Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh bêta lac tam trong chế phẩm bằng điện di mao quản

Mục lục
ĐẶT VẤN ĐỀ
PHẦN 1- TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về điện di mao quản
1.1.1. Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản
1.1.2. Điện di mao quản vùng
1.1.3. Sắc ký điện động Mixen (MEKC)
1.1.4. Một số ưu điểm của CE
1.2 Đại cương kháng sinh β-lactam
1.2.1. Đại cương chung kháng sinh β-lactam
1.2.2. Amoxicilin trihydrat
1.2.3. Kali clavulanat
1.2.4. Cefuroxime axetil
1.2.5. Kết hợp Amoxicilin và Kali clavulanat
1.3. Một số phương pháp định lượng kháng sinh b-lactam
1.3.1. Định lượng Penicilin
1.3.2. Định lượng kháng sinh Cephalosporin
1.3.3. Một số chương trình định lượng kháng sinh bằng phương pháp
điện di mao quản
PHẦN 2- ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Các chế phẩm có một hoạt chất
2.1.2. Các chế phẩm kết hợp hai thành phần
2.2. Điều kiện nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất và chất đối chiếu
2.2.2. Thiết bị - dụng cụ
2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Xây dựng phương pháp định lượng Cefuroxime axetil trong viên
nén
2.3.2. Xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Amoxicilin và Kali
clavulanat trong viên nén và bột cốm

2.3.3. Xử lý số liệu thực nghiệm

Trang

1
3
3
3
14
15
17
18
18
20
20
21
22
23
23
27
28
30
30
30
30
31
31
31
32
32

34
35


Phần 3-THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Xây dựng phương pháp CZE để định lượng Cefuroxime axetil
trong viên nén
3.1.1.Lựa chọn điều kiện điện di
3.1.2.Chuẩn bị dung dịch chuẩn
3.1.3. Thẩm định phương pháp định lượng
3.1.4. Kết quả định lượng Cefuroxime axetil trong chế phẩm
3.2. Xây dựng phương pháp MEKC để định lượng đồng thời Amoxicilin
và Kali clavulanat trong viên nén và bột cốm
3.2.1. Lựa chọn điều kiện điện di
3.2.2 Chọn chất nội chuẩn
3.2.3 Chuẩn bị mẫu chuẩn
3.2.4. Thẩm định phương pháp định lượng
3.2.5. Kết quả định lượng Amoxicilin và Kali clavulanat trong chế phẩm
Phần 4 – BÀN LUẬN
4.1. Về điện thế
4.2. Về ưu điểm của phương pháp MEKC
4.3. Về việc xử lý mẫu
4.4. Về dung dịch điện di nền
4.5. Về chất nội chuẩn
Phần 5 – KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
5.1. Kết luận
5.2. Đề xuất
TÀI LIỆU THAM KHẢO

38

38
38
40
40
46
49
49
52
52
53
60
63
63
65
66
66
66
69
69
70
71


Danh mục các bảng
Trang

Bảng 1.1 - Một số kiểu điện di và cơ chế tách
Bảng 1.2 - Một số chương trình CE định lượng các kháng sinh b-lactam
Bảng 3.1 - Các hệ đệm được dùng để khảo sát phương pháp CZE với Cefu
Bảng 3.2 - Diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ Cefu tương ứng.

Bảng 3.3 - Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp CZE trong định
lượng Cefu
Bảng 3.4 - Kết quả xác định độ đúng của phương pháp CZE trong định
lượng Cefu.
Bảng 3.5 - Kết quả định lượng viên nén Zinnat 125mg.
Bảng 3.6 - Kết quả định lượng viên nén Zinmax.
Bảng 3.7 - Dãy dung dịch khảo sát nồng độ tuyến tính trong định lượng
hỗn hợp Amox và Clavu
Bảng 3.8 - Diện tích pic của Amox và chất nội chuẩn của các mẫu.
Bảng 3.9 - Diện tích pic của Clavu và chất nội chuẩn của các mẫu.
Bảng 3.10 - Nồng độ của Amox và Clavu xác định độ lặp lại.
Bảng 3.11 - Kết quả xác định độ lặp lại của phương pháp.
Bảng 3.12 - Kết quả xác định độ đúng với định lượng Amox.
Bảng 3.13 - Kết quả xác định độ đúng định lượng Clavu.
Bảng 3.14 - Kết quả định lượng viên nén Augmex.
Bảng 3.15 - Kết quả định lượng bột cốm Augbactam.
Bảng 4.1 - Kết quả kiểm định chuẩn nội với dẫy mẫu có nồng độ Amox
thay đổi có nồng độ Clavu (0,35 mg/mL) và nồng độ IS
(0,055mg/mL) cố định

11
29
38
42
44
45
47
48
53
54

55
57
57
58
59
61
62

68


Danh mục các Hình
Trang

Hình 1.1 - Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản
Hình 1.2 - Dòng EOF trong mao quản silica
Hình 1.3 - Thứ tự rửa giải trên điện di đồ
Hình 1.4 - Đổi chiều EOF nhờ các chất hoạt động bề mặt cation.
Hình 1.5 - Sơ đồ hệ thống điện di
Hình 1.6 - Quá trình tách các chất trong CZE
Hình 1.7 - Cấu trúc của các Mixen và EOF trong MEKC
Hình 3.1 - Phổ hấp thụ UV-VIS của Cefuroxime axetil trong đệm A3.
Hình 3.2 - Chồng pic điện di đồ của Cefu trong mẫu chuẩn và mẫu thử
Hình 3.3 - Chồng pic điện di đồ của Amox, Clavu và IS trong mẫu chuẩn
và mẫu thử
Hình 3.4 - Điện di đồ của dung dịch chuẩn Cefu trong dãy nồng độ khảo
Hình 3.5 - Quan hệ của diện tích pic trên điện di đồ và nồng độ Cefu.
Hình 3.6 - Điện di đồ của mẫu thu được từ viên nén Zinnat 125mg
Hình 3.7 - Điện di đồ của mẫu thu được từ viên nén Zinmax
Hình 3.8 - Phổ hấp thụ UV-VIS của Kali clavulanat trong hệ đệm A.

Hình 3.9 - Phổ hấp thụ UV-VIS của Amoxicilin trihydrat trong hệ đệm A.
Hình 3.10 - Điện di đồ khảo sát khoảng tuyến tính của Amox và Clavu so
với nội chuẩn
Hình 3.11 - Quan hệ giữa tỷ lệ diện tích pic của Amox và chất nội chuẩn
và nồng độ của Amox.
Hình 3.12 - Quan hệ giữa tỷ lệ diện tích pic của Clavu và chất nội chuẩn
và nồng độ của Clavu.
Hình 3.13 - Điện di đồ định lượng viên nén Augmex
Hình 3.14 - Điện di đồ định lượng bột cốm Augbactam.
Hình 4.1 - Điện di đồ Cefu bằng phương pháp CZE ở điện thế 25kV.
Hình 4.2 - Điện di đồ Amox và Clavu bằng phương pháp MEKC ở điện thế
30kV.
Hình 4.3 - Điện di đồ CZE của hỗn hợp Amox, Clavu và chất nội chuẩn

3
5
7
9
13
15
16
39
41
41
42
43
47
48
50
51

54
55
56
61
62
63
64
65


Các chữ viết tắt
Amox

Amoxicilin trihydrat

Cefu

Cefuroxime axetil

Clavu

Kali clavulanat

CZE

Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis).

H%

Hệ số thu hồi

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao

IS

Chuẩn nội

MEKC

Sắc ký điện động Mixen (Micellar Electrokinetic Chromatography).

MeOH

Methanol

PA

Tinh khiết phân tích

RSD%

Độ lệch chuẩn tương đối (Relative Standard Deviation)

SDS

Sodium dodecyl sulfat

SKS

Số kiểm soát


Lời cảm ơn
Tôi xin bầy tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Thái Nguyễn
Hùng Thu đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện thuận lợi
nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Từ Minh Koóng, các
thầy cô trong Ban Giám hiệu và trong nhà trường, Phòng
Đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong
thời gian học tập tại trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Trần Tử An và Bộ
môn Phân Tích Trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình giúp
đỡ tôi trong quá trình học tập và làm thực nghiệm.
Xin trân trọng cảm ơn Ban giám đốc Viện Kiểm
Nghiệm, tập thể cán bộ phòng Mỹ Phẩm đã tạo điều kiện
thuận lợi cho tôi trong thời gian làm luận văn.
Cuối cùng xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động
viên khích lệ, giúp đỡ tôi tận tình.
Hà Nội, ngày 10 tháng10 năm 2006

Tống Thị Thanh Vượng


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay trên thị trường thuốc Việt Nam đang lưu hành rất nhiều chế
phẩm kháng sinh sản xuất trong nước cũng như nhập từ nước ngoài với

nhiều loại hoạt chất và dạng bào chế khác nhau (thuốc tiêm, viên, bột,
nước...). Do điều kiện khí hậu nhiệt đới cũng như môi trường sống chưa đảm
bảo vệ sinh, các bệnh nhiễm khuẩn là một nhóm quan trọng trong cơ cấu
bệnh học của nước ta. Vì thế mà kháng sinh là một nhóm dược phẩm có tỷ
trọng lớn trên thị trường Việt Nam, có mặt trong hơn 35% các đơn thuốc
được kê. Để đảm bảo hiệu quả trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc
quản lý chất lượng thuốc kháng sinh là rất cần thiết. Vì vậy cần có những
phương pháp phân tích có độ tin cậy cao nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt
chất lượng thuốc kháng sinh.
Cho tới nay, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân
tích hóa lý đã được đa số các dược điển quốc tế lựa chọn làm phương pháp
để định lượng nhiều kháng sinh [9]. Ưu điểm của phương pháp này là có độ
lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã
được tích hợp với hầu hết các kỹ thuật phát hiện hóa lý hiện có (phổ UVVIS, phân tích điện hóa, phổ MS, NMR...) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ
thấp giới hạn phát hiện của phép phân tích. Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi
hỏi sử dụng các dung môi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại ảnh
hưởng xấu đến sức khỏe của những người làm công tác phân tích và gây ô
nhiễm môi trường. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển
phương pháp định lượng kháng sinh dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế
cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách phân
tích mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao
quản (Capillary Electrophoresis - CE).


2
Căn cứ đầu tiên cho sự lựa chọn là một số ưu điểm nổi bật của CE so
với HPLC. Trong khi HPLC, nhất là sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
(Reversed-phase liquid chromatography) tương đối hạn chế trong phân tích
các chất có khả năng ion hóa, thì CE có phạm vi áp dụng rộng hơn nhiều, có
thể áp dụng cho phân tích cả các chất ion hóa lẫn các chất không ion hóa.

Thêm vào đó, phân tích bằng CE tốn ít hóa chất hơn HPLC. Kỹ thuật CE
phần lớn thực hiện trong các dung dịch đệm rất ít sử dụng dung môi hữu cơ,
nên chi phí vận hành rẻ hơn nhiều đồng thời lại ít độc hại cho môi trường và
người sử dụng. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ kỹ
thuật sắc ký lỏng trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có các lĩnh vực
nghiên cứu về dược.
Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã quy định trong Dược điển một
số nước như Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc.... Tuy nhiên tại Việt Nam, CE chưa
được ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dược phẩm
còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình sẽ rất
có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc tại
nước ta.
Từ những phân tích trên và nhằm góp phần nâng cao chất lượng việc
xây dựng tiêu chuẩn và quản lý các thuốc kháng sinh đang lưu hành
trên thị trường chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
"Nghiên cứu phân tích một số kháng sinh β - lactam trong chế phẩm
bằng điện di mao quản".
Với các mục tiêu sau:
 Xây dựng một số chương trình điện di phù hợp và ổn định để định lượng
một số kháng sinh β-lactam dưới dạng đơn thành phần hay hỗn hợp.
 áp dụng các chương trình xây dựng được vào định lượng một số kháng
sinh β-lactam trong một số dạng chế phẩm thông dụng.


3

PHẦN 1

TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về điện di mao quản:

1.1.1. Cơ chế của quá trình điện di trong mao quản:
Điện di mao quản là một kỹ thuật tách phân tích được Việt hoá từ
thuật ngữ Capillary Electrophoresis, thường được gọi tắt là CE.
Nguyên tắc của quá trình tách trong điện di mao quản là dựa trên cơ sở
tính chất điện di khác nhau của các phần tử chất tan. Quá trình này xẩy ra
trong mao quản trên nền của dung dịch chất điện ly có pH thích hợp, dưới
tác dụng của một điện trường E xác định đặt vào hai đầu mao quản.
Cơ chế của điện di là sự di chuyển của các phần tử chất tan trong mao
quản dưới tác dụng của lực điện trường nhất định (Electric Field Force,
được viết tắt là EFF) và tính chất của dòng chảy điện thẩm (Electro-Osmotic
Flow, được viết tắt là EOF). EOF là một loại của dòng chảy khối của chất
lỏng trong mao quản. Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành
mao quản. EOF sẽ quyết định thời gian tồn tại của chất tan trong mao quản.
Nó tồn tại bao trùm lên dòng di chuyển của chất tan, nghĩa là chất tan di
chuyển trong dòng này [15].

Hình 1.1 - Sự di chuyển của ion và phân tử trong mao quản


4
Thế tạo ra điện trường E đặt vào hai đầu mao quản được dùng trong
kỹ thuật CE là rất lớn, thông thường từ 10 - 30 kV. Chính lực điện trường
này làm động lực cho các phần tử chất tan di chuyển theo một hướng nhất
định và các chất có điện tích và độ lớn khác nhau sẽ di chuyển với các tốc độ
khác nhau. Do đó mà tạo nên sự tách của các chất phân tích.
Mao quản sử dụng trong CE thường có độ dài từ 25 đến 100 cm,
đường kính trong (id) 25 - 100 µm. Loại mao quản có đường kính trong
khoảng 50 - 75µm là thích hợp nhất vì hiệu ứng nhiệt nhỏ, dễ khống chế
nhiệt độ mao quản. Mao quản được chế tạo từ nhiều vật liệu khác nhau,
nhưng phổ biến nhất là silica nung chảy (fused silica). Trên thực tế hầu hết

các nghiên cứu đã thực hiện bằng CE cho tới nay đều tiến hành trên loại mao
quản này. Đây cũng là loại mao quản chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu
của mình. Do đó chúng tôi sẽ trình bày kỹ cơ chế của quá trình điện di xảy ra
với mao quản silica nung chảy[4],[7].
1.1.1.1. Dòng điện thẩm:
Dòng điện thẩm (EOF) được Việt hoá từ thuật ngữ Electro-osmotic
flow hoặc Electroendosmotic flow. Trong CE dòng điện thẩm EOF là một
thành phần cơ bản tạo nên sự di chuyển của toàn bộ dung dịch trong mao
quản bắt nguồn từ điện tích bề mặt của thành trong mao quản.
 Nguồn gốc EOF:
Khi điện di với mao quản silica, các nhóm silanol (SiOH) ở trên thành
mao quản sẽ giải phóng ra H+ vào dung dịch và bề mặt thành mao quản sẽ
P

P

mang điện tích âm. Quá trình giải phóng H+ phụ thuộc vào hằng số cân bằng
P

P

K. Với mao quản silica, khó xác định chính xác trị số K, nhưng thực nghiệm
chỉ rõ dòng EOF có giá trị đáng kể khi pH dung dịch trên 4. Các vật liệu
không ion hoá như Teflon dùng làm mao quản cũng cho dòng EOF vì nó hấp


5
phụ các anion[4].

Hình 1.2 - Dòng EOF trong mao quản silica [15]

a) Bề mặt mao quản silica tích điện âm (SiO-)
P

P

b) Các cation hydrat hoá tập trung gần bề mặt mao quản.
c) Khối dung dịch trong mao quản di chuyển về catod dưới tác dụng của điện
trường (dòng EOF).

Vì bề mặt thành trong mao quản mang điện tích âm, nên đối ion (chủ
yếu là cation) do lực hút tĩnh điện sẽ tạo thành một lớp điện kép để cân bằng
điện tích và tạo nên một hiệu điện thế ở vùng sát thành mao quản gọi là thế


6
Zeta (ζ). Khi có áp thế vào mao quản, các cation trong lớp điện kép khuếch
tán sẽ di chuyển về phía catod. Nhưng các cation này bị solvat hoá nên kéo
theo cả khối dung dịch trong mao quản về catod. Sự di chuyển của khối dung
dịch trong mao quản silica dưới tác dụng của điện trường gọi là dòng điện
thẩm EOF.
Thế Zeta ζ được xác định chủ yếu bằng điện tích bề mặt của thành mao
quản. Điện tích phụ thuộc vào pH, vì vậy trị số EOF thay đổi theo pH. ở pH
càng cao, các nhóm silanol mất proton H+ càng nhiều nên trị số dòng EOF
P

P

càng lớn. Phụ thuộc vào điều kiện điện di cụ thể, với pH trong khoảng 2-12
dòng EOF có thể thay đổi.
Ngoài pH dung dịch điện di, dòng EOF sẽ thay đổi khi:

- Lực ion của dung dịch tăng lên, làm giảm thế Zeta nên dòng EOF giảm.
- Trong một số trường hợp dung dịch đệm nước có thêm một số dung dịch
hữu cơ như methanol, acetonitril (để hoà tan chất phân tích), hằng số điện
môi của dung dịch điện di giảm xuống kéo theo sự giảm của dòng EOF.
 Hai đặc điểm của EOF:
* Đặc điểm đầu tiên của dòng EOF là tạo nên một dòng chuyển khối
phẳng trong mao quản. Bởi vì lực tạo ra sự di chuyển của EOF phân bố đồng
nhất dọc theo mao quản, cho nên không có sụt áp trong mao quản: dòng
đồng nhất từ đầu này đến đầu kia của mao quản. Nếu dùng bơm đẩy dung
dịch như trong LC thì dòng chảy sẽ có dạng parabol (do hiệu ứng thành: các
phân tử giữa dòng di chuyển với tốc độ cực đại, các phân tử gần thành di
chuyển với tốc độ chậm hơn nhiều và dần tới có tốc độ bằng 0).
Tuy nhiên tính chất tạo dòng chuyển khối phẳng của dung dịch điện di
chỉ xuất hiện khi đường kính trong mao quản (d i ) < 200 µm. Nếu đường kính
R

R

trong của mao quản vượt quá xa 200 µm thì sức căng bề mặt không đủ tạo


7
ra sự di chuyển đồng nhất giữa phần chất lỏng ở giữa và ở gần thành mao
quản.
* Đặc điểm thứ hai của dòng EOF là đưa tất cả các tiểu phân có mặt
trong dung dịch điện di (bất kể có điện tích hay không) di chuyển theo cùng
một hướng. Với điều kiện thông thường (thành mao quản tích điện âm), dòng
này di chuyển về catod. Các anion cũng sẽ di chuyển về phía catod vì tốc độ
EOF lớn hơn nhiều so với tốc độ điện di.
Cation di chuyển nhanh nhất do lực điện di và EOF cùng hướng, tiếp

theo là các chất không mang điện tích di chuyển theo EOF nhưng không tách
khỏi nhau được. Cuối cùng là anion. Trên điện di đồ thứ tự rửa giải theo thời
gian như sau: cation có điện tích lớn kích thước nhỏ ra trước nhất, anion có
điện tích lớn và kích thước nhỏ ra cuối cùng.

+

_
_
_

_

_

+

+

+
+
+

_

Hình 1.3 - Thứ tự rửa giải trên điện di đồ
 Kiểm soát EOF:
EOF là một trong các thông số cơ bản quyết định quá trình điện di, vì
vậy cần phải được kiểm soát. ở pH cao, EOF có thể quá lớn làm cho quá
trình rửa giải các chất khỏi mao quản xẩy ra quá nhanh khi chưa kịp tách

khỏi nhau. Ngược lại ở pH thấp, thành mao quản mang điện tích âm có thể
hấp phụ cation nhờ lực hút tĩnh điện. Điều đó có thể gây khó khăn khi điện
di tách protein base. Trong một số kỹ thuật CE thường cần giảm EOF.
Để kiểm soát dòng điện thẩm người ta thường tìm cách thay đổi điện
tích bề mặt mao quản hoặc độ nhớt của dung dịch điện di. Có thể thống kê
một số yếu tố làm tăng EOF:


8
- Tăng thế áp vào hai đầu mao quản.
- Tăng pH của dung dịch điện di (trong khoảng 2-12).
- Tăng nhiệt độ điện di.
- Giảm nồng độ các chất trong dung dịch (giảm lực ion).
Ngoài ra thay đổi thành mao quản có thể gây ra giảm, loại trừ hoặc đổi
chiều của EOF. Trên hình 1.3 mô tả rửa giải theo thứ tự: cation, các chất
trung hoà, cuối cùng anion. Nếu bây giờ cần phân tích anion, thời gian rửa
giải có thể giảm xuống bằng cách đổi chiều EOF và đổi cực của thế áp mao
quản. Thứ tự rửa giải sẽ là: anion, các chất trung hoà, rồi đến cation.
Để làm đổi chiều EOF, người ta thường thêm vào dung dịch một muối
alkyl amoni bậc 4. Đầu thân nước mang điện tích dương sẽ cố định với nhóm
SiO- của thành mao quản nhờ tương tác ion. Phần sơ nước của hydrocarbon
P

P

sẽ liên kết (tương tác sơ nước) với các phân tử muối alkyl amoni tự do. Đầu
mang điện tích dương của muối này sẽ hút các anion của dung dịch. Các
anion hydrat hoá này sẽ di chuyển về phía anod kéo toàn bộ khối dung dịch
trong mao quản đi theo, tạo ra EOF di chuyển về phía anod.

9

Hình 1.4 - Đổi chiều EOF nhờ các chất hoạt động bề mặt cation.
Các muối alkyl amoni bậc 4 thường dùng cho đổi chiều EOF là: Cetyl
trimetyl amoni bromid (CTAB) hoặc clorid (CTAC), Tetradecyl trimetyl
amoni bromid (TTAB). Ngoài ra có thể dùng dietylen triamin (DETA) [12].
1.1.1.2. Các thông số phân tích của CE:
 Thời gian di chuyển t M (migration times):
R

R

Thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ khi đưa vào mao quản
đến thời điểm được phát hiện bởi detector được gọi là thời gian di chuyển t M .
R

R

Quãng đường di chuyển là chiều dài hiệu dụng của mao quản. Đó là
độ dài từ điểm tiêm mẫu đến điểm phát hiện. Tốc độ di chuyển gồm hai
thành phần:
-Tốc độ điện di của ion:
vep = µ ep .E = µ ep .

-Tốc độ điện thẩm, tốc độ EOF:

V
L

10
veo = µ eo .E = µ eo .

V
L

Thời gian di chuyển của ion chất tan sẽ là:
tM =

trong đó:

l
l
l .L
=
=
vep + veo ( µ ep + µ eo ).E ( µ ep + µ eo ).V

l : chiều dài hiệu dụng của mao quản (cm).
V : thế áp vào 2 đầu mao quản có chiều dài là l (cm).
µ ep + µ eo =µ a : linh độ biểu kiến.
R

R

R

R

R

R

 Tốc độ di chuyển:
Tốc độ di chuyển của một ion ν i được xác định bằng:
R

R

vi = µ ep .E

µ ep : linh độ điện di của ion chất tan (cm2/(V.s)).
R

R

P

P

E : cường độ điện trường (V/cm).

Linh độ µ ep là cơ sở tách bằng điện di, phụ thuộc vào nhiều yếu tố
R

R

của môi trường điện di, thể hiện ở:
- Lực điện F e gây ra sự chuyển động của các ion: F e = q.E

R

R

R

R

- Lực ma sát của môi trường điện di cho ion dạng hình cầu:
F f = -6 π η r i ν i
R

trong đó:

R

R

R

R

η: độ nhớt của dung dịch trong mao quản.
r i và ν i : bán kính và tốc độ di chuyển của ion.
R

R

R

R

dấu (-) thể hiện lực F f ngược chiều với F e (qui ước lấy dấu +).
R

R

R

R

Quá trình điện di đạt trạng thái ổn định khi hai lực trên (F e và F f ) bằng
R

R

R

R

nhau: qE =6 π η r i ν i
R

R

R

 Số đĩa lý thuyết của cột mao quản:
N=

µ aVl
2 DL

=

µ a El
2D

D: Hệ số khuếch tán của chất phân tích di chuyển ra khỏi cột với thời gian t.


11
 Độ phân giải của hai chất (R):
R=

với

N ∆µ
4 µ

∆µ=µ 2 - µ 1
R

R

R

1
2

µ = ( µ 2 + µ1 )

1.1.1.3. Phân loại CE
Theo cơ chế, bản chất và đặc điểm của sự tách trong mao quản mà
người ta thường phân chia thành các loại hay các kiểu khác nhau như trong
bảng 1.1.

Bảng 1.1 - Một số kiểu điện di và cơ chế tách
Kiểu điện di
1. Điện di mao quản vùng CZE
(capillary zone electrophoresis)
2. Sắc ký điện động mixen MEKC
(micellarelectrokinetic chromatography)
3. Điện di mao quản gel CGE
(capillary gel electrophoresis)
4. Điện sắc ký mao quản CEC
(capillary electrochromatography)

Cơ chế tách
Linh độ khác nhau của các
ion trong dung dịch tự do.
Tương tác sơ nước/ion với
hạt mixen trong dung dịch
Kích thước và điện tích
(molecular sieve)
Sự phân bố và linh độ khác
nhau của các chất.

1.1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng:
 Điện thế:

Thời gian phân tích sẽ tỷ lệ nghịch với điện thế đặt vào hai đầu mao
quản. Tuy nhiên nếu tăng điện thế lên quá cao sẽ sinh hiệu ứng Joule tạo ra


12
gradient nhiệt trong mao quản và dẫn đến thay đổi độ nhớt ở từng vùng trong
mao quản làm cho các phân tử ngay cả của một chất tan cũng di chuyển
không đồng nhất dẫn đến sự khuếch tán khác nhau và làm mở rộng vùng
mẫu.
 Nhiệt độ:
ảnh hưởng chính của nhiệt độ là làm thay đổi vận tốc và độ dẫn điện
của đệm. Trong một số trường hợp nếu nhiệt độ trong mao quản tăng là
nguyên nhân làm thay đổi cấu tạo của protein, làm thay đổi thời gian điện di
và hiệu quả phân tích.
 Cột mao quản:
Kích thước của cột mao quản (chiều dài và đường kính) ảnh hưởng
đến thời gian tách và hiệu quả phân tích. Nếu tăng cả hai yếu tố là chiều dài
hiệu dụng và chiều dài cột mao quản có thể làm giảm điện trường và tăng
thời gian phân tích.
 Dung dịch đệm:
• Loại đệm và nồng độ: Đệm thích hợp cho CE là đệm có tác dụng tốt nhất
trong dẫy đệm đã chọn và giảm thấp nhất sự sinh nhiệt trong đệm.
• pH: pH của đệm có thể tác dụng lên khả năng phân tích và làm thay đổi
EOF. Tăng pH của đệm thường gây tăng EOF.
• Dung môi hữu cơ: Dung môi hữu cơ có thể làm tăng khả năng tan của
một số chất tan trong đệm. Khi thêm dung môi hữu cơ vào trong đệm thường
làm giảm EOF.


13

1

5

2

3

4
Hình 1.5 - Sơ đồ hệ thống điện di
1. Điều nhiệt mao quản,

2. Dung dịch mẫu,

3. Dung dịch đệm,

4. Dung dịch đệm dự trữ,

5. Detector (DAD).

1.1.1.5. Thiết bị CE:
Sơ đồ một hệ thống điện di mao quản như trong hình 1.5, thường gồm
các bộ phận sau:
- Bộ phận buồng điện cực, các điện cực và bình điện cực
- Nguồn cấp thế cao một chiều (10-30 kV) biến thiên được.
- Cột tách- mao quản.
- Bộ phận nạp mẫu vào mao quản.
- Bộ phận phát hiện chất (detector).
- Bộ phận ghi sắc đồ (computer).

14
- Bộ phận điều nhiệt cho mao quản.
1.1.2. Điện di mao quản vùng :
1.1.2.1.Cơ sở điện di mao quản vùng:
Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis - CZE) là
phương pháp phân tích cơ bản nhất của kỹ thuật CE, do tính đơn giản của cơ
chế tách và tính linh hoạt của nó. Phương pháp này có phạm vi ứng dụng
rộng trong việc tách và phân tích nhiều loại hợp chất khác nhau, bao gồm các
amino acid, các peptid, các hợp chất cấu tạo ion, các hợp chất đồng phân
không gian và nhiều loại hợp chất có khả năng ionic hoá[7].
Đây là phương pháp tách dựa trên sự di chuyển của chất tan có điện tích
trong điện trường với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào độ linh động điện di
của chúng. Độ linh động điện di là đại lượng phụ thuộc vào điện tích ion,
chính xác hơn là tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của ion, bán kính của ion,
trạng thái của ion như mức độ ion hoá, trạng thái liên kết với các đối ion. Do
đó độ linh động điện di phụ thuộc vào hằng số điện môi, pH, độ nhớt của
dung dịch... Khi ta đặt một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, các tiểu
phân tích điện sẽ bắt đầu di chuyển, tất nhiên là về phía điện cực trái dấu.
Các ion có độ linh động điện di cao hơn sẽ di chuyển nhanh hơn, hình thành
các vùng các ion có độ linh động điện di tương tự nhau. Mặt khác khi đặt
một điện áp cao vào hai đầu của mao quản, ở một vùng pH đủ lớn, sẽ hình
thành một dòng điện thẩm.


15

Hình 1.6 - Quá trình tách các chất trong CZE
Trong mao quản silic dòng này hướng về phía cực âm (catod). Do các
ion dương có cùng hướng với dòng này cho nên tốc độ được tăng thêm, các

ion âm do không cùng hướng với dòng điện di thẩm thấu cho nên di chuyển
chậm lại và nếu không vượt được nó thì cũng bị cuốn đi về phía cực âm.
Các phân tử không tích điện sẽ di chuyển cùng tốc độ với dòng điện thẩm.
CZE là mô hình phân tích đơn giản nhất của CE. Hệ thống phân tích
CZE cũng chính là cơ sở xuất phát cho các kỹ thuật CE khác. Từ xuất phát
điểm là một mao quản với một dung dịch đệm nhất định (hay còn gọi là dung
dịch điện ly nền - Background Electrolyte Solution), người sử dụng chỉ cần
thêm vào một hay nhiều chất phụ gia (modifier) thích hợp là có thể chuyển
sang các kỹ thuật điện di khác. Tùy thuộc vào chất phụ thêm vào có nhiều kỹ
thuật CE khác nhau.
1.1.2.2. Ứng dụng của CZE :
Hiện nay CZE đã được ứng dụng tương đối nhiều trong lĩnh vực sinhy học, đặc biệt là lĩnh vực tách và phân tích các chất peptid, protein, các
amino acid và glycoprotein.
1.1.3. Sắc ký điện động Mixen (MEKC):
1.1.3.1. Cơ sở sắc ký điện động Mixen:
Bản chất và trung tâm của sự tách ở đây là sự hình thành các phần tử
Mixen trong mao quản và các tiểu phân này sẽ dẫn dắt đóng góp thêm khả


16
năng của quá trình tách các chất trên nền của dung dịch chất đệm và chất
điện ly của quá trình điện di . Sự tách của các phân tử chất tan trung hoà
bằng kỹ thuật MEKC là được điều chỉnh bởi các chất hoạt động bề mặt trong
dung dịch đệm điện di. Khi nồng độ chất hoạt động bề mặt cao hơn nồng độ
ngưỡng của Mixen (chuẩn giới hạn hình thành Mixen, CMC: Critial
Micellary Concentration). Ví dụ CMC = 9 mM đối với SDS (Sodium
Dodecyl Sulfat), các phân tử chất diện hoạt sẽ sắp xếp lại thành các tập hợp
được gọi là mixen, trong đó phần thân nước của phân tử chất diện hoạt sẽ
hướng ra ngoài dung dịch điện ly nền tạo ra phần ngoài ưa nước của mixen,
phần thân dầu của phân tử chất diện hoạt hướng vào trong tạo ra phần lõi kỵ

nước của mixen [15].

Hình 1.7 - Cấu trúc của các Mixen và dòng EOF trong MEKC
Nếu ái lực giữa chất phân tích và lõi kỵ nước của mixen đủ lớn, chất
phân tích sẽ được phân bố giữa dung dịch điện ly nền và mixen với một hằng
số phân bố K i xác định. Quá trình tách trong MEKC là kết quả tổng hợp của
R

R


17
2 quá trình: quá trình điện di và quá trình phân bố của chất phân tích giữa
dung dịch điện ly nền và mixen chất diện hoạt. Sự có mặt của quá trình thứ 2
là yếu tố chủ yếu làm tăng khả năng phân tách của MEKC so với CZE. Hai
phân tử có cùng linh độ điện di sẽ không tách được bằng CZE, nhưng nếu ái
lực của chúng với mixen chất diện hoạt khác nhau đáng kể, chúng có thể
được tách riêng bằng MEKC. Độ chọn lọc của hệ pha MEKC có thể thay
đổi được thông qua việc thay đổi nồng độ Mixen, thay đổi pH của dung dịch
đệm, việc thêm các chất phụ gia, thêm dung môi hữu cơ thích hợp vào trong
hệ pha của MEKC.
Các chất hoạt động bề mặt có thể dùng ở đây như các chất loại
cationic (DTAB), loại anionic (SDS), các chất ionic kép (CHAPS,
CHAPSO),

loại

không

ionic

hoá

(Octyglucoside,

n-Dodecyl-β-D-

maltoside...) hay là dùng hỗn hợp của chúng với nhau [26].
1.1.3.2. Ứng dụng của MEKC:
Phương pháp MEKC được sử dụng để tách cả các chất mang điện tích
và các chất không mang điện tích. Phương pháp này cũng được sử dụng tốt
để tách và phân tích các chất amino acid, các chất họ nucleotid, các loại
vitamin, các chất loại hydrocarbon thơm, các dược phẩm và hợp chất sinh
học.
1.1.4. Một số ưu điểm của CE:
Điện di mao quản có một số ưu điểm sau:
- Có hiệu lực tách các chất rất cao trong mao quản silica nung chảy
hay ống Teflon (có đường kính trong 25-100µm).
- Số đĩa lý thuyết N của cột tách là rất lớn, thông thường N từ 105 đến
P

P

106 nên cho kết quả tách tốt những hợp chất phức tạp.
P

P

- Thời gian tách ngắn hơn so với các loại sắc ký HPLC trên cùng loại

18
đối tượng mẫu.
- Lượng (thể tích) mẫu cần là rất nhỏ, thường là từ 5-50 nL cho một
lần bơm mẫu vào cột tách.
- Có nhiều kiểu tách theo CE, nên khả năng ứng dụng thực tế là rất
rộng rãi và đa dạng.
- Sự tách được thực hiện chủ yếu trong môi trường nước với sự có mặt
của chất điện ly nên không tốn nhiều dung môi hữu cơ và rất kinh tế.
- Quá trình phân tích không phức tạp (tương tự như trong HPLC).
- Có khả năng tự động hóa trong tách và phân tích hàng loạt.
Tuy nhiên do đặt một điện thế cao vào hai đầu mao quản do đó sinh ra
hiệu ứng nhiệt Joule dẫn đến sự giãn rộng pic. Vì vậy phải khống chế nhiệt
độ của mao quản để đảm bảo thu được kết quả phân tích tốt nhất.
1.2 Đại cương kháng sinh β-lactam
1.2.1. Đại cương chung kháng sinh β-lactam:
1.2.1.1. Cấu trúc hóa học:
Các kháng sinh β-lactam có chứa trong phân
tử một vòng β-lactam, đó là một amid vòng 4 cạnh:

O

N H

Nếu ngưng tụ vòng β-lactam với:

S

 một vòng Thiazolidin ta được penam là khung
cơ bản của các kháng sinh penicilin.

O

N

 một vòng dihydrothiazin thì được dẫn chất

S

cephem là khung cơ bản của các Cephalosporin.
O

N

Nếu thay thế H gắn với N của vòng β-lactam bằng nhóm SO 3 H được
R

monobactam là khung cơ bản của các kháng sinh monobactam.

R


19

O

N

SO3H

1.2.1.2. Phân loại:
Các kháng sinh β-lactam được chia thành 4 nhóm [3]:
- Các penicilin.
- Các cephalosporin.
- Các carbapenem.
- Các monobactam.
1.2.1.3. Cơ chế tác dụng:
Thành tế bào là yếu tố cần thiết cho quá trình phát triển bình thường của
vi khuẩn. Peptidoglycan là thành phần tạo nên sự bền vững của thành tế bào
vi khuẩn. Quá trình sinh tổng hợp Peptidoglycan được thực hiện nhờ các Dalanin transpeptidase.Các enzym này là những đích thu hút các β-lactam và
được gọi là các protein gắn penicilin (penicilin binding protein-PBP). Các
kháng sinh β-lactam có khả năng acyl hoá các D-alanin transpeptidase làm
cho chúng không thực hiện nhiệm vụ của mình, làm cho quá trình sinh tổng
hợp thành tế bào vi khuẩn bị gián đoạn, vi khuẩn bị tiêu diệt.
Tất cả các vi khuẩn đều có chứa các PBP với số lượng thay đổi tuỳ
theo từng loại vi khuẩn, mỗi PBP có một chức năng khác nhau và ái lực của
chúng cũng thay đổi đối với từng loại kháng sinh β-lactam.
ở các vi khuẩn Gram (-) vỏ của chúng phức tạp hơn vì có thêm một
màng ngoài giàu lipid (Gram (+) không có), do đó muốn kết hợp với các
PBP của vi khuẩn thì các β-lactam phải khuếch tán qua những ống dẫn (gọi
là porin) và đi vào phía trong tới khoảng gian bào tương để gắn với các PBP.
Ngoài ra người ta còn thấy rằng trong vi khuẩn có các enzym tự phân