. Sơ đồ quá trình đó diễn ra như sau:
Nhựa khô

ị
Đồng thể

Nước cất 0 - 4 °c

Nhựa
Dịch trong

Ly tâm lanh
lOOOOv/ phút X 30 phút

Dịch ly tâm

Làm lạnh

Đông khô

Tinh thể

Đóng lọ, bảo quản
Hình 2. Sơ đồ tinh chế papain bằng phưoíng pháp đông khô
3 J .3. Các dược liệu khác:
- Ngưu tất: Đạt tiêu chuẩn DĐVN [3, 219-220], [8,48-49] được sắc bằng nước
3 lần. Các dịch sắc được gộp lại và cô bớt nước, còn lại dịch sắc tưcfng ứng vód
5g ngưu tất/ 50 ml.

21


- Hoàng cầm: Đạt tiêu chuẩn làm thuốc [8, 311-314J, được sắc bằng nước 3
lần. Các dịch sắc được gộp lại và cô bớt nước, còn lại dịch sắc tương ứng với
5g hoàng cầm/ 50 ml.

3.2. Súc vật thí nghiệm:
- Chuột nhắt trắng thuần chủng giống Swiss, đực và cái, nuôi ưong cùng điều
kiện, cân nặng 20 - 22 gram, do viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp.
- Chuột lớn trắng thuần chủng giống Swiss, đực và cái, nuôi trong cùng điều
kiện, cân nặng khoảng 100 gram, do viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp.

3.3. Thiết bỊ, dụng cụ:
- Máy điện di Biometra.
- Máy ly tâm thường Hettich zentrifugen EBA 12.
- Máy ly tâm lạnh Biofuge 15R.

Nơi nhúng
chân chuột

- Máy đông khồ Jouan LP3
- Máy đo quang Trung Quốc 752.
- Tủ lạnh.

I

Thang chia dộ
— Dung dịch màu

Ihủy ngân

- Tủ sấy.
“ Thiết bị điều nhiệt.
- Dụng cụ thuỷ ngân có chia độ dùng đo thể
...................

tích chân chuột (Hìiứi 3).

Hình 3. Dụng cụ đo thể tích chán chuột

3.4. Hoá chất thí nghiệm:
3.4.Ỉ. Thuốc íhửGornaỉỉ. [18, 223]
3.4.2. Dung dịch Casein ỉ,2% :
Cân chính xác 1,20 g casein cho vào cốc có mỏ đã đánh dấu sả i vạch
100 ml. Thêm dung dịch đệm phosphat 0,03M (pH = 7,5) vừa đủ 100 ml. Đun
cách thuỷ đến tan hoàn toàn, vừa đun vừa khuấy đều. Bổ sung dung dịch đệm

22